Artykuł metodologiczny

Drosophila Przygotowanie i obrazowanie podłużne funkcji serca in vivo przy użyciu optycznej mikroskopii koherentnej (OCM)

DOI:

10.3791/55002

⸱

12 grudnia 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Bioengineering Program, Lehigh University, 2Center for Photonics and Nanoelectronics, Lehigh University, 3Department of Electrical and Computer Engineering, Lehigh University, 4State Key Laboratory of Software Engineering, Wuhan University, 5Genetics and Aging Research Unit, Department of Neurology, Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisane są eksperymentalne protokoły przygotowania Drosophila na różnych etapach rozwoju i wykonywania podłużnego optycznego obrazowania uderzeń serca Drosophila za pomocą niestandardowego systemu optycznej mikroskopii koherentnej (OCM). Zmiany morfologiczne i dynamiczne serca można scharakteryzować ilościowo, analizując parametry strukturalne i funkcjonalne serca na podstawie obrazów OCM.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podłużne badanie bicia serca u małych zwierząt przyczynia się do zrozumienia zmian strukturalnych i funkcjonalnych podczas rozwoju serca. Wykazano, że optyczna mikroskopia koherentna (OCM) jest w stanie obrazować serca małych zwierząt z wysoką rozdzielczością przestrzenną i ultradużą szybkością obrazowania. Wysoki kontrast obrazu i nieinwazyjne właściwości sprawiają, że OCM idealnie nadaje się do wykonywania badań podłużnych bez konieczności preparowania tkanek lub barwienia. Drosophila jest szeroko stosowana jako organizm modelowy w badaniach rozwojowych serca ze względu na dużą liczbę ortologicznych genów chorób ludzkich, podobieństwo mechanizmów molekularnych i szlaków genetycznych do kręgowców, krótki cykl życia i niski koszt hodowli. W tym miejscu opisano protokoły eksperymentalne dotyczące przygotowania Drosophila i optycznego obrazowania bicia serca za pomocą niestandardowego systemu OCM przez cały cykl życia próbki. Postępując zgodnie z krokami przedstawionymi w tym raporcie, można uzyskać poprzeczne obrazy w trybie M i 3D OCM w celu przeprowadzenia badań podłużnych morfologii i funkcji serca Drosophila. Pokazano również, że obrazy OCM en face i osiowe oraz histogramy tętna (HR) i okresu aktywności serca (CAP) analizują zmiany strukturalne serca i określają ilościowo dynamikę serca podczas metamorfozy Drosophila, w połączeniu z filmami skonstruowanymi za pomocą obrazów w trybie M w celu intuicyjnego śledzenia aktywności serca. Ze względu na podobieństwo genetyczne między Drosophila a kręgowcami, podłużne badania morfologii i dynamiki serca u muszek owocowych mogą pomóc w ujawnieniu pochodzenia chorób serca u ludzi. Protokół ten stanowiłby skuteczną metodę przeprowadzania szerokiego zakresu badań w celu zrozumienia mechanizmów chorób serca u ludzi.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podłużne badanie serca u małych zwierząt przyczynia się do zrozumienia różnych chorób sercowo-naczyniowych związanych z ludźmi, takich jak wrodzone wady serca związane z genami1,2. W ostatnich dziesięcioleciach różne modele zwierzęce, takie jak mysz3,4, Xenopus5,6, danio pręgowany7,8, ptasi9 i Drosophila10-16, były wykorzystywane do prowadzenia badań związanych z rozwojem ludzkiego serca. Model mysi jest szeroko stosowany do badania prawidłowego i nieprawidłowego rozwoju serca oraz fenotypów wad serca ze względu na podobieństwa do ludzkiego serca3,4. Zarodek Xenopus jest szczególnie przydatny w badaniach nad rozwojem serca ze względu na łatwość obsługi i częściową przezroczystość5,6. Przezroczystość zarodka i wczesnej larwy modelu danio pręgowanego pozwala na łatwą obserwację optyczną rozwoju serca7,8. Model ptasi jest częstym przedmiotem badań rozwojowych serca, ponieważ serce jest łatwo dostępne po usunięciu skorupek jaj i podobieństwie morfologicznym ptasich serc do ludzkich9. Model Drosophila ma kilka unikalnych cech, które sprawiają, że idealnie nadaje się do wykonywania badań podłużnych serca. Po pierwsze, rurka serca Drosophila znajduje się ~ 200 μm poniżej powierzchni grzbietowej, co zapewnia wygodę dostępu optycznego i obserwacji serca. Ponadto wiele mechanizmów molekularnych i szlaków genetycznych jest zachowanych między Drosophila a kręgowcami. Ortologi ponad 75% ludzkich genów chorobowych znaleziono u Drosophila, co sprawiło, że jest on szeroko stosowany w badaniach transgenicznych11,13. Ponadto ma krótki cykl życia i niskie koszty utrzymania oraz jest powszechnie stosowany jako model próbny do badań biologii rozwojowej14-16.

