Artykuł metodologiczny

Skuteczna metoda izolacji wysoce oczyszczonego RNA z nasion do zastosowania w ilościowej analizie transkryptomu

DOI:

10.3791/55008

⸱

11 stycznia 2017

 ,  , 
1Laboratory of Biological Diversity, Department of Evolutionary Biology and Biodiversity, National Institute for Basic Biology, 2Department of Basic Biology, SOKENDAI (The Graduate University for Advanced Studies), 3Department of Cell Biology, National Institute for Basic Biology

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Udało nam się ustalić metodę izolacji RNA z nasion roślin zawierających duże ilości olejów, białek i polifenoli, które mają działanie hamujące izolację RNA o wysokiej czystości. Nasza metoda jest odpowiednia do monitorowania ekspresji genów z transkryptami niskiego poziomu w nasionach.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nasiona roślin gromadzą duże ilości rezerw magazynowych zawierających biodegradowalną materię organiczną. Ludzie polegają na zapasach nasion do przechowywania żywności i materiałów przemysłowych. Profile ekspresji genów są potężnymi narzędziami do badania regulacji metabolicznej w komórkach roślinnych. Dlatego do hodowli roślin wymagane są szczegółowe, dokładne profile ekspresji genów podczas rozwoju nasion. Pozyskiwanie wysoce oczyszczonego RNA jest niezbędne do produkcji tych profili. Potrzebne są skuteczne metody izolowania wysoce oczyszczonego RNA z nasion. W tym miejscu opisujemy metodę izolowania RNA z nasion zawierających duże ilości olejów, białek i polifenoli, które mają działanie hamujące izolację RNA o wysokiej czystości. Nasza metoda umożliwia uzyskanie wysoko oczyszczonego RNA z nasion bez użycia fenolu, chloroformu lub dodatkowych procesów oczyszczania RNA. Ta metoda ma zastosowanie do Arabidopsis, nasion rzepaku i soi. Nasza metoda będzie przydatna do monitorowania wzorców ekspresji transkryptów niskiego poziomu w rozwijających się i dojrzałych nasionach.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rośliny wytwarzają nasiona, które dają początek następnemu pokoleniu. Nasiona gromadzą duże ilości rezerw magazynowych, takich jak oleje, węglowodany i białka, do wzrostu po kiełkowaniu. Ludzie wykorzystują rezerwy do przechowywania nasion jako źródła pożywienia i paszy dla zwierząt, a zatem nasiona roślin są jednym z głównych dostawców jadalnej materii organicznej na całym świecie. Zwiększenie plonów nasion jest ważnym wyzwaniem w nauce o roślinach.

Ponieważ rezerwy do przechowywania nasion są komercyjnie cennym źródłem żywności i materiałów przemysłowych, mechanizmy molekularne leżące u podstaw regulacji metabolizmu tych rezerw zostały szeroko zbadane1-6. Dalsze wyjaśnienie tych mechanizmów będzie przydatne w zwiększaniu plonów nasion w uprawach. Nasiona rozwijają się w jajnikach roślin po zapłodnieniu i dojrzewają przez szereg etapów rozwojowych1,6,7. Dalsze zrozumienie mechanizmu molekularnego leżącego u podstaw rozwoju nasion wymaga szczegółowych, precyzyjnych profili ekspresji genów z serii rozwijających się nasion, które mają zostać wyprodukowane. Jednak duże ilości olejów, białek, węglowodanów i polifenoli w nasionach roślin utrudniają wyizolowanie wysoko oczyszczonego RNA, co uniemożliwia precyzyjne profilowanie ekspresji genów.

Tutaj wprowadzamy skuteczną metodę izolacji RNA z nasion oleistych zawierających duże ilości olejów, białek i polifenoli. Za pomocą tej metody naukowcy będą w stanie przygotować wysoce oczyszczone RNA. Takie RNA będzie przydatne do monitorowania zmian transkrypcyjnych w kluczowych genach kontrolujących metaboliczną regulację rezerw magazynowych nasion w rozwijających się i dojrzałych nasionach oleistych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Ekstrakcja całkowitego RNA z nasion roślin

