Artykuł metodologiczny

Metoda pomiaru metabolizmu w posortowanych subpopulacjach złożonych zbiorowisk komórkowych za pomocą śledzenia stabilnych izotopów

DOI:

10.3791/55011

⸱

4 lutego 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, Unit of Computational Medicine, Karolinska Institutet, 2Center for Molecular Medicine, Karolinska Institutet, 3Department of Medical Biochemistry and Biophysics, Division of Physiological Chemistry 2, Karolinska Institutet, 4Department of Medicine, University of California San Diego

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł opisuje metodę badania metabolizmu komórkowego w złożonych społecznościach wielu typów komórek, wykorzystując kombinację śledzenia stabilnych izotopów, sortowania komórek w celu izolowania określonych typów komórek oraz spektrometrii mas.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Typy komórek ssaków wykazują wyspecjalizowany metabolizm i istnieje wiele dowodów na to, że różne współistniejące typy komórek angażują się we współpracę metaboliczną. Co więcej, nawet kultury jednego typu komórek mogą zawierać komórki w różnych stanach metabolicznych, takich jak komórki w stanie spoczynku lub cyklu życia. Metody pomiaru aktywności metabolicznej takich subpopulacji są cennymi narzędziami do zrozumienia metabolizmu komórkowego. Złożone populacje komórek są najczęściej rozdzielane za pomocą sortera komórek, a subpopulacje wyizolowane tą metodą mogą być analizowane metodami metabolomicznymi. Jednak problem z tym podejściem polega na tym, że procedura sortowania komórek poddaje komórki stresom, które mogą zniekształcić ich metabolizm.

Aby przezwyciężyć te problemy, doszliśmy do wniosku, że rozkłady masowych izotopomerów (MID) metabolitów z komórek hodowanych za pomocą stabilnych izotopowych składników odżywczych będą prawdopodobnie bardziej stabilne niż bezwzględne stężenia metabolitów, ponieważ MID powstają w dłuższych skalach czasowych i powinny być mniej podatne na krótkotrwałe narażenie na warunki sortowania komórek. W tym miejscu opisujemy metodę opartą na tej zasadzie, łączącą sortowanie komórek z chromatografią cieczową ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości (LC-HRMS). Procedura polega na analizie trzech rodzajów próbek: (1) ekstraktów metabolitów uzyskanych bezpośrednio z populacji złożonej; (2) ekstrakty z "pozorowanych posortowanych" komórek przepuszczonych przez urządzenie do sortowania komórek bez bramkowania żadnej określonej populacji; oraz (3) wyciągi z faktycznie posortowanych populacji. Próbne posortowane komórki są porównywane z bezpośrednią ekstrakcją w celu sprawdzenia, czy MID rzeczywiście nie są zmieniane przez samą procedurę sortowania komórek, przed analizą rzeczywistych posortowanych populacji. Pokazujemy przykładowe wyniki z komórek HeLa posortowanych według fazy cyklu komórkowego, ujawniając zmiany w metabolizmie nukleotydów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wyższe organizmy zawierają złożone społeczności różnych typów komórek, które współpracują ze sobą, aby realizować bardziej złożone funkcje. Na przykład guzy zawierają nie tylko komórki rakowe, ale także fibroblasty, komórki tworzące naczynia krwionośne, a często nacieki komórek odpornościowych1; Krew zawiera złożoną mieszaninę kilkudziesięciu podtypów komórek odpornościowych2; A nawet hodowane linie komórkowe mogą składać się z wielu subpopulacji, takich jak podtypy luminalne i podstawowe komórek raka piersi3. Co więcej, różne typy komórek, które współistnieją, mogą wykazywać "współpracę" metaboliczną. Na przykład uważa się, że w mózgu astrocyty przekształcają glukozę w mleczan, który jest następnie "podawany" neuronom utleniającym ten substrat4; Limfocyty T są w niektórych kontekstach zależne od sąsiednich komórek dendrytycznych jako źródła cysteiny5; a komórki rakowe mogą współpracować z powiązanymi fibroblastami w nowotworach6. Aby zrozumieć zachowanie metaboliczne takich systemów, konieczne jest oddzielenie i zmierzenie aktywności metabolicznej różnych obecnych typów komórek.

