Artykuł metodologiczny

Rozszerzenie naczyń krwionośnych izolowanych naczyń krwionośnych i izolacja macierzy zewnątrzkomórkowej myszy o napiętej skórze

DOI:

10.3791/55036

⸱

24 marca 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Anesthesiology, Medical College of Wisconsin, 2Clement J. Zablocki Veterans Affairs Medical Center, 3Department of Surgery, Division of Pediatric Surgery, Children's Research Institute, 4Department of Orthopedic Surgery, Medical College of