Artykuł metodologiczny

Metoda ChIP-exo: identyfikacja interakcji białko-DNA z precyzją bliską par zasad

DOI:

10.3791/55016

⸱

23 grudnia 2016

 , 
1Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół pozwalający osiągnąć rozdzielczość oddziaływań białko-DNA w pobliżu par zasad. Uzyskuje się to poprzez traktowanie egzonukleazą fragmentów DNA selektywnie wzbogaconych przez immunoprecypitację chromatyny (ChIP-exo), a następnie sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) jest niezbędnym narzędziem w dziedzinie epigenetyki i regulacji genów, które izoluje specyficzne interakcje białko-DNA. ChIP sprzężony z sekwencjonowaniem o wysokiej przepustowości (ChIP-seq) jest powszechnie stosowany do określania lokalizacji genomowej białek, które oddziałują z chromatyną. Jednak sekwencja ChIP jest utrudniona przez stosunkowo niską rozdzielczość mapowania wynoszącą kilkaset par zasad i wysoki sygnał tła. Metoda ChIP-exo to udoskonalona wersja ChIP-seq, która znacznie poprawia zarówno rozdzielczość, jak i szum. Kluczową różnicą w metodologii ChIP-exo jest włączenie trawienia egzonukleazą lambda do procesu przygotowania biblioteki, aby skutecznie śladować lewą i prawą granicę 5' DNA w miejscu usieciowania białko-DNA. Biblioteki ChIP-exo są następnie poddawane sekwencjonowaniu o wysokiej przepustowości. Uzyskane dane można wykorzystać do zapewnienia unikalnych i ultrawysokiej rozdzielczości wglądów w funkcjonalną organizację genomu. W tym miejscu opisujemy metodę ChIP-exo, którą zoptymalizowaliśmy i usprawniliśmy dla systemów ssaków i platformy sekwencjonowania przez syntezę nowej generacji.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) to skuteczna metoda badania mechanizmów regulacji genów poprzez selektywne wzbogacanie o fragmenty DNA, które oddziałują z danym białkiem w żywych komórkach. Metody wykrywania fragmentów DNA wzbogaconych w ChIP ewoluowały wraz z rozwojem technologii, od wykrywania pojedynczego locus (standard ChIP-qPCR) przez hybrydyzację na mikromacierzach oligonukleotydowych (chip ChIP) po sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości (ChIP-seq) 1. Chociaż ChIP-seq ma szerokie zastosowanie, heterogeniczność chromatyny i niespecyficzne interakcje DNA pogorszyły jakość danych, prowadząc do wyników fałszywie dodatnich i nieprecyzyjnego mapowania. Aby obejść te ograniczenia, dr Frank Pugh opracował metodę ChIP-exo 2. Istotną cechą ChIP-exo jest to, że zawiera egzonukleazę od 5 'do 3', skutecznie śladując miejsca wiązania czynnika transkrypcyjnego. W rezultacie, metodologia ChIP-exo osiąga wyższą rozdzielczość, większy zakres dynamiczny detekcji i niższy szum tła.

Chociaż ChIP-exo jest technicznie trudniejsze do opanowania niż ChIP-seq, jest szeroko stosowane, ponieważ badania mają na celu uzyskanie unikalnych spostrzeżeń w ultra wysokiej rozdzielczości przy użyciu różnych systemów biologicznych 3-8. Rzeczywiście, ChIP-exo został z powodzeniem zastosowany do bakterii, drożdży, myszy, szczurów i ludzkich systemów komórkowych. Jako dowód słuszności, ChIP-exo został pierwotnie użyty do identyfikacji precyzyjnego motywu wiązania dla kilku czynników transkrypcyjnych drożdży 2. Technika ta została również wykorzystana u drożdży do zbadania organizacji kompleksu transkrypcji przed inicjacją oraz do rozszyfrowania struktury subnukleosomalnej różnych histonów 9,10. Niedawno wykorzystaliśmy ChIP-exo do rozwiązania sąsiednich zdarzeń wiązania TFIIB i Pol II w ludzkich promotorach i wykazaliśmy, że rozległa rozbieżna transkrypcja wynika z odrębnych kompleksów inicjacyjnych 11.

Przedstawiony tutaj przepływ pracy jest zoptymalizowany i usprawniony dla ssaków ChIP-exo (Rysunek 1). Po pierwsze, żywe komórki pierwotne lub hodowle tkankowe są traktowane formaldehydem w celu zachowania interakcji białko-DNA in vivo poprzez kowalencyjne wiązanie krzyżowe. Komórki są poddawane lizie, a chromatyna jest ścinana do fragmentów o wielkości ~ 100 - 500 par zasad. Następnie ChIP selektywnie wzbogaca się o fragmenty DNA usieciowane z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania. W tym momencie zwykle przygotowywane są biblioteki ChIP-seq, co z natury ogranicza rozdzielczość wykrywania do średniego rozmiaru fragmentu wynoszącego kilkaset par zasad. Jednak ChIP-exo pokonuje to ograniczenie, przycinając lewą i prawą granicę 5' DNA miejsca usieciowania białko-DNA za pomocą egzonukleazy lambda. Biblioteki sekwencjonowania są następnie konstruowane z DNA strawionego egzonukleazą, jak opisano poniżej. Powstałe zagnieżdżone granice 5' reprezentują ślad in vivo interakcji białko-DNA (Figura 1, krok 14) i są wykrywane przez sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości. Chociaż metodologia ChIP-exo jest bardziej złożona niż ChIP-seq, przejścia między większością etapów wymagają prostego mycia ściegów, co minimalizuje utratę próbki i zmienność eksperymentalną. Co ważne, ponieważ ChIP-exo jest udoskonaloną wersją ChIP-seq, każda próbka, która odniesie sukces z ChIP-seq, powinna również odnieść sukces z ChIP-exo.