  1. Przygotuj zestawy buforowe, kolumny wirujące, probówki polipropylenowe o pojemności 1,5 i 2,0 ml oraz probówki polipropylenowe o pojemności 1,5 ml bez nukleaz.
  2. Dodać 1% (w/v) poliwinylopirolidon klasy biologii molekularnej (zwany dalej PVP) do buforu do lizy komórek w celu ekstrakcji RNA i energicznie wirować. Inkubować przez 20 minut w temperaturze 25 °C do całkowitego rozpuszczenia. Po 20 minutach inkubacji delikatnie wymieszaj bufor, obracając probówkę do góry nogami, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków. Przed użyciem przechowywać w temperaturze pokojowej (15-25 °C).
  3. Zbierz owoce z roślin Arabidopsis thaliana i umieść je w probówkach polipropylenowych o pojemności 1,5 ml na lodzie. Umieść owoce na aluminiowych płytkach utrzymywanych w temperaturze 4 °C i odizoluj nasiona od owoców pod mikroskopem stereoskopowym.
    1. Umieść izolowane nasiona (około 200 nasion) w probówkach polipropylenowych o pojemności 1,5 ml, które były przechowywane w aluminiowym stojaku na lodzie i natychmiast umieść probówki w ciekłym azocie.
  4. Wyjmij rurki z ciekłego azotu i umieść je z powrotem na aluminiowym stojaku na lodzie. Dodać 100 μl buforu zawierającego 1% PVP i odwirowywać przez 1 minutę w temperaturze 1 000 x g w temperaturze 4 °C.
  5. Homogenizować próbkę za pomocą tłuczka ze stali nierdzewnej za pomocą młynka silnikowego przez 60 s, trzymając probówkę w aluminiowym stojaku na lodzie.
  6. Dodać 550 μl buforu zawierającego 1% PVP, delikatnie wymieszać bufor, obracając probówkę do góry dnem i inkubować przez 10 minut w temperaturze 25 °C.
  7. Wirować przez 5 minut przy 8 000 x g w temperaturze 25 °C i przenieść 550 μl supernatantu do nowej probówki polipropylenowej o pojemności 1,5 ml.
  8. Wirować przez 5 minut przy 10 000 x g w temperaturze 25 °C i przenieść 450 μl supernatantu do nowej probówki polipropylenowej o pojemności 1,5 ml.
  9. Użyć supernatantu jako lizatu komórkowego do ekstrakcji RNA. Następnie postępuj zgodnie z procedurą opisaną w instrukcjach producenta w dostępnym na rynku zestawie.
  10. Eluować RNA przy użyciu minimalnej objętości buforu elucyjnego, aby zapewnić wystarczająco wysokie stężenie RNA do monitorowania wzorców ekspresji transkryptów niskiego poziomu. Przechowuj RNA w głębokiej zamrażarce do czasu użycia.

2. Weryfikacja jakości RNA

  1. Rozmrozić całe RNA, wymieszać przez delikatne stukanie i umieścić probówkę w aluminiowym stojaku na lodzie.
  2. Zmierz stężenie RNA, stosunek A260/A280 i stosunek A260/A230 za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego.
  3. Rozcieńczyć całkowite RNA w wodzie wolnej od RNaz do końcowego stężenia 70 ng/μl.

3. Odwrotna transkrypcja całkowitego RNA z nasion

  1. Rozmrozić całkowite zestawy RNA i z zestawu komercyjnego. Trzymaj enzymy z zestawu na lodzie po delikatnym stuknięciu. Przygotuj probówki polipropylenowe o pojemności 0,2 ml bez nukleazy.
  2. Dodać 5 μl całkowitego RNA, 1 μl startera Oligo dT (50 μM) i 1 μM losowego 6-mera (50 μM) do probówki polipropylenowej o pojemności 0,2 ml na lodzie.
  3. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C i umieścić na lodzie.
  4. Następnie postępuj zgodnie z procedurą opisaną w instrukcjach producenta w zestawie do odwrotnej transkrypcji-PCR.
  5. Przed użyciem umieść produkty odwrotnej transkrypcji na lodzie.

