Metoda pomiaru metabolizmu w posortowanych subpopulacjach złożonych zbiorowisk komórkowych za pomocą śledzenia stabilnych izotopów

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje metodę badania metabolizmu komórkowego w złożonych społecznościach wielu typów komórek, wykorzystując kombinację śledzenia stabilnych izotopów, sortowania komórek w celu izolowania określonych typów komórek oraz spektrometrii mas.

Streszczenie

Typy komórek ssaków wykazują wyspecjalizowany metabolizm i istnieje wiele dowodów na to, że różne współistniejące typy komórek angażują się we współpracę metaboliczną. Co więcej, nawet kultury jednego typu komórek mogą zawierać komórki w różnych stanach metabolicznych, takich jak komórki w stanie spoczynku lub cyklu życia. Metody pomiaru aktywności metabolicznej takich subpopulacji są cennymi narzędziami do zrozumienia metabolizmu komórkowego. Złożone populacje komórek są najczęściej rozdzielane za pomocą sortera komórek, a subpopulacje wyizolowane tą metodą mogą być analizowane metodami metabolomicznymi. Jednak problem z tym podejściem polega na tym, że procedura sortowania komórek poddaje komórki stresom, które mogą zniekształcić ich metabolizm.

Aby przezwyciężyć te problemy, doszliśmy do wniosku, że rozkłady masowych izotopomerów (MID) metabolitów z komórek hodowanych za pomocą stabilnych izotopowych składników odżywczych będą prawdopodobnie bardziej stabilne niż bezwzględne stężenia metabolitów, ponieważ MID powstają w dłuższych skalach czasowych i powinny być mniej podatne na krótkotrwałe narażenie na warunki sortowania komórek. W tym miejscu opisujemy metodę opartą na tej zasadzie, łączącą sortowanie komórek z chromatografią cieczową ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości (LC-HRMS). Procedura polega na analizie trzech rodzajów próbek: (1) ekstraktów metabolitów uzyskanych bezpośrednio z populacji złożonej; (2) ekstrakty z "pozorowanych posortowanych" komórek przepuszczonych przez urządzenie do sortowania komórek bez bramkowania żadnej określonej populacji; oraz (3) wyciągi z faktycznie posortowanych populacji. Próbne posortowane komórki są porównywane z bezpośrednią ekstrakcją w celu sprawdzenia, czy MID rzeczywiście nie są zmieniane przez samą procedurę sortowania komórek, przed analizą rzeczywistych posortowanych populacji. Pokazujemy przykładowe wyniki z komórek HeLa posortowanych według fazy cyklu komórkowego, ujawniając zmiany w metabolizmie nukleotydów.

Wprowadzenie

Wyższe organizmy zawierają złożone społeczności różnych typów komórek, które współpracują ze sobą, aby realizować bardziej złożone funkcje. Na przykład guzy zawierają nie tylko komórki rakowe, ale także fibroblasty, komórki tworzące naczynia krwionośne, a często nacieki komórek odpornościowych¹; Krew zawiera złożoną mieszaninę kilkudziesięciu podtypów komórek odpornościowych2; A nawet hodowane linie komórkowe mogą składać się z wielu subpopulacji, takich jak podtypy luminalne i podstawowe komórek raka piersi³. Co więcej, różne typy komórek, które współistnieją, mogą wykazywać "współpracę" metaboliczną. Na przykład uważa się, że w mózgu astrocyty przekształcają glukozę w mleczan, który jest następnie "podawany" neuronom utleniającym ten substrat⁴; Limfocyty T są w niektórych kontekstach zależne od sąsiednich komórek dendrytycznych jako źródła cysteiny⁵; a komórki rakowe mogą współpracować z powiązanymi fibroblastami w nowotworach⁶. Aby zrozumieć zachowanie metaboliczne takich systemów, konieczne jest oddzielenie i zmierzenie aktywności metabolicznej różnych obecnych typów komórek.

