Artykuł metodologiczny

Pierwotna hodowla neuronów hipokampa o niskiej gęstości

21.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55000

⸱

18 kwietnia 2017

 ,  , 
1Department of Physiology and Pathophysiology, University of Manitoba, 2Kleysen Institute for Advanced Medicine, Health Sciences Centre

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje protokół hodowli pierwotnych neuronów hipokampa o niskiej gęstości rosnących na szklanych szkiełkach nakrywkowych odwróconych na monowarstwie glejowej. Warstwy neuronów i glejowe są oddzielone kulkami wosku parafinowego. Neurony wyhodowane tą metodą nadają się do obrazowania optycznego o wysokiej rozdzielczości i testów funkcjonalnych.

Streszczenie

Możliwość badania struktury i fizjologii poszczególnych komórek nerwowych w hodowli jest kluczowa dla badań neurobiologicznych i pozwala na elastyczność w genetycznym i chemicznym manipulowaniu pojedynczymi komórkami lub zdefiniowanymi sieciami. Taka łatwość manipulacji jest prostsza w systemie hodowli zredukowanej w porównaniu z nienaruszoną tkanką mózgową. Chociaż istnieje wiele metod izolacji i wzrostu tych pierwotnych neuronów, każda z nich ma swoje własne ograniczenia. Protokół ten opisuje metodę hodowli embrionalnych neuronów hipokampa gryzoni o niskiej gęstości i wysokiej czystości na szklanych szkiełkach nakrywkowych, które są następnie zawieszane na monowarstwie komórek glejowych. Ta "kultura warstwowa" pozwala na wyłączny, długoterminowy wzrost populacji neuronów, jednocześnie umożliwiając troficzne wsparcie ze strony leżącej poniżej monowarstwy glejowej. Gdy neurony są w odpowiednim wieku lub na odpowiednim poziomie dojrzałości, szkiełka nakrywkowe neuronów można wyjąć z naczynia glejowego i wykorzystać w obrazowaniu lub testach funkcjonalnych. Neurony wyhodowane tą metodą zazwyczaj przeżywają kilka tygodni i rozwijają rozległe altany, połączenia synaptyczne i właściwości sieci.

Wprowadzenie

Mózg jest zorganizowany w skomplikowane sieci neuronów. Udział poszczególnych neuronów w aktywności sieci i funkcjonowaniu mózgu można badać poprzez selektywną zmianę ich składu molekularnego i perurbancji ich właściwości fizjologicznych. Genetyczna i chemiczna manipulacja pojedynczymi neuronami jest prawdopodobnie łatwiejsza w hodowanych neuronach niż w nienaruszonej tkance mózgowej, nieobciążonej przez komórkową heterogeniczność i złożoność tej ostatniej. Neurony w kulturze rozwijają dobrze zdefiniowane altany aksonalne i dendrytyczne i tworzą ze sobą rozległe połączenia synaptyczne.

Chociaż hodowla neuronów od dorosłych zwierząt lub z innych regionów układu nerwowego jest możliwa, embrionalne kultury hipokampa są często preferowane ze względu na ich zdefiniowaną populację komórek piramidalnych i stosunkowo niską gęstość glejową 1,2. Neurony hipokampa hodowane w niskiej gęstości w kulturze są szczególnie podatne na badanie lokalizacji subkomórkowej, transportu białek, polaryzacji neuronów i rozwoju synaps. Neurony w kulturze są również szeroko wykorzystywane do badania procesów molekularnych w plastyczności synaptycznej 3,4,5,6. Preparaty do hodowli neuronów od myszy z globalnymi delecjami genetycznymi, które nie przeżywają po urodzeniu, były szczególnie przydatne w badaniu komórkowych i synaptycznych ról niektórych genów 7.

Podobnie jak w mózgu, hodowane neurony hipokampa są zależne od troficznego wsparcia ze strony komórek glejowych. To komplikuje ich kulturę i doprowadziło do opracowania kilku różnych metod, za pomocą których to wsparcie jest dostarczane. Jedna z powszechnie stosowanych metod polega na posiewaniu neuronów bezpośrednio na monowarstwie komórek glejowych 8, lub pozwalaniu na proliferację zanieczyszczonych komórek glejowych z nabytej tkanki hipokampa i tworzenie monowarstwy pod neuronami 9. Chociaż metoda ta odniosła pewien sukces, zanieczyszczenie powstałej kultury neuronalnej jest niekorzystne dla eksperymentów obrazowych. Inną powszechnie stosowaną metodą hodowli neuronów jest całkowite pominięcie warstwy zasilającej glej, a zamiast tego zapewnienie wsparcia troficznego w postaci zdefiniowanej pożywki wzrostowej 10.

