Lewitacja magnetyczna w połączeniu z przenośnym obrazowaniem i analizą w diagnostyce chorób

Tutaj prezentujemy platformę technologiczną i technikę, która wykorzystuje lewitację magnetyczną w połączeniu z automatycznym obrazowaniem i analizą do analizy rozkładu gęstości komórek pacjenta jako wskaźnika choroby. To wszechstronne podejście do analizy cytometrycznej opartej na gęstości może być ostatecznie zastosowane w diagnostyce wielu chorób. Jednak, aby była kompatybilna z testami i stosowaniem w miejscu opieki nad pacjentem w krajach rozwijających się, technika ta musi spełniać wymagania dotyczące niskich kosztów, przenośności i użyteczności. Urządzenie i materiały eksploatacyjne muszą być łatwo dostępne przy niskich kosztach. Przygotowanie próbki musi być proste, analiza powinna być zautomatyzowana z minimalnymi wymaganiami dotyczącymi wprowadzania danych przez użytkownika lub interpretacji, a wyniki powinny być szybko zwracane. Co więcej, urządzenie musi być kompaktowe i przenośne, aby było przydatne w warunkach klinicznych, a także w krajach rozwijających się. W związku z tym opracowaliśmy urządzenie i metodę wykorzystania lewitacji magnetycznej w technologii kompatybilnej z przyłóżkowym traktowaniem poprzez sprzężenie zautomatyzowanego obrazowania i analizy obrazu w celu uzyskania wyników dotyczących rozkładu gęstości populacji komórek pacjenta.

Technologie przyłóżkowe oferują znaczną przewagę nad obecnymi procedurami badań klinicznych. Obecnie dostępna technologia jest zbyt droga, aby mógł być posiadany przez lekarza, lub zbyt skomplikowana, aby mógł być wykonywany przez personel medyczny. Wiele z tych procedur wymaga pracochłonnych protokołów, które muszą być wykonane przez przeszkolonego technika. Z tych powodów próbki pacjentów, takie jak krew lub mocz, są zazwyczaj pobierane w gabinecie lekarskim, a następnie przekazywane do zdalnego, scentralizowanego laboratorium testowego w celu przeprowadzenia badań klinicznych, które mogą potrwać kilka dni, zanim lekarz otrzyma wyniki testu. W niektórych przypadkach może to powodować opóźnienia lub komplikacje w przebiegu leczenia, co sprawia, że badanie to jest bardzo kosztowne i nieefektywne (powodując obciążenie finansowe dla płatników ubezpieczeń), a ponadto sprawia, że wiele metod diagnostycznych jest niedostępnych w krajach o niskich zasobach i rozwijających się.

Tutaj prezentujemy technikę lewitacji magnetycznej połączoną z automatycznym obrazowaniem i analizą zarówno w urządzeniu z wbudowanym obrazowaniem i przetwarzaniem (Rysunek 1), jak i w urządzeniu kompatybilnym ze smartfonem (Rysunek 2). Te urządzenia oparte na lewitacji magnetycznej reprezentują szeroko stosowaną technologię platformową, która może być stosowana w wielu różnych zastosowaniach medycznych. Podejście oparte na lewitacji magnetycznej opiera się na równowadze między dwiema siłami: siłą magnetyczną i siłą wyporu^1,2,3. Kiedy cząstka jest zawieszona w ośrodku paramagnetycznym i wprowadzona w pole magnetyczne generowane przez dwa magnesy o podobnych biegunach skierowanych do siebie, siła magnetyczna działa na cząstkę w kierunku linii środkowej między dwoma magnesami. Siła wyporu jest spowodowana względną gęstością cząstki w porównaniu z ośrodkiem zawieszającym i jest skierowana w górę w przypadku cząstek o mniejszej gęstości niż ośrodek i w dół w przypadku cząstek gęstszych niż otaczający ośrodek. W oparciu o te dwie siły, cząstki osiągną pozycję równowagi lewitacji w polu, która równoważy te dwie siły; Pozycja ta jest bezpośrednio związana z gęstością cząstki, przy czym gęstsze cząstki lewitują niżej w polu niż cząstki o mniejszej gęstości. Moduł obrazowania, albo wbudowana kamera w smartfonie^4,5,6 lub niezależne komponenty optyczne wyposażone w soczewkę powiększającą7^,8, są używane do wizualizacji pozycji cząstek. Przetwarzanie obrazu, za pomocą aplikacji na smartfony^4,5,6 lub wbudowanej jednostki przetwarzającej^7,8, następnie przetwarza przechwycone obrazy w celu ilościowego określenia rozkładu przestrzennego, a tym samym rozkładu gęstości populacji. W celu analizy większych próbek (takich jak te, w których na mililitr przypada tylko kilka interesujących cząstek, przepływ można zintegrować bezpośrednio z urządzeniem, tak aby cząstki były lewitowane i analizowane podczas przechodzenia przez obszar obrazowania (rysunek 2).