Zdecydowanie najczęściej używaną metodą rozdzielania typów komórek jest sortowanie komórek aktywowane fluorescencją. Metoda ta ma szerokie zastosowanie, pod warunkiem, że typ komórki lub stan zainteresowania może być "znakowany" za pomocą przeciwciał fluorescencyjnych, ekspresji zmodyfikowanych białek fluorescencyjnych lub innych barwników. Jedną z opcji jest początkowe rozdzielenie typów komórek za pomocą sortera komórek, ponowne wyhodowanie poszczególnych uzyskanych typów komórek, a następnie przeprowadzenie badań metabolizmu tych kultur⁷. Jest to jednak możliwe tylko wtedy, gdy typ lub fenotyp komórki jest stabilny w warunkach hodowli i nie może uchwycić przejściowych zachowań, takich jak stany cyklu komórkowego, ani współpracy metabolicznej w kokulturach. W takich przypadkach metabolizm musi być mierzony bezpośrednio na posortowanych komórkach. Jest to trudne, ponieważ procedura sortowania komórek poddaje komórki stresom, które mogą zniekształcić ich metabolizm⁸, a wiemy tylko o kilku badaniach wykorzystujących to podejście^9,10. W szczególności odkryliśmy, że główne metabolity, takie jak aminokwasy, mogą wyciekać z komórek przechowywanych w buforze do sortowania komórek, tak że pomiary bezwzględnej obfitości metabolitów nie są już wiarygodne¹¹ (chociaż względne porównanie między posortowanymi frakcjami może być nadal cenne).

Aby obejść te problemy, przed sortowaniem oznaczamy komórki stabilnymi izotopami i skupiamy się na MIDach w metabolitach komórkowych, a nie na obfitości metabolitów. Ponieważ MID powstają w dłuższych skalach czasowych, krótkoterminowe narażenie na warunki sortowania powinno mieć na nie mniejszy wpływ. Określamy ilościowo MID za pomocą spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości z pełnym skanowaniem, która jest wystarczająco czuła, aby dostarczyć danych na temat setek metabolitów, zaczynając od około 500 000 posortowanych komórek, co wymaga około 30-60 minut czasu sortowania komórek. Porównuje się kontrolę "pozorowaną sortowaną" (komórki przeszły przez przyrząd do sortowania komórek bez bramkowania żadnej określonej populacji) a ekstrakcją metabolitów bezpośrednio z szalki hodowlanej w celu zapewnienia, że obserwowane MID są reprezentatywne dla tych w oryginalnej hodowli. W zależności od wyboru znaczników stabilnych izotopów, za pomocą tej metody można badać różne szlaki metaboliczne.