Poprzednie raporty opisywały protokoły monitorowania funkcji serca Drosophila, takich jak bicie serca. Konieczne były jednak zabiegi preparacyjne17,18. Obrazowanie optyczne zapewnia skuteczny sposób wizualizacji rozwoju serca u zwierząt ze względu na jego nieinwazyjny charakter. W badaniach kardiologicznych na zwierzętach zastosowano różne metody obrazowania optycznego, takie jak mikroskopia dwufotonowa19, mikroskopia konfokalna20,21, mikroskopia arkuszy świetlnych22 i optyczna tomografia koherentna (OCT)16,23-26. Dla porównania, OCT jest w stanie zapewnić dużą głębię obrazowania w sercach małych zwierząt bez użycia środków kontrastowych, przy jednoczesnym zachowaniu wysokiej rozdzielczości i ultrawysokiej szybkości obrazowania, które są ważne dla obrazowania żywych zwierząt. Dodatkowo niski koszt opracowania systemu OCT spopularyzował tę technikę obrazowania optycznego próbek. OCT został z powodzeniem wykorzystany do badania podłużnego Drosophila. Za pomocą OCT przeprowadzono obrazowanie morfologiczne i funkcjonalne serca w celu zbadania struktur serca, funkcjonalnych ról genów oraz mechanizmów wad sercowo-naczyniowych w modelach zmutowanych podczas rozwoju serca. Na przykład zależne od wieku pogorszenie czynności serca zostało potwierdzone za pomocą obniżonego genu związanego z konwertasą angiotensyny (ACER) u Drosophila z OCT27. Fenotypowanie kardiomiopatii związanej z genami wykazano u Drosophila przy użyciu OCT28-33. Badania z wykorzystaniem OCT ujawniły również funkcjonalną rolę ludzkiego genu SOX5 w sercu Drosophila34. W porównaniu z OCT, OCM wykorzystuje obiektyw o większej aperturze numerycznej, aby zapewnić lepszą rozdzielczość poprzeczną. W przeszłości badano dysfunkcję serca spowodowaną wyciszeniem ortologicznego ludzkiego genu okołodobowego dCry/dClock przy użyciu niestandardowego systemu OCM15,16, a także wpływ diety wysokotłuszczowej na kardiomiopatie u Drosophila, aby zrozumieć choroby serca wywołane otyłością. 15

Tutaj protokół eksperymentalny jest podsumowany dla podłużnego badania morfologicznych i funkcjonalnych zmian serca u Drosophila w drugim stadium (L2), trzecim stadium (L3), poczwarce dnia 1 (PD1), poczwarki dnia 2 (PD2), poczwarki dnia 3 (PD3), poczwarki dnia 4 (PD4), poczwarki dnia 5 (PD5) i dorosłego (Rysunek 1) przy użyciu OCM w celu ułatwienia badania wrodzonych chorób serca związanych z człowiekiem. Parametry czynnościowe serca, takie jak HR i CAP, analizowano ilościowo na różnych etapach rozwoju, aby ujawnić cechy rozwoju serca.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie systemu OCM do obrazowania optycznego Drosophila16

  1. Wybierz spektrometr i szybką kamerę do skanowania liniowego, które zapewniają częstotliwość odświeżania co najmniej 80 klatek na sekundę, aby system OCM był w stanie rozpoznać bicie serca Drosophila.
  2. Użyj szerokopasmowego źródła światła, aby zapewnić rozdzielczość osiową 2 μm, aby zidentyfikować strukturę serca Drosophila.
  3. Użyj obiektywu 10X, aby uzyskać wysoką rozdzielczość poprzeczną.
  4. Użyj lustra prętowego 45°, aby odbić wiązkę światła ramienia referencyjnego i wygenerować pierścieniową wiązkę światła ramienia próbki, aby zwiększyć głębokość ogniskowania w próbkach.
  5. Opracuj niestandardowy program komputerowy do sterowania systemem OCM i wykonywania pomiarów.