Tutaj opisujemy metodę hodowli neuronów "kanapkową" lub "bankierską" 2,11. Metoda ta polega na posiewaniu neuronów hipokampa na szklanych szkiełkach nakrywkowych, które są następnie zawieszane na monowarstwie komórek glejowych oddzielonych kulkami wosku parafinowego. Ułatwia to długotrwałą hodowlę jednorodnej populacji neuronów bez zanieczyszczania gleju, a jednocześnie umożliwia troficzne wsparcie ze strony leżącej poniżej monowarstwy glejowej. Gdy neurony są w odpowiednim wieku lub na odpowiednim poziomie dojrzałości, szkiełka nakrywkowe neuronów można wyjąć z naczynia glejowego i wykorzystać w obrazowaniu lub testach funkcjonalnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty i protokoły z użyciem zwierząt laboratoryjnych zostały zatwierdzone przez komisję etyki zwierząt Uniwersytetu Manitoba i były zgodne z wytycznymi Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami.

1. Przygotowanie instrumentów, i roztworów

  1. Sterylizuj przez autoklawowanie wszystkich urządzeń preparacyjnych, szklanych pipet Pasteura, końcówek do pipet, aparatury filtrującej i wody dejonizowanej.
  2. Przygotuj 20% (w/v; 1,1 M) podstawowy roztwór glukozy w wodzie dejonizowanej i sterylizuj filtrem. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  3. Przygotować 100 mM roztwór pirogronianu sodu w wodzie dejonizowanej i wysterylizować z filtrem. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  4. Przygotuj wolny od wapnia i magnezu zrównoważony roztwór soli Hanka (CMF-HBSS), sporządzając roztwór 10% HBSS (10x), 10 mM HEPES i 100 U/ml penicyliny-streptomycyny w wodzie dejonizowanej. Przechowywać w temperaturze 4 °C nie dłużej niż 1 do 2 miesięcy.
  5. Przygotować 10 mg/ml dezoksyrybonukleazy I (DNazy) w CMF-HBSS, a następnie wysterylizować metodą filtracyjną i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  6. Przygotować pożywkę glejową, sporządzając roztwór 30 mM glukozy (ze sterylnego roztworu), 95 U/ml penicyliny-streptomycyny i 10-15% surowicy wzrostu bydła (BGS) w pożywce minimum niezbędnej (MEM).
    UWAGA: Jak wskazano w protokole, w razie potrzeby można użyć roztworu 5% BGS w celu spowolnienia proliferacji komórek. Zamiast BGS można stosować surowicę końską, ale należy pamiętać, że każda partia musi zostać przetestowana przed użyciem ze względu na różnice między partiami. Przygotowany roztwór przechowywać w temperaturze 4 °C nie dłużej niż 1 do 2 miesięcy. Chociaż wiele laboratoriów korzysta z FBS, konsekwentnie zaobserwowaliśmy, że wzrost gleju w BGS jest tak samo silny jak w FBS. BGS pochodzi z płodowej surowicy cielęcej, która jest uzupełniona o chemicznie zdefiniowane składniki. Ponadto BGS jest znacznie bardziej ekonomiczny niż FBS.
  7. Przygotuj pożywkę do wzrostu i utrzymania neuronów (neurobasal-B27, NBG), sporządzając roztwór 1x suplementu B27 i 0,5 mM L-Glutaminy w 500 ml pożywki neurobazalnej. Przechowywać w temperaturze 4 °C nie dłużej niż 1 do 2 miesięcy. L-Glutaminę można zastąpić GlutaMAX, który sugeruje się, że jest bardziej stabilny w pożywce wzrostowej.
  8. Przygotuj pożywkę do powlekania neuronów, sporządzając roztwór 30 mM glukozy (ze sterylnego roztworu), 1 mM pirogronianu sodu (ze sterylnego roztworu) i 10% BGS w MEM. Przechowywać w temperaturze 4 °C nie dłużej niż 1 do 2 miesięcy.
  9. Przygotować roztwór 1 mM cytarabiny (Ara-C) i wysterylizować z filtrem. Porcjować na porcje o pojemności 1 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  10. Przygotować roztwór 100 mM APV w 100 mN wysterylizowanym filtrem NaOH. Przechowywać w temperaturze -20 °C.
  11. Rozpuścić 1 mg/ml poli-L-lizyny w buforze boranowym o pH 8,5 (50 mM kwasu borowego i 12 mM boraksu) i wysterylizować filtrem. Podwielokrotność porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C. Zamiast poli-L-lizyny można użyć poli-L-ornityny, która może być mniej toksyczna dla komórek.

