Artykuł metodologiczny

Inżynieria rozpoznawania molekularnego za pomocą polimerów biomimetycznych na jednościennych nanorurkach węglowych

DOI:

10.3791/55030

⸱

10 stycznia 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of California Berkeley, 2California Institute for Quantitative Biosciences (QB3), University of California Berkeley

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy protokół inżynierii fazy koronowej w bliskiej podczerwieni fluorescencyjnych jednościennych nanorurek węglowych (SWNT) przy użyciu amfifilowych polimerów i DNA do opracowania czujników dla celów molekularnych bez znanych elementów rozpoznających.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Semiconducting single-wall carbon nanotube (SWNTs) to klasa optycznie aktywnych nanomateriałów, które fluoryzują w bliskiej podczerwieni, zbiegając się z oknem optycznym, gdzie próbki biologiczne są najbardziej przezroczyste. W tym miejscu przedstawiamy techniki adsorpcji polimerów amfifilowych i kwasów polinukleinowych na powierzchni SWNT w celu inżynierii ich faz koronowych i stworzenia nowatorskich czujników molekularnych dla małych cząsteczek i białek. Te funkcjonalne czujniki SWNT są zarówno biokompatybilne, jak i stabilne. Polimery są adsorbowane na powierzchni nanorurek albo przez bezpośrednią sonikację SWNT i polimeru, albo przez zawieszenie SWNT za pomocą środka powierzchniowo czynnego, a następnie dializę polimerem. Emisja fluorescencji, stabilność i reakcja tych czujników na docelowe anality są potwierdzane za pomocą spektroskopii absorbancji i fluorescencji w bliskiej podczerwieni. Ponadto demonstrujemy unieruchomienie powierzchni czujników na szkiełkach podstawowych, aby umożliwić mikroskopię fluorescencyjną pojedynczych cząsteczek w celu scharakteryzowania kinetyki adsorpcji polimerów i wiązania analitu.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jednościenne nanorurki węglowe (SWNT) to atomowo cienkie warstwy atomów węgla zwinięte w długie, cienkie cylindry, które wykazują unikalne właściwości elektroniczne i optyczne. 1 Do takich właściwości zalicza się przerwę energetyczną wytwarzającą emisję fluorescencji w bliskiej podczerwieni (nIR) poprzez rekombinację ekscytonów, która jest bardzo wrażliwa na lokalne środowisko. Emisja nIR SWNT mieści się w oknie bliskiej podczerwieni, w którym głębokość przenikania światła jest maksymalna dla tkanki biologicznej. 2,3 Dodatkowo, SWNT wykazują kilka unikalnych cech nietypowych w przeciwieństwie do fluoroforów organicznych: SWNT wykazują duże przesunięcie Stokesa, nie fotowybielają i nie mrugają. 4 Wykorzystanie tych cech doprowadziło do opracowania szeregu nowatorskich czujników molekularnych mających zastosowanie w biologii. 5,6 Niezmodyfikowane SWNT są jednak nierozpuszczalne w wodzie, a uzyskanie zawiesin poszczególnych SWNT może być wyzwaniem. 7,8 Wiązanie i agregacja SWNT w roztworze może zaciemnić ich fluorescencję pasma wzbronionego,2 czyniąc je nieodpowiednimi do zastosowań detekcyjnych.

Dyspersja pojedynczych nanorurek węglowych w roztworze wodnym wymaga modyfikacji ich powierzchni, aby zapobiec agregacji napędzanej hydrofobowością. 9 Podczas gdy modyfikacja kowalencyjna może sprawić, że SWNT staną się rozpuszczalne w wodzie,10 a także nadać specyficzną chemię wiązania, miejsca defektów w sieci SWNT zmniejszają lub zmniejszają ich emisję fluorescencji. Zamiast tego funkcjonalizację SWNT można osiągnąć za pomocą środków powierzchniowo czynnych, lipidów, polimerów i DNA9,11-13, które adsorbują się na powierzchni nanorurek poprzez oddziaływania hydrofobowe i układanie pi-pi. Powstałe w ten sposób środowisko chemiczne otaczające funkcjonalizowane powierzchniowo SWNT określa się mianem fazy koronowej. Zaburzenia w fazie koronowej mogą mieć duży wpływ na ekscytony przemieszczające się po powierzchni nanorurek, powodując modulacje emisji fluorescencji SWNT. To właśnie ten wrażliwy związek między fazą koronową a fluorescencją SWNT może być wykorzystany do opracowania nowych czujników molekularnych poprzez włączenie specyficznych modalności wiązania do dużej powierzchni SWNT. Zaburzenia w fazie korony SWNT po związaniu analitu mogą prowadzić do zmian w lokalnym środowisku dielektrycznym, przenoszenia ładunku lub wprowadzania defektów sieciowych, z których wszystkie mogą modulować emisję fluorescencji SWNT, aby służyć jako mechanizm transdukcji sygnału. 14 Podejście to jest wykorzystywane do opracowywania nowych czujników fluorescencyjnych do wykrywania wielu różnych klas cząsteczek, w tym DNA15,16,glukozy17 i małych cząsteczek, takich jak ATP,18, reaktywne formytlenu19 i tlenek azotu. 20,21 Podejścia te są jednak ograniczone, ponieważ opierają się na istnieniu znanej metody wiązania dla docelowego analitu.