Zdecydowanie najczęściej używaną metodą rozdzielania typów komórek jest sortowanie komórek aktywowane fluorescencją. Metoda ta ma szerokie zastosowanie, pod warunkiem, że typ komórki lub stan zainteresowania może być "znakowany" za pomocą przeciwciał fluorescencyjnych, ekspresji zmodyfikowanych białek fluorescencyjnych lub innych barwników. Jedną z opcji jest początkowe rozdzielenie typów komórek za pomocą sortera komórek, ponowne wyhodowanie poszczególnych uzyskanych typów komórek, a następnie przeprowadzenie badań metabolizmu tych kultur7. Jest to jednak możliwe tylko wtedy, gdy typ lub fenotyp komórki jest stabilny w warunkach hodowli i nie może uchwycić przejściowych zachowań, takich jak stany cyklu komórkowego, ani współpracy metabolicznej w kokulturach. W takich przypadkach metabolizm musi być mierzony bezpośrednio na posortowanych komórkach. Jest to trudne, ponieważ procedura sortowania komórek poddaje komórki stresom, które mogą zniekształcić ich metabolizm8, a wiemy tylko o kilku badaniach wykorzystujących to podejście9,10. W szczególności odkryliśmy, że główne metabolity, takie jak aminokwasy, mogą wyciekać z komórek przechowywanych w buforze do sortowania komórek, tak że pomiary bezwzględnej obfitości metabolitów nie są już wiarygodne11 (chociaż względne porównanie między posortowanymi frakcjami może być nadal cenne).

Aby obejść te problemy, przed sortowaniem oznaczamy komórki stabilnymi izotopami i skupiamy się na MIDach w metabolitach komórkowych, a nie na obfitości metabolitów. Ponieważ MID powstają w dłuższych skalach czasowych, krótkoterminowe narażenie na warunki sortowania powinno mieć na nie mniejszy wpływ. Określamy ilościowo MID za pomocą spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości z pełnym skanowaniem, która jest wystarczająco czuła, aby dostarczyć danych na temat setek metabolitów, zaczynając od około 500 000 posortowanych komórek, co wymaga około 30-60 minut czasu sortowania komórek. Porównuje się kontrolę "pozorowaną sortowaną" (komórki przeszły przez przyrząd do sortowania komórek bez bramkowania żadnej określonej populacji) a ekstrakcją metabolitów bezpośrednio z szalki hodowlanej w celu zapewnienia, że obserwowane MID są reprezentatywne dla tych w oryginalnej hodowli. W zależności od wyboru znaczników stabilnych izotopów, za pomocą tej metody można badać różne szlaki metaboliczne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Ekstrakcja metabolitów