Ślad in vivo interakcji białko-DNA z ChIP-exo daje zasadniczo odmienną strukturę danych od ChIP-seq. Chociaż typowe wywołania ChIP-seq mogą być stosowane do danych ChIP-exo, w celu uzyskania najbardziej precyzyjnych wywołań szczytowych zalecamy narzędzia bioinformatyczne zaprojektowane specjalnie z myślą o unikalnej strukturze danych ChIP-exo. Należą do nich Genetrack, GEM, MACE, Peakzilla i ExoProfiler 12-15.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uwaga: Podwójnie destylowany H2O lub odpowiednik klasy molekularnej jest zalecany dla wszystkich i mieszanin reakcyjnych.

Dzień 0: Przygotowanie materiału i zbieranie komórek

1. Przygotowanie bufora

  1. Przygotuj do lizy 1 - 3 (tabele 1 - 3) i dodaj 100 μl kompletnego inhibitora proteazy (CPI) do 50 ml każdego buforu bezpośrednio przed użyciem. Przygotować wywar CPI, rozpuszczając jedną tabletkę w 1 ml masy cząsteczkowejH2O.
  2. Przygotuj ChIP (tabele 4 - 7). Dodaj 100 μl bulionu CPI do 50 ml blokujących i RIPA. Nie dodawaj CPI do elucyjnych Tris i ChIP.

2. Wyżarzanie oligonukleotydów adaptera

Uwaga: Konkretne sekwencje oligonukleotydów można znaleźć w sekcji Dodatkowe informacje.

  1. Przygotuj mieszanki do wyżarzania adaptera (tabele 8 - 9). Wiruj, aby wymieszać i krótko zakręć rurkami, aby zebrać zawartość. Podamy 100 μl każdego roztworu do probówek o pojemności 0,5 ml.
  2. Zhybrydyzuj oligonukleotydy, uruchamiając program (Tabela 10) w Thermocyclerze.
    Wyżarzane oligonukleotydy przechowywać w temperaturze -80 °C.

3. Sieciowanie chromatyny in vivo z formaldehydem

UWAGA: Dla typowego eksperymentu ChIP, materiał wyjściowy powinien zawierać około 50 milionów komórek.

  1. Dodać świeży 37% roztwór podstawowy formaldehydu bez metanolu do przemytej hodowli komórkowej z buforem soli fizjologicznej (PBS) do końcowego stężenia 1% (v/v), dokładnie wymieszać i pozostawić w temperaturze pokojowej na 10 min.
    UWAGA: Na przykład zwykle dodajemy 1,4 ml formaldehydu bez metanolu o zawartości 37% do komórek w 50 ml PBS o temperaturze pokojowej. Unikaj również sieciowania formaldehydu w pożywce, ponieważ białka w pożywce ugaszą część formaldehydu.
  2. Reakcję sieciowania wygaszać przez dodanie 2,5 M glicyny do końcowego stężenia 125 mM. Dokładnie wymieszaj.
  3. Przenieść komórki do probówki o pojemności 50 ml na lodzie. Wirować komórki przez 5 minut w temperaturze 1 000 x g w temperaturze 4 °C. Dekantacja supernatantu.
  4. Dodać 1 ml lodowatego 1x PBS do osadu komórkowego i ponownie zawiesić przez pipetowanie. Przenieść do probówki o pojemności 1,5 ml.
  5. Wirować komórki przez 3 minuty w temperaturze 2 000 x g w temperaturze 4 °C. Aspirować supernatant.
  6. Natychmiast błyskawicznie zamrozić granulki komórek w probówkach o pojemności 1,5 ml z ciekłym azotem. Przechowywać w temperaturze -80 °C. Usieciowane ogniwa są stabilne przez czas nieokreślony w temperaturze -80 °C.

Dzień 1: Liza komórek, Sonikacja i ChIP

4. Liza komórek

UWAGA: Podczas wszystkich sekcji lizy komórek, próbki MUSZĄ być trzymane na lodzie lub w temperaturze 4 °C, aby zminimalizować odwrócenie usieciowania.

  1. Krótko rozmrozić usieciowane osady komórkowe. Dokładnie zawiesić każdą granulkę w 0,5 ml Lysis Buffer 1 i połączyć z 4,5 ml Lysis Buffer 1 w 15 ml probówce z polistyrenu.
  2. Rury skalne przez 10 minut w temperaturze 4 °C na platformie bujanej. Wirować przez 4 minuty w temperaturze 2 000 x g w temperaturze 4 °C. Dekantować nad osadem.
  3. Dokładnie zawiesić każdą osadkę w 0,5 ml Lysis Buffer 2 i dodać 4,5 ml Lysis Buffer 2 po ponownym zawieszeniu.
  4. Kołysz się przez 5 minut w temperaturze 4 °C na bujanej platformie. Wirować przez 5 minut w temperaturze 2 000 x g w temperaturze 4 °C. Zdekantować supernatant i delikatnie wklepać nadmiar w ręcznik papierowy.
  5. Dokładnie zawiesić każdą granulkę w 0,5 ml Lysis Buffer 3 i dodać 1 ml Lysis Buffer 3 po ponownym zawieszeniu. Utrzymuj lizaty jądrowe na lodzie i natychmiast przystąp do sonikacji.