2. Przygotowanie kultur glejowych

  1. Przygotuj kulturę komórek astrogleju korowego
    1. Pozyskać młode szczura w ciągu 24 godzin od urodzenia. Umieść szczenięta na lodzie, aby je znieczulić.
    2. Spryskaj szczenięta 70% etanolem i odetnij im głowy.
    3. Umieść głowy w naczyniu o średnicy 100 mm na lodzie zawierającym 15 ml CMF-HBSS.
    4. Wypreparuj każdy mózg, przecinając skórę głowy, otwierając czaszkę, przecinając pień mózgu, a następnie przenosząc mózg na 60-milimetrowe szalki Petriego na lodzie zawierającym 3 ml CMF-HBSS.
    5. Oddziel półkule mózgowe od hipokampów, a następnie usuń otaczające je opony mózgowe. Zachowaj odpowiednie środki ostrożności, aby zapewnić minimalne zanieczyszczenie fibroblastami opon mózgowych. Fibroblasty opon mózgowych w kulturze mogą konkurować z glejem o wzrost i być szkodliwe dla zdrowia neuronów. Zebrać wszystkie półkule mózgowe na 60-milimetrowej szalce Petriego na lodzie zawierającym 5 ml CMF-HBSS.
    6. Usuń CMF-HBSS, a następnie zmiel pobraną tkankę korową tak drobno, jak to możliwe, za pomocą nożyczek sprężynowych do mikropreparowania.
    7. Dodać wystarczającą ilość CMF-HBSS do posiekanej tkanki. Za pomocą szklanej pipety Pasteura przenieś kawałki tkanki do probówki o pojemności 15 ml. Doprowadzić całkowitą objętość do 12 ml, dodając CMF-HBSS.
    8. Dodaj po 1,5 ml 2,5% trypsyny i 10 mg/ml roztworu DNazy. Otrzymaną mieszaninę inkubować w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej przez 12 minut.
    9. Tkankę należy rozcierać 10-15 razy za pomocą szklanej pipety Pasteura, a następnie inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 3 minuty.
    10. Przefiltrować supernatant przez bibułę do soczewek lub siatkę filtracyjną do probówki o pojemności 50 ml zawierającej 5 ml BGS. Ma to na celu usunięcie kawałków niezdysocjowanej tkanki. Alternatywnie można użyć dostępnych na rynku filtrów siatkowych.
    11. Dodać 13,5 ml CMF-HBSS i 1,5 ml 2,5% trypsyny do probówki zawierającej pozostałe fragmenty tkanki i dalej inkubować w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej przez dodatkowe 10 minut.
    12. Pozostałą tkankę należy ponownie roztrzeć, a następnie ponownie przefiltrować zawiesinę do probówki o pojemności 50 ml zawierającej początkowy filtrat. Następnie opłucz papier do soczewek 3 ml BGS. Ostateczna objętość powinna wynosić około 38 ml.
    13. Odwirować zawiesinę zawierającą zdysocjowane komórki glejowe przez 6 minut przy sile 130 x g. Ostrożnie odwirować supernatant za pomocą szklanej pipety Pasteura. Upewnij się, że granulowane komórki na dole nie są naruszone. Dno osadu wydaje się lekko czerwonawe i zawiera składniki krwi.
    14. Przenieść komórki glejowe w 1 ml pożywki glejowej do świeżej probówki, uważając, aby nie naruszyć czerwonawej części osadu.
    15. Dodaj do 2 ml pożywki glejowej na szczenię, aby ponownie zawiesić połączone zdysocjowane komórki glejowe. Na przykład, jeśli użyto 10 szczeniąt, całkowita objętość rekompozycji wyniesie 20 ml.
    16. Przygotować jedną kolbę do hodowli komórkowych o średnicy 75cm2 na młode. Dodać 18 ml wstępnie ogrzanej pożywki glejowej do każdej kolby.