  1. Ekstrakcja z naczynia
    1. Hodowla komórek na 6-dołkowej płytce w trzech egzemplarzach w pożywkach hodowlanych znakowanych stabilnymi izotopami + dializowane suplementy (surowica lub inne suplementy wzrostu), aż komórki staną się zlewne w 75%.
      UWAGA: Tutaj hoduj komórki HeLa przez 48 godzin w RPMI zawierającym 40% U-13C-Glucose i 70% U-13C, 15N2-Glutaminy i 5% dializowanej FBS (płodowej surowicy bydlęcej). Dializowany FBS służy do pozbycia się metabolitów o małej masie cząsteczkowej, które mogą zanieczyścić znakowane pożywki. Zaleca się hodowlę komórek w dializowanym suplemencie przed prawdziwym eksperymentem, aby upewnić się, że komórki normalnie rosną w pożywce. Suplementy są dializowane w 0,15 M roztworze NaCl przez noc za pomocą rurki do dializy ze skóry węża.
    2. W dniu ekstrakcji wyrzuć pożywkę hodowlaną, przepłucz studzienki dwukrotnie zimnym 500 μl zimnego HBSS, a następnie wyrzuć.
      UWAGA: Tutaj użyj HBSS zawierającego 40% C-glukozy U-13, ponieważ znajduje się on również w pożywkach hodowlanych.
    3. Dodaj 600 μl 100% metanolu wstępnie schłodzonego na suchym lodzie.
    4. Przenieś naczynie do suchego lodu i usuń materiał komórkowy za pomocą skrobaka do komórek.
    5. Ostrożnie pipetować ekstrakty komórek do probówki mikrowirówkowej i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu analizy spektrometrii mas.
  2. Ekstrakcja pozorowanych posortowanych komórek
    1. Komórki hodowlane w naczyniu o średnicy 100 mm w trzech egzemplarzach w pożywkach hodowlanych znakowanych stabilnymi izotopami + suplementy dializowane.
      UWAGA: Tutaj hoduj komórki HeLa przez 48 godzin w szalce 100 mm, ponieważ do uzyskania 500 000 posortowanych komórek potrzebna jest duża liczba komórek (~4 x 106). Ta liczba ekstraktu z komórek HeLa była wymagana do uzyskania dobrego pomiaru metabolitów. Użytą pożywką hodowlaną był RPMI zawierający 40% U-13C-glukozy i 70% U-13C, 15N2-Glutaminy i 5% dializowanego FBS.
    2. W dniu ekstrakcji wyrzuć pożywkę hodowlaną, przepłucz studzienki 1,5 ml ciepłego HBSS, a następnie wyrzuć.
    3. Odłącz komórki, dodając 1,5 ml trypsyny/EDTA na 4 minuty w temperaturze 37 °C. Wykonaj następujące czynności w temperaturze 4 °C lub w lodzie.
    4. Dezaktywuj trypsynę, dodając 3 ml lodowatego HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) + dializowany suplement.
    5. Zebrać komórki w probówce o pojemności 15 ml i odwirować przy 750 x g przez 3 minuty.
    6. Zawiesić osad w HBSS + dializowany suplement + 1 mM EDTA w stężeniu 1-2 x 106 komórek/ml, przepuścić przez sitka komórkowe 40 μm w celu uzyskania pojedynczych komórek i przenieść do probówki o pojemności 5 ml.
    7. Sortować komórki przez sortownik komórek z bramkowaniem tylko dla singletów i odwirowywać posortowane komórki przy 750 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Tutaj sortuj komórki HeLa z szybkością 1,000 zdarzeń/s, przy ciśnieniu przyrządu 27 psi i przy użyciu dyszy 100 μm. Komórki HeLa są duże, więc powinny być sortowane w wolnym tempie i z dużą dyszą, aby uzyskać jak najbardziej nienaruszony granul. Utrzymuj komórki w zimnych blokach podczas sortowania, aby zmniejszyć metabolizm. Dokładny opis procedury sortowania jest opisany wcześniej12.
    8. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 50 μl lodowatego dH2O w celu uzyskania jednorodnej osadki przed dodaniem metanolu. Dodanie zimnego metanolu bezpośrednio do granulatu tworzy stałą osadkę, która jest trudna do ponownego zawieszenia.
    9. Ekstrahować metabolity przez dodanie 540 μl metanolu przechowywanego w suchym lodzie i utrzymywać ekstrakty w temperaturze -80 °C do czasu chromatografii cieczowej – analizy spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości (LC-HRMS).
  3. Ekstrakcja komórek posortowanych w cyklu komórkowym
    1. Komórki hodowlane w naczyniu o średnicy 100 mm w trzech egzemplarzach w pożywkach hodowlanych + suplementy dializowane.
      UWAGA: Tutaj hoduj komórki HeLa zawierające Geminin Fucci Green (mAG1-hGem) probe13, co pozwala na sortowanie komórek G1 (ujemnych) i SG2M (dodatnich). Komórki mogą być hodowane w stabilnych izotopowych pożywkach śledzących tak długo, jak jest to wymagane. Tutaj hodowaliśmy je przez 46 godzin w nieoznakowanych podłożach, a następnie przeszliśmy na RPMI zawierające 40% U-13C-Glucose i 70% U-13C, 15N2-Glutaminy na 2 godziny przed rozpoczęciem sortowania. Zrobiono to, aby móc badać fazy cyklu komórkowego, co wymaga znakowania krótkim impulsem.
    2. W dniu ekstrakcji wyrzuć pożywkę hodowlaną, przepłucz studzienki 1,5 ml ciepłego HBSS, a następnie wyrzuć.
    3. Odłącz komórki, dodając 1,5 ml trypsyny/EDTA na 4 minuty w temperaturze 37 °C. Wykonaj następujące czynności w temperaturze 4 °C lub w lodzie.
    4. Dezaktywuj trypsynę, dodając 3 ml lodowatego suplementu HBSS + dializowanego.
    5. Zebrać komórki w probówce o pojemności 15 ml i odwirować przy 750 x g przez 3 minuty.
    6. Zawiesić osad w HBSS + dializowany suplement + 1 mM EDTA w stężeniu 1-2 x 106 komórek/ml, przepuścić przez sitka komórkowe 40 μm w celu uzyskania pojedynczych komórek i przenieść do probówki o pojemności 5 ml.
    7. Sortować komórki przez sortownik komórek, usuwając resztki i dublety, a następnie bramkować w celu uzyskania interesującego markera komórkowego i odwirować posortowane komórki w temperaturze 750 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Tutaj sortuj komórki HeLa z szybkością 1,000 zdarzeń/s, przy ciśnieniu przyrządu 27 psi i przy użyciu dyszy 100 μm. Utrzymuj komórki w zimnych blokach podczas sortowania, aby zmniejszyć tempo metabolizmu.
    8. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 50 μl lodowatego dH2O w celu uzyskania jednorodnej osadki przed dodaniem metanolu. Dodanie zimnego metanolu bezpośrednio do granulatu tworzy stałą osadkę, która jest trudna do ponownego zawieszenia.
    9. Wyekstrahować metabolity, dodając 540 μl metanolu przechowywanego w suchym lodzie i utrzymywać ekstrakty w temperaturze -80 °C do czasu analizy LC-HRMS.