Rysunek 1: Samodzielna platforma lewitacji magnetycznej. a) Kompaktowe urządzenie do lewitacji magnetycznej, w skład którego wchodzi moduł magnetycznego ogniskowania, elementy obrazowania (dioda elektroluminescencyjna (LED), soczewka optyczna i detektor kamery) oraz jednostka przetwarzająca z ekranem wyświetlacza. (b) Natężenie pola magnetycznego w przekroju poprzecznym obszaru między magnesami, do których wkładana jest próbka. Natężenie pola jest największe na powierzchni magnesów i zbliża się do zera na linii środkowej między nimi. (c) Cząstki, takie jak komórki, znajdujące się w polu magnetycznym doświadczają kilku sił: siły magnetycznej (F_m) w kierunku linii środkowej między magnesami, której wielkość zmienia się w zależności od położenia cząstki; siła grawitacji (F_g'), która zależy od gęstości cząstek w stosunku do gęstości ośrodka zawieszającego, oraz siła oporu (F_d) stawiająca opór ruchowi cząstek. Reprodukowane, za zgodą, z Yenilmez, et al.⁸ Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Kompatybilna ze smartfonami platforma lewitacji magnetycznej wspomaganej przepływem. lit. a-c) Widok z przodu (a), z boku (b) i z tyłu (c) urządzenia do lewitacji magnetycznej (d) Elementy składowe urządzenia obejmują: 1) moduł lewitacji magnetycznej, w tym magnesy trwałe, soczewkę powiększającą oraz diodę LED i dyfuzor światła, 2) obudowę smartfona, 3) elektronikę, w tym mikrokontroler, sterownik pompy i odbiornik Bluetooth, 4) uchwyt mikropompy, 5) regulowany otwór, 6) uchwyt rurki odpływowej, 7) uchwyt baterii, 8) uchwyt na próbkę, 9) dwufunkcyjny stojak i pokrywa. (e) Schemat przepływu, pokazujący pompowanie próbki przez pole magnetyczne. (f) Przekrój poprzeczny modułu lewitacji magnetycznej, pokazujący jak cząstki o różnej gęstości będą się ustawiać w miarę pompowania przez pole; mniej gęste cząstki, takie jak cząstka 1, będą równoważyć się na wyższej wysokości lewitacji niż gęstsze cząstki, takie jak cząstka 2. Reprodukowane, za zgodą, z Amin, et al.¹ Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Minimalne wymagania dotyczące użycia dowolnej próbki do analizy rozkładu gęstości w tym systemie obejmują możliwość uzyskania zawiesiny komórek lub cząstek większych niż około 5 μm i mniejszych niż około 250 μm (do obrazowania i przetwarzania obrazu) oraz jej kompatybilność z mieszaniem w roztworze roztworu paramagnetycznego, takiego jak używany tutaj gadobutrol. Do diagnostyki chorób kompatybilne zastosowania obejmują te, w których (i) komórki będące przedmiotem zainteresowania mają z natury zmienioną gęstość, gdy są nosicielami choroby, w porównaniu ze zdrowymi osobami z grupy kontrolnej, (ii) zmiana gęstości może być wywołana w komórce przez dodanie odczynnika lub innego alternatywnego leczenia przez krótki czas inkubacji, lub (iii) różne typy komórek są identyfikowane w jednej próbce i z natury (lub poprzez pewne leczenie) mają unikalne charakterystyczne gęstości.

