Method Article

Dwie techniki tworzenia myszy z niedoczynnością przytarczyc: paratyreoidektomia przy użyciu gruczołów GFP i ablacja przytarczyc za pośrednictwem toksyny błoniczej

DOI:

10.3791/55010

⸱

March 14th, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Endocrine Unit, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 2West China School of Stomatology, Sichuan University, 3Department of Oral Medicine, Infection and Immunity, Harvard School of Dental Medicine, 4State Key Laboratory of Oral Diseases, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Myszy z nabytą niedoczynnością przytarczyc byłyby przydatne do badania nowych terapii lekowych na niedoczynność przytarczyc. Zademonstrowano dwie procedury tworzenia takich myszy. Mysz GFP-PTX jest generowana przez chirurgiczną paratyreoidektomię pod kontrolą zielonych fluoryzujących przytarczyc. Drugie, niechirurgiczne podejście opiera się na specyficznej dla przytarczyc ekspresji receptora toksyny błoniczej.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niedoczynność przytarczyc (HP) to zaburzenie charakteryzujące się niskim poziomem PTH, który prowadzi do hipokalcemii, hiperfosfatemii i niskiego obrotu kostnego. Najczęstszą przyczyną choroby jest przypadkowe usunięcie przytarczyc podczas operacji tarczycy. Potrzebne są nowatorskie terapie HP, ale ich testowanie wymaga wiarygodnych modeli zwierzęcych nabytego HP.

Tutaj demonstrujemy generowanie dwóch modeli myszy nabytych HP. W modelu GFP-PTX myszy z białkiem zielonej fluorescencji (GFP) ulegającym specyficznej ekspresji w przytarczycach (PTHcre-mTmG) stworzono przez skrzyżowanie myszy PTHcre + z myszami Rosa-mTmGfl / fl. Zielone fluoryzujące przytarczyce można łatwo zidentyfikować pod fluorescencyjnym mikroskopem preparacyjnym, a paratyreoidektomię wykonuje się w mniej niż 20 minut. Po operacji pod kontrolą fluorescencji myszy są głęboko hipokalcemiczne. W przeciwieństwie do tradycyjnej tyreo-przytarczyc, to precyzyjne podejście chirurgiczne pozostawia tarczycę i funkcję tarczycy nienaruszone. Drugi model, który nie wymaga operacji, opiera się na podejściu opartym na toksynie błoniczej. Myszy PTHcre-iDTR, które wyrażają receptor toksyny błoniczej (DT) specyficznie w przytarczycach, zostały wygenerowane przez skrzyżowanie indukowalnej myszy DTR z myszą PTHcre. Komórki przytarczyc stają się w ten sposób wrażliwe na toksynę błoniczą (DT) i mogą być selektywnie niszczone przez systemowe wstrzykiwanie myszom DT. Uzyskany fenotyp hipokalcemiczny, jest stabilny.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Od czasu pierwszego systematycznego opisu gruczołów przytarczyc u człowieka i kilku innych gatunków przez Sandströma w 1880 roku 1, zrozumienie znaczenia tego małego organu endokrynnego dla fizjologii i choroby człowieka stale się poprawia. Przytarczyce wydzielają parathormon (PTH), główny regulator metabolizmu wapnia. PTH jest również ważnym hormonem dla homeostazy fosforanów i obrotu kostnego 1,2. Przypadkowe usunięcie lub uszkodzenie przytarczyc podczas operacji szyi jest najczęstszą przyczyną niedoczynności przytarczyc, choroby charakteryzującej się niskim poziomem wapnia we krwi, niskim PTH i podwyższonym poziomem fosforu 1.

Aby lepiej badać nabytą niedoczynność przytarczyc i testować nowe terapie, potrzebne są niezawodne i łatwo dostępne modele myszy. Myszy są szeroko wykorzystywane w badaniach, ponieważ u tego gatunku dostępna jest szeroka gama narzędzi genetycznych, co pozwala na zaawansowane badania mechanistyczne in vivo. Jednakże, podczas gdy chirurgiczna paratyreoidektomia (PTX) może być stosowana u szczurów 2,3,4,5, oraz większych ssaków 6,7,8, jest to technicznie bardzo trudne ze względu na mały rozmiar gruczołów i ich zmienny rozkład anatomiczny 9. Dlatego tyreo-przytarczyce (TPTX) jest zwykle wykonywana u myszy, u których tarczyca i przytarczyce są usuwane razem 10. Jednak niski poziom hormonów tarczycy jest potencjalnym czynnikiem zakłócającym w eksperymentach, komplikując ten model. Ponadto limfocyty C w obrębie tarczycy, które wytwarzają kalcytoninę, hormon ważny w homeostazie wapnia u gryzoni, są również tracone po usunięciu tarczycy 11.