2. Kultura Drosophila

  1. Standardowe przygotowywanie pokarmu dla much
    1. Umieść ~ 5 ml błyskawicznej formuły Drosophila w polistyrenowej tubie fiolki za pomocą papierowego zsypu.
    2. Wlej ~ 8 ml wody do formuły, aby odpowiednio nasycić żywność.
    3. Dodaj różne suplementy do standardowego pokarmu dla much dla różnych eksperymentów. Przygotowując się do pokarmu all-trans-retinalnego (ATR) do eksperymentu stymulacji optogenetycznej35, użyj pipety, aby wyekstrahować 100 mM ATR i rozpuść w ~ 8 ml wody, aby uzyskać stężenie ATR 1 mM w żywności. Po równomiernym wymieszaniu roztworu wlej roztwór do formuły i wystarczająco wymieszaj.
    4. Aby przygotować dietę wysokotłuszczową do badania dysfunkcji serca związanych z otyłością u Drosophila,10,15 wymieszaj ~10 ml formuły z 15 ml wody w filiżance i podgrzewaj przez 30 sekund w kuchence mikrofalowej. Wlej trochę organicznego oleju kokosowego z pierwszego tłoczenia do innej filiżanki i podgrzewaj przez 90 sekund w kuchence mikrofalowej.
    5. Wyekstrahuj 7,5 ml oleju kokosowego i wymieszaj z przygotowaną formułą na tyle, aby uzyskać stosunek masy do objętości oleju kokosowego do jedzenia ~ 30/100, a następnie wyekstrahuj ~ 2 ml zmieszanego pokarmu i umieść go na dnie tubki.
    6. Odczekaj 1 minutę, aż podłoże zostanie dokładnie nasycone. Ostrożnie zagęść pokarm płaską powierzchnią, aby zoptymalizować warunki życia dla Drosophila. Do przygotowanej formuły dodaj 6 - 8 ziaren drożdży i zatkaj tubkę kiścią bawełny.
  2. Krzyże muszek owocowych i kultura
    1. Weź tubkę z przygotowanym standardowym pokarmem na muchy i usuń zatkaną bawełnę. Ostrożnie przenieś dorosłe muchy (samca i samicę) do rurki i natychmiast zatkaj rurkę bawełną. Sprawdź bawełnę, aby upewnić się, że między bawełną a ścianką rurki nie ma szczeliny, aby zapobiec ucieczce much z tuby.
    2. Muszki owocówki należy przechowywać w inkubatorze w temperaturze 25 °C w celu krzyżowania. Większość genów jest aktywna, a białka komórkowe są syntetyzowane w temperaturze25 °C 36-39.
    3. Wyjmij probówkę z inkubatora po 8 ręcznym przenoszeniu dorosłych much z probówki, aby uzyskać jaja w podobnym wieku do kontroli eksperymentalnej.
    4. Kontynuować hodowlę jaj w inkubatorze w temperaturze 25 °C, która jest standardową temperaturą dla rozwoju Drosophila z okresem rozwoju wynoszącym 8,5 dnia40,41,
      UWAGA: Temperatura wpływa na okres rozwoju (od jaja do dorosłego osobnika) i poziom ekspresji różnych genów.