Niedokrwistość sierpowatokrwinkowa to zaburzenie genetyczne powodujące wytwarzanie zmutowanej formy hemoglobiny, HbS, w czerwonych krwinkach (RBC) danej osoby, co może powodować sporadyczne zdarzenia wazo-okluzyjne i przewlekłą niedokrwistość hemolityczną⁹. Diagnozuje się go za pomocą ogniskowania izoelektrycznego hemoglobiny, frakcjonowania wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) lub elektroforezy hemoglobiny, które są bardzo dokładne, ale muszą być wykonane w laboratorium klinicznym, ponieważ są niezgodne z warunkami przyłóżkowymi. Zaproponowano testy rozpuszczalności i testy papierowe na niedokrwistość sierpowatokrwinkową, ale generalnie wymagają one subiektywnej interpretacji użytkownika i testów potwierdzających. W tym przypadku stosujemy podejście oparte na gęstości do identyfikacji sierpowatych krwinek czerwonych, które osiągają większą gęstość niż erytrocyty od osób bez niedokrwistości sierpowatokrwinkowej. Mechanizm ten obejmuje polimeryzację zmutowanej formy hemoglobiny, HbS, która powoduje odwodnienie RBC w krwinkach czerwonych z niedokrwistością sierpowatokrwinkową w warunkach odtlenienia^10,11,12,13.

To podejście oparte na gęstości może być również zastosowane do oddzielnych komórek różnych typów na podstawie gęstości: białych krwinek (WBC) i krwinek czerwonych⁷. WBC są ogólnie odpowiedzialne za zwalczanie infekcji w organizmie. Cytometria WBC może być używana do ilościowego określania liczby tych komórek we krwi i służy jako przydatne narzędzie diagnostyczne. Liczba WBC wyższa niż normalnie (ogólnie uważana za większą niż 11 000 komórek na μl) może wskazywać na infekcję, zaburzenia układu odpornościowego lub białaczkę. Liczba krwinek białych krwi poniżej normalnego zakresu (około 3500 komórek na μl) może być spowodowana zaburzeniami autoimmunologicznymi lub stanami, które uszkadzają szpik kostny. W przeciwieństwie do alternatywnych technologii, przedstawiony tutaj proces nie opiera się na lizie krwinek czerwonych ani barwieniu w celu identyfikacji białych krwinek. Ten test oparty na komórkach wykorzystuje unikalną naturalną gęstość dwóch typów komórek do przeprowadzenia separacji, ponieważ stwierdzono, że gęstość populacji WBC jest niższa niż w populacji RBC, jak obliczono wcześniej za pomocą wirowania w gradiacji gradientu gęstości^1,5,8.

W porównaniu do alternatywnych testów w odległych lokalizacjach, ten test jest szybki, z prostym przygotowaniem próbki (Rysunek 3), separacją komórek w urządzeniu w ciągu 10 - 15 minut oraz automatycznym obrazowaniem i analizą, które wymagają mniej niż 1 minut. W ten sposób urządzenie może szybko zwracać wyniki, aby lepiej informować o decyzjach medycznych, umożliwiać natychmiastowe podjęcie leczenia w celu złagodzenia bólu fizycznego i psychicznego oraz zmniejszyć ryzyko powikłań związanych z opóźnieniem opieki medycznej. Technika ta może być wykonywana na miejscu zarówno w warunkach klinicznych, jak i dzięki prostemu przygotowaniu próbki oraz zautomatyzowanemu obrazowaniu i analizie, które zwraca wynik przy minimalnym wkładzie użytkownika lub interpretacji. Ze względu na zastosowanie prostego podejścia wykorzystującego magnesy trwałe do analizy próbki oraz użycie smartfona lub prostych komponentów elektrycznych do obrazowania i przetwarzania obrazu, zarówno urządzenie, jak i koszty testu są minimalne w porównaniu z niektórymi zaawansowanymi procedurami testowymi.