5. Sonikacja lizatów jądrowych

UWAGA: Podczas wszystkich sekcji sonikacji, próbki MUSZĄ być trzymane na lodzie, aby zminimalizować odwrócenie usieciowania. Konkretny model sonikatora używany w połączeniu z poniższym protokołem można znaleźć w Tabeli Materiałów. Szczegółowe informacje na temat konkretnego zastosowania sonikatora oraz wytyczne dotyczące innych instrumentów można znaleźć w Sekcji Dodatkowe informacje.

  1. Umieść adaptery rezonansowe w 15 ml probówkach polistyrenowych zawierających ekstrakty jądrowe (metalowy pręt nie powinien dotykać ścianki rurki).
  2. Sonikuj lizaty jądrowe w lodowatej kąpieli wodnej przez 2 sesje po 15 minut z 30 sekundami włączenia/30 sekund wyłączenia przy średniej mocy. Jednorazowo należy poddać sonizacji tylko dwie probówki o pojemności 15 ml. Ustawienia te działają na szerokim zakresie linii komórkowych i pierwotnych typów komórek, ale dalsza optymalizacja może być konieczna, jeśli ścinanie chromatyny jest niekompletne.
  3. Aby sprawdzić wyniki sonikacji, przenieś 2 x 10 μl próbek z lizatu do probówek o pojemności 1,5 ml.
    1. Aby odwrócić usieciowanie, połącz pierwsze 10 μl podwielokrotności z 10 μl TE-RNazy A i 0,2 μl proteinazy K. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 min. Dodać 4 μl 6x ksylenowy barwnik DNA.
    2. Aby zachować wiązania krzyżowe, połącz drugą 10 μl podwielokrotności z 2 μl 6x ksylenowego barwnika DNA.
    3. Obie próbki należy umieścić w 1,5% żelu agarozowym pod napięciem 140 V przez około 30–45 minut, aż barwnik bromofenolowy w drabince znajdzie się w 3/4 w dół żelu.
  4. Jeśli sonikacja zakończyła się sukcesem (większość fragmentów DNA ścięta do 100 - 500 pz), przenieś sonikowane lizaty do probówek o pojemności 2 ml zawierających 150 μl 10% Triton X-100. Wirować do mieszania.
  5. Aby osadzać nierozpuszczalną chromatynę i zanieczyszczenia, należy wirować sonikowany lizat jądrowy przez 10 minut w temperaturze 20 000 x g w temperaturze 4 °C.
  6. Przenieść supernatant do nowej probówki o pojemności 2 ml. Natychmiast przejść do ChIP lub przechowywać próbki w temperaturze -80 °C przez czas nieokreślony. Ekstrakty sonikowane nie powinny być zamrażane i rozmrażane więcej niż raz.

6. Sprzężenie przeciwciała z koralikami

UWAGA: Nigdy nie wiruj ani nie zamrażaj/nie rozmrażaj kulek magnetycznych, ponieważ roztrzaskają się one i zwiększą sygnał tła.

  1. Po dokładnym wymieszaniu bulionu, podwielokrotność Y μl gluzki rozprowadzić do probówki o pojemności 1,5 ml, gdzie Y = 1,1 x 2,5 μl x (liczba próbek ChIP). Zdolność wiązania dla 2,5 μl zawiesiny perełkowej wynosi do 13 μg IgG. Przemyj zebrane kulki 3x za pomocą 1 ml buforu blokującego.
  2. Aby uzyskać bardziej spójne porcjowanie kulek po praniu, ponownie zawiesić kulki w 10-krotnej pierwotnej objętości gnojowicy (25 μl/ChIP) z buforem blokującym. Podaniec 25 μl na próbkę ChIP do probówek o pojemności 1,5 ml.
  3. Dodać 5 - 10 μg przeciwciała do odpowiedniej porcji kulek zawiesinowych. Doprowadzić końcową objętość do 250 μl za pomocą bufora blokującego. Próbki należy inkubować przez 4 godziny (alternatywnie przez noc przez 16 godzin) na platformie obrotowej w temperaturze 4 °C.
  4. Aspirowany supernatant. Aby usunąć niezwiązane lub nadmiar przeciwciała, przemyj kulki raz 1 ml buforu blokującego.
  5. Po odessaniu ostatniego przemycia natychmiast dodać 50 milionów ekwiwalentów komórkowych sonikowanych ekstraktów (~ 1,6 ml) do koniugatów przeciwciało: kulki. Jeśli ekstrakty sonikowane nie są gotowe, ponownie zawieś kulki w 100 μl buforu blokującego, aż będą gotowe. Bardzo ważne jest, aby nigdy nie dopuścić do wyschnięcia koralików.

7. Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP)

  1. Dla każdej próbki ChIP połączyć 1,5 ml sonikowanych ekstraktów z koniugatami przeciwciało: kulka w probówkach o pojemności 1,5 ml lub 2 ml.
  2. Inkubować probówki na rotatorze mini-probówek przez noc (około 16 godzin) przy prędkości 9 w temperaturze 4 °C. Po kilku minutach sprawdzić, czy próbki nie przeciekają i czy mieszają się prawidłowo.

Dzień 2: Mycie ChIP i reakcje enzymatyczne na żywicy

8. ChIP myje

UWAGA: Aby zminimalizować zanieczyszczenie krzyżowe, krótko obracaj rurki między każdym praniem. W przypadku pierwszej aspiracji zmieniaj końcówki między każdą próbką. Podczas kolejnych prań można używać tej samej końcówki, o ile nie dotykała koralików. Zobacz sekcję Informacje dodatkowe, aby uzyskać wskazówki dotyczące prawidłowego mycia ChIP.

  1. Bardzo krótko odwiruj probówki za pomocą mikrowirówki (~ 3 sekundy przy 500 x g), aby zebrać płyn w nakrętkach i umieścić na stojaku magnetycznym na 1 minutę. Będąc jeszcze na stojaku magnetycznym, odessaj ekstrakt.
  2. Dodać 0,75 ml buforu RIPA do każdej probówki. Wyjmij probówki ze stojaka magnetycznego i odwróć kilka razy, aby wymieszać. Wymień rurki na stojaku magnetycznym i odessaj supernatant. Powtórz 7 razy.
  3. Dodać 0,75 ml 10 mM Tris HCl (pH 7,5) do każdej probówki. Wyjmij probówki ze stojaka magnetycznego i odwróć kilka razy, aby wymieszać. Wymień rurki na stojaku magnetycznym i odessaj supernatant. Powtórz 2 razy.
  4. Po zassaniu ostatniego mycia przejdź do polerowania.
    Uwaga: Po każdej reakcji inkubacji w sekcjach 9.3, 10.3, 11.3, 12.3, 13.3, 14.3 i 15.3, należy krótko odwirować probówki i przyłożyć je na 1 minutę do stojaka magnetycznego i zassać supernatant. Przemyć 2x 0,75 ml buforu RIPA i 2x 0,75 ml Tris HCl (pH 7,5).

9. Reakcja polerowania

  1. Wypełnij obliczenia dotyczące mieszanki wzorcowej polerowania (Tabela 11). Przygotuj mieszankę polerską w tubce o pojemności 1,5 ml na lodzie. Odpipetować do mieszania.
  2. Natychmiast po odessaniu ostatniego płukania ChIP dodaj 50 μl mieszanki polerskiej do każdej próbki żywicy, znajdując się jeszcze na stojaku magnetycznym. Inkubować próbki przez 30 minut w temperaturze 3 x g w temperaturze 30 °C w termomieszalniku.
  3. Po zasysaniu ostatniego mycia, zgodnie z opisem w uwadze po sekcji 8.4, należy przejść do A-tailing.

10. Reakcja ogona A

  1. Wypełnij obliczenia głównego miksu ogonowego (tabela 12). Przygotuj mieszankę ogonów A w tubce o pojemności 1,5 ml na lodzie. Odpipetować do mieszania.
  2. Natychmiast po sekcji polerowania dodaj 50 μl mieszanki ogonów A do każdej próbki żywicy, nadal znajdując się na stojaku magnetycznym. Inkubować próbki przez 30 minut w temperaturze 3 x g w temperaturze 37 °C w termomieszalniku.
  3. Po zassaniu ostatniego prania, zgodnie z opisem w uwadze po rozdziale 8.4, przejdź do podwiązania adaptera P7.

11. Reakcja na podwiązanie adaptera P7

  1. Wypełnij obliczenia głównego miksu ligacji (tabela 13). Zrób podwiązanie w 1,5 ml probówce na lodzie. Odpipetować do mieszania.
  2. Bezpośrednio po sekcji ogonowej A dodaj 48 μl mieszanki głównej ligacji P7 i 2 μl innego wskaźnika adaptera do każdej żywicy próbki, nadal znajdując się na stojaku magnetycznym. Inkubować próbki przez 2 godziny w temperaturze 3 x g w temperaturze 25 °C w termomieszalniku.
    Uwaga: Użycie różnych indeksów dla każdej próbki pozwoli na sekwencjonowanie większej liczby próbek w jednej komórce przepływowej.
  3. Po zasysaniu ostatniego prania, jak opisano w uwadze po sekcji 8.4, przejdź do naprawy Φ-29 Nick.

12. Reakcja naprawcza Phi-29 Nick

  1. Wypełnij obliczenia mieszanki głównej Φ-29 (tabela 14). Zrób Φ-29 mieszając w 1,5 ml probówce na lodzie. Odpipetować do mieszania.
  2. Natychmiast po sekcji ligacji P7 dodaj 50 μl mieszanki Φ-29 do każdej próbki żywicy, nadal na stojaku magnetycznym. Próbki inkubować przez 20 minut w temperaturze 3 x g w temperaturze 30 °C w termomikserze.
  3. Po odessaniu ostatniego płukania, jak opisano w uwadze po sekcji 8.4, przejść do reakcji kinazy.

