Method Article

Metoda pomiaru metabolizmu w posortowanych subpopulacjach złożonych zbiorowisk komórkowych za pomocą śledzenia stabilnych izotopów

DOI:

10.3791/55011

⸱

February 4th, 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, Unit of Computational Medicine, Karolinska Institutet, 2Center for Molecular Medicine, Karolinska Institutet, 3Department of Medical Biochemistry and Biophysics, Division of Physiological Chemistry 2, Karolinska Institutet, 4Department of Medicine, University of California San Diego

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł opisuje metodę badania metabolizmu komórkowego w złożonych społecznościach wielu typów komórek, wykorzystując kombinację śledzenia stabilnych izotopów, sortowania komórek w celu izolowania określonych typów komórek oraz spektrometrii mas.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Typy komórek ssaków wykazują wyspecjalizowany metabolizm i istnieje wiele dowodów na to, że różne współistniejące typy komórek angażują się we współpracę metaboliczną. Co więcej, nawet kultury jednego typu komórek mogą zawierać komórki w różnych stanach metabolicznych, takich jak komórki w stanie spoczynku lub cyklu życia. Metody pomiaru aktywności metabolicznej takich subpopulacji są cennymi narzędziami do zrozumienia metabolizmu komórkowego. Złożone populacje komórek są najczęściej rozdzielane za pomocą sortera komórek, a subpopulacje wyizolowane tą metodą mogą być analizowane metodami metabolomicznymi. Jednak problem z tym podejściem polega na tym, że procedura sortowania komórek poddaje komórki stresom, które mogą zniekształcić ich metabolizm.

Aby przezwyciężyć te problemy, doszliśmy do wniosku, że rozkłady masowych izotopomerów (MID) metabolitów z komórek hodowanych za pomocą stabilnych izotopowych składników odżywczych będą prawdopodobnie bardziej stabilne niż bezwzględne stężenia metabolitów, ponieważ MID powstają w dłuższych skalach czasowych i powinny być mniej podatne na krótkotrwałe narażenie na warunki sortowania komórek. W tym miejscu opisujemy metodę opartą na tej zasadzie, łączącą sortowanie komórek z chromatografią cieczową ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości (LC-HRMS). Procedura polega na analizie trzech rodzajów próbek: (1) ekstraktów metabolitów uzyskanych bezpośrednio z populacji złożonej; (2) ekstrakty z "pozorowanych posortowanych" komórek przepuszczonych przez urządzenie do sortowania komórek bez bramkowania żadnej określonej populacji; oraz (3) wyciągi z faktycznie posortowanych populacji. Próbne posortowane komórki są porównywane z bezpośrednią ekstrakcją w celu sprawdzenia, czy MID rzeczywiście nie są zmieniane przez samą procedurę sortowania komórek, przed analizą rzeczywistych posortowanych populacji. Pokazujemy przykładowe wyniki z komórek HeLa posortowanych według fazy cyklu komórkowego, ujawniając zmiany w metabolizmie nukleotydów.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wyższe organizmy zawierają złożone społeczności różnych typów komórek, które współpracują ze sobą, aby realizować bardziej złożone funkcje. Na przykład guzy zawierają nie tylko komórki rakowe, ale także fibroblasty, komórki tworzące naczynia krwionośne, a często nacieki komórek odpornościowych1; Krew zawiera złożoną mieszaninę kilkudziesięciu podtypów komórek odpornościowych2; A nawet hodowane linie komórkowe mogą składać się z wielu subpopulacji, takich jak podtypy luminalne i podstawowe komórek raka piersi3. Co więcej, różne typy komórek, które współistnieją, mogą wykazywać "współpracę" metaboli....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Ekstrakcja metabolitów