3. Wykonywanie obrazowania optycznego za pomocą OCM

  1. Zamontuj larwę muchy do obrazowania optycznego
    UWAGA: Jajo Drosophila wykluwa się w ciągu 22 - 24 godzin w temperaturze 25 °C do pierwszej larwy w stadium rozwojowym (L1). Druga larwa w stadium rozwojowym pojawia się po kolejnych 24 godzinach. Największą formą larwalną jest larwa w trzecim stadium rozwojowym, która linieje po około 24 godzinach. Cechy strukturalne larw można wykorzystać do rozróżnienia ich różnych etapów rozwoju. Wielkość aparatów gębowych między pierwszym a drugim instar jest różna. Haczyki gębowe pierwszej larwy w stadium rozwojowym są bardzo małe i wyglądają jak dwie pary maleńkich czarnych plamek, podczas gdy haczyki gębowe larwy drugiej larwy w stadium rozwojowym są większe, a struktura jest wyraźniejsza. Przetchlinki są zwykle używane do identyfikacji drugiego i trzeciego stadium rozwojowego. Larwa drugiego stadium rozwojowego ma maczugowate przednie przetchlinki, podczas gdy w trzecim stadium przetchlinki przednie są rozgałęzione. Ciemnopomarańczowy pierścień zacznie pojawiać się na końcu tylnych przetchlinków u larwy trzeciego stadium rozwojowego.
    1. Nałóż kawałek taśmy dwustronnej na czyste szkiełko mikroskopowe. Usuń pęcherzyki powietrza znajdujące się pod taśmą, aby uniknąć odbić spowodowanych przez pęcherzyki powietrza podczas obrazowania.
    2. Wyjmij jedną z probówek z hodowanymi muchami z inkubatora w stadium larwalnym.
    3. Zidentyfikuj larwę w pożywce, usuń ją z podłoża miękką szczoteczką i umieść na czystej chusteczce. Usuń wszelkie pokarmy przyklejone do larwy wilgotną miękką szczoteczką i osusz je na chusteczce.
    4. Przenieś oczyszczoną muchę na tkankę pod soczewką obiektywu mikroskopu szerokokątnego.
    5. Dostosuj ostrość mikroskopu, aby uzyskać wyraźny widok muchy. Zidentyfikuj właściwy etap rozwojowy larwy na podstawie jej cech strukturalnych za pomocą mikroskopu.
    6. Ustaw rozporek za pomocą miękkiej szczotki. Upewnij się, że korpus jest prosty ze stroną grzbietową skierowaną do góry, aby przygotować się do montażu na szklanym szkiełku po stronie grzbietowej. Wykonaj ten krok pod mikroskopem.
    7. Upewnij się, że larwa jest całkowicie sucha przed zamontowaniem na taśmie. W przeciwnym razie larwa nie przylgnie do taśmy.
    8. Przyklej grzbietową stronę umieszczonego muchy do dwustronnej taśmy na szkiełku z umiarkowanym naciskiem. Należy pamiętać, że zbyt duży nacisk może zabić muchę, a zbyt mała siła doprowadzi do ruchu muchy podczas obrazowania.
  2. Obrazowanie optyczne Drosophila w stadiach larwalnych (L2 i L3) za pomocą OCM
    UWAGA: Szerokie światło rurki serca można znaleźć w segmentach od A5 do A8 w stadiach larwalnych (ryc. 1). Poprzeczne obrazy OCM w trybie M (2D + czas) zostały pozyskane w segmencie A7 rurki serca dla każdej larwy, aby ułatwić analizę skurczową i rozkurczową.
    1. Umieść zamontowaną larwę na regulowanym stoliku na próbkę systemu OCM wzdłuż kierunku poprzecznego y, ze stroną grzbietową skierowaną do góry poniżej soczewki obiektywu. Mały otwór w stoliku na próbkę jest niezbędny do umieszczenia larwy, aby uniknąć jej kontaktu z płaszczyzną stopnia.
    2. Dostosuj stolik próbki, aby przesunąć rurkę serca muszki owocowej do płaszczyzny ogniskowej wiązki obrazowania. Aby łatwo znaleźć segment A7, znajdź tylny obszar rurki serca z obrazami OCM przekroju poprzecznego w czasie rzeczywistym w oprogramowaniu do akwizycji obrazów. Następnie przesuń stół montażowy do przodu, aż segment A7 będzie widoczny.
    3. Ustaw parametry oprogramowania do akwizycji obrazu na 100 A-skanów na B-skan (klatka), 100 B-skanów i napięcie skanera tak, aby obejmowało ~ 0,28 mm w kierunku poprzecznym x i 0 V w kierunku poprzecznym y. Kliknij przycisk "start" w oprogramowaniu, aby uzyskać dane o szumie tła do odjęcia tła poprzez zablokowanie ścieżki wiązki próbki ciemną szmatką.
      UWAGA: 3 ze 100 klatek można użyć do odejmowania tła.
    4. Ustaw parametry oprogramowania do akwizycji danych na 128 A-skanów na B-skan, 4096 B-skanów, a napięcie skanera tak, aby obejmowało ~ 0,28 mm w kierunku poprzecznym x i 0 V w kierunku poprzecznym y. Kliknij przycisk "start" w oprogramowaniu, aby uzyskać poprzeczne obrazy w trybie M w segmencie A7 rurki serca muchy w obszarze obejmującym 0,28 x 0,57 mm2 przez około 30 sekund.
    5. Zablokuj wiązkę obrazowania za pomocą ciemnej szmatki podczas procesu zapisywania danych, aby uniknąć długotrwałej ekspozycji serca muchy na światło obrazowania.
    6. Powtórz pomiar 5 razy, aby uzyskać wiarygodny pomiar czynności serca.
    7. Ustaw parametry oprogramowania do akwizycji obrazu na 400 skanów A na skan B, 800 skanów B, a napięcie skanera tak, aby obejmowało ~ 1,7 mm w kierunku poprzecznym x i ~ 4 mm w kierunku poprzecznym y. Przesuń stolik w obu kierunkach, aby upewnić się, że można sfotografować całą muszkę owocową. Kliknij przycisk "start" w oprogramowaniu, aby uzyskać jeden zestaw danych w celu uzyskania obrazów muszki owocowej w 3 wymiarach. Uwaga: Strukturę muchy 3D można renderować za pomocą oprogramowania Amira 3D