Oświadczenie etyczne: Wszystkie procedury z udziałem próbek ludzkiej krwi zostały przeprowadzone zgodnie z regulacjami instytucjonalnymi. Wszystkie protokoły zostały zweryfikowane i zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną. Wszyscy uczestnicy wyrazili świadomą zgodę.

1. Przygotowanie próbki do diagnozy niedokrwistości sierpowatokrwinkowej^5,8

1. Przygotuj 50 mM roztwór gadobutrolu w zrównoważonym roztworze soli Hanka (HBSS).
2. Rozpuścić 10 mM pirosiarczynu sodu w roztworze gadolinu.
   UWAGA: Pirosiarczyn sodu jest toksyczny przez drogi oddechowe i silnie działa drażniąco na skórę i tkanki. Jest to kwas po zmieszaniu z wodą. Może ulegać rozkładowi, wydzielając toksyczne opary tlenków siarki i sodu po podgrzaniu do wysokiej temperatury.
3. Pobrać próbkę krwi za pomocą opuszki palca lub wkłucia żyły.
   1. Pobrać krew za pomocą nakłuwacza z czystym, jednorazowym lancetem. Uciskaj w pobliżu miejsca przekłucia i wytrzyj powstałą kroplę krwi trzy do czterech razy przed pobraniem krwi za pomocą pipety; Należy uważać, aby nie "doić" palca poprzez ściskanie tkanki, ponieważ spowoduje to zanieczyszczenie próbki płynem tkankowym.
   2. Alternatywnie, pobierz krew za pomocą standardowych procedur nakłucia żyły¹⁴.
      UWAGA: Jeśli próbki będą przechowywane dłużej niż kilka godzin, należy pobrać krew do urządzenia próżniowego z antykoagulantem, takim jak EDTA.
4. Dodać mniej niż 1 μl krwi do 100 μl roztworu pirosiarczynu gadolinu i sodu.

2. Przygotowanie próbki do cytometrii WBC⁷

1. Pobrać próbkę krwi przez nakłucie palca lub nakłucie żyły, jak w punkcie 1.
2. Opcjonalnie: Liza erytrocytów za pomocą buforu do lizy RBC. Odpipetować 5 μl krwi do 500 μl buforu do lizy RBC i inkubować w temperaturze pokojowej przez 3 - 5 min.
   UWAGA: można to zrobić, aby potwierdzić zakres lewitacji izolowanej populacji WBC. Nie jest jednak konieczne wykonywanie tego kroku, ponieważ przedstawione tutaj wyniki pokazują, że erytrocyty lewitują w wyraźnie niższej pozycji niż WBC.
3. Rozcieńczyć krew pełną w stosunku 1:1,000 w 25 mM Gd w HBSS
   UWAGA: jeśli przeprowadzono lizę komórek, rozcieńczyć próbkę zlizowaną 9:1 próbka zlizowana: 250 mM Gd, aby uzyskać próbkę zawierającą 25 mM Gd.