  1. Ekstrakcja z naczynia
    1. Hodowla komórek na 6-dołkowej płytce w trzech egzemplarzach w pożywkach hodowlanych znakowanych stabilnymi izotopami + dializowane suplementy (surowica lub inne suplementy wzrostu), aż komórki staną się zlewne w 75%.
      UWAGA: Tutaj hoduj komórki HeLa przez 48 godzin w RPMI zawierającym 40% U-13C-Glucose i 70% U-13C, 15N2-Glutaminy i 5% dializowanej FBS (płodowej surowicy bydlęcej). Dializowany FBS służy do pozbycia się metabolitów o małej masie cząsteczkowej, które mogą zanieczyścić znakowane pożywki. Zaleca się hodowlę komórek w dializowanym s....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jako przykład, tutaj opisujemy eksperyment badający metabolizm komórek HeLa posortowanych według fazy cyklu komórkowego. Aby oznaczyć szeroką gamę centralnych metabolitów zarówno na węglach, jak i azotach, hodowaliśmy komórki przez 48 godzin, używając U-13C-glukozy i U-13C, 15N-glutaminy jako znaczników. Aby uzyskać bogate MID do eksperymentu walidacyjnego, wybraliśmy tutaj mieszaninę 40% U-13C-glukozy i 70% U-13 C,15N2-glu.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nasza metoda opiera się na zasadzie, że MID w metabolitach komórkowych odzwierciedlają "historię" aktywności metabolicznej komórki. Umożliwia to zbadanie aktywności metabolicznej w subpopulacji komórek, tak jak zachodziła ona w złożonej społeczności komórek, przed procedurą sortowania komórek. W przeciwieństwie do tego, obszary pików metabolitów różnią się znacznie między ekstraktami z posortowanych komórek a bezpośrednią ekstrakcją z szalki hodowlanej11. Częściowo wynika to z faktu, że różny skła.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować dr Anasowi Kamlehowi za cenną pomoc w optymalizacji metod spektrometrii mas oraz Annice von Vollenhoven za pomoc w sortowaniu komórek. Badania te były wspierane przez Szwedzką Fundację Badań Strategicznych (grant nr 1). FFL12-0220) oraz Strategiczny Program Badań nad Rakiem (IR, RN); Szwedzka Fundacja Płuco-Sercowa (CEW, HG); oraz Fundacja Mary Kay (JW, MJ).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
HBSSSigmaH6648
INFLUX (sorter inFlux v7)BD Biosciences
U-13C-GlukozaIzotopy Cambridge40762-22-9 / GLC-018
U-13C,15N2-glutaminaIzotopy CambridgeCNLM-1275-H-0,1
Metanol (JT Baker), klasa HPLCFiltryBAKR8402.2500
Ultrafree - MC - VV. Durapore PVDF 0,1 i mikro; mMilliporeUFC30VV00
Ultimate 3,000 UHPLCThermo Fisher naukowy
spektrometr masowy Q-Exactive OrbitrapThermo Fisher scientific
Merk-Sequant ZIC HILIC (150 mm x 4,6  mm, 5 i mikro; m)Merck KGaA1.50444.0001
Kolumna ochronna Merk-Sequant ZIC HILIC (20 mm x 2,1 mm)Merck KGaA
Acetonitryl Optima LC-MS, szkło bursztynoweFisher ScientificA955-212
Milli-Q wodaMilliporeProdukowane w systemie gradientowym Milli-Q
Myrsyra 99,5% Optima (kwas mrówkowy)Fisher Scientific11423423
X100 Fiolka z nakrętką 1,5 ml, 8-425 32x11,6 mm, bursztynowa, 100 sztukThermo Fisher scientific10560053
X100 Lock Skruv Vitt PTFE Opakowanie 8-425 (nakrętki)Thermo Fisher scientific12458636
ProteoMass LTQ/FT-Hybrid ESI Poz. Tryb Cal MixSigma-AldrichMSCAL5Zestaw kalibracyjny
SNAKESKIN 10K MWCO Thermo Fisher scientific88245
Mathematica v.10 Badania Wolframa
odśrodkowe VWR

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gregersen, P. K. Cell type-specific eQTLs in the human immune system. Nat. Genet. 44 (5), 478-480 (2012).
  2. Heppner, G. H. Tumor heterogeneity. Cancer Res. 44 (6), 2259-2265 (1984).
  3. Prat, A., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Stable Isotope TracingCell SortingMetabolite ExtractionLC HRMS AnalysisMass Isotopomer DistributionsCell Cycle SortingMock Sorted CellsMetabolic CollaborationNucleotide MetabolismFlow Cytometry

Related Articles