Protokół

1. Ekstrakcja metabolitów

1. Ekstrakcja z naczynia hodowlanego
   1. Hodować komórki w płytce 6-dołkowej w trzech powtórzeniach w pożywce hodowlanej znakowanej stabilnymi izotopami + dializowanej suplementacji (surowica lub inne suplementy wzrostu), aż komórki osiągną 75% konfluencji.
      UWAGA: W tym przypadku hodowano komórki HeLa przez 48 h w pożywce RPMI zawierającej 40% U-¹³C-glukozy, 70% U-¹³C, ¹⁵N2-glutaminy oraz 5% dializowanej FBS (płodowej surowicy bydlęcej). Dializowaną FBS stosuje się w celu usunięcia metabolitów o niskiej masie cząsteczkowej, które mogłyby zanieczyścić pożywkę znakowaną. Zaleca się hodowanie komórek z dializowanymi suplementami przed właściwym eksperymentem, aby upewnić się, że komórki rosną prawidłowo w danej pożywce. Suplementy dializuje się w 0,15 M roztworze NaCl przez noc, używając membrany dializacyjnej typu „snake skin”.
   2. W dniu ekstrakcji usunąć pożywkę hodowlaną, przepłukać dołki dwukrotnie 500 µL zimnego HBSS, a następnie go odessać.
      UWAGA: W tym przypadku należy użyć HBSS zawierającego 40% U-¹³C-glukozy, ponieważ znajduje się ona również w pożywce hodowlanej.
   3. Dodać 600 µL 100% metanolu uprzednio schłodzonego na suchym lodzie.
   4. Przenieść naczynie na suchy lód i zebrać materiał komórkowy za pomocą skrobaka do komórek.
   5. Ostrożnie przenieść pipetą ekstrakty komórkowe do probówki do mikrocentryfugi i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu analizy spektrometrią mas.
2. Ekstrakcja z komórek poddanych pozornej sortowaniu (mock sorted)
   1. Hodować komórki w szalce 100 mm w trzech powtórzeniach w pożywce hodowlanej znakowanej stabilnymi izotopami + dializowanej suplementacji.
      UWAGA: W tym przypadku hodowano komórki HeLa przez 48 h w szalce 100 mm, ponieważ do uzyskania 500 000 posortowanych komórek potrzebna była duża liczba komórek (~4 x 10⁶). Taka liczba ekstraktów z komórek HeLa była niezbędna do uzyskania dokładnych pomiarów metabolitów. Stosowano pożywkę RPMI zawierającą 40% U-¹³C-glukozy, 70% U-¹³C, ¹⁵N2-glutaminy oraz 5% dializowanej FBS.
   2. W dniu ekstrakcji usunąć pożywkę hodowlaną, przepłukać dołki 1,5 mL ciepłego HBSS, a następnie go odessać.
   3. Odłączyć komórki, dodając 1,5 mL trypsyny/EDTA na 4 min w temperaturze 37 °C. Kolejne kroki należy wykonywać w temperaturze 4 °C lub w lodzie.
   4. Dezaktywować trypsynę, dodając 3 mL lodowatego HBSS (zrównoważonego roztworu soli Hanksa) + dializowanej suplementacji.
   5. Zebrać komórki do probówki 15 mL i wirować przy 750 x g przez 3 min.
   6. Resuspendować osad w HBSS + dializowanej suplementacji + 1 mM EDTA do stężenia 1-2 x 10⁶ komórek/mL, przefiltrować przez sitka komórkowe 40 µm w celu uzyskania pojedynczych komórek i przenieść do probówki 5 mL.
   7. Posortować komórki za pomocą sortera komórkowego, bramkując wyłącznie singlety, a następnie wirować posortowane komórki przy 750 x g przez 3 min w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: W tym przypadku sortowano komórki HeLa z prędkością 1 000 zdarzeń/s, przy ciśnieniu urządzenia 27 psi i przy użyciu dyszy 100 µm. Komórki HeLa są duże, dlatego powinny być sortowane przy niskiej częstotliwości zdarzeń i z użyciem dużej dyszy, aby uzyskać jak najbardziej nienaruszony osad. Przez cały czas sortowania komórki należy utrzymywać w blokach chłodzących, aby ograniczyć metabolizm. Szczegółowy opis procedury sortowania przedstawiono wcześniej¹².
   8. Usunąć nadsącz i resuspendować osad w 50 µL lodowatej dH₂O, aby uzyskać jednorodny osad przed dodaniem metanolu. Bezpośrednie dodanie zimnego metanolu do osadu powoduje powstanie zwartego grudkowatego osadu, który jest trudny do resuspendowania.
   9. Wyekstrahować metabolity, dodając 540 µL metanolu przechowywanego na suchym lodzie, i przechowywać ekstrakty w temperaturze -80 °C do czasu analizy chromatografią cieczową z wysokorozdzielczą spektrometrią mas (LC-HRMS).
3. Ekstrakcja z komórek posortowanych według cyklu komórkowego
   1. Hodować komórki w szalce 100 mm w trzech powtórzeniach w pożywce hodowlanej + dializowanej suplementacji.
      UWAGA: W tym przypadku hodowano komórki HeLa zawierające sondę Geminin Fucci Green (mAG1-hGem)¹³, która umożliwia sortowanie komórek w fazie G1 (negatywne) i SG2M (pozytywne). Komórki można hodować w pożywce do śledzenia stabilnych izotopów przez wymagany czas. Tutaj hodowano je przez 46 h w pożywce nieznakowanej, a następnie 2 h przed rozpoczęciem sortowania zmieniono pożywkę na RPMI zawierającą 40% U-¹³C-glukozy i 70% U-¹³C, ¹⁵N2-glutaminy. Zastosowano to w celu umożliwienia badania faz cyklu komórkowego, co wymaga krótkiego znakowania pulsacyjnego.
   2. W dniu ekstrakcji usunąć pożywkę hodowlaną, przepłukać dołki 1,5 mL ciepłego HBSS, a następnie go odessać.
   3. Odłączyć komórki, dodając 1,5 mL trypsyny/EDTA na 4 min w temperaturze 37 °C. Kolejne kroki należy wykonywać w temperaturze 4 °C lub w lodzie.
   4. Dezaktywować trypsynę, dodając 3 mL lodowatego HBSS + dializowanej suplementacji.
   5. Zebrać komórki do probówki 15 mL i wirować przy 750 x g przez 3 min.
   6. Resuspendować osad w HBSS + dializowanej suplementacji + 1 mM EDTA do stężenia 1-2 x 10⁶ komórek/mL, przefiltrować przez sitka komórkowe 40 µm w celu uzyskania pojedynczych komórek i przenieść do probówki 5 mL.
   7. Posortować komórki za pomocą sortera komórkowego, odrzucając debris i dublety, a następnie bramkując na wybrany marker komórkowy; posortowane komórki wirować przy 750 x g przez 3 min w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: W tym przypadku sortowano komórki HeLa z prędkością 1 000 zdarzeń/s, przy ciśnieniu urządzenia 27 psi i przy użyciu dyszy 100 µm. Przez cały czas sortowania komórki należy utrzymywać w blokach chłodzących, aby obniżyć tempo metabolizmu.
   8. Usunąć nadsącz i resuspendować osad w 50 µL lodowatej dH₂O, aby uzyskać jednorodny osad przed dodaniem metanolu. Bezpośrednie dodanie zimnego metanolu do osadu powoduje powstanie zwartego grudkowatego osadu, który jest trudny do resuspendowania.
   9. Wyekstrahować metabolity, dodając 540 µL metanolu przechowywanego na suchym lodzie, i przechowywać ekstrakty w temperaturze -80 °C do czasu analizy LC-HRMS.