Ostatnio opracowano bardziej ogólne podejście do projektowania czujników fluorescencyjnych przy użyciu SWNT niekowalencyjnie funkcjonalizowanych amfifilowymi heteropolimerami, fosfolipidami i kwasami polinukleinowymi. Cząsteczki te adsorbują się na powierzchniach nanorurek węglowych, wytwarzając wysoce stabilne zawiesiny poszczególnych SWNT22-25 z unikalnymi fazami koronowymi, które mogą specyficznie wiązać białka26,27 lub małe cząsteczki, w tym neuroprzekaźnik dopaminę. 28-30 Inżynieria fazy koronowej w celu rozproszenia SWNT i specyficznego wiązania docelowych analitów jest określana jako rozpoznawanie molekularne fazy koronowej (CoPhMoRe). 28 Niewielkie rozmiary, niska toksyczność, wysoka stabilność i niebielejąca fluorescencja nIR czujników CoPhMoRe SWNT sprawiają, że są one doskonałymi kandydatami do wykrywania in vivo w przypadku dłuższych pomiarów z rozdzielczością czasową. 6 Niedawne prace wykazały ich zastosowanie w tkankach roślinnych do optycznego wykrywania reaktywnych form azotu i tlenu. 31 Szczególnie ekscytującym zastosowaniem czujników SWNT CoPhMoRe jest możliwość bezznacznikowego wykrywania neuroprzekaźników, takich jak dopamina in vivo, podczas gdy inne techniki, takie jak wykrywanie elektrochemiczne lub immunohistochemia, cierpią z powodu braku rozdzielczości przestrzennej, czasowej i swoistości.

Projektowanie i odkrywanie czujników SWNT CoPhMoRe było do tej pory ograniczone przez rozmiar i różnorodność chemiczną biblioteki dyspergatorów, co ograniczało prawdopodobieństwo znalezienia czujnika dla konkretnego celu. Do tej pory naukowcy jedynie zarysowali powierzchnię dostępnych polimerów sprzężonych, koblokowych, biologicznych i biomimetycznych, które mogłyby służyć jako funkcjonalnie aktywne dyspergatory dla czujników SWNT. W tym miejscu przedstawiamy różne metody zarówno dyspergowania SWNT, jak i charakteryzowania ich fluorescencji w celu przeprowadzenia wysokoprzepustowych badań przesiewowych oraz analizy za pomocą pojedynczego czujnika SWNT. W szczególności przedstawiamy procedurę powlekania SWNT oligomerami kwasu polinukleinowego za pomocą bezpośredniej sonikacji, a także sposób funkcjonalizacji SWNT polimerami amfifilowymi poprzez wymianę środków powierzchniowo czynnych przez dializę. Jako przykłady używamy (GT)15-DNA i glikolu polietylenowego funkcjonalizowanego izotiocyjanianem rodaminy (RITC-PEG-RITC). Demonstrujemy zastosowanie (GT)15-DNA SWNT jako czujnika CoPhMoRe do wykrywania dopaminy. Na koniec przedstawiamy procedury wykonywania pomiarów za pomocą czujników jednocząsteczkowych, które można wykorzystać do charakteryzacji lub wykrywania pojedynczych cząsteczek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uwaga: Przed użyciem proszę zapoznać się ze wszystkimi odpowiednimi kartami charakterystyki substancji niebezpiecznej (SDS). Nanomateriały mogą stwarzać dodatkowe zagrożenia w porównaniu z ich odpowiednikami produkowanymi w materiałach sypkich. Stosuj wszystkie odpowiednie praktyki bezpieczeństwa, w tym kontrole inżynieryjne (wyciąg, osłona akustyczna) i środki ochrony osobistej (okulary ochronne, gogle, fartuch laboratoryjny, długie spodnie, buty z zakrytymi palcami).