Istnieje kilka genetycznych modeli niedoczynności przytarczyc u myszy, w tym mysz PTH-null 12, mysz GCM2-null 13, oraz mysz Nuf z mutacją aktywującą w receptorze wyczuwającym wapń (CaSR) 14,15. Jednak te wady genetyczne są już obecne podczas rozwoju embrionalnego, a zatem funkcja przytarczyc jest upośledzona już podczas embriogenezy. Może to wpływać na rozwój narządów, takich jak szkielet. Kontrastuje to z pacjentami z pooperacyjną niedoczynnością przytarczyc, którzy nabywają chorobę w późniejszym życiu. Co więcej, niektóre z tych modeli myszy wykazują wczesną śmiertelność i zmniejszoną płodność, co dodatkowo komplikuje ich użytkowanie 12,13,14.

Opracowaliśmy dwa nowe modele myszy dla nabytej niedoczynności przytarczyc. Wykorzystanie genetycznie zmodyfikowanych myszy, które wykazują ekspresję GFP specyficznie w przytarczycach, pozwala na łatwą identyfikację przytarczyc do chirurgicznego usunięcia bez usuwania tarczycy. Ta mysz została wygenerowana przez skrzyżowanie myszy PTH-Cre, która wyraża rekombinazę Cre pod kontrolą promotora PTH o mocy 5,5 kb 16 z myszą ROSAmTmG. Wynikowy PTHcre; Myszy mTmG wyrażają zielone białko fluorescencyjne specyficznie w komórkach przytarczyc. Drugi model myszy wykorzystuje ten sam PTH-Cre, tym razem do usunięcia kasety STOP z indukowalnej myszy DTR, co powoduje ekspresję receptora toksyny błoniczej specyficznie w przytarczycach. Ogólnoustrojowe podawanie DT niszczy komórki przytarczyc, powodując niedoczynność przytarczyc zwierząt bez operacji.

Dwa modele myszy przedstawione w tym badaniu wykazują stabilny fenotyp hipokalcemiczny w ciągu trzymiesięcznego okresu obserwacji. Procedury są łatwe do wykonania, fenotyp jest powtarzalny, a myszy z niedoczynnością przytarczyc wykazują wysoki wskaźnik przeżywalności 17.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie zostało zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) Szpitala Ogólnego w Massachusetts. Przed rozpoczęciem należy uzyskać odpowiednią zgodę instytucjonalną na to badanie na zwierzętach. Niektóre techniki mogą wymagać dostosowania zgodnie z lokalnymi wymogami IACUC.