    17. Przenieść 2 ml zawiesiny komórkowej do każdej kolby i inkubować w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
    18. Po jednym dniu zastąp 20 ml pożywki glejowej. Na tym etapie hodowla jest mieszanką komórek glejowych i innych niepożądanych typów komórek.
    19. Cztery dni po wysianiu komórek energicznie potrząśnij kolbami, aby usunąć komórki inne niż astrocyty. W tym celu należy przepłukać kolby raz za pomocą CMF-HBSS, a następnie dodać 10 ml świeżego CMF-HBSS do każdej kolby. Energicznie wstrząsnąć kolbami 5-10 razy, a następnie odessać CMF-HBSS. Przepłukać dwukrotnie CMF-HBSS, a następnie dodać 20 ml pożywki glejowej.
      UWAGA: Ten krok ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia usunięcia typów komórek innych niż docelowe i nie powinien powodować utraty pożądanych astrocytów.
    20. Zastąp świeżą pożywką glejową dwa razy w tygodniu, aż komórki zaczną się zlewać (ryc. 1).
  2. Zamrażanie gleju
    1. Gdy kultury zlewają się, odessać pożywkę i przemyć monowarstwę komórek 10 ml CMF-HBSS.
    2. Dodać 10 ml 0,25% trypsyny/EDTA do każdej kolby i inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 minuty.
    3. Delikatnie postukaj w kolby, aby usunąć komórki. Dodać 1 ml BGS do każdej kolby i przenieść zawiesiny komórek do probówek o pojemności 15 ml.
    4. Odwirować probówki o sile 130 x g przez 6 minut. Powstały supernatant należy wyrzucić.
    5. Zawiesić osad komórkowy w 2 ml pożywki glejowej.
    6. Przygotować pożywkę do zamrażania glejowego (1 część sulfotlenku dimetylu i 4 części BGS). Dodać 0,5 ml tego roztworu do każdej z 4 fiolek kriogenicznych w kolbie.
    7. Przenieść 0,5 ml zawiesiny komórkowej do każdej fiolki, a następnie powoli zamrażać komórki, umieszczając fiolki w izolowanym pojemniku w zamrażarce o temperaturze -80 °C na noc. Po jednym dniu należy przenieść fiolki do zamrażarki z ciekłym azotem w celu długotrwałego przechowywania.
  3. Poszycie ożywiło glej
    1. Glej płytkowy 1-2 tygodnie przed dniem hodowli neuronów.
    2. Przygotuj probówkę o pojemności 50 ml z 10 ml podgrzanej pożywki glejowej.
    3. Rozmrażać 1 zamrożoną fiolkę z glejem w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 2-3 minuty.
    4. Przenieść zawartość fiolki do probówki o pojemności 50 ml zawierającej 10 ml pożywki glejowej.
    5. Odwirować probówkę przez 5 minut przy sile 130 x g i odessać sklarowany nad osadem.
    6. Zawiesić osad w 20 ml pożywki glejowej.
    7. Dodać 3 ml świeżej pożywki glejowej do każdej z szalek hodowlanych (60 mm), a następnie przenieść 1 ml zawiesiny komórkowej do każdej szalki. Inkubować kultury w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
    8. Karm komórki dwa razy w tygodniu. Jeśli gęstość komórek osiągnie 50% konfluencji na długo przed dniem hodowli neuronów, zmień na pożywkę glejową zawierającą 5% BGS, aby spowolnić tempo wzrostu gleju. Pożądane zsumowanie monowarstwy glejowej dla hodowli neuronów wynosi 50% - 70%.
    9. Zastąp pożywkę glejową pożywką NBG (6 ml / talerz) 1-2 dni przed hodowlą neuronów.