13. Reakcja kinazy

  1. Wypełnij obliczenia głównej mieszanki kinazy (Tabela 15). Zrób mieszankę kinazy w 1,5 ml probówce na lodzie. Odpipetować do mieszania.
  2. Natychmiast po przecięciu Φ-29 dodaj 50 μl mieszanki kinazy do każdej próbki żywicy, nadal znajdując się na stojaku magnetycznym. Inkubować próbki przez 20 minut w temperaturze 3 x g w temperaturze 37 °C w termomikserze.
  3. Po zasysaniu ostatniego płukania, jak opisano w uwadze po sekcji 8.4, należy przejść do reakcji egzonukleazy lambda.

14. Reakcja egzonukleazy lambda

  1. Wypełnij obliczenia głównego miksu egzonukleazy lambda (tabela 16). Przygotować mieszankę egzonukleazy lambda w 1,5 ml probówce na lodzie. Odpipetować do mieszania.
  2. Natychmiast po przecięciu kinazy dodaj 50 μl mieszanki egzonukleazy lambda do każdej próbki żywicy, nadal znajdując się na stojaku magnetycznym. Inkubować próbki przez 30 minut w temperaturze 3 x g w temperaturze 37 °C w termomieszalniku.
  3. Po odessaniu ostatniego przemycia, jak opisano w uwadze po sekcji 8.4, przejść do reakcjiRecJ f.

15. RecJf Reakcja nukleazy

  1. Proszę wypełnić obliczenia RecJf master mix (tabela 17). Przygotuj RecJf w 1,5 ml probówce na lodzie. Odpipetować do mieszania.
  2. Bezpośrednio po sekcji egzonukleazy lambda dodaj 50 μl mieszankiRecJ f do każdej próbki żywicy, nadal znajdując się na stojaku magnetycznym. Inkubować próbki przez 30 minut w temperaturze 3 x g w temperaturze 37 °C w termomieszalniku.
  3. Po zasysaniu ostatniego przemycia, zgodnie z opisem w uwadze po sekcji 8.4, należy przejść do elucji ChIP.

16. Elucja i odwrócenie usieciowania

  1. Przygotować mieszaninę główną: liczba próbek x 1,1 x (200 μl buforu elucyjnego ChIP + 1 μl 20 mg/ml proteinazy K) w probówce o pojemności 1,5 ml. Dodać 200 μl buforu elucyjnego ChIP + głównej mieszanki proteinazy K do każdej próbki żywicy.
  2. Próbki inkubować przez noc (około 16 godzin) w temperaturze 3 x g w temperaturze 65 °C w termomikserze z podgrzewaną pokrywą, aby zapobiec kondensacji.

Dzień 3: Ekstrakcja DNA i ligacja adaptera

17. Elucja i odwrócenie usieciowania (ciąg dalszy)

  1. Po całonocnej inkubacji w temperaturze 65 °C należy krótko odwirować próbki w celu zebrania kondensatu. Umieść próbki na stojaku magnetycznym na 1 minutę.
  2. Przenieść 200 μl supernatantu do nowej probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 200 μl buforu TE (pH 7,5).

18. Ekstrakcja alkoholem izoamylowym (PCIAA)

  1. Do każdej próbki dodać 400 μl fenolu, chloroformu, alkoholu izoamylowego. Wirować mieszać przez 20 sekund.
  2. Wirować przez 10 minut przy 20 000 x g w temperaturze pokojowej (RT). Ostrożnie przenieść 325 μl górnej warstwy wodnej do świeżej probówki.
    Uwaga: Uważaj, aby nie przenieść żadnej substancji organicznej (dolnej warstwy) do nowej tuby.
  3. Do każdej próbki dodać 1/10 objętości 3 M NaOAc (pH 5,5) i 1 μl 20 mg/ml glikogenu. W przypadku wielu próbek należy przygotować mieszankę wzorcową.
  4. Do każdej próbki dodać 3 objętości lodowatego 100% etanolu. Wirować do mieszania. Inkubować przez 15 minut w temperaturze -80 °C.
  5. Wirować przez 15 minut przy 20 000 x g w temperaturze 4 °C. Ostrożnie zdekantować supernatant, uważając, aby nie naruszyć osadu.
  6. Delikatnie dodaj 500 μl świeżo przygotowanego lodowatego 70% etanolu, uważając, aby nie naruszyć granulatu. Wirować przez 5 minut przy 20 000 x g w temperaturze 4 °C. Ostrożnie zdekantować supernatant.
  7. Suszyć granulki przez około 20 minut (lub do wyschnięcia) w próżni o prędkości 45 °C.
    UWAGA: Jest to punkt pauzy w protokole. Suche granulki DNA można przechowywać w temperaturze -20 °C.
  8. Zawiesić osady w 10 μl ddH2O. Kilkakrotnie pipetować nad obszarem, w którym DNA zostało granulowane, nawet jeśli nie widać wysuszonego osadu.
  9. Przenieść 10 μl każdej próbki do świeżej probówki PCR o pojemności 0,3 ml lub do 8 stojaków, w zależności od liczby próbek.