1. Myszy GFP-PTX

  1. Uzyskaj myszy PTHcre + i myszy Rosa-mTmG w wieku 8 - 10 tygodni do dalszego krycia.
  2. Krzyżowanie wsteczne myszy PTHcre + (mieszane 129; tło FVB) z myszami C57BL/6 przez 6 pokoleń, aby uzyskać myszy z tłem C57BL/6.
  3. Myszy wsobne PTHcre+ w celu uzyskania myszy PTHcre+/+17.
    UWAGA: Aby przeprowadzić genotypowanie, wyekstrahuj DNA z czubka ogona i użyj go do PCR. Startery PCR do sprawdzania heterozygotyczności i homozygotyczności transgenu PTHcre są następujące: starter do przodu A, CCTGTCAAGGATGTGGAAGA, starter odwrotny A', TCAGATCACACCACACAGCA, starter do przodu B, CAGTTGTCTTTAGTTTACTCAGCATCAG, starter odwrócony B', GATAATCGCGAACATCTTCAGGTT17.
  4. Skrzyżowanie PTHcre+/+ mice16 z myszami Rosa-mTmG18. Odstawienie od łóżka PTHcre; mTmG szczenięta w wieku 4 tygodni.
  5. Znieczulenie 8 - 10 tygodniowego PTHcre; Myszy mTmG przez wstrzyknięcie dożylnie tribromoetanolu (Avertin) w dawce 0,6 mg/g masy ciała lub innych środków, takich jak ketamina/ksylazyna. Stosować buprenorfinę w dawce 0,1 mg/kg s.c. co 12 godzin jako środek przeciwbólowy przez 48 godzin po zabiegu zgodnie z zatwierdzonym protokołem. Zapewnić odpowiednią głębokość znieczulenia za pomocą odruchu wycofania szczypania palców u nóg lub w inny sposób. Ułóż zwierzę w pozycji leżącej.
  6. Rozciągnij i przygotuj brzuszną okolicę szyi, goląc skórę za pomocą ostrzy o pojedynczej krawędzi. Zdezynfekuj ogoloną skórę płatkiem antyseptycznym z jodonem powidonu.
  7. Przykryj zwierzę sterylnymi obłożnikami chirurgicznymi, aby zmniejszyć zanieczyszczenie pola operacyjnego i użyj autoklawowanych narzędzi mikrochirurgicznych do zabiegu chirurgicznego.
  8. Wytnij 2 cm podłużne nacięcie w skórze za pomocą skalpela chirurgicznego. Wypreparuj powięź i odepchnij gruczoły ślinowe na bok przez rozwarstwienie zakrzywionymi ząbkowanymi kleszczami.
  9. Pod mikroskopem preparacyjnym przy użyciu światła halogenowego i powiększenia 4 - 5x przeciąć i oddzielić mięśnie przytchawicze za pomocą ostrych końcówek kleszczy i odsłonić tchawicę.
  10. Zidentyfikuj tarczycę z prawym i lewym płatem znajdującym się obok tchawicy.
  11. Przełącz źródło światła na światło fluorescencyjne i uwidocznij dwa zielonofluorescencyjne przytarczyce.
    UWAGA: Zazwyczaj dwa przytarczyce znajdują się na powierzchni tarczycy lub w jej pobliżu, ale czasami znajdują się dalej.
  12. Ostrożnie usuń zielone przytarczyce za pomocą kleszczy chirurgicznych i nożyczek. Użyj sterylnej gazy do hemostazy i dokładnie sprawdź wzdłuż tchawicy, aby upewnić się, że cała zielona tkanka została usunięta.
  13. Zamknij mięśnie przytchawicze przez przerwanie szwu za pomocą szwów 6-0 polyglactin 910. Zamknij nacięcie skóry za pomocą szwu Halsted za pomocą szwów 6-0 polyglactin 910.
  14. Opcjonalnie: Wstrzyknąć myszom sterylny, normalny 0,9% roztwór chlorku sodu o stężeniu 10 μl / g w celu wymiany płynów.
  15. Umieścić zwierzęta po operacji w oddzielnej klatce na ciepłym inkubatorze (37 °C) w celu odzyskania temperatury ciała. Gdy myszy się obudzą i znajdą się w pozycji leżącej, połóż na podłodze klatki granulkę i wodę z odrobiną żelatyny.
  16. Po okresie obserwacji pooperacyjnej trwającym 2 godziny należy zwrócić mysz do pomieszczenia dla zwierząt i postępować zgodnie z lokalnymi wymaganiami dotyczącymi opieki pooperacyjnej.
  17. 3 dni po paratyreoidektomii należy pobrać 10 μl krwi ogonowej i zmierzyć zjonizowany we krwi Ca++ za pomocą analizatora, takiego jak analizator Ca++/pH układu gazometrycznego. Udana paratyreoidektomia skutkuje jonizacją Ca ++ we krwi równą lub niższą niż -2SD u myszy kontrolnych operowanych pozorowo (1,20 mmol / L w naszych eksperymentach n = 30).