2. Analiza spektrometrią mas

Uwaga: W tym miejscu opisujemy protokół analizy ekstraktów komórkowych w systemie LC-HRMS. Do analizy ekstraktów komórkowych można zastosować dowolne metody metabolomiczne. Analiza pełnego skanu (full scan) może być przydatna do wykrywania szerokiego zakresu metabolitów.

1. skalibrować instrument, używając referencyjnej mieszaniny kalibracyjnej do spektrometrii mas.
2. rozmrozić ekstrakty komórkowe na lodzie przez 30 min i wymieszać w wortexie przez 15 s.
3. przenieść 100 µL ekstraktu komórkowego do filtra wirówkowego i wirować przez 10 min przy 13,000 x g w temperaturze 4 °C.
4. wstrzyknąć 12.5 µL filtratu do systemu LC-HRMS.
5. rozdzielić metabolity przy użyciu kolumny do zwitterionowej chromatografii cieczowej z oddziaływaniem hydrofilowym (ZIC-HILIC) (150 mm x 4.6 mm, wielkość cząstek 5 µm) wyposażonej w kolumnę guardingową ZIC-HILIC (20 mm × 2.1 mm), stosując elucję gradientową z użyciem 0.1% kwasu mrówkowego w wodzie (rozpuszczalnik A) i acetonitrylu (rozpuszczalnik B). Rozpocząć elucję gradientową od 20% rozpuszczalnika A i zwiększać do 80% w ciągu 17 min. Utrzymać ten procent przez 4 min przy przepływie 400 µL min^-1, temperaturze kolumny 23 °C oraz temperaturze tacy z próbkami 4 °C.
6. do detekcji metabolitów użyć instrumentu sprzężonego z rozdzielaniem chromatograficznym, jako źródła jonizacji zastosować podgrzewany rozpylacz elektrosprayowy (H-ESI II) w trybie dodatnim i ujemnym oraz tryb akwizycji full scan przy rozdzielczości masy 70,000 Full Width Half Maximum (FWHM) (m/z 200).
7. użyć azotu (czystość >99.995%) jako gazu osłonowego i pomocniczego przy przepływach odpowiednio 45 i 10 a.u. (jednostki umowne), ustawić temperaturę waporyzatora na 350 °C oraz napięcie elektrosprayowe na 4 kV w trybie dodatnim i -3.5 kV w trybie ujemnym.