19. Reakcja na rozszerzenie startera P7

  1. Wypełnij obliczenia mieszanki głównej P7 Primer Extension (Tabela 18). Przygotuj mieszankę przedłużającą w 1,5 ml tubie na lodzie. Odpipetować do mieszania.
  2. Dodać 10 μl mieszanki przedłużającej (minus polimeraza Φ-29) do każdych 10 μl próbki. Odpipetować do mieszania.
  3. Uruchom próbki w termocyklerze za pomocą programu (Tabela 19), aby wyżarzyć podkład do szablonu, aż do etapu "utrzymania" w temperaturze 30 °C.
  4. Dodać 1 μl polimerazy Φ-29 podczas kroku "zatrzymania" w 30 °C w programie. Odpipetować do mieszania. Wznów pozostałą część programu (Tabela 19).

20. Reakcja ogona A

  1. Wypełnij obliczenia głównego miksu ogonowego A (tabela 20). Przygotuj mieszankę ogonów A w tubce o pojemności 1,5 ml na lodzie. Odpipetować do mieszania.
  2. Do każdej próbki dodać 10 μl mieszanki ogonów A. Odpipetować do mieszania.
  3. W termocyklerze inkubować próbki przez 30 minut w temperaturze 37 °C, a następnie inaktywować przez 20 minut w temperaturze 75 °C.

21. Reakcja na podwiązanie adaptera P5

  1. Wypełnij obliczenia głównej mieszanki podwiązanej adapterem P5 (Tabela 21). Zrób podwiązanie w 1,5 ml probówce na lodzie. Odpipetować do mieszania.
  2. Do każdej próbki dodać 20 μl mieszanki do ligacji P5. Odpipetować do mieszania.
  3. W termocyklerze inkubować próbki przez 2 godziny w temperaturze 25 °C.

22. Czyszczenie koralików

Uwaga: Proszę zapoznać się z sekcją Materiały, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat czyszczenia koralików.

  1. Przenieść każdą próbkę o objętości 50 μl do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.
  2. Zawieś koraliki czyszczące na rotatorze mini-tube przy ustawieniu prędkości 15 na 15 minut przy RT. Nie pozwól, aby kulki osiadły przed pipetowaniem.
  3. Dodaj 60 μl kulek czyszczących do próbki (stosunek kulek czyszczących 1,2:1 do próbki ma kluczowe znaczenie dla usunięcia DNA krótszego niż 200 par zasad). Pipetować do mieszania przez 20 sekund.
  4. Zawieś koraliki czyszczące na rotatorze mini-rurkowym przy ustawieniu prędkości 15 na 3 minuty przy RT. Krótko zakręć rurkami.
  5. Umieść probówki na stojaku magnetycznym na 1 minutę. Odpipetować i wyrzucić supernatant.
    UWAGA: NIE używaj aspiracji próżniowej w tej sekcji, ponieważ spowoduje to zassanie koralików czyszczących.
  6. Dodaj 400 μl świeżo przygotowanego RT 70% etanolu do każdej próbki, gdy znajdują się one na stojaku magnetycznym. NIE mieszać. Aspirowany supernatant. Powtórz 2 razy.
  7. Suszyć kulki czyszczące przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Kolor kulek zmieni kolor na ciemnobrązowy na jasnobrązowy, a po wyschnięciu kulek w granulkach żywicy będą widoczne bardzo małe pęknięcia.
  8. Aby wymyć DNA, dodaj 40 μl 10mM Tris (pH 7,5). Dokładnie pipetować, aby mieszać przez 20 sekund.
  9. Umieścić próbki na stojaku magnetycznym na 1 minutę. Powoli pipetować i przenieść 36 μl eluatu bezpośrednio do probówek PCR o pojemności 0,3 ml.
  10. Przejść bezpośrednio do reakcji PCR lub przechowywać eluaty w temperaturze -20 °C.

Dzień 4: PCR i analiza żelu

23. PCR

  1. Wypełnij obliczenia mieszanki głównej PCR (tabela 22). Zrób mieszankę PCR. Pipetować bardzo delikatnie, aby wymieszać, aby uniknąć pęcherzyków.
  2. Dodać 14 μl mieszanki PCR do każdej próbki DNA o objętości 36 μl. Odpipetować do mieszania. Próbki należy przechowywać na lodzie do czasu, aż będą gotowe do włożenia do termocyklera.
  3. W przypadku pozytywnej kontroli PCR należy dołączyć wcześniej przygotowaną bibliotekę. W przypadku ujemnej kontroli PCR należy dołączyć wodę. Uruchom próbki w termocyklerze za pomocą programu PCR (Tabela 23).