    8. Za pomocą mokrej miękkiej szczotki zwilż odmierzoną muchę i delikatnie wyjmij ją ze szkiełka. Przenieś go do osobnej tuby, aby zapewnić ciągły rozwój. Oznacz probówkę do badania podłużnego przez kolejne etapy rozwoju.
  3. Obraz Drosophila w stadium poczwarki
    UWAGA: Wszystkie muszki owocowe zostały pobrane w celu obrazowania od PD1 do PD5. Jak pokazano na schemacie larwy na rysunku 1b, szerokie światło pozostaje w segmentach A5 do A8 rurki serca aż do PD1. Od PD2 zaczyna rozwijać się stożkowa komora między segmentami A1 do A4. Aby uzyskać spójne obrazy i ułatwić analizę serca, uzyskano poprzeczne obrazy w trybie M z segmentu A7 w PD1 i z segmentu A1 po PD2, jak zaznaczono na rycinie 1b.
    1. Zdjęcie Drosophila w PD1
      UWAGA: Drosophila będzie miała białe poczwarkę przez krótki czas (0 - 1 godzina) podczas PD1. To okno czasowe jest idealne do wykonywania obrazowania optycznego wczesnych poczwarek, ponieważ wysoka przezroczystość prowadzi do większej penetracji światła dla obrazowania OCM.
      1. Ponieważ muszki owocowe znajdują się na ściance rurki, gdy stają się poczwarkami, usuń poczwarkę z poszczególnych probówek do obrazowania w PD1 za pomocą mokrej miękkiej szczoteczki i wyczyść poczwarkę szczoteczką, jeśli do ciała przykleił się pokarm.
      2. Zamontuj muszkę owocową na małym szklanym szkiełku bezpośrednio za pomocą mokrej szczotki i trzymaj stronę grzbietową skierowaną do góry (ryc. 1a). Upewnij się, że szklane szkiełko jest wystarczająco małe, aby zmieścić się z powrotem w tubie po zakończeniu obrazowania na tym etapie.
      3. Usuń nadmiar wody z boku korpusu muchy.
      4. Umieść szklane szkiełko na stoliku na próbki systemu OCM, trzymając muszkę owocową na wierzchu. Znajdź wyraźny obraz w czasie rzeczywistym segmentu A7 serca muchy, wykorzystując tę samą strategię, która została opisana w pomiarze larwy.
      5. Ustaw te same parametry oprogramowania do akwizycji danych, co w sekcji 3.2 i zobrazuj bicie serca w segmencie A7, aby uzyskać poprzeczny tryb M i obrazy 3D.
      6. Po zobrazowaniu użyj pęsety, aby umieścić szklane szkiełko z poczwarką z powrotem w probówce w celu kontynuowania hodowli.
    2. Obraz Drosophila na etapach PD2 do PD5
      UWAGA: Ponieważ próbka staje się coraz bardziej nieprzezroczysta w stadiach poczwarki, głębokość penetracji systemu obrazowania zostanie zmniejszona.
      1. Użyj pęsety, aby ostrożnie wyjąć szklany szkiełko zamontowane z rozporkiem na PD2 z rurki w celu obrazowania. W PD2 otoczka próbki staje się żółtawa, a ciało staje się mniej przezroczyste w porównaniu z PD1 (ryc. 1).
      2. Umieść szkiełko na stoliku na próbki systemu OCM.
      3. Dostosuj stolik próbki, aby przesunąć muchę w płaszczyznę ogniskową wiązki obrazowania systemu OCM. Znajdź przedni koniec rurki serca za pomocą przekroju poprzecznego OCM w czasie rzeczywistym. Przesuń ~ 50 μm z powrotem w kierunku tylnym, aby znaleźć segment A1 rurki serca.
        UWAGA: W tym momencie rozwoju serca (PD2) stożkowa komora będzie bardzo mała i może nie bić.
      4. Zbieraj zestawy danych poprzecznych trybów M z segmentu A1, a także dane 3D przy użyciu tej samej metody, co poprzednie etapy rozwoju.
      5. Ostrożnie włóż szkiełko z powrotem do probówki, aby zapewnić ciągłą hodowlę.
        UWAGA: W PD3 kolor próbki w skorupie jest ciemniejszy niż na etapie PD2. Na etapie PD4 można zaobserwować czarne paski wewnątrz skorupy próbek. Niektóre muchy rozwiną się w dorosłe osobniki z tego etapu następnego dnia, podczas gdy inne ewoluują w PD5. W stadium PD5 czarne paski są jeszcze bardziej widoczne u muszek owocowych. Muchy te staną się dorosłe następnego dnia.
  4. Obraz Drosophila w stadium dorosłym
    UWAGA: W stadium dorosłym muchy samice i samce można odróżnić po wielkości ciała i kolorze dolnej części brzucha. Dorosłe samice mają większy rozmiar, podczas gdy samce są mniejsze i ciemno ubarwione w dolnej części brzucha.
    1. Wyjąć probówkę z inkubatora, gdy muszka owocowa rozwinie się w dorosłego osobnika, i przenieść dorosłą muchę do pustej fiolki o pojemności ~ 45 ml.
    2. Zanurz chłonną końcówkę (~ 1 cm długości, ~ 3 mm średnicy) różdżki w znieczuleniu, włóż różdżkę do fiolki i zatkaj rurkę wiązką bawełny, aby utrzymać końcówkę znieczulającą tuż pod zatkaną bawełną i znieczulić muchę na 3 minuty. Czas trwania znieczulenia zależy od wielkości muchy i może wynosić od 2,5 do 3,5 minuty (na przykład: samiec przez 2,5 minuty, samica przez 3 lub 3,5 minuty).
    3. Przygotuj szkiełko szkiełkowe z kawałkiem taśmy dwustronnej.
    4. Przesuń znieczuloną muchę na szklane szkiełko stroną grzbietową skierowaną do góry za pomocą miękkiej szczoteczki.
    5. Oddziel skrzydła za pomocą pęsety i przyklej skrzydła do taśmy pod mikroskopem, aby unieruchomić muchę i odsłonić obszar serca do obrazowania.
    6. Wyobraź sobie muchę z segmentu A1 serca muchy (ryc. 1). Pod koniec eksperymentu mucha może zostać złożona w ofierze.