1. Przygotowanie roztworów, środków powierzchniowo czynnych i polimerów

  1. Przygotowanie 100 mM roztworu NaCl
    1. Rozpuść 584 mg NaCl w 80 ml wody dejonizowanej. Dodaj wodę dejonizowaną, aby uzyskać całkowitą objętość do 100 ml.
  2. Przygotowanie 3% roztworu dodecylosiarczanu sodu (SDS)
    1. Rozpuść 3 g SDS w 80 ml wody dejonizowanej. Dodaj wodę dejonizowaną, aby uzyskać całkowitą objętość do 100 ml.
  3. Przygotowanie 2% roztworu cholanu sodu (SC)
    1. Rozpuść 2 g wodzianu cholanu sodu w 80 ml wody dejonizowanej. Dodaj wodę dejonizowaną, aby uzyskać całkowitą objętość do 100 ml.
  4. Przygotowanie bufora obrazowania (1x Tris: 20 mM Tris, 100 mM NaCl)
    1. Rozpuść 22,23 g zasady Tris i 58,44 g NaCl w 500 ml wody dejonizowanej za pomocą mieszadła magnetycznego i płytki.
    2. Ostrożnie dodawać skoncentrowany HCl, aż do osiągnięcia pH 8,1.
    3. Dodaj wodę dejonizowaną, aby osiągnąć końcową objętość 1 l.
  5. Synteza polimeru RITC-PEG-RITC
    1. Rozpuścić difunkcjonalizowany aminy glikol polietylenowy (PEG) (5 kDa lub 20 kDa, 0,1 mol/l) i izotiocyjanian rodaminy (RITC, 0,2 mol/l) w 1 ml mieszaniny dichlorometanu i dimetyloformamidu (DMF) w stosunku 1:1.
    2. Dodać 0,2 mol/l N,N-diizopropyloetyloaminy (DIEA).
    3. Po 3 godzinach wytrącić osad z 10-krotną objętością eteru dietylowego, a następnie przeprowadzić filtrację próżniową.
    4. Ponownie rozpuścić w DMF i powtórzyć wytrącanie eteru, a następnie filtrację próżniową.
      UWAGA: Inne cząsteczki modyfikowane izotiocyjanianami (np. izotiocyjanian fluoresceiny, FITC) mogą być przyłączane do PEG lub innych polimerów modyfikowanych aminami przy użyciu podobnej metody.
  6. Otrzymywanie pegylowanego DNA (PEG-DNA)
    1. Połączyć 100 μl roztworu chlorowodorku tris(2-karboksyetylo)fosfiny (TCEP) (0,5 M, pH 7,0) z 44,9 μl DNA modyfikowanego 5'-tiolem (1 mg/10 μl w 0,1 M NaCl) i dodać do 4,855 ml wody dejonizowanej.
    2. Mieszaj przez 1 godzinę.
    3. Rozpuścić 500 mg maleimidu glikolu metoksypolietylenowego w 5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanem.
    4. Połącz roztwory DNA i PEG (łącznie 10 ml) i mieszaj przez 24 godziny.