2. Myszy PTH-cre-iDTR

  1. Zdobądź myszy PTHcre + i DTRfl / fl w wieku 8 - 10 tygodni do krycia.
  2. Krzyżowanie wsteczne myszy PTHcre (mieszane 129; tło FVB) z myszami C57BL/6 przez 6 pokoleń, aby uzyskać myszy z tłem C57BL/6.
  3. Chów wsobny myszy PTHcre+ (tło C57BL/6) w celu uzyskania PTHcre +/+ myszy < klasa sup = "xref">17.
    UWAGA: Aby przeprowadzić genotypowanie, DNA z końcówek ogonów myszy zostało wyekstrahowane i wykorzystane do PCR. Startery genotypowania: starter do przodu A, CCTGTCAAGGATGTGGAAGA, starter odwrotny A', TCAGATCACACCACACAGCA, starter do przodu B, CAGTTGTCTTTAGTTTACTCAGCATCAG, starter odwrotny B', GATAATCGCGAACATCTTCAGGTT17.
  4. Połącz PTHcre+/+ mice16 z DTRfl/fl mice19, aby uzyskać myszy PTHcre-iDTR.
  5. Przygotować roztwór DT, rozcieńczając proszek toksyny błoniczej sterylnym roztworem soli fizjologicznej do stężenia 0,5 μg/ml. Przefiltrować jałowo i przechowywać podwielokrotności w temperaturze -80 °C.
  6. Wybierz 8-10 tygodniowe myszy PTHcre-iDTR do eksperymentu iniekcyjnego. Rozmrozić podwielokrotność DT do temperatury pokojowej, podać DT dootrzewnowo w stężeniu 5 μg/kg (10 μl/g) masy ciała zwierzęcia. Aby uzyskać maksymalną skuteczność i najmniejszą toksyczność, podawanie DT powtarza się w sumie 2 wstrzyknięcia w odstępie 3 dni17.
  7. 3 dni po drugim wstrzyknięciu należy pobrać 10 μl krwi ogonowej od każdej myszy PTHcre-iDTR/PTHcre-iDTR-mTmG i zmierzyć poziom Ca++ we krwi za pomocą analizatora Ca++/pH systemu gazometrii.
    UWAGA: Myszy z zjonizowanym we krwi Ca ++ niższym niż 1,18 mmol / L definiujemy jako myszy z niedoczynnością przytarczyc, co jest równe 2SD poniżej średniej myszy kontrolnych, którym wstrzyknięto nośnik (n = 22).

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lokalizacja przytarczyc

Po pierwsze, zarejestrowaliśmy rozmieszczenie przytarczyc u 54 myszy PTHcre-mTmG, które zaobserwowano pod fluorescencyjnym mikroskopem preparacyjnym. 74% (40/54) myszy miało dwie zielone gruczoły przytarczyc (Rysunek 1A, C, E), 26% (14/54) myszy miało dodatkowy trzeci gruczoł przytarczyc (Figura 1B, D, F). Nie zaobserwowano myszy z pojedynczym gruczołem lub więcej niż trzema gruczołami. Zazwyczaj przytarczyce znajdowały się w pobliżu górnej granicy tarczycy (58%, 71/122; Rysunek 1A(1,2), B(1,2), C(2), D(1,2), E(2), F(3)). 27% (33/122) gruczołów znajdowało się w pobliżu dolnej granicy tarczycy (ryc. 1C(1), D(3), F(1)), a 13% (16/122) znajdowało się z dala od tarczycy (ryc. 1B(3), E(1), F(2)). Nasze odkrycia są zgodne i rozszerzają wcześniejsze odkrycia dotyczące różnych lokalizacji gruczołów przytarczyc20.

Myszy GFP-PTX

Cała operacja, od znieczulenia do zamknięcia nacięcia skóry, trwała około 20 minut na mysz. Wskaźnik przeżycia myszy po operacji w ciągu 3-miesięcznego okresu obserwacji wynosił 96,3% (53/55). 92,4% (49/53) myszy GFP-PTX wykazywało poziom zjonizowanego wapnia, który był o 2 SD niższy niż średnia myszy kontrolnych operowanych pozorem lub niższy. Fenotyp niedoczynności przytarczyc u myszy GFP-PTX (hipokalcemia, niski PTH i podwyższone stężenie fosforanów w surowicy) był stabilny przez cały czas obserwacji wynoszący 3 miesiące. Co ważne, czynność tarczycy nie różniła się od czynności zwierząt operowanych pozorowo 3 miesiące po operacji (TSH = 42 ± 24 vs. 30 ± 15 mU/L, p = 0,171; T4 = 3,0 ± 0,6 vs. 3,1 ± 0,9 μg/dl, p = 0,707 (rysunek 2).

