Badanie inwazyjnej zdolności naczyniowej komórek nowotworowych u danio pręgowanego (Danio rerio)

Podsumowanie

Ta metoda wykorzystuje embriony danio pręgowanego do skutecznego testowania inwazyjnej zdolności komórek rakowych do naczyń krwionośnych. Fluorescencyjne komórki rakowe są wstrzykiwane do zatoki przedsercowej lub woreczka żółtkowego rozwijających się zarodków. Inwazję naczyniową i wynaczynienie komórek rakowych ocenia się za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej obszaru ogonowego od 24 do 96 godzin później.

Streszczenie

Inwazja naczyń krwionośnych komórek rakowych jest cechą charakterystyczną progresji przerzutów. Tradycyjne modele in vitro inwazji komórek rakowych na śródbłonek zazwyczaj nie mają dynamiki płynów, na którą atakujące komórki są narażone in vivo. Jednak systemy in vivo, takie jak modele mysie, choć bardziej istotne z fizjologicznego punktu widzenia, wymagają dłuższych ram czasowych eksperymentów i stanowią wyjątkowe wyzwania związane z monitorowaniem i analizą danych. W tym miejscu opisujemy test danio pręgowanego, który ma na celu wypełnienie tej luki technicznej, umożliwiając szybką ocenę inwazji naczyniowej i wynaczynienia komórek rakowych. Metoda polega na wstrzyknięciu fluorescencyjnych komórek nowotworowych do zatoki przedsercowej przezroczystych 2-dniowych zarodków danio pręgowanego, których unaczynienie jest zaznaczone kontrastowym fluorescencyjnym reporterem. Po wstrzyknięciu komórki rakowe muszą przetrwać w krążeniu, a następnie wynaczynić z naczyń do tkanek w okolicy ogonowej zarodka. Wynaczynione komórki nowotworowe są skutecznie identyfikowane i oceniane w żywych zarodkach za pomocą obrazowania fluorescencyjnego w ustalonym punkcie czasowym. Technikę tę można zmodyfikować w celu zbadania wynaczynienia i/lub konkurencji między heterogeniczną mieszaniną komórek nowotworowych poprzez zmianę miejsca wstrzyknięcia na woreczek żółtkowy. Razem metody te mogą ocenić charakterystyczne zachowanie komórek nowotworowych i pomóc w odkryciu mechanizmów wskazujących na złośliwą progresję do fenotypu przerzutowego.

Wprowadzenie

Choroba przerzutowa jest główną przyczyną śmiertelności z powodu raka, a wiele mechanizmów umożliwiających rozprzestrzenianie się komórek rakowych pozostaje do odkrycia¹. Aby komórka rakowa mogła pomyślnie dać przerzuty, musi najpierw zaatakować przez zrąb otaczający guz pierwotny, wejść (wewnątrznaczyniowy) do układu krążenia, przetrwać w transporcie, wyjść (wynaczynić) z krążenia, a na koniec ustanowić żywotną kolonię w odległym miejscu narządu². Wewnątrznaczyniowość i wynaczynienie są zatem kluczowymi etapami kaskady przerzutowej, ale nie każda komórka rakowa jest z natury biegła w zakłócaniu i migracji przez połączenia śródbłonka³.....

Protokół

Oświadczenie etyczne: Zarodki danio pręgowanego zostały wygenerowane zgodnie z zatwierdzonym protokołem IACUC. Eksperymenty te zostały przeprowadzone zgodnie z zaleceniami Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Georgetown.

1. Organizuj zarodki do wstrzykiwań i twórz roztwory podstawowe

1. Wygeneruj wymagane larwy danio pręgowanego, aby ocenić inwazję naczyniową komórek rakowych.
   1. Ustaw parowanie krzyżowe lub grupowe za pomocą Tg(kdrl:grcfp)zn1; Mitfa^B692; EDNRB1^B140 Ryba.
      UWAGA: Wygenerowaliśmy Tg(kdrl:grcfp)zn1; Mitfa^B692

Wyniki

W niniejszej pracy przetestowano zdolność do naciekania naczyń powszechnie stosowanych linii komórkowych raka piersi w modelu embrionu rybki danio (Rycina 1). Do oceny ekstrawasacji dla tych różnych linii komórkowych zastosowano rygorystyczne kryteria, zgodnie z którymi zdarzenia dodatnie zaliczano tylko wtedy, gdy komórki nowotworowe wyraźnie uległy ekstrawasacji; miało to na celu przede wszystkim ograniczenie wyników fałszywie dodatnich, które mogłyby wynikać z oceny de.......

Dyskusja

Technika ta wykorzystuje model danio pręgowanego do skutecznego testowania inwazyjnej zdolności naczyniowej komórek nowotworowych (patrz ryc. 1). W tym przypadku zastosowaliśmy tę technikę do panelu linii komórkowych raka piersi, aby zapewnić punkt odniesienia, na którym inni badacze mogą następnie zbudować własne badania (patrz Tabela 1; Rysunki 2 - 3). Obserwacja, że komórki MDA-MB-231 łatwo atakują obszar ogonowy zarodków danio pręgowanego, czyni tę linię komórkową id.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0,05% Trypsin-EDTA	Life Technologies	25300-054
100 mm Naczynia	Corning Incorporated	3160-100
5 3/4 "Jednorazowe pipety pasturskie, szkło borokrzemianowe	marki Fisher	13-678-20B
60 mm Naczynie	Corning Incorporated	3160-60
Agaroza, niskotopliwe	Fisher	BP165-25
Agaroza, klasa molekularna	Bioline	BIO-41026
Szkło kapilarne, standardowe, 1.2 mm x 0.68 mm, 4"	A-M Systems, Inc	627000
David Kopf 700C Pionowy ściągacz do pipet	Hofstra Group	3600
DMEM	Life Technologies	11995-065
Słoik do przechowywania elektrod, 1,0 mm	World Precision Instruments, Inc	E210
Sól metanosulfonianu 3-aminobenzoesanu etylu (Trikaina, MS-222)	Fluka	A5040
Szczoteczka do rzęs	Ted Pella, Inc	113
Surowica bydlęca, inaktywowana termicznie	Pipety transferowe Omega Scientific	FB-12
Fisherbrand	ThermoFisher Scientific	13-711-7M
Końcówki	do pipet do ładowania żeluFisher Brand	02-707-181
Naczynia ze szklanym dnem (12,0 mm)	ThermoFisher Scientific	150680
Szklana prowadnica depresyjna	VWR	470005-634
Sól oceaniczna instant, sól morska	Żarówki	IS50
, 2 ml, zestaw 72 sztuk	Heathrow Scientific	HS20622B
SP8	Leica
Mikromanipulator	Narishige
Eclipse E600	Nikon
PBS	Life Technologies	10010-023
Penicylina-G Potas	Fisher Biotech	BP914-100
Płytki Petriego, 100 mm x 15 mm Marka	Fisher
Picospritzer II	General Valve Corporation
RPMI 1640 Średni	Life Technologies	11875-093
Siarczan streptomycyny	Fisher Biotech	BP910-50
Vybrant DiI	ThermoFisher Scientific	V22885
Vybrant DiO	ThermoFisher Scientific	V22886
Danio pręgowany	Georgetown Zebrafish Shared Resources
Linie komórkowe utrzymywano w DMEM + 10% FBS, z oczekiwaniem komórek BT-474 i HCC18-6, które były utrzymywane w RPMI + 10% FBS.

z gumy lateksowej Pentair Mikroskop konfokalny FB0875713