2. Przygotowanie jednościennych zawiesin z nanorurek węglowych (SWNT)

  1. Przemycie SWNT w celu usunięcia katalizatora i zanieczyszczeń.
    1. Dodaj 200-300 mg niemytych SWNT do plastikowej probówki wirówkowej zawierającej 45 ml wody dejonizowanej.
    2. Wirować roztwór przez 2 minuty i sonikować za pomocą sonikatora kąpielowego przez 5 minut. Należy pamiętać, że ustawienia sonikatora różnią się w zależności od instrumentu, więc sprawdź, czy gęstość optyczna roztworu SWNT wzrasta (tj. zmienia kolor na), aby upewnić się, że SWNT są rozproszone.
    3. Odwirowywać roztwór przez 20 minut przy 16 100 x g i odrzucić supernatant.
    4. Dodaj około 45 ml świeżej wody dejonizowanej.
    5. Powtórz kroki 2.1.2-2.1.4 do 8 razy.
    6. Usuń jak najwięcej wody, uważając, aby nie przeszkadzać granulowanym SWNT i pozwól granulkom SWNT wyschnąć na powietrzu.
  2. Zawiesiny kwasów nukleinowych SWNT
    1. Rozpuścić kwasy nukleinowe (NA) w 0,1 M NaCl do stężenia 100 mg/ml.
    2. Usuń elektryczność statyczną z jednorazowej szpatułki, probówek do mikrowirówek i materiału SWNT za pomocą pistoletu antystatycznego. W dygestorium dodać 20 μl roztworu NA do 980 μl 0,1 M NaCl, a następnie dodać 1 mg SWNT.
    3. Za pomocą ultrasonografu z końcówką o średnicy 3 mm należy sonikować roztwór przez 10 minut przy 40% amplitudzie w łaźni lodowej.
    4. Odwirować roztwór DNA-SWNT DWUKROTNIE przez 90 minut przy 16 100 x g. W przypadku stosowania PEG-DNA należy oczyścić nadmiar i nieprzereagowane DNA oraz PEG za pomocą filtra spinowego o sile 100 kDa. Dodaj tyle PBS, aby napełnić filtr wirowy i wirować z prędkością 9 300 x g przez 1,5 minuty, powtórz ten krok prania 3 razy.
    5. Zebrać i przechowywać supernatant, uważając, aby nie naruszyć osadu zawierającego wiązki CNT i agregaty. Granulki należy wyrzucić zgodnie z instytucjonalnymi procedurami dotyczącymi odpadów niebezpiecznych, właściwymi dla nanomateriałów.
    6. Zmierzyć absorbancję roztworu przy 632 nm za pomocą spektrofotometru UV/Vis w celu określenia przybliżonego stężenia zawieszonych SWNT przy użyciu ε=0,036 L/cm·mg zgodnie z prawem Lamberta-Beera i odpowiednim współczynnikiem rozcieńczenia.
  3. Amfifilowe zawiesiny polimerowe SWNT
    1. Usuń elektryczność statyczną z jednorazowej szpatułki, mikroprobówek wirówkowych i zapasów SWNT. W dygestorium dodać 5 mg SWNT do 5 ml 2% roztworu SC (alternatywnie można użyć roztworu SDS).
    2. Za pomocą ultrasonografu z końcówką o średnicy 6 mm sonikować roztwór przez 1 godzinę przy amplitudzie 40% w łaźni lodowej.
    3. Odwirować próbkę o masie 150 000 x g przez 4 godziny za pomocą ultrawirówki i ostrożnie zebrać supernatant.
    4. Rozpuścić 1% wag. polimeru amfifilowego (np. RITC-PEG-RITC) w roztworze SC-SWNT.
    5. Roztwór polimeru SC-SWNT należy dializować za pomocą membrany dializacyjnej o sile 3,5 kDa w stosunku do 1 litra wody dejonizowanej lub buforu przez 5 dni. Wymień wodę lub bufor po godzinie 2 i godzinie 4. Można zastosować większą membranę do dializy, o ile pozwala ona na usunięcie wybranego środka powierzchniowo czynnego, ale zachowanie zarówno SWNT, jak i polimeru amfifilowego.