Myszy PTH-cre-iDTR

Myszy z wstrzykniętym DT PTH-Cre-iDTR rozwinęły niedoczynność przytarczyc (niski poziom wapnia we krwi zjonizowany, podwyższony poziom fosforu we krwi i niewłaściwie niski normalny poziom PTH). Wcześniej informowaliśmy, że kilka komórek PTH dodatnich unika ablacji przez toksynę błoniczą, co wyjaśnia mierzalny krążący PTH, a tym samym nieco łagodniejszy fenotyp tych myszy17.

Niedoczynność przytarczyc u myszy GFP-PTX i myszy PTH-cre-iDTR

Znaczące obniżenie poziomu Ca++ i PTH w surowicy krwi zaobserwowano u myszy GFP-PTX 3 dni po operacji, w porównaniu do poziomów stwierdzonych u myszy operowanych pozorowanych (Ca++ = 1,05 ± 0,40 vs. 1,30 ± 0,03 mmol/L, p < 0,05; PTH=32 ± 22 vs. 580 ± 137 pg/mL, p < 0,05). Fenotyp niedoczynności przytarczyc był stabilny przez 3-miesięczny okres obserwacji (Figura 3A, przedrukowana za zgodą (odniesienie#17)). Po 2 wstrzyknięciach 5 μg/kg DT w odstępie 3 dni, dawce i schemacie zoptymalizowanym pod kątem użycia najmniejszej ilości DT w celu uzyskania maksymalnego fenotypu przytarczyc, myszy z wstrzykniętymi DT PTH-cre-iDTR wykazywały znaczną hipokalcemię i zmniejszoną PTH w porównaniu z myszami kontrolnymi nośnikiem, które utrzymywały się przez 90-dniowy okres obserwacji (Ca++ = 1,10 ± 0,07 mmol/L vs. 1,26 ± 0,05 mmol/L, p < 0,05; PTH = 218 ± 156 pg/ml vs. 572 ± 164 pg/mL, p < 0,05) (Rysunek 3B, przedruk za zgodą (odniesienie#17)).

figure-results-1
Rycina 1: Reprezentatywne obrazy różnych lokalizacji przytarczyc u 54 myszy PTHcre-mTmG pod fluorescencyjnym mikroskopem preparacyjnym. Myszy miały albo dwa (A, C, E), albo trzy (B, D, F) zielone gruczoły przytarczycowe. Większość przytarczyc znajdowała się w pobliżu górnej granicy (A(1,2), B(1,2), C(2), D(1,2), E(2), F(3) lub w pobliżu dolnej granicy tarczycy (C(1), D(3), F(1)). W rzadkich przypadkach niektóre były zlokalizowane ektopowo (B(3), E(1), F(2)). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rycina 2: Poziom TSH i T4 myszy GFP-PTX. 3 miesiące po GFP-PTX uzyskano surowicę do pomiarów TSH i T4. Myszy GFP-PTX wykazywały stężenia TSH (42 ± 24 mU / L) (A) i stężenia T4 (3,0 ± 0,6 μg / dl) (B), które nie różniły się od myszy kontrolnych (TSH = 30 ± 15 mU / L, p = 0,171, n = 11, T4 = 3,1 ± 0,9, p = 0,707, n = 11). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rycina 3: Poziomy Ca ++ i PTH we krwi u myszy GFP-PTX i myszy PTH-cre-iDTR z wstrzyknięciem DT. Zarówno myszy GFP-PTX (A), jak i myszy z wstrzykniętym DT PTH-cre-iDTR (B) wykazywały stabilną hipokalcemię i obniżone poziomy PTH w ciągu 3-miesięcznego okresu obserwacji (N = 6 - 8, ***p < 0,001) (przedrukowane za zgodą z odnośnika #17). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Demonstrujemy technikę paratyreoidektomii pod kontrolą GFP przy użyciu transgenicznych myszy z selektywną ekspresją GFP w przytarczycach. W PTHcre; U myszy mTmG, podwójna fluorescencja (zielony GFP w komórkach z ekspresją Cre i czerwony pomidor w komórkach bez ekspresji Cre) umożliwiła nam wyraźną identyfikację i precyzyjne usunięcie wszystkich gruczołów przytarczyc bez usuwania tarczycy. Chociaż preferujemy stosowanie myszy mTmG o podwójnej fluorescencji w celu identyfikacji fluorescencyjnej czerwonej tkanki nieprzytarczycowej, nasza procedura powinna również działać dobrze przy użyciu pojedynczych fluorescencyjnych zwierząt, takich jak pomidor czerwony (B6. Mysz Cg-Ct(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J). Zabieg jest stosunkowo łatwy do wykonania, wymaga około 20 minut na mysz i skutkuje ciężkim i utrzymującym się fenotypem przytarczyc.