3. Analiza próbek za pomocą platformy lewitacji magnetycznej^4,5,6,7,8

1. Uruchom urządzenie lewitacji magnetycznej:
   1. W przypadku urządzenia samodzielnego podłącz urządzenie, pozwól mu się włączyć i umieść na płaskiej, równej powierzchni.
   2. W przypadku wersji kompatybilnej ze smartfonem uruchom aplikację na smartfona i przesuń palcem w lewo, aby przejść do trybu przechwytywania obrazu i umieść na płaskiej, równej powierzchni.
2. Dla statycznej lewitacji magnetycznej:
   1. Załaduj przygotowaną próbkę do kwadratowej szklanej rurki mikrokapilarnej, zanurzając koniec w roztworze i pozwalając próbce wypełnić kapilar poprzez działanie kapilarne.
   2. Uszczelnij koniec uszczelniaczem w tubce, powoli wciskając jeden koniec kapilary w materiał.
   3. Włóż kapilarę między magnesy urządzenia do lewitacji magnetycznej tak, aby widoczny był tylko 1 cm rurki (patrz rysunek 3 w celu zilustrowania przygotowania próbki) .
      UWAGA: Ten krok pozostaje taki sam zarówno dla urządzenia kompatybilnego ze smartfonem, jak i samodzielnego.
   4. Odczekaj 10 minut, nie naruszając pracy urządzenia ani kapilary.
3. Do lewitacji magnetycznej wspomaganej przepływem:
   1. Załaduj próbkę do probówki z próbką.
   2. Podłączyć rurkę wlotową między pojemnikiem na próbkę a mikrokapilarą i podłączyć rurkę wylotową między mikrokapilarą a pojemnikiem na odpady.
   3. Ustaw parametry intensywności i przepływu diody LED.
4. Upewnij się, że komórki są widoczne w polu view, a następnie naciśnij przycisk przechwytywania, aby przechwycić obraz (przycisk 3 na urządzeniu autonomicznym i przycisk aparatu u dołu ekranu w aplikacji na smartfona).
   UWAGA: Jeśli do przechowywania obrazów używany jest port USB, utwórz folder o nazwie "obrazy" i włóż go do pamięci USB przed włączeniem urządzenia. Jeśli nie ma dysku, urządzenie zapisze obrazy w pamięci wewnętrznej i zostanie przesłane później.
   UWAGA: Można przechwycić i przeanalizować kilka obrazów, aby zmniejszyć ryzyko anomalii poprzez przesuwanie kapilary do środka lub na zewnątrz o około 1/2 cm między przechwytywaniem obrazu.
   UWAGA: Jeśli liczba komórek w polu view jest zbyt duża lub zbyt mała (zgodnie z wykryciem i raportem w interfejsie użytkownika), przesuń kapilarnę do środka lub na zewnątrz urządzenia lub przygotuj inną próbkę.
5. Usunąć próbkę i wyrzucić próbkę zgodnie z przepisami instytucjonalnymi lub lokalnymi. Kapilary należy utylizować jako ostre narzędzie.

Rysunek 3: Przygotowanie próbki i interfejs użytkownika. (a) Procedura przygotowania próbki polega na nakłuciu palca badanego, uformowaniu kropli krwi, przeniesieniu kropli krwi do roztworu do badania próbki, mieszaniu próbki i załadowaniu do rurki kapilarnej poprzez działanie kapilarne oraz włożeniu próbki do urządzenia lewitacji magnetycznej. (b) Te etapy przygotowania próbki są również wyświetlane na ekranie urządzenia, aby ułatwić przygotowanie próbki. (c) Urządzenie zawiera cztery przyciski: przycisk do przybliżania przykładowego obrazu w celu prawidłowego ustawienia ostrości za pomocą pokrętła regulacyjnego; przycisk do uzyskania pojedynczego pomiaru (zaimplementowano 5-sekundowe opóźnienie, aby dać użytkownikowi czas na wprowadzenie próbki); pomiar poklatkowy (6 zdjęć wykonywanych jest w odstępach 5 s); oraz przycisk do wyłączania urządzenia po użyciu. Reprodukowane, za zgodą, z Yenilmez, et al. ⁸Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Analiza obrazu^4,5,6,7,8

1. Uruchom oprogramowanie do analizy obrazu dołączone do urządzenia dla odpowiedniej próbki (rozkład komórek lub separacja typów komórek).
   UWAGA: W przypadku urządzenia autonomicznego analiza jest wykonywana automatycznie i wyświetlana w graficznym interfejsie użytkownika. W przypadku urządzenia kompatybilnego ze smartfonem, aby przeprowadzić analizę, przejdź do galerii i wybierz żądany plik wideo do analizy.
2. Obserwuj i zapisuj wyniki analizy wyświetlane na ekranie.
   UWAGA: W przypadku analizy rozmieszczenia komórek (takiej jak diagnostyka niedokrwistości sierpowatokrwinkowej) wynikiem będzie szerokość zamknięcia populacji komórek.
   UWAGA: W przypadku separacji typów komórek (takich jak identyfikacja WBC) wynikiem będzie obraz ze zidentyfikowaną populacją WBC. Aby obliczyć liczbę komórek na mikrolitr, pomnóż średnią liczbę WBC na obraz przez współczynnik 2,000. Na przykład, jeśli zaobserwowano 5 WBC, oznaczałoby to 10 000 WBC/μL. Za normalny zakres uważa się 3 500 - 11 000 WBCs/μL.
3. Powtórz analizę, przesuwając probówkę z próbką lub wyjmując ją z urządzenia na około 1/2 cm i przechwytując kolejny obraz do analizy, jak opisano powyżej.
   UWAGA: Zaleca się powtórzenie analizy 5 - 6 razy na próbkę, aby uniknąć błędów.