24. Przygotowanie żelu, wycinanie DNA i wizualizacja

  1. Dokładnie wyczyść i wypłucz odpowiedniej wielkości pudełko żelowe wodą dejonizowaną. Przygotuj 1,5% żel agarozowy (zawierający 0,5 mg/ml bromku etydyny) z grubym, szeroko wnękanym grzebieniem, który może pomieścić 60 μl.
    UWAGA: Bromek etydyny (EtBr) jest substancją rakotwórczą i należy obchodzić się z nim ostrożnie.
  2. Krótko odkręć probówki z próbkami do PCR, aby zebrać kondensację.
  3. Dodać 1/5 objętości 6x ksylenowego barwnika DNA do połączonej próbki. Nie należy używać błękitu bromofenolowego w barwniku DNA, ponieważ migruje on w tym samym miejscu, co DNA próbki.
  4. Załaduj całą próbkę do każdej studzienki, najlepiej z pustymi studzienkami pomiędzy próbkami.
    Uwaga: Biblioteki o tych samych indeksach NIE mogą być uruchamiane w tym samym żelu.
  5. Załadować drabinkę o objętości 7 μl i spektrum 100 pz po obu stronach próbek. Uruchom żel pod napięciem 140 V przez około 30-45 minut, aż barwnik bromofenolowy w drabince znajdzie się w 3/4 w dół żelu.
  6. Obraz i wizualizacja żelu na transiluminatorze przy niskim ustawieniu UV. Wyciąć skrawki agarozy zawierające fragmenty DNA 200 - 500 pz. Bądź bardzo ostrożny, aby nie wyciąć pasma dimera adaptera, które działa z prędkością 125 pz.
  7. Umieść każdy wycięty plasterek żelu w tubce o pojemności 15 ml. Zapisuj wagę netto każdego plasterka żelu. Napisz tę wagę bezpośrednio na tubie.
  8. Zobrazuj, zapisz i opisz wycięty żel, aby potwierdzić wybór prawidłowego zakresu rozmiarów.

25. Oczyszczanie żelu

  1. Oczyść DNA z wyciętego plastra żelu zgodnie z instrukcjami producenta, z następującymi modyfikacjami.
  2. Rozpuść plasterek żelu, kołysząc się z prędkością RT na platformie kołyszącej. Rozpuszczenie zajmie około 20 minut.
  3. Aby uzyskać wysoce oczyszczone DNA, przemyj kolumny 0,5 ml buforu QG po przejściu rozpuszczonego żelu przez kolumnę.
  4. Po umyciu buforem PE pozostaw kolumny w temperaturze pokojowej przez 2 - 5 minut. Wiruj przez 1 minutę przy 13 000 x g w temperaturze pokojowej.
  5. Aby zrobić miejsce na główną mieszaninę reakcji PCR, eluuj próbki za pomocą 40 μl buforu EB do świeżej probówki o pojemności 1,5 ml.

26. Kwantyfikacja DNA

  1. Próbki należy przygotować zgodnie z instrukcjami producenta (tabela 24). Zmierz próbki w określonym przyrządzie za pomocą tub optycznych.
  2. Po ilościowym określeniu bibliotek ChIP-exo prześlij je do sekwencjonowania na platformie, która wykorzystuje chemię sekwencjonowania przez syntezę 16, która jest kompatybilna z adapterami DNA w tym protokole.
    UWAGA: Zazwyczaj do oznaczania ilościowego wystarcza 2 μl próbki, ale może być konieczne więcej, jeśli stężenie próbki jest niższe. Wydajność DNA zwykle waha się od 50 do 200 ng.
  3. Po ilościowym określeniu należy przechowywać próbki w temperaturze -20 °C.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Poniższe rysunki ilustrują reprezentatywne wyniki z przedstawionego tutaj protokołu ChIP-exo. W przeciwieństwie do tradycyjnych metodologii ChIP-seq z kilkoma etapami enzymatycznymi, ChIP-exo wymaga jedenastu sekwencyjnie zależnych reakcji enzymatycznych (ryc. 1). W związku z tym na każdym etapie należy zachować ostrożność, aby upewnić się, że każdy składnik reakcji jest dodawany do odpowiedniej wzorcowej mieszaniny reakcji. Zalecamy wygenerowanie arkusza kalkulacyjnego z...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy funkcjonalny protokół genomiczny w celu określenia dokładnego miejsca wiązania białek oddziałujących z chromatyną w bezstronny, obejmujący cały genom sposób w rozdzielczości bliskiej parom zasad. Najważniejszym krokiem do osiągnięcia rozdzielczości mapowania par bliskich parom zasad jest traktowanie egzonukleazą DNA wzbogaconego w ChIP, podczas gdy immunoprecypitat pozostaje na żywicy magnetycznej. Pozornie kompleksy białkowe mogą potencjalnie blokować ślad in vivo dowolnej podjednostki (np.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Venters Lab i członkom Wydziału Fizjologii Molekularnej i Biofizyki za pomocne dyskusje. Specjalne podziękowania dla Franka Pugha za jego wskazówki, mentoring i wiele wnikliwych dyskusji na temat niuansów ChIP-exo, kiedy byłem stażystą podoktoranckim w jego laboratorium.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
37% formaldehydu, bez metanolu, 10 x 10 ml ampułkiThermoFisher Scientific28908Sekcja 3
Kompletny koktajl inhibitorów proteazy (CPI)Roche Life Science11873580001Sekcje 4, 8
Sonikator BioruptorDiagenodeUCD200Sekcja 5
Probówki polistyrenowe 15 mlBD Falcon352095Sekcja 5
Białko MagSepharose G Xtra koralikiGE Healthcare28-9670-66Sekcja 6
DynaMag-1,5 ml Boczny stojak magnetycznyInvitrogen12321DSekcje 6-17, 22
Rotator mini-rurkiFisher Scientific05-450-127Sekcje 7, 22
Polimeraza DNA T4New England BioLabsM0203Sekcja 9
Polimeraza DNA I, KlenowNew England BioLabsM0210Sekcja 9
10x NEBuffer 2 (10x Bufor reakcyjny 2)New England BioLabsB7002Sekcje 9-11, 13, 15, 20
Thermomixer CEppendorf5382Sekcje 9-16
ATPRoche Life Science010419979001Sekcje 9, 11, 13
dNTPNew England BioLabsN0447Sekcje 9, 12, 19, 23
Kinaza polinukleotydowa T4New England BioLabsM0201Sekcje 9, 13
dATPNew England BioLabsN0440Sekcje 10, 20
Klenow 3'-5' Exo MinusNew England BioLabsM0212Sekcje 10, 20
Ligaza DNA T4 New England BioLabsM0202Sekcje 11, 21
Φ-29 Polimeraza DNANew England BioLabsM0269Sekcje 12, 19
10x Φ-29 BuforNew England BioLabsB0269Sekcje 12, 19
Egzonukleaza lambdaNowa Anglia BioLabsM0262Sekcja 14
10x Bufor LambdaNew England BioLabsB0262Sekcja 14
RecJf EgzonukleazaNowa Anglia BioLabsM0264Sekcja 15
Proteinaza KRoche Nauki przyrodnicze03115828001Sekcja 16
GlikogenRoche Nauki przyrodnicze010901393001Sekcja 18
10x Bufor ligazy T4Nowa Anglia BioLabsB0202Sekcja 21
Koraliki AMPure XP (czyszczenie) Beckman CoulterA63881Sekcja 22
Q5 Polimeraza DNA na gorąco New England BioLabsM0493Sekcja 23
5x Bufor Q5 (5x Bufor PCR)New England BioLabsB9027Sekcja 23
Zestaw do ekstrakcji żelu QIAquickQiagen28704Section 25
Qubit FluorometrInvitrogenQ33216Sekcja 26
Optyczne przezroczyste rurki kubitowe InvitrogenQ32856Sekcja 26
Zestaw do oznaczania wysokiej czułości Qubit dsDNAInvitrogenQ32851Sekcja 26