Ponadto kolejną zaletą przytarczyc GFP-dodatnich jest łatwość wykrywania nieprawidłowych przytarczyc. Nasze badania wykazują błędną lokalizację przytarczyc u około jednej czwartej myszy B6 (ryc. 1), które są łatwo wykrywane w naszym modelu mysim przez zieloną fluorescencję. W przeciwieństwie do tyreoidektomii, nasza technika pozwala uniknąć usunięcia tarczycy, co wiąże się z późniejszą koniecznością wymiany hormonów tarczycy i nieznanym efektem usunięcia komórek C tarczycy wytwarzających kalcytoninę. Znakowane fluorescencyjnie przytarczyce mogą być również wykorzystywane do innych badań, które wymagają izolacji przytarczyc. Ograniczeniem tego modelu jest wymóg poddania się zabiegowi chirurgicznemu. Wymagane są podstawowe umiejętności mikrochirurgiczne oraz mikroskop preparacyjny z fluorescencyjnym źródłem światła.

Zademonstrowano drugą technikę generowania myszy z niedoczynnością przytarczyc, która eliminuje potrzebę operacji. Myszy PTHcre-iDTR leczone toksyną błonicy wykazują łagodniejszy fenotyp niedoczynności przytarczyc, ale po prostu wymagają wstrzyknięcia DT dootrzewnowo myszy. Kluczową częścią generowania tego modelu była optymalizacja dawki i schematu dawkowania. Wysokie dawki DT prowadziły do toksyczności, ale niskie dawki zmniejszały skuteczność tego podejścia. Ustaliliśmy, że schemat dawkowania składający się z 2 wstrzyknięć w dawce 5 μg/kg, podawanych w odstępie 3 dni, powodował wiarygodną i stabilną hipokalcemię z zerową lub minimalną śmiertelnością.

Ostatecznie mamy nadzieję, że te dwa podejścia dostarczą użytecznych mysich modeli nabytej niedoczynności przytarczyc. Korzystając z nowatorskiego, długo działającego PTH, odnotowaliśmy pierwsze zastosowanie obu tych modeli w określaniu skuteczności nowych leków na niedoczynność przytarczyc17.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez granty NIH R01-DK100584 oraz China State Key Laboratory of Oral Diseases Open Funding SKLOD2015OF01 (RB). Dziękujemy Wenping Zhao, Tadatoshi Sato i Kelly Lauter za pomoc.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Myszy ROSAmT/mGMyszy Jackson Laboratory7676
PTH-CreMyszy7900
6-0 poliglaktyna 910 z igłąEthicon, IncJ510G
Bezpieczne żyletki jednokrawędzioweAmerykańska firmazajmująca się maszynką do golenia66-0089
Jednorazowamaszynka do golenia z piór skalpela Co., LTD72042-11
Podkładki przygotowawcze z powidonem i jodemDynarex Corporation1108
Gaza warstwowaBusse. IncBHD707
0,9% roztwór chlorku soduHOSPIRA Worldwide, Inc07983-09
1 ml 29 g strzykawka insulinowaBECTON DICKINSON329622
Serwety chirurgiczne do nacięć3M6640EZ
Kleszcze Dumstar BiologyRoboz Surgical Instrument Co., IncRS-4984
Mikro nożyczki sprężynowe do preparowaniaRoboz Surgical Instrument Co., IncRS-5605
Uchwyt igłyMILTEX., IncV98-42
2,2,2-tribromethanolSigma-AldrichT48402
2-metylo-2-butanolSigma-Aldrich152463Do rozpuszczenia 2,2,2-tribrometalu
Toksyna błonicy w proszkuSigma-AldrichD0564Rozpuścić w 0,9% roztworze chlorku sodu o stężeniu 1 mg/ml jako roztwór podstawowy w -80 ° C
Multicap Probówki kapilarne do pobierania krwiSiemens Healthcare Diagnostics Ltd855578Do pobierania krwi w analizie iCa2+ za pomocą RapidLab 348 Analizator Ca2+/pH
RapidLab 348 Ca2+/pHSiemens HealthcareDo analizy iCa2+
iDTRmice Jackson Laboratory