Do analizy rozkładu gęstości komórek, która jest techniką używaną do diagnozowania niedokrwistości sierpowatokrwinkowej, celem jest określenie szerokości rozmieszczenia populacji komórek. Komórki krwi od pacjentów bez niedokrwistości sierpowatokrwinkowej będą ograniczone do przewidywalnej szerokości. Komórki od pacjentów z niedokrwistością sierpowatokrwinkową będą rozmieszczone w szerszym regionie, z odchyleniem w dół w dystrybucji komórek (patrz rycina 4). Dla każdego konkretnego zastosowania można ustawić próg między szerokością rozkładu próbek kontrolnych a szerokością zdrowych próbek jako granicę między "zdrowymi" a "pozytywnymi dla choroby"5,8.

Ryc. 4: Przykład lewitacji magnetycznej do analizy rozkładu gęstości jako wskaźnika niedokrwistości sierpowatokrwinkowej w próbkach krwi. Po lewej stronie czerwone krwinki są dobrze zamknięte w wąskim obszarze. Po prawej stronie podzbiór czerwonych krwinek osiąga większą gęstość, a tym samym niższą wysokość lewitacji, co przekrzywia dystrybucję w dół i zwiększa szerokość zamknięcia. Podziałka = 200 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Aby przeanalizować rozkład gęstości próbki, w urządzeniu zaimplementowany jest algorytm obliczeniowy. Najpierw obliczane są gradienty intensywności pikseli wzdłuż osi pionowej i poziomej. Krawędzie magnesu i krawędzie kapilary są wykrywane jako piki w pionowych profilach gradientu pikseli. Wiadomo, że odległość między wewnętrznymi krawędziami kapilary w pikselach wynosi 0,7 mm i dlatego jest używana jako współczynnik skalowania do przeliczania odległości z pikseli na milimetry. Gradient intensywności pikseli wzdłuż osi poziomej jest największy tam, gdzie znajdują się komórki. Ten profil gradientu jest analizowany i dopasowywany do krzywej Gaussa. Wartość 4-krotność odchylenia standardowego tej krzywej jest podawana jako szerokość ograniczenia.

Wyniki na rysunku 5 pokazują szerokość zamknięcia zarówno dla próbek kontrolnych, jak i próbek niedokrwistości sierpowatokrwinkowej. W tym przypadku próbki o większej szerokości zamknięcia (ponad 50 μm) zostałyby uznane za dodatnie w kierunku niedokrwistości sierpowatokrwinkowej, a te poniżej tego progu zostałyby uznane za ujemne w kierunku choroby. Należy zauważyć, że inne metody analizy rozmieszczenia krwinek sierpowatych zostały zbadane i opisane przez Yenilmez i wsp.8

Rycina 5: Kwantyfikacja szerokości zamknięcia w diagnostyce niedokrwistości sierpowatokrwinkowej. Wyniki eksperymentalne dla szerokości kontroli zamknięcia (n = 48 obrazów u 4 osób) i niedokrwistości sierpowatokrwinkowej (n = 93 obrazy u 10 osób) krwinek czerwonych. Wyniki są statystycznie istotne według dwustronnego testu Manna-Whitneya-Wilcoxona (normalne przybliżenie, n1 = 3, n2 = 10, Z = -2,6764, p = 0,0074). Wąsy reprezentują minimalną i maksymalną szerokość zamknięcia w badanych próbkach, a gwiazdki oznaczają wartości odstające. Reprodukowane, za zgodą, z Yenilmez, et al. 8 Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Do separacji cząstek, która może być wykorzystana do identyfikacji WBC w próbkach krwi, celem jest zidentyfikowanie dwóch odrębnych populacji. Jeśli populacje mają różne zagęszczenia, będą obserwowane w różnych regionach w polu widzenia. W ten sposób jednorodne populacje dwóch lub więcej cząstek o różnych gęstościach mogą być lewitowane, a po rozdzieleniu wielokrotne populacje mogą być obserwowane na obrazie i wykrywane za pomocą algorytmu analizy obrazu4 (patrz rysunek 6).