4. Analiza obrazowa16

  1. Twórz programy Matlab do konwersji plików binarnych 2D i 3D zebranych za pomocą oprogramowania do akwizycji obrazów na pliki obrazów.
  2. Użyj ImageJ, aby zidentyfikować obszar rurki serca na poprzecznych obrazach w trybie M i algorytmu magicznej różdżki, aby utworzyć maskę obszaru serca dla każdego poprzecznego obrazu w trybie M. Podziel zamaskowany obszar na segmenty i użyj algorytmu znajdowania pików, aby zidentyfikować lokalizacje skurczowe i rozkurczowe. Oblicz zależne od czasu zmiany średnicy serca na podstawie poprzecznych obrazów w trybie M.
  3. Na podstawie uzyskanych średnic serca zależnych od czasu oblicz parametry serca, takie jak tętno, okres aktywności serca (CAP), końcowa średnica skurczu (EDD), końcowa średnica skurczu (ESD), końcowa powierzchnia skurczu (EDA) i końcowa powierzchnia skurczu (ESA). Oblicz ułamkowe skrócenie (FS) za pomocą figure-protocol-1
  4. Użyj ImageJ do analizy obrazów 3D OCM w celu wizualizacji rozwoju strukturalnego serca muchy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podłużne obrazowanie serca zostało przeprowadzone przy użyciu muszek owocowych ze szczepem 24B-GAL4/+ w temperaturze pokojowej z OCM. Pomiary wykonano w L2, L3 oraz w odstępach 8-godzinnych od PD1 do PD4 oraz w 1. dniu dorosłej (AD1) w celu śledzenia procesu metamorfozy (Tabela 1). Larwy, wczesne poczwarki, późne poczwarki i dorosłe muchy umieszczono na szkiełkach podstawowych, jak pokazano na rysunku 1A. Cechy segmentów serca u larw i dorosłych much przedstawiono na schematycznych przed...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szybkie bicie serca Drosophila, z maksymalnym HR około 400 uderzeń na minutę w stadiach larwalnych i dorosłych, wymaga dużej szybkości obrazowania w celu rozwiązania rozkurczów i skurczów serca (nie mniej niż 80 klatek na sekundę w oparciu o doświadczenia). Ze względu na mały rozmiar komory serca i grubość ścianki serca w skali mikronowej (5 - 10 μm), do rozdzielczości struktur rurki serca wymagana jest wysoka rozdzielczość przestrzenna (lepsza niż 2 μm). W tym badaniu opracowano system OCM o wysokiej rozdzielcz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów w związku z niniejszym badaniem.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Lehigh University Start-Up Fund, NIH (R00EB010071 do C.Z., R15EB019704 do C.Z. i A.L., R03AR063271 do A.L., oraz R01AG014713 i R01MH060009 do R.E.T.), NSF (1455613 do C.Z. i A.L.), Cure Alzheimer's Fund (do R.E.T.) oraz Massachusetts General Hospital (Nagroda Komitetu Wykonawczego ds. Badań dla A.L.). M.C. i Y.M. były wspierane przez National Key Basic Research Program Chin (Program 973) w ramach grantu nr 2014CB340404.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Niestandardowy system obrazowania OCMOpracowany w naszym laboratorium
mój Temp Mini Cyfrowy inkubatorBenchmarkH2200-HC
Szkło osłonoweAmScope200 sztuk Bawełniana kulka
RITE AID
Instant Drosophila FormułaCAROLINAFormuła 4-24
DrożdżeActiveDry
MikroskopSONYWILD M420
SzczotkaLoew-Cornell245Bsłuży do przenoszenia próbek
Oprogramowanie Labview
ImageJNational Institutes of Health
MatlabMathworks
PęsetaWihaAA SAdo mocowania owoców skrzydła latające
FlyNapCarolina Biological Supply Company4,224,898
dwustronna szkocka, 3-metrowaszkocka
FisherbrandMU18837
Organiczny ekstra olej kokosowySpring Valley13183
Szkiełko mikroskopoweCapitolBrandM3504-E
Drosophila FiolkiSEOH8401SS
All-trans-retinalSigma-Aldrich Co.Czynnik R2500
National Instruments Stała taśma pipeta