2. Analiza spektrometrii mas

Uwaga: Tutaj opisujemy protokół analizy ekstraktów komórkowych w systemie LC-HRMS. Można stosować dowolne metody metabolomiczne do analizy ekstraktów komórkowych. Pełna analiza skanowania może być przydatna do wykrywania szerokiego zakresu metabolitów.

  1. Skalibrować przyrząd za pomocą referencyjnej mieszanki kalibracyjnej spektrometrii mas.
  2. Rozmrażaj ekstrakty komórkowe na lodzie przez 30 minut i wiruj przez 15 sekund.
  3. Przenieść 100 μl ekstraktu komórkowego do filtra wirowego i wirować przez 10 minut przy 13 000 x g w temperaturze 4 °C.
  4. Wstrzyknąć 12,5 μl filtratu do systemu LC-HRMS.
  5. Rozdzielić metabolity za pomocą kolumny do chromatografii cieczowej z obojczojonowymi sprawami hydrofilowymi (ZIC-HILIC) (150 mm x 4,6 mm, wielkość cząstek 5 μm) wyposażonej w kolumnę ochronną ZIC-HILIC (20 mm × 2,1 mm) przy użyciu gradientowej elucji 0,1% kwasu mrówkowego w wodzie (rozpuszczalnik A) i acetonitrylu (rozpuszczalnik B). Rozpocznij elucję gradientową przy 20% rozpuszczalniku A i zwiększ do 80% w ciągu 17 minut. Utrzymać ten procent przez 4 minuty przy przepływie 400 μl min-1 i temperaturze kolumny oraz tacy na próbkę odpowiednio w temperaturze 23 °C i 4 °C.
  6. Do wykrywania metabolitów należy użyć przyrządu sprzężonego z separacją chromatograficzną, podgrzanego elektrorozpylania (H-ESI II) zarówno w trybie dodatnim, jak i ujemnym jako źródła jonizacji oraz trybu akwizycji pełnego skanowania przy zdolności rozdzielczej masy 70 000 Full Width Half Maximum (FWHM) (m/z 200).
  7. Użyć azotu (czystość >99,995%) dla gazu osłonowego i gazu pomocniczego o natężeniu przepływu 45 i 10 j.a. (jednostki dowolne) i ustawić temperaturę parownika na 350 °C, a napięcie elektrorozpylania na 4 kV w trybie dodatnim i -3,5 kV w trybie ujemnym.