3. Analiza danych

1. Wybierz grupę metabolitów, dla których dostępne są standardy i które wykazują piki dobrej jakości w próbkach. Piki dobrej jakości charakteryzują się wysokim stosunkiem sygnału do szumu. Ważne jest zweryfikowanie jakości pików i upewnienie się, że nie uwzględniono fałszywych izotopów. Piki izotopowe, które różnią się kształtem i/lub czasem retencji, są prawdopodobnie fałszywe.
2. Dla próbek znakowanych izotopowo oblicz frakcje izotopomerów masy (MI), dzieląc pole piku każdego MI przez sumę pól pików wszystkich MI.
3. Oblicz frakcje znakowanego węgla/azotu, odpowiednio wzbogacenie w ¹³C i ¹⁵N, zgodnie z wzorem:
   
   gdzie n to całkowita liczba atomów węgla (lub odpowiednio azotu) w metabolicie, a MIx to frakcja MI dla x.
   UWAGA: Wszystkie obliczenia można przeprowadzić przy użyciu języków programowania.

Wyniki

Jako przykład opisujemy tutaj eksperyment badający metabolizm komórek HeLa posortowanych zgodnie z fazą cyklu komórkowego. Aby oznakować szeroki zakres głównych metabolitów zarówno w atomach węgla, jak i azotu, hodowaliśmy komórki przez 48 h, wykorzystując jako znaczniki U-¹³C-glukozę oraz U-¹³C, ¹⁵N-glutaminę. W celu uzyskania bogatych rozkładów MID dla eksperymentu walidacyjnego, wybraliśmy tutaj mieszaninę 40% U-¹³C-glukozy i 70% U-¹³

Dyskusja

Nasza metoda opiera się na zasadzie, że MID w metabolitach komórkowych odzwierciedlają "historię" aktywności metabolicznej komórki. Umożliwia to zbadanie aktywności metabolicznej w subpopulacji komórek, tak jak zachodziła ona w złożonej społeczności komórek, przed procedurą sortowania komórek. W przeciwieństwie do tego, obszary pików metabolitów różnią się znacznie między ekstraktami z posortowanych komórek a bezpośrednią ekstrakcją z szalki hodowlanej¹¹. Częściowo wynika to z faktu, że różny skła...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
HBSS	Sigma	H6648
INFLUX (sorter inFlux v7)	BD Biosciences
U-13C-Glukoza	Izotopy Cambridge	40762-22-9 / GLC-018
U-13C,15N2-glutamina	Izotopy Cambridge	CNLM-1275-H-0,1
Metanol (JT Baker), klasa HPLC	Filtry	BAKR8402.2500
Ultrafree - MC - VV. Durapore PVDF 0,1 i mikro; m	Millipore	UFC30VV00
Ultimate 3,000 UHPLC	Thermo Fisher naukowy
spektrometr masowy Q-Exactive Orbitrap	Thermo Fisher scientific
Merk-Sequant ZIC HILIC (150 mm x 4,6  mm, 5 i mikro; m)	Merck KGaA	1.50444.0001
Kolumna ochronna Merk-Sequant ZIC HILIC (20 mm x 2,1 mm)	Merck KGaA
Acetonitryl Optima LC-MS, szkło bursztynowe	Fisher Scientific	A955-212
Milli-Q woda	Millipore		Produkowane w systemie gradientowym Milli-Q
Myrsyra 99,5% Optima (kwas mrówkowy)	Fisher Scientific	11423423
X100 Fiolka z nakrętką 1,5 ml, 8-425 32x11,6 mm, bursztynowa, 100 sztuk	Thermo Fisher scientific	10560053
X100 Lock Skruv Vitt PTFE Opakowanie 8-425 (nakrętki)	Thermo Fisher scientific	12458636
ProteoMass LTQ/FT-Hybrid ESI Poz. Tryb Cal Mix	Sigma-Aldrich	MSCAL5	Zestaw kalibracyjny
SNAKESKIN 10K MWCO	Thermo Fisher scientific	88245
Mathematica v.10	Badania Wolframa

odśrodkowe VWR