3. Przygotowanie szkiełek nakrywkowych

  1. Czyszczenie i przygotowanie kulek parafinowych
    1. Zanurzyć szkiełka nakrywkowe w stężonym kwasie azotowym (70% wag./wag.; UWAGA: silnie) i sonikować je przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Inne laboratoria uznały, że korzystna jest inkubacja szkiełek nakrywkowych w 70% kwasie azotowym w ceramicznych stojakach przez 12-24 godziny w temperaturze pokojowej.
    2. Ostrożnie wyrzuć kwas azotowy do wyznaczonego dygestorium chemicznego zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi. Spłucz szkiełka nakrywkowe 3-5 razy wodą dejonizowaną.
    3. Zanurz szkiełka nakrywkowe w wodzie dejonizowanej i ponownie poddaj je sonikacji przez 30 minut (pomiń, jeśli stosujesz metodę alternatywną).
    4. Usuń wodę dejonizowaną i spłucz szkiełka nakrywkowe jeszcze trzy razy.
    5. Zanurz szkiełka nakrywkowe w 50 ml wody dejonizowanej i wysterylizuj je w autoklawie. Alternatywnie można sterylizować szkiełka nakrywkowe w temperaturze 225 °C w piekarniku przez 6 godzin. W przypadku korzystania z tego alternatywnego podejścia przejdź do kroku 3.1.9.
    6. Po sterylizacji w autoklawie przenieś szkiełka nakrywkowe do sterylnego okapu z przepływem laminarnym, aby wykonać następujące czynności.
    7. Usuń wodę dejonizowaną i spłucz 20-30 ml 100% etanolu.
    8. Dodać 20-30 ml 100% etanolu i przenieść szkiełka nakrywkowe i etanol na szalkę Petriego o średnicy 100 mm.
    9. Użyj pęsety, aby przenieść szkiełka nakrywkowe na szalki Petriego o średnicy 60 mm, 4-5 szkiełek nakrywkowych na naczynie, a następnie pozostaw je do wyschnięcia na powietrzu, opierając szkiełka nakrywkowe o krawędź naczynia. Po odparowaniu etanolu połóż szkiełka nakrywkowe płasko na powierzchni.
    10. Przenieś 10 g parafiny do odpowiedniej butelki ze szkła żaroodpornego. Rozpuść parafinę i utrzymuj ją w temperaturze około 150-200 °C na gorącej płycie przez co najmniej 1 godzinę. Idealna temperatura, do której należy podgrzać parafinę, może wymagać pewnych poprawek. Nieidealne temperatury mogą prowadzić do trudności w wytwarzaniu odpowiedniego rozmiaru kulek parafinowych. Okres oczekiwania po stopieniu pomaga zapewnić stałą temperaturę w całej cieczy.
    11. Zanurz pipetę Pasteura w parafinie, a następnie szybko przyłóż ją do trzech miejsc w pobliżu krawędzi każdego szkiełka nakrywkowego (każde miejsce jest oddalone od siebie o około 120°). Krople zestalą się w kulki o wysokości około 0,3-0,5 mm i średnicy 1,0-2,0 mm i będą działać w celu zapewnienia przestrzeni między neuronami na szkiełku nakrywkowym a monowarstwą glejową poniżej (ryc. 2).
    12. Naczynia sterylizujemy w świetle UV przez 30 min, a następnie przykrywamy folią aluminiową i przechowujemy w temperaturze pokojowej. Przygotowane szkiełka nakrywkowe można przechowywać i używać do jednego miesiąca. Kulki parafinowe powinny przylegać do szkiełek nakrywkowych przez co najmniej tydzień przed użyciem. Zapobiegnie to odklejaniu się parafiny podczas pozostałych etapów protokołu.
  2. Powlekanie szkiełek nakrywkowych poli-L-lizyną
    1. Otrzymać szalki Petriego zawierające wcześniej przygotowane szkiełka nakrywkowe z kulkami parafiny.
    2. Dodać 200 μl poli-L-lizyny w buforze boranowym na powierzchnię każdego szkiełka nakrywkowego i pozostawić roztwór na szkiełkach nakrywkowych na noc pod przykryciem w temperaturze pokojowej. Pokryj tę samą powierzchnię, na której znajdują się kulki parafinowe. Należy pamiętać, że przy prawidłowym oczyszczeniu poli-L-lizyna powinna łatwo się rozprowadzać, pokrywając powierzchnię szkiełka nakrywkowego.
    3. Po jednym dniu należy umyć szkiełka nakrywkowe dwukrotnie, mocząc je za każdym razem w sterylnej wodzie dejonizowanej przez 2 godziny. Po ostatnim umyciu zastąp wodę 4 ml pożywki do powlekania neuronów na naczynie. Należy pamiętać, że ważne jest, aby powierzchnia szkiełek nakrywkowych nie mogła wyschnąć po pokryciu poli-L-lizyną.
    4. Umieścić naczynia zawierające szkiełko nakrywkowe w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Powlekane szkiełka nakrywkowe należy inkubować przez co najmniej 24 godziny przed hodowlą neuronów. Ma to na celu przygotowanie pożywki do hodowli neuronów.