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Liberatore, C. M., Searcy-Schrick, R. D., Yutzey, K. E. Ventricular expression of tbx5 inhibits normal heart chamber development. Dev. Biol. 223 (1), 169-180 (2000).
  2. Christoffels, V. M., et al. Chamber formation and morphogenesis in the developing mammalian heart. Dev. Biol. 223 (2), 266-278 (2000).
  3. Wessels, A., Sedmera, D. Developmental anatomy of the heart: a tale of mice and man. Physiol. Genomics. 15 (3), 165-176 (2003).
  4. Savolainen, S. M., Foley, J. F., Elmore, S. A. Histology atlas of the developing mouse heart with emphasis on E11.5 to E18.5. Toxicol. Pathol. 37 (4), 395-414 (2009).
  5. Yang, V. X. D., et al. High speed, wide velocity dynamic range Doppler optical coherence tomography (Part II): Imaging in vivo cardiac dynamics of Xenopus laevis. Opt. Express. 11 (14), 1650-1658 (2003).
  6. Yelin, R., et al. Multimodality optical imaging of embryonic heart microstructure. J. Biomed. Opt. 12 (6), 064021(2007).
  7. Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovasc. Res. 91 (2), 279-288 (2011).
  8. Staudt, D., Stainier, D. Uncovering the molecular and cellular mechanisms of heart development using the zebrafish. Annu. Rev. Genet. 46, 397-418 (2012).
  9. Drake, V. J., Koprowski, S. L., Lough, J. W., Smith, S. M. Gastrulating chick embryo as a model for evaluating teratogenicity: a comparison of three approaches. Birth Defects Res. A. 76 (1), 66-71 (2006).
  10. Birse, R. T., et al. High-fat-diet-induced obesity and heart dysfunction are regulated by the TOR pathway in Drosophila. Cell Metab. 12 (5), 533-544 (2010).
  11. Bodmer, R. Heart development in Drosophila and its relationship to vertebrates. Trends in Cardiovas. Med. 5 (1), 21-28 (1995).
  12. Harvey, R. P. Nk-2homeobox genes and heart development. Dev. Biol. 178 (2), 203-216 (1996).
  13. Bodmer, R., Venkatesh, T. V. Heart development in Drosophila and vertebrates: conservation of molecular mechanisms. Dev Genet. 22 (3), 181-186 (1998).
  14. Cripps, R. M., Olson, E. N. Control of cardiac development by an evolutionarily conserved transcriptional network. Dev. Biol. 246 (1), 14-28 (2002).
  15. Men, J., et al. Optical coherence tomography for brain imaging and developmental biology. J. Sel. Top. Quantum Electron. 22 (4), 6803213(2016).
  16. Alex, A., et al. A circadian clock gene, Cry, affects heart morphogenesis and function in Drosophila as revealed by optical coherence microscopy. PloS one. 10 (9), e0137236(2015).
  17. Vogler, G., Ocorr, K. Visualizing the beating heart in Drosophila. J Vis Exp. (31), e1425(2009).
  18. Cooper, A. S., Rymond, K. E., Ward, M. A., Bocook, E. L., Cooper, R. L. Monitoring heart function in larval Drosophila melanogaster for physiological studies. J Vis Exp. (33), e1425(2009).
  19. Yalcin, H. C., et al. Two-photon microscopy-guided femtosecond-laser photoablation of avian cardiogenesis: noninvasive creation of localized heart defects. Am. J. Physiol. Heart C. 299 (5), H1728-H1735 (2010).
  20. Dolber, P. C., Spach, M. S. Conventional and confocal fluorescence microscopy of collagen fibers in the heart. J. Histochem. Cytochem. 41 (3), 465-469 (1993).
  21. Mao, H., Gribble, M., Pertsov, A. M., Wang, L., Shi, P. Understanding embryonic heart morphogenesis through automatic segmentation and confocal imaging with optical clearing. ISBI. , 1303-1306 (2014).
  22. Bouchard, M. B., et al. Swept confocally-aligned planar excitation (SCAPE) microscopy for high-speed volumetric imaging of behaving organisms. Nat. Photonics. 9 (2), 113-119 (2015).
  23. Boppart, S. A., et al. Noninvasive assessment of the developing Xenopus cardiovascular system using optical coherence tomography. Proc. Natl. Acad. Sci. 94 (9), 4256-4261 (1997).
  24. Kagemann, L., et al. Repeated, noninvasive, high resolution spectral domain optical coherence tomography imaging of zebrafish embryos. Molecular Vision. 14, 2157-2170 (2008).