4. Ilościowa analiza PCR w czasie rzeczywistym

  1. Skonstruuj plazmidy zawierające docelowe sekwencje genów przy użyciu protokołu producenta.
  2. Dostosuj stężenia do 100-500 000 kopii/μl dla matryc DNA dla krzywych standardowych.
  3. Rozcieńczyć roztwory cDNA (1:100) wodą destylowaną.
  4. Dodać 2 μl rozcieńczonych roztworów cDNA i plazmidy dla krzywych wzorcowych do mieszanki głównej z ilościowego zestawu do PCR w czasie rzeczywistym.
  5. Skonfiguruj PCR w czasie rzeczywistym, używając następujących warunków cyklicznych: 95 °C przez 30 s, a następnie 40 cykli w temperaturze 95 °C przez 5 s i 60 °C przez 35 s.
  6. Przeanalizuj liczbę kopii zgodnie z instrukcjami producenta systemu PCR w czasie rzeczywistym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Najpierw zbadaliśmy optymalne stężenie PVP przy użyciu dojrzałych nasion Arabidopsis. Całkowite RNA wyizolowano z około 1000 nasion zgodnie z opisanym powyżej protokołem przy użyciu buforu do lizy komórek zawierającego 0%, 0,25%, 0,5%, 1,0% lub 2,0% PVP. Po homogenizacji i odwirowaniu pobrano supernatant, unikając warstwy oleju i resztek nasion (ryc. 1A).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Profile ekspresji genów przyczyniają się do naszego zrozumienia fizjologii roślin; w związku z tym opracowano specyficzne metody izolacji RNA dla każdego warunku próbki9-12. Zbadaliśmy procesy, które zostały zahamowane podczas izolacji RNA z nasion i stwierdziliśmy, że wiązanie RNA z błonami krzemionkowymi było poważnie zahamowane. Duże ilości oleju, białek i polifenoli hamują izolację RNA. Zmodyfikowaliśmy proces ekstrakcji RNA, aby usunąć te związki za pomocą roztworu do lizy przed procesem wiązania RNA z me...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy personelowi Zakładu Genomiki Funkcjonalnej oraz Zakładu Spektrografii i Bioobrazowania, Głównego Ośrodka Badawczego NIBB oraz Ośrodka Badawczego Roślin Modelowych, Centrum Zasobów Biologicznych NIBB.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
RNeasy Plant Mini KitQIAGEN74904
poliwinylopirolidonSigma-AldrichP5288-100G
HOMOGENIZATOR S-303AS ONE1-1133-02
NanoDrop LiteThermo ScientificND-NDL-US-CAN
PrimeScript RT (idealny czas rzeczywisty)TAKARARR037A
KAPA SYBR Zestaw do szybkiego qPCRKapa biosystemsKK4601
Zestaw odczynników

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hills, M. J. Control of storage-product synthesis in seeds. Curr Opin Plant Biol. 7 (3), 302-308 (2004).
  2. Li-Beisson, Y., et al. Acyl-lipid metabolism. Arabidopsis Book. 11, e0161(2013).
  3. Bates, P. D., Stymne, S., Ohlrogge, J. Biochemical pathways in seed oil synthesis. Curr Opin Plant Biol. 16 (3), 358-364 (2013).
  4. Santos-Mendoza, M., et al. Deciphering gene regulatory networks that control seed development and maturation in Arabidopsis. Plant J. 54 (4), 608-620 (2008).
  5. Durrett, T. P., Benning, C., Ohlrogge, J. Plant triacylglycerols as feedstocks for the production of biofuels. Plant J. 54 (4), 593-607 (2008).
  6. Kanai, M., et al. The Plastidic DEAD-box RNA helicase 22, HS3, is essential for plastid functions both in seed development and in seedling growth. Plant Cell Physiol. 54 (9), 1431-1440 (2013).
  7. Kanai, M., et al. Extension of oil biosynthesis during the mid-phase of seed development enhances oil content in Arabidopsis seeds. Plant Biotechnol J. 14 (5), 1241-1250 (2016).
  8. Dekkers, B. J., et al. Identification of reference genes for RT-qPCR expression analysis in Arabidopsis and tomato seeds. Plant Cell Physiol. 53 (1), 28-37 (2012).
  9. Salzman, R. A., et al. An improved RNA isolation method for plant tissues containing high levels of phenolic compounds or carbohydrates. Plant Mol Biol Rep. 17 (1), 11-17 (1999).
  10. Vicient, C. M., Delseny, M. Isolation of total RNA from Arabidopsis thaliana seeds. Anal Biochem. 268 (2), 412-413 (1999).
  11. Wang, G. F., et al. Isolation of high quality RNA from cereal seeds containing high levels of starch. Phytochem Analysis. 23 (2), 159-163 (2012).
  12. Birtic, S., Kranner, I. Isolation of high-quality RNA from polyphenol-, polysaccharide- and lipid-rich seeds. Phytochem Analysis. 17 (3), 144-148 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Izolacja RNAekstrakcja RNA z nasionmetoda z buforem PVPwysokiej czysto ci RNAmetoda kolumienek wirowychPCR w czasie rzeczywistymanaliza spektrofotometrycznanasiona rzepakunasiona Arabidopsis

Powiązane artykuły