4. Sekcja hipokampa i neuronów poszycia

  1. Uzyskaj ciężarną szczur (dzień embrionalny 18-19, mierzony od dnia odkrycia czopa dopochwowego) i poddaj się eutanazji przez dekapitację znieczuloną izofluranem lub inną zatwierdzoną metodę.
  2. Spryskaj spód szczura 70% etanolem, a następnie wykonaj nacięcie od okolicy łonowej do końca jamy brzusznej. Aby uniknąć zanieczyszczenia, na tym etapie należy uważać, aby przeciąć tylko skórę.
  3. Ponownie opłucz narzędzia preparacyjne 70% etanolem, a następnie przeciąć ścianę brzucha, aby odsłonić macicę. Usuń dwa rogi macicy i umieść je na sterylnej szalce Petriego o średnicy 100 mm.
  4. Pozostałe kroki wykonaj w okapie z przepływem laminarnym. Usuń błonę macicy otaczającą płody. Odetnij im głowy i umieść je na 100-milimetrowej szalce Petriego zawierającej 20 ml CMF-HBSS.
  5. Wypreparuj mózgi i natychmiast umieść je na szalce Petriego o średnicy 60 mm zawierającej 2 ml CMF-HBSS na lodzie. Zbierz tylko 2-3 mózgi na naczynie, aby zapewnić wystarczająco dużo miejsca na następny krok.
  6. Pod mikroskopem preparacyjnym usuń opony mózgowe z linii środkowej półkul mózgowych, a następnie wypreparuj hipokampy i umieść je na 60-milimetrowej szalce Petriego zawierającej 4,5 ml CMF-HBSS. Należy zauważyć, że hipokamp można rozróżnić jako strukturę w kształcie półksiężyca na przyśrodkowej powierzchni półkuli korowej i jest łatwy do usunięcia, ponieważ jest otoczony bocznie komorą.
  7. Przenieś pobraną tkankę hipokampa i CMF-HBSS do probówki o pojemności 15 ml. Dodać 0,5 ml 2,5% trypsyny, a następnie inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 minut. Papaina może być stosowana zamiast trypsyny, ponieważ jest łagodniejsza i może zwiększyć wydajność.
  8. Delikatnie usuń roztwór trypsyny za pomocą pipety Pasteura, pozostawiając nienaruszoną tkankę hipokampa na dnie probówki.
  9. Delikatnie umyć tkankę dwukrotnie za pomocą 5 ml CMF-HBSS, inkubując ją w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Po drugim płukaniu doprowadzić całkowitą objętość do co najmniej 5 ml, dodając odpowiednią objętość CMF-HBSS do tkanki. Jeśli hipokampy pochodzą od więcej niż 10 młodych, można dodać do 8 ml CMF-HBSS.
  10. Przygotuj dwa warianty pipet polerowanych ogniowo do dysocjacji tkanek. Końcówka jednego z wariantów ma normalną średnicę pipety, ale z wygładzonymi krawędziami, polerowanymi na ogniowo. Drugi wariant to taki, w którym średnica końcówki jest zmniejszona o połowę. Na krótko wystawić końcówkę szklanej pipety Pasteura po przekątnej na źródło płomienia, a następnie zbadaj końcówki pipet.
    1. Powtarzaj ten krok, aż krawędź końcówki zostanie wygładzona lub średnica zostanie zmniejszona. Ważne jest, aby ćwiczyć, aby znaleźć idealną średnicę, aby zapewnić, że tkanka zostanie zdysocjowana, aby uzyskać pojedyncze komórki bez uszkadzania tych komórek.
  11. Najpierw przetrzeć tkankę hipokampa przez około 10 przejść przez normalną szklaną pipetę Pasteura o gładkich krawędziach, a następnie kolejne 5 do 10 przejść przez pipetę o zmniejszonej średnicy. Celem jest uzyskanie jednorodnego roztworu komórek bez grudek tkanek lub z bardzo małą ich ilością.
  12. Określ gęstość komórek za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek. Zazwyczaj 0,8 do 1,0 miliona komórek na młode uzyskuje się po połączeniu hipokampów z dwóch półkul.
  13. Przenieść wystarczającą objętość zawiesiny komórek do szalek zawierających szkiełka nakrywkowe pokryte poli-L-lizyną w pożywce galwanicznej o pojemności 4 ml, aby uzyskać gęstość posiewu wynoszącą 300 000 komórek na szalkę o średnicy 60 mm. Gęstość komórek może wahać się od 100 000 do 500 000, w zależności od zamierzonego eksperymentu.
  14. Po 3-4 godzinach przenieś szkiełka nakrywkowe z neuronami przyłączonymi do szalek zawierających komórki glejowe w pożywce NBG. Należy to zrobić tak, aby strona, po której zostały posiane neurony, była skierowana w dół w kierunku warstwy komórek glejowych. Dodaj w sumie 4-5 szkiełek nakrywkowych na naczynie glia.
  15. Dwa lub trzy dni po posiewie dodać roztwór Ara-C do końcowego stężenia 5 μM na szalkę, aby zatrzymać wzrost gleju.
  16. Karm komórki raz w tygodniu, zastępując 2 ml starej pożywki 2,5 ml świeżej pożywki przy każdym karmieniu. Dodana dodatkowa pożywka ma na celu skompensowanie parowania w czasie, a tylko część pożywki jest zmieniana, aby zapewnić stałe kondycjonowanie pożywki przez komórki glejowe. Kultury te są zazwyczaj zdrowe przez co najmniej jeden miesiąc (ryc. 3). Przeżycie neuronów można poprawić, dodając APV do pożywki hodowlanej do końcowego stężenia 100 μM. APV jest antagonistą receptora NMDA i wspomaga przeżycie poprzez zmniejszenie ekscytotoksyczności glutaminianu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W tej „kanapkowej” metodzie pierwotnej hodowli komórek nerwowych neurony hipokampa (Rysunek 3) rosną na warstwie komórek glejowych (Rysunek 1), przedzielonej kuleczkami parafinowymi (Rysunek 2). Zapewnia to selektywny wzrost neuronów na szkiełkach podstawkowych przy minimalnym zanieczyszczeniu komórkami glejowymi, przy jednoczesnym zapewnieniu odpowiedniego wsparcia troficznego z gleju rosnącego na naczyniu hodowlanym. Zazwyczaj neurony m...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Podczas gdy metoda "kanapkowa" hodowli neuronów została dobrze opisana w innym miejscu2,11, w całym protokole jest kilka kroków, które są dość trudne do opisania w samym tekście, co może prowadzić do frustracji badaczy, którzy chcą ją przyjąć.