    6. Zmierzyć absorbancję roztworu przy 632 nm za pomocą spektrofotometru UV/Vis w celu określenia przybliżonego stężenia zawieszonych SWNT przy użyciu ε=0,036 l/cm*mg zgodnie z prawem Lamberta-Beera i odpowiednim współczynnikiem rozcieńczenia.

3. Przygotowanie powierzchniowo unieruchomionych czujników SWNT

  1. Przygotowanie roztworów podstawowych BSA-biotyny i NeutrAwidyny
    1. Rozpuścić 10 mg liofilizowanej biotyny BSA w 1 ml wody dejonizowanej do sporządzenia roztworu podstawowego o stężeniu 10 mg/ml i przechowywać w temperaturze 4 °C.
    2. Rozpuścić 10 mg białka neutrawidyny (NAV, deglikozylowane białko awidyny) w 2 ml wody dejonizowanej, aby uzyskać roztwór podstawowy o stężeniu 5 mg/ml. Podwielokrotności należy przechowywać w temperaturze -20 °C. Rozmrożone porcje można przechowywać przez kilka dni w temperaturze 4 °C.
  2. Przygotowanie szkiełek mikroskopowych pokrytych BSA-Biotyną
    1. Wyczyść szkiełko mikroskopowe i szkło nakrywkowe o średnicy 0,17 mm (lub odpowiednio do obiektywu mikroskopu) wodą dejonizowaną, a następnie metanolem, acetonem i ostatnim płukaniem wodą dejonizowaną.
    2. Utwórz kanały, umieszczając kilka kawałków taśmy dwustronnej w odległości około 5 mm od siebie na czystym szkiełku mikroskopowym. Uszczelnij kanały, biorąc długie szklane szkiełko nakrywkowe i dociskając je do górnej części taśmy dwustronnej. Upewnij się, że jest wyśrodkowany na szkiełku mikroskopu, tak aby krawędzie szkiełka nakrywkowego i szkiełka nie były zlicowane.
    3. Dodać 100 μl roztworu podstawowego BSA-Biotyny do 900 μl 1x buforu Tris do końcowego stężenia 1 mg/ml.
    4. Wlać 50 μl roztworu biotyny BSA do kanału, pipetując roztwór na jeden koniec i odprowadzając roztwór z drugiej za pomocą chusteczki. Inkubować przez 5 minut, a następnie 3-5 rzutów z 50 μl 0,1 M NaCl.
    5. Rozcieńczyć 40 μl 5 mg/ml NAV w 960 μL 1x bufor Tris do końcowego stężenia 0,2 mg/ml.
    6. Wlać 50 μl roztworu NAV do kanału, pipetując roztwór na jeden koniec i odprowadzając roztwór z drugiej za pomocą chusteczki. Inkubować przez 2-5 minut, a następnie 3-5 rzutów 50 μl 0,1 M NaCl.
    7. Rozcieńczyć roztwory podstawowe zawieszonych SWNT w buforze obrazowania do stężenia 1-10 mg/l i wprowadzić 50 μl roztworu do kanału i inkubować przez 5 minut.
    8. Delikatnie spłucz nadmiar SWNT za pomocą 50 μl buforu do obrazowania.
  3. Przygotowanie silanizowanych szkiełek mikroskopowych APTES
    UWAGA: Silanizowane szkiełka APTES umożliwiają unieruchomienie ujemnie naładowanych SWNT owiniętych DNA na powierzchni szklanego podłoża.
    1. Przygotować 10% roztwór (3-aminopropylo)trietoksysilanu (APTES) w etanolu.
    2. Korzystając z kanałów wykonanych zgodnie z krokami opisanymi w 3.2.2, przelej 100 μL 1x buforu Tris.
    3. Przepłukać kanał roztworem APTES i inkubować przez 5 minut. Przemyć 1x buforem Tris.
    4. Rozcieńczyć roztwory podstawowe zawieszonych DNA-SWNT w buforze do obrazowania do stężenia 1-10 mg/ląd, wprowadzić 50 μl roztworu do kanału i inkubować przez 5 minut.
    5. Delikatnie spłucz nadmiar SWNT za pomocą 50 μl buforu do obrazowania.