Aby przeanalizować separację dwóch różnych typów komórek, zaimplementowany jest algorytm, który rozróżnia dwie oddzielone populacje w stanie równowagi. W podobny sposób, jak opisano w przypadku analizy niedokrwistości sierpowatokrwinkowej, do próbki dopasowane są dwa rozkłady Gaussa, a nie pojedyncza krzywa. Każdy szczyt w gradientach intensywności pikseli reprezentuje inną populację komórek. Krzywe Gaussa pasujące do tych danych podają zarówno średnią wysokość lewitacji (w stosunku do położenia dolnego magnesu) jako średnią krzywej Gaussa, jak i szerokość uwięzienia jako odchylenie standardowe krzywej7.

Rysunek 6: Przykład lewitacji magnetycznej mieszanej populacji mikrocząstek o różnych gęstościach. (a) Krzywe kalibracyjne korelujące gęstość mikrosfery z wysokością lewitacji w pięciu różnych stężeniach Gd w zakresie od 12,5 do 200 mM. Nachylenie jest największe przy najniższych stężeniach Gd, co zapewnia większą rozdzielczość (tj. wrażliwość na małe różnice gęstości). Nachylenie jest najmniejsze dla wyższych stężeń Gd, co świadczy o zwiększonym zasięgu wykrywania, ale z niższą rozdzielczością. b) Zależne od czasu rozdzielenie jednorodnych mikrosfer próbki o dwóch różnych gęstościach w ciągu dwóch minut. W stanie równowagi (po prawej) algorytm analizy obrazu wykrywa dwa odrębne pasma. Reprodukowane, za zgodą, z Yenilmez, et al.7 Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Aby zidentyfikować poszczególne typy komórek o różnych gęstościach dla danego zastosowania, zaleca się najpierw lewitować jeden typ komórek na raz, aby określić oczekiwaną wysokość lewitacji. Rycina 7a przedstawia wysokość lewitacji WBC na podstawie próbki krwi, w której erytrocyty uległy lizie. Określa to obszar uwięzienia WBC do dalszej analizy. Wyniki wskazują, że erytrocyty lewitują niżej niż WBC, a zatem WBC można odróżnić od próbek krwi na podstawie pozycji lewitacji. Objętość w danym polu widzenia wynosi 0,5 μl. W próbkach, które zostały rozcieńczone w stosunku 1:1 000, liczbę WBC/μL można obliczyć, zliczając liczbę WBC w polu widzenia i mnożąc przez współczynnik 2 0007.

Rycina 7: Cytometria WBC we krwi pełnej. (a) Lewitacja WBC z krwi po lizie RBC. Określa on zakres w jakim WBC lewitują w polu magnetycznym w 25 mM Gd. (b) Przykład liczenia WBC (WBC oznaczone niebieskimi strzałkami). Górna wkładka ramy pokazuje WBC, a dolna ramka i dolna wkładka ramy pokazują populację RBC. Reprodukowane, za zgodą, z Yenilmez, et al.7 Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy, Stephanie Knowlton i Savas Tasoglu, są założycielami i mają udziały w mBiotics, startupie pracującym nad komercjalizacją opisanej w niniejszym dokumencie platformy lewitacji magnetycznej dla rozwiązań diagnostycznych w miejscu opieki nad pacjentem. Tymczasowy patent zatytułowany "Lewitacja magnetyczna z pokładowym obrazowaniem optycznym i analizą obrazu w celu separacji, identyfikacji i pomiaru na podstawie gęstości" został złożony w sprawie UCONN nr 16-027 dotyczącej opisanej tutaj technologii.