Metodę można podzielić na trzy szerokie przepływy pracy: hodowla glejowa, przygotowanie szkiełek nakrywkowych oraz hodowla i utrzymanie neuronów. Każdy z tych trzech preparatów ma kluczowe znacze...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez CIHR MOP-142209 dla TJS.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Przyrządy do preparacji
Micro Nożyczki preparacyjneRobozRS-5910
Mikro nożyczki sprężynowe do preparowaniaRobozRS-5650
Mikro nożyczki sprężynowe do preparowaniaRobozRS-5605
Dumont KleszczeRobozRS-5045
Dumont Kleszcze (#PP)RobozRS-4950
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Preparat tkankowy
Trypsyna (2,5%)Gibco15-090-046
Trypsyna-EDTA (0,25%)Gibco25-200-072
Uchwyt filtra Swinnex, 25  mmEMD MilliporeSX0002500Używany jako sitko do komórek. Najpierw zmontuj z filtrem i autoklawem
IsofloranePharmaceutical Partners of Canada Inc.
HemocytometrHausser Scientific1492
Grade 105 Chusteczka do czyszczenia soczewekGE Healthcare2105-841Używany jako sitko do komórek. Zamontuj najpierw w uchwycie filtra i autoklawie
Szklane pipety Pasteura z filtrem bawełnianymVWR14672-412
HEPES (1 M)Gibco15-630-080
Zbilansowany roztwór soli Hanka bez wapnia, magnezu, czerwieni fenolowej (HBSS, 10x)Gibco14-185-052
Szklane pipety PasteuraVWR14672-380
Deoksyrybonukleaza I z trzustki bydlęcej (Dnase)Sigma-AldrichDN25-100mg
Butan Bunsen BurnerWall-Lenk Mfg. Co.Wirówka model 65
Eppendorf5810R
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kultura tkankowa
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/mL)Gibco15-140-122
Szalka Petriego (100 mm)SzalkaFB0875712
(60 mm)FisherFB0875713A
Serum dla koniGibco16050-122Może być używana zamiast BGS, ale każda partia musi zostać przetestowana ze względu na różnice między partiami. Zalecana jest inaktywacja surowicy na gorąco.
Wodorotlenek soduFisher ScientificS318-1
Pirogronian soduSigma-AldrichP2256
Minimum niezbędne podłoże (MEM)Gibco11-095-080
Podłoże neuropodstawoweGibco21-103-049
L-glutamina (200 mM)Gibco25-030-081
Suplement GlutaMAXGibco35050061Może być stosowany zamiast L-glutaminy w pożywce NBG
Naczynie hodowlane (60 mm)Corning, Inc353002
Kolby hodowlane (75 cm^2)Greiner Bio-One658170
Cytarabina (Ara-C)Sigma-AldrichC3350000
D-(+)-GlukozaSigma-AldrichG8270
Bydlęca surowica wzrostu (BGS)HyCloneSH3054103Przed użyciem zaleca się inaktywację termiczną.
Suplement B27 (50x)Gibco17-504-044
Dimetylosulfotlenek (DMSO)Sigma-AldrichD8418-100ml
Fiolki kriogeniczneVWR89094-806
Kwas DL-2-amino-5-fosfonopentanowy (APV)Sigma-AldrichA5282
NazwaFirmaNumer katalogowy<strong>Komentarze
Preparat do szkiełek nakrywkowych
Tetraboran sodu dekahydrat (boraks)Sigma-AldrichB9876-1KG
Bromowodorek poli-L-lizynySigma-AldrichP2636
Histoplast Wosk parafinowyFisher22-900-700
Grawitacyjny piec konwekcyjnyVWR89511-404Używany do alternatywnej metody czyszczenia szkiełek nakrywkowych omówionej w protokole
Kąpiel ultradźwiękowa (Sonicator)Fisher Scientific15337400
Kwasy azotoweAnachemia62786-460
Ceramiczne stojaki do barwieniaThomas Scientific8542E40Używany do alternatywnej metody czyszczenia szkiełek nakrywkowych omówionej w protokole
Szkiełka nakrywkoweGlaswarenfabrik Karl Hecht  GmbH1001/18Producent jest bardzo ważny, ponieważ neurony nie przylegają dobrze do szkła o niższej jakości 
Kwas borowySigma-AldrichB0252
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Różne
sterylne filtry strzykawkoweVWR28145-477Używany ze strzykawką BD do strzykawka do sterylizacji filtra
 BD302832Używany ze sterylnymi filtrami strzykawkowymi VWR do sterylizacji fliterami
Kąpiel wodnaFisher Scientific15-460-16Q
Mikroskop odwróconyOlympusCKX41
15 mL Stożkowe sterylne probówki wirówkoweThermoScientific339650
50 ml Stożkowe sterylne probówki wirówkoweThermoScientific339652
CP0406V2 Petriego Fishera