3. Analiza danych

  1. Należy wybrać pewną liczbę metabolitów, dla których dostępne są wzorce i które wykazują dobrej jakości piki w próbkach. Dobrej jakości piki mają wysoki stosunek sygnału do szumu. Ważne jest, aby sprawdzić jakość piku i upewnić się, że nie zawiera fałszywych izotopów. Piki izotopowe, które różnią się kształtem i/lub czasem retencji, są prawdopodobnie fałszywe.
  2. W przypadku próbek znakowanych izotopowo należy obliczyć frakcje izotopomeru masowego (MI), dzieląc powierzchnię piku każdego wskaźnika MI przez całkowitą powierzchnię pików wszystkich MI.
  3. Obliczyć oznakowane frakcje węgla/azotu, wzbogacenie odpowiednio 13C i 15N, jako
    figure-protocol-1
    gdzie n jest całkowitą liczbą atomów węgla (lub azotów, odpowiednio) w metabolicie, a MIx jest frakcją MI x,
    UWAGA: Wszystkie obliczenia można wykonać przy użyciu języków programowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jako przykład, tutaj opisujemy eksperyment badający metabolizm komórek HeLa posortowanych według fazy cyklu komórkowego. Aby oznaczyć szeroką gamę centralnych metabolitów zarówno na węglach, jak i azotach, hodowaliśmy komórki przez 48 godzin, używając U-13C-glukozy i U-13C, 15N-glutaminy jako znaczników. Aby uzyskać bogate MID do eksperymentu walidacyjnego, wybraliśmy tutaj mieszaninę 40% U-13C-glukozy i 70% U-13 C,15N2-glu...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nasza metoda opiera się na zasadzie, że MID w metabolitach komórkowych odzwierciedlają "historię" aktywności metabolicznej komórki. Umożliwia to zbadanie aktywności metabolicznej w subpopulacji komórek, tak jak zachodziła ona w złożonej społeczności komórek, przed procedurą sortowania komórek. W przeciwieństwie do tego, obszary pików metabolitów różnią się znacznie między ekstraktami z posortowanych komórek a bezpośrednią ekstrakcją z szalki hodowlanej11. Częściowo wynika to z faktu, że różny skła...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować dr Anasowi Kamlehowi za cenną pomoc w optymalizacji metod spektrometrii mas oraz Annice von Vollenhoven za pomoc w sortowaniu komórek. Badania te były wspierane przez Szwedzką Fundację Badań Strategicznych (grant nr 1). FFL12-0220) oraz Strategiczny Program Badań nad Rakiem (IR, RN); Szwedzka Fundacja Płuco-Sercowa (CEW, HG); oraz Fundacja Mary Kay (JW, MJ).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
HBSSSigmaH6648
INFLUX (sorter inFlux v7)BD Biosciences
U-13C-GlukozaIzotopy Cambridge40762-22-9 / GLC-018
U-13C,15N2-glutaminaIzotopy CambridgeCNLM-1275-H-0,1
Metanol (JT Baker), klasa HPLCFiltryBAKR8402.2500
Ultrafree - MC - VV. Durapore PVDF 0,1 i mikro; mMilliporeUFC30VV00
Ultimate 3,000 UHPLCThermo Fisher naukowy
spektrometr masowy Q-Exactive OrbitrapThermo Fisher scientific
Merk-Sequant ZIC HILIC (150 mm x 4,6  mm, 5 i mikro; m)Merck KGaA1.50444.0001
Kolumna ochronna Merk-Sequant ZIC HILIC (20 mm x 2,1 mm)Merck KGaA
Acetonitryl Optima LC-MS, szkło bursztynoweFisher ScientificA955-212
Milli-Q wodaMilliporeProdukowane w systemie gradientowym Milli-Q
Myrsyra 99,5% Optima (kwas mrówkowy)Fisher Scientific11423423
X100 Fiolka z nakrętką 1,5 ml, 8-425 32x11,6 mm, bursztynowa, 100 sztukThermo Fisher scientific10560053
X100 Lock Skruv Vitt PTFE Opakowanie 8-425 (nakrętki)Thermo Fisher scientific12458636
ProteoMass LTQ/FT-Hybrid ESI Poz. Tryb Cal MixSigma-AldrichMSCAL5Zestaw kalibracyjny
SNAKESKIN 10K MWCO Thermo Fisher scientific88245
Mathematica v.10 Badania Wolframa
odśrodkowe VWR