4. Spektroskopia fluorescencyjna i mikroskopia czujników SWNT

  1. Mikroskopia fluorescencyjna nIR
    1. Wykonaj obrazowanie unieruchomionych powierzchniowo SWNT za pomocą wzbudzenia laserowego i mikroskopu odwróconego wyposażonego w matrycę czujników InGaAs do obrazowania.
    2. Skieruj wiązkę lasera tak, aby weszła do tylnego portu oświetlenia odwróconego mikroskopu za pomocą luster na regulowanych mocowaniach kinematycznych i pary przysłon zamontowanych na słupku ustawionych na wysokości portu. Upewnij się, że wiązka jest wypoziomowana i prosta, potwierdzając, że przechodzi przez obie tęczówki po umieszczeniu między kolejnymi lustrami i przed wejściem do portu oświetlenia. W razie potrzeby wyreguluj wysokość belki za pomocą zespołu peryskopowego. Usuń wszelkie krótkoprzepustowe filtry ciepła z portu oświetlenia, które tłumiłyby wiązkę.
    3. Włóż odpowiednią kostkę filtracyjną do mikroskopu, aby odbić światło wzbudzenia do obiektywu i zebrać światło emisyjne. Zazwyczaj składa się on z dichroicznego filtra długoprzepustowego z odcięciem powyżej długości fali wzbudzenia (np. 750 LP) i filtra długoprzepustowego emisji (np. 850 LP), aby jeszcze bardziej zminimalizować rozproszone światło wzbudzenia przed uderzeniem w czujnik. Dodatkowo filtr emisyjny można wybrać tak, aby był selektywny dla emisji SWNT o określonej chiralności.
    4. Dokonaj precyzyjnej regulacji wyrównania wiązki, wkładając odpowiednią kostkę wyrównującą, zastępując obiektyw dwoma przesuniętymi, matowymi tarczami zawierającymi otwory o średnicy 1 mm. Wyrównaj belkę do środka zarówno dolnej, jak i górnej tarczy wyrównowania.
    5. Podłącz matrycę czujników 2D InGaAs do bocznego portu obrazowania mikroskopu za pomocą odpowiedniego adaptera i obiektywu 0,5x, jeśli to konieczne, aby dostosować się do rozmiaru czujnika.
    6. Używając obiektywu zanurzeniowego 100X (1,4 NA), nałóż bezfluorescencyjny olejek immersyjny i umieść unieruchomioną próbkę SWNT na stoliku mikroskopu.
    7. Podnieś obiektyw, aż olej zetknie się z dolną częścią szkła nakrywkowego (#1.5, grubość 170 μm). W razie potrzeby dokonaj regulacji kołnierza obiektywu ze względu na warunki obrazowania, np. temperaturę, grubość szkła itp.
    8. Powoli podnieś obiektyw z włączonym źródłem wzbudzenia i monitoruj sygnał fluorescencji kamery InGaAs. Intensywność fluorescencji powinna stopniowo wzrastać w miarę zbliżania się płaszczyzny ogniskowej do powierzchni i ustawiania ostrości przez unieruchomione czujniki.
  2. Spektroskopia fluorescencyjna nIR
    UWAGA: Spektroskopię fluorescencyjną można przeprowadzić przy użyciu tej samej konfiguracji mikroskopu, ale poprzez skierowanie zebranego światła z korpusu mikroskopu do spektrometru i detektora liniowego InGaAs.
    1. Korzystając z mocowań kinematycznych i zwierciadeł przystosowanych do pomiaru podczerwieni, skieruj ścieżkę światła w kierunku szczeliny wejściowej spektrometru. Skoncentruj światło w dół do punktu na szczelinie wejściowej za pomocą soczewki skupiającej (np. płasko-wypukłej, f = 150 mm). To wyrównanie odbywa się poprzez osłabienie mocy lasera do <1 mW i zastąpienie obiektywu mikroskopu lustrem 1" oraz użycie kostki filtrującej rozdzielającej wiązkę 50/50. Światło wzbudzenia opuści następnie korpus mikroskopu przez port wyjściowy i może być użyte do regulacji luster i soczewki, aby skupić wiązkę na szczelinie wejściowej.
    2. Po wymianie obiektywu mikroskopu i filtra długoprzepustowego umieść płytkę dołka na stoliku i zarejestruj widma próbki w ostrości za pomocą spektrometru i układu InGaAs.
  3. Pomiar odwracalnej odpowiedzi (GT)15 DNA-SWNT na dopaminę
    1. Zamontuj kanały pokryte czujnikiem na stoliku mikroskopu i ustaw ostrość za pomocą obiektywu olejowego 100X i kamery InGaAs. Dodać 50 μl 100 μM roztworu dopaminy w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do kanału przepływowego i zarejestrować zmianę intensywności fluorescencji.
    2. Wypłukać roztwór dopaminy za pomocą soli fizjologicznej buforowanej fosforanami i obserwować zmianę fluorescencji poszczególnych czujników SWNT.
  4. Badanie przesiewowe na studzience pod kątem reakcji analitu czujników SWNTs