Bibliografia

  1. Banker, G. A., Cowan, W. M. Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain Res. 126, 397-425 (1977).
  2. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
  3. Adamantidis, A., et al. Optogenetics: 10 years after ChR2 in neurons--views from the community. Nat Neurosci. 18, 1202-1212 (2015).
  4. Ho, V. M., Lee, J. A., Martin, K. C. The cell biology of synaptic plasticity. Science. 334, 623-628 (2011).
  5. Huganir, R. L., Nicoll, R. A. AMPARs and synaptic plasticity: the last 25 years. Neuron. 80, 704-717 (2013).
  6. Luscher, C., et al. Role of AMPA receptor cycling in synaptic transmission and plasticity. Neuron. 24, 649-658 (1999).
  7. Varoqueaux, F., et al. Neuroligins determine synapse maturation and function. Neuron. 51, 741-754 (2006).
  8. Huettner, J. E., Baughman, R. W. Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats. J Neurosci. 6, 3044-3060 (1986).
  9. Lester, R. A., Quarum, M. L., Parker, J. D., Weber, E., Jahr, C. E. Interaction of 6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione with the N-methyl-D-aspartate receptor-associated glycine binding site. Mol Pharmacol. 35, 565-570 (1989).
  10. Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35, 567-576 (1993).
  11. Banker, G., Goslin, K. Rat hippocampal neurons in low-density culture. Culturing nerve cells. 2, 339-370 (1998).
  12. Hanisch, U. K. Microglia as a source and target of cytokines. Glia. 40, 140-155 (2002).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

neurony o niskiej g sto cipod o e z monowarstwy glejowejmetoda hodowli kanapkowejsekcja embrionalnego hipokampapowlekanie poli L lizynprzygotowanie wspornik w parafinowychhodowla kom rek glejowychg sto wysiewu neuron wobrazowanie fluorescencyjne

Powiązane artykuły