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Venters, B. J., Pugh, B. F. How eukaryotic genes are transcribed. Crit Rev Biochem Mol Biol. 44, 117-141 (2009).
  2. Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution. Cell. 147, 1408-1419 (2011).
  3. Chen, J., et al. Single-molecule dynamics of enhanceosome assembly in embryonic stem cells. Cell. 156, 1274-1285 (2014).
  4. Wales, S., Hashemi, S., Blais, A., McDermott, J. C. Global MEF2 target gene analysis in cardiac and skeletal muscle reveals novel regulation of DUSP6 by p38MAPK-MEF2 signaling. Nucleic acids research. 42, 11349-11362 (2014).
  5. Cho, S., et al. The architecture of ArgR-DNA complexes at the genome-scale in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 43, 3079-3088 (2015).
  6. Katainen, R., et al. CTCF/cohesin-binding sites are frequently mutated in cancer. Nat Genet. 47, 818-821 (2015).
  7. Murphy, M. W., et al. An ancient protein-DNA interaction underlying metazoan sex determination. Nat Struct Mol Biol. 22, 442-451 (2015).
  8. Zere, T. R., et al. Genomic Targets and Features of BarA-UvrY (-SirA) Signal Transduction Systems. PLoS One. 10, e0145035(2015).
  9. Rhee, H. S., Pugh, B. F. Genome-wide structure and organization of eukaryotic pre-initiation complexes. Nature. 483, 295-301 (2012).
  10. Rhee, H. S., Bataille, A. R., Zhang, L., Pugh, B. F. Subnucleosomal structures and nucleosome asymmetry across a genome. Cell. , 1377-1388 (2014).
  11. Pugh, B. F., Venters, B. J. Genomic Organization of Human Transcription Initiation Complexes. PLoS One. 11, e0149339(2016).
  12. Albert, I., Wachi, S., Jiang, C., Pugh, B. F. GeneTrack--a genomic data processing and visualization framework. Bioinformatics. 24, 1305-1306 (2008).
  13. Guo, Y., Mahony, S., Gifford, D. K. High resolution genome wide binding event finding and motif discovery reveals transcription factor spatial binding constraints. PLoS computational biology. 8, e1002638(2012).
  14. Bardet, A. F., et al. Identification of transcription factor binding sites from ChIP-seq data at high resolution. Bioinformatics. 29, 2705-2713 (2013).
  15. Wang, L., et al. MACE: model based analysis of ChIP-exo. Nucleic Acids Res. 42, e156(2014).
  16. Bentley, D. R., et al. Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry. Nature. 456, 53-59 (2008).
  17. Rhee, H. S., Pugh, B. F. ChIP-exo method for identifying genomic location of DNA-binding proteins with near-single-nucleotide accuracy. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 21, Unit 21.24(2012).
  18. Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22, 1813-1831 (2012).
  19. Serandour, A. A., Brown, G. D., Cohen, J. D., Carroll, J. S. Development of an Illumina-based ChIP-exonuclease method provides insight into FoxA1-DNA binding properties. Genome Biol. 14, R147(2013).
  20. He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints. Nat Biotechnol. 33, 395-401 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Trawienie egzonukleaz lambdaimmunoprecypitacja chromatynysekwencjonowanie wysokoprzepustowewarunki sonikacjiinkubacja na statywie magnetycznymreakcja nukleazy RecJfocena analizatorem Bioanalyzermiejsca startu transkrypcji

Powiązane artykuły