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brandi, M. L., Brown, E. M. Hypoparathyroidism. , Springer. (2015).
  2. van Abel, M. Coordinated control of renal Ca(2+) transport proteins by parathyroid hormone. Kidney Int. 68, 1708-1721 (2005).
  3. Sebastian, E. M., Suva, L. J., Friedman, P. A. Differential effects of intermittent PTH(1-34) and PTH(7-34) on bone microarchitecture and aortic calcification in experimental renal failure. Bone. 43, 1022-1030 (2008).
  4. Rodriguez-Ortiz, M. E. Calcium deficiency reduces circulating levels of FGF23. J Am Soc Nephrol. 23, 1190-1197 (2012).
  5. Liao, H. W. Relationship between Fibroblast Growth Factor 23 and Biochemical and Bone Histomorphometric Alterations in a Chronic Kidney Disease Rat Model Undergoing Parathyroidectomy. PloS one. 10, e0133278(2015).
  6. Fox, J., Care, A. D. Effect of low calcium and low phosphorus diets on the intestinal absorption of water in intact and parathyroidectomized pigs. Calcif Tissue Int. 31, 253-255 (1980).
  7. Finco, D. R., Brown, S. A., Ferguson, D. C., Crowell, W. A. Selective parathyroidectomy of the dog. Can J Vet Res. 57, 288-292 (1993).
  8. Can, I. Parathyroid allotransplantation in rabbits without cultivation. Int J Clin Exp Med. 7, 280-284 (2014).
  9. Dunn, T. B. Melanoblasts in the stroma of the parathyroid glands of strain C58 mice. j Natl Cancer Inst. 10, 725-733 (1949).
  10. CRIVER. , Available from: http://www.criver.com/products-services/basic-research/rodent-surgery/soft-tissue-procedures (2010).
  11. Sakai, A. Osteoclast development in immobilized bone is suppressed by parathyroidectomy in mice. J Bone Miner Metab. 23, 8-14 (2005).
  12. Miao, D. Skeletal abnormalities in Pth-null mice are influenced by dietary calcium. Endocrinology. 145, 2046-2053 (2004).
  13. Gunther, T. Genetic ablation of parathyroid glands reveals another source of parathyroid hormone. Nature. 406, 199-203 (2000).
  14. Hough, T. A. Activating calcium-sensing receptor mutation in the mouse is associated with cataracts and ectopic calcification. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 13566-13571 (2004).
  15. Hannan, F. M. The Calcilytic Agent NPS 2143 Rectifies Hypocalcemia in a Mouse Model With an Activating Calcium-Sensing Receptor (CaSR) Mutation: Relevance to Autosomal Dominant Hypocalcemia Type 1 (ADH1). Endocrinology. 156, 3114-3121 (2015).
  16. Libutti, S. K. Parathyroid gland-specific deletion of the mouse Men1 gene results in parathyroid neoplasia and hypercalcemic hyperparathyroidism. Cancer Res. 63, 8022-8028 (2003).
  17. Bi, R. Diphtheria Toxin- and GFP-Based Mouse Models of Acquired Hypoparathyroidism and Treatment with a Long-Acting Parathyroid Hormone Analog. J Bone Miner Res. , (2015).
  18. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
  19. Buch, T. A Cre-inducible diphtheria toxin receptor mediates cell lineage ablation after toxin administration. Nat Methods. 2, 419-426 (2005).
  20. Dunn, T. B. Melanoblasts in the stroma of the parathyroid glands of strain C58 mice. J Natl Cancer Inst. 10, 725-733 (1949).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Hypoparathyroid Mouse ModelsParathyroidectomy SurgeryGFP Guided SurgeryDiphtheria Toxin AblationPTHcre MiceFluorescence DissectionIonized Calcium AnalysisThyroid Function IntactStable Hypocalcemia PhenotypeParathyroid Gland Removal

Related Articles