  25. Jenkins, M. W., et al. Ultrahigh-speed optical coherence tomography imaging and visualization of the embryonic avian heart using a buffered Fourier Domain Mode Locked laser. Opt. Express. 15 (10), 6251-6267 (2007).
  26. Larin, K. V., Larina, I. V., Liebling, M., Dickinson, M. E. Live imaging of early developmental processes in mammalian embryos with optical coherence tomography. J. Innov. Opt. Health Sci. 2 (03), 253-259 (2009).
  27. Liao, F. -T., Chang, C. -Y., Su, M. -T., Kuo, W. -C. Necessity of angiotensin-converting enzyme-related gene for cardiac functions and longevity of Drosophila melanogaster assessed by optical coherence tomography. J. Biomed. Opt. 19 (1), 011014(2014).
  28. Wolf, M. J., et al. Drosophila as a model for the identification of genes causing adult human heart disease. Proc. Natl. Acad. Sci. 103 (5), 1394-1399 (2006).
  29. Choma, M. A., Izatt, S. D., Wessells, R. J., Bodmer, R., Izatt, J. A. In vivo imaging of the adult Drosophila melanogaster heart with real-time optical coherence tomography. Circulation. 114 (2), e35-e36 (2006).
  30. Li, A., et al. Changes in the expression of the Alzheimer's disease-associated presenilin gene in drosophila heart leads to cardiac dysfunction. Curr. Alzheimer Res. 8 (3), 313(2011).
  31. Choma, M. A., Suter, M. J., Vakoc, B. J., Bouma, B., Tearney, G. J. Heart wall velocimetry and exogenous contrast-based cardiac flow imaging in Drosophila melanogaster using Doppler optical coherence tomography. J. Biomed. Opt. 15 (5), 056020(2010).
  32. Choma, M. A., Suter, M. J., Vakoc, B. J., Bouma, B. E., Tearney, G. J. Physiological homology between Drosophila melanogaster and vertebrate cardiovascular systems. Dis. Model. Mech. 4 (3), 411-420 (2011).
  33. Tsai, M. T., et al. Noninvasive imaging of heart chamber in Drosophila with dual-beam optical coherence tomography. J. Biophotonics. 6 (9), 708-717 (2013).
  34. Li, A., et al. Silencing of the Drosophila ortholog of SOX5 in heart leads to cardiac dysfunction as detected by optical coherence tomography. Hum. Mol. Genet. 22 (18), 3798-3806 (2013).
  35. Alex, A., Li, A., Tanzi, R. E., Zhou, C. Optogenetic pacing in Drosophila melanogaster. Sci. Adv. 1 (9), e1500639(2015).
  36. Mirault, M. E., Goldschmidt-Clermont, M., Moran, L., Arrigo, A. P., Tissieres, A. The effect of heat shock on gene expression in Drosophila melanogaster. IEEE T. Med. Imaging. 42, 819-827 (1978).
  37. Boothroyd, C. E., Wijnen, H., Naef, F., Saez, L., Young, M. W. Integration of Light and Temperature in the Regulation of Circadian Gene Expression in Drosophila. PLoS Genet. 3 (4), (2007).
  38. McGuire, S. E., Roman, G., Davis, R. L. Gene expression systems in Drosophila: a synthesis of time and space. Trends Genet. 20 (8), 384-391 (2004).
  39. Ashburner, M., Bonner, J. J. The induction of gene activity in drosophila by heat shock. Cell. 17 (2), 241-254 (1979).
  40. Ashburner, M., Thompson, J. N. Jr Laboratory culture of Drosophila. 2a, Academic Press. London. 1-109 (1978).
  41. Ashburner, M. Drosophila: a laboratory handbook. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1978).
  42. Molina, M. R., Ostia Cripps, R. M. the inflow tracts of the Drosophila heart, develop from a genetically distinct subset of cardial cells. Mech. Dev. 109 (1), 51-59 (2001).
  43. Monier, B., Astier, M., Sémériva, M., Perrin, L. Steroid-dependent modification of Hox function drives myocyte reprogramming in the Drosophila heart. Development. 132 (23), 5283-5293 (2005).
  44. Liu, L., et al. Imaging the subcellular structure of human coronary atherosclerosis using micro-optical coherence tomography. Nat. Med. 17 (8), 1010-1014 (2011).
  45. Ahsen, O. O., et al. Swept source optical coherence microscopy using a 1310 nm VCSEL light source. Opt. Express. 21 (15), 18021-18033 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Serce Drosophilaobrazowanie funkcji sercapoprzeczny tryb Mobrazowanie 3D OCMilo ciowe okre lanie cz sto ci akcji sercaokres aktywno ci sercaprzeobra enie Drosophilaobrazowanie nieinwazyjnebadanie pod u ne

Powiązane artykuły