    UWAGA: Badania przesiewowe różnych analitów można przeprowadzić za pomocą przezroczystej płytki studzienkowej sterowanej za pomocą zmotoryzowanego stolika. Idealna płyta studzienkowa jest przezroczysta dla widzialnego i podczerwonego oraz ma czarne ścianki boczne, aby zminimalizować przesłuchy między studzienkami.
    1. Odpipetować równe objętości zawieszonego czujnika SWNT (np. stężenie 5 mg/l) do każdego dołka, wystarczające do równomiernego pokrycia dna studzienki, zwykle >100 μl dla płytki 96-dołkowej i >30 μl dla płytki 384-dołkowej.
    2. Pipetować anality (np. 2 μl, 100 μM objętość końcowa) z biblioteki przesiewowej do płytek studzienkowych. Przygotuj każdy analit w trzech egzemplarzach, aby uwzględnić potencjalne wahania między studniami, wahania intensywności wzbudzenia lub temperaturę.
    3. Podnieś obiektyw (np. 20X achroplan, 0,45 NA) podczas monitorowania widm emisyjnych za pomocą spektrometru i macierzy InGaAs. Optymalna pozycja obiektywu sprawi, że płaszczyzna ogniskowej znajdzie się mniej więcej w środku objętości próbki w studzience, co powinno odpowiadać maksimum zmierzonej intensywności.
    4. Dla każdej studzienki próbki zapisz ekspozycję 1-10 s, aby zebrać widmo.
    5. Porównaj widma emisyjne dla każdej studzienki z kontrolą zawierającą tylko SWNT bez dodatkowego analitu, aby określić ilościowo odpowiedź fluorescencyjną.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SWNT zawieszono w roztworze wodnym przy użyciu zarówno środków powierzchniowo czynnych, jak i polimerów amfifilowych poprzez bezpośrednią sonikację i wymianę dializ. Rysunek 1 przedstawia SWNT wyhodowane metodą katalizowaną karbonylem żelaza (HiPCO), zawieszone przy użyciu SC, RITC-PEF20-RITC i (GT)15-DNA. Gęstość optyczna SWNT z SDS (lub polimerem) wzrasta dramatycznie po sonikacji i zmniejsza się po usunięciu agregatów i zanieczyszczeń poprzez oczyszczanie pr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SWNT są łatwo zawieszane w roztworze wodnym poprzez bezpośrednią sonikację z SDS lub ssDNA, na co wskazuje wzrost gęstości optycznej zapewniony przez koloidalną dyspersję powstałej hybrydy SWNT-polimer. SDS i ssDNA dyspersjonują i rozpuszczają wiązki SWNT poprzez adsorpcję na powierzchni SWNT poprzez oddziaływania hydrofobowe lub pi-pi. Ponadto inne polimery, takie jak genomowe DNA, polimery amfifilowe, polimery sprzężone i lipidy, mogą być adsorbowane na powierzchni SWNT poprzez dializę próbek zawieszonych za pomocą SC ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Burroughs Wellcome Fund Career Award at the Scientific Interface (CASI), grant Fundacji Simonsa oraz grant dla młodych badaczy Fundacji Brain and Behavior Research.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
chlorek soduFisher ScientificS271-1
dodecylosiarczan soduSigma AldrichL6026
hydrat cholanu soduSigma AldrichC6445
zasada tris (zasada Trizma)Sigma Aldrich93362
kwas solnyFisher ScientificA144-212
Amina-PEG-amina,NH2-PEG-NH2Nanocs IncPG2-AM-5k
rodamina B izotiocyjanianSigma Aldrich283924
izotiocyjanian fluoresceinySigma AldrichF7250
dichlorometanSigma Aldrich676853
dimetyloformamidSigma AldrichD4551
N,N-diizopropyloetyloaminaSigma AldrichD125806
eter dietylowySigma Aldrich673811
Chlorowodorek tris(2-karboksetylo)fosfinySigma AldrichC4706 
DNA modyfikowane 5'-tiolem Zintegrowane technologie DNA Maleimid
glikolu metoksypolietylenowegoSigma Aldrich63187
100 kDa filtry spinoweMillipore
HiPCO Super oczyszczone jednościenne nanorurki węgloweIntegrisHiPco SuperPurified
buforowana fosforanemPistolet antystatyczny Sigma AldrichP5493
Wirówka MiltyMilty Zerostat 3
Eppendorf5415 D
ultrasonografCole ParmerCV18
kasety dializacyjneThermo scientificSlide-A-Lyzer G2 87722
BSA-biotynaThermo scientific29130
Białko neutrawidynyThermo scientific31000
(3-Aminopropylo)trietoksysilan (APTES)Sigma Aldrich440140
odwróconyZeissAxio Observer.Z1
lustra kinematyczneThorLabsKM200-E03
peryskopThorLabsRS99
olejek immersyjnyZeissObiektyw Immersol 518f
100XZeissPlanapochromatyczny 100X olej, 1.4NA, PH3, 420791-9911-000
Obiektyw 20XZeissN-Achroplan 0.45 NA, 420953-9901-000 
nakrywkoweHealthrow ScientificHS159879H
chlorowodorek dopaminySigma AldrichH8502 
kamera na podczerwień 2DInstrumentsNIRvana matryca czujników
podczerwieni 1DInstrumentsSpektrograf PyLoN IR
nIRPrinceton InstrumentsSCT-320
soczewka planowypukłaThorLabsLA1384
płytki dołkowe (szklane dno)Corning4580
sól fizjologiczna mikroskop szkło Princeton Princeton