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gregersen, P. K. Cell type-specific eQTLs in the human immune system. Nat. Genet. 44 (5), 478-480 (2012).
  2. Heppner, G. H. Tumor heterogeneity. Cancer Res. 44 (6), 2259-2265 (1984).
  3. Prat, A., et al. Characterization of cell lines derived from breast cancers and normal mammary tissues for the study of the intrinsic molecular subtypes. Breast Cancer Res. Treat. 142 (2), 237-255 (2013).
  4. Magistretti, P. J., Allaman, I. A Cellular Perspective on Brain Energy Metabolism and Functional Imaging. Neuron. 86 (4), 883-901 (2015).
  5. Angelini, G., et al. Antigen-presenting dendritic cells provide the reducing extracellular microenvironment required for T lymphocyte activation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 1491-1496 (2002).
  6. Koukourakis, M. I., Giatromanolaki, A., Harris, A. L., Sivridis, E. Comparison of metabolic pathways between cancer cells and stromal cells in colorectal carcinomas: A metabolic survival role for tumor-associated stroma. Cancer Res. 66 (2), 632-637 (2006).
  7. Hollenbaugh, J. A., Munger, J., Kim, B. Metabolite profiles of human immunodeficiency virus infected CD4+ T cells and macrophages using LC-MS/MS analysis. Virology. 415 (2), 153-159 (2011).
  8. Richardson, G. M., Lannigan, J., Macara, I. G. Does FACS perturb gene expression. Cytom. Part A. 87 (2), 166-175 (2015).
  9. Moussaieff, A., et al. High-resolution metabolic mapping of cell types in plant roots. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (13), E1232-E1241 (2013).
  10. Johnson, C., et al. A metabolic signature of colon cancer initiating cells. Cancer Metab. 2, 32(2014).
  11. Roci, I., et al. Metabolite Profiling and Stable Isotope Tracing in Sorted Subpopulations of Mammalian Cells. Anal. Chem. 88 (5), 2707-2713 (2016).
  12. Shapiro, H. Practical flow cytometry. , Wiley-Liss. New York. (2003).
  13. Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132 (3), 487-498 (2008).
  14. Noack, S., Wiechert, W. Quantitative metabolomics: A phantom. Trends Biotechnol. 32 (5), 238-244 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Stable Isotope TracingCell SortingMetabolite ExtractionLC HRMS AnalysisMass Isotopomer DistributionsCell Cycle SortingMock Sorted CellsMetabolic CollaborationNucleotide MetabolismFlow Cytometry

Powiązane artykuły