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dresselhaus, M. S., Dresselhaus, G., Avouris, P. Carbon Nanotubes. 80, Springer. Berlin Heidelberg: Berlin, Heidelberg. (2001).
  2. O'Connell, M. J., Bachilo, S. M., et al. Band gap fluorescence from individual single-walled carbon nanotubes. Science. 297 (5581), 593-596 (2002).
  3. Wang, F., Dukovic, G., Brus, L. E., Heinz, T. F. The Optical Resonances in Carbon Nanotubes Arise from Excitons. Science. 308 (5723), (2005).
  4. Heller, D. A., Baik, S., Eurell, T. E., Strano, M. S. Single-Walled Carbon Nanotube Spectroscopy in Live Cells: Towards Long-Term Labels and Optical Sensors. Adv Mat. 17 (23), 2793-2799 (2005).
  5. Boghossian, A. A., et al. Near-Infrared Fluorescent Sensors based on Single-Walled Carbon Nanotubes for Life Sciences Applications. Chem Sus Chem. 4 (7), 848-863 (2011).
  6. Kruss, S., et al. Carbon nanotubes as optical biomedical sensors. Adv Drug Del Rev. 65 (15), 1933-1950 (2013).
  7. Girifalco, L. A., Hodak, M., Lee, R. S. Carbon nanotubes, buckyballs, ropes, and a universal graphitic potential. Phys Rev B. 62 (19), 13104-13110 (2000).
  8. Baughman, R. H., et al. Carbon nanotubes--the route toward applications. Science. 297 (5582), 787-792 (2002).
  9. Zheng, M., et al. DNA-assisted dispersion and separation of carbon nanotubes. Nature Materials. 2 (5), 338-342 (2003).
  10. Banerjee, S., Hemraj-Benny, T., Wong, S. S. Covalent Surface Chemistry of Single-Walled Carbon Nanotubes. Adv Mat. 17 (1), 17-29 (2005).
  11. Moore, V. C., et al. Individually Suspended Single-Walled Carbon Nanotubes in Various Surfactants. Nano Letters. 3 (10), 1379-1382 (2003).
  12. Tu, X., Zheng, M. A DNA-based approach to the carbon nanotube sorting problem. Nano Research. 1 (3), 185-194 (2008).
  13. Mangalum, A., Rahman, M., Norton, M. L. Site-Specific Immobilization of Single-Walled Carbon Nanotubes onto Single and One-Dimensional DNA Origami. J Am Chem Soc. 135 (7), 2451-2454 (2013).
  14. Monopoli, M. P., Åberg, C., Salvati, A., Dawson, K. A. Biomolecular coronas provide the biological identity of nanosized materials. Nature Nano. 7 (12), 779-786 (2012).
  15. Jeng, E. S., Moll, A. E., Roy, A. C., Gastala, J. B., Strano, M. S. Detection of DNA Hybridization Using the Near-Infrared Band-Gap Fluorescence of Single-Walled Carbon Nanotubes. Nano Letters. 6 (3), 371-375 (2006).
  16. Yang, R., et al. Carbon Nanotube-Quenched Fluorescent Oligonucleotides: Probes that Fluoresce upon Hybridization. J Am Chem Soc. 130 (26), 8351-8358 (2008).
  17. Yum, K., Ahn, J., McNicholas, T., Barone, P., Mu, B. Boronic acid library for selective, reversible near-infrared fluorescence quenching of surfactant suspended single-walled carbon nanotubes in response to glucose. Acs Nano. 6 (1), 819-830 (2011).
  18. Kim, J. H., et al. A Luciferase/Single-Walled Carbon Nanotube Conjugate for Near-Infrared Fluorescent Detection of Cellular ATP. Ange Chem Int Ed. 49 (8), 1456-1459 (2010).
  19. Jin, H., et al. Detection of single-molecule H2O2 signalling from epidermal growth factor receptor using fluorescent single-walled carbon nanotubes. Nat Nano. 5 (4), 302-309 (2010).
  20. Kim, J. H., et al. The rational design of nitric oxide selectivity in single-walled carbon nanotube near-infrared fluorescence sensors for biological detection. Nat Chem. 1 (6), 473-481 (2009).
  21. Giraldo, J. P., et al. Plant nanobionics approach to augment photosynthesis and biochemical sensing. Nat Mat. 13 (4), 400-408 (2014).
  22. Samanta, S. K., et al. Conjugated Polymer-Assisted Dispersion of Single-Wall Carbon Nanotubes: The Power of Polymer Wrapping. Acc Chem Res. 47 (8), 2446-2456 (2014).
  23. Zou, J., et al. Dispersion of Pristine Carbon Nanotubes Using Conjugated Block Copolymers. Adv Mat. 20 (11), 2055-2060 (2008).
  24. Zheng, M., et al. Structure-Based Carbon Nanotube Sorting by Sequence-Dependent DNA Assembly. Science. 302 (5650), (2003).
  25. Strano, M. S., et al. Understanding the Nature of the DNA-Assisted Separation of Single-Walled Carbon Nanotubes Using Fluorescence and Raman Spectroscopy. Nano Lett. 4 (4), 543-550 (2004).
  26. Bisker, G., et al. Protein-targeted corona phase molecular recognition. Nat Comm. 7, 10241(2016).
  27. Nelson, J. T., et al. Mechanism of Immobilized Protein A Binding to Immunoglobulin G on Nanosensor Array Surfaces. Anal Chem. 87 (16), 8186-8193 (2015).
  28. Zhang, J., et al. Molecular recognition using corona phase complexes made of synthetic polymers adsorbed on carbon nanotubes. Nat nanotechnol. 8 (12), 959-968 (2013).
  29. Kruss, S., et al. Neurotransmitter detection using corona phase molecular recognition on fluorescent single-walled carbon nanotube sensors. J Am Chem Soc. 136 (2), 713-724 (2014).
  30. Salem, D. P., et al. Chirality dependent corona phase molecular recognition of DNA-wrapped carbon nanotubes. Carbon. 97, 147-153 (2016).
  31. Giraldo, J. P., et al. A Ratiometric Sensor Using Single Chirality Near-Infrared Fluorescent Carbon Nanotubes: Application to In Vivo Monitoring. Small. 11 (32), 3973-3984 (2015).
  32. Karousis, N., Tagmatarchis, N., Tasis, D. Current Progress on the Chemical Modification of Carbon Nanotubes. Chem Rev. 110 (9), 5366-5397 (2010).
  33. Movia, D., Del Canto, E., Giordani, S. Purified and Oxidized Single-Walled Carbon Nanotubes as Robust Near-IR Fluorescent Probes for Molecular Imaging. J Phys Chem C. 114 (43), 18407-18413 (2010).
  34. Cognet, L., et al. Stepwise quenching of exciton fluorescence in carbon nanotubes by single-molecule reactions. Science. 316 (5830), 1465-1468 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Polimery biomimetycznefluorescencja w bliskiej podczerwienisensory molekularneadsorpcja polimer wunieruchamianie na powierzchnispektroskopia fluorescencyjnadetekcja dopaminymikroskopia pojedynczych cz steczekzawiesina polimeru amfifilowego

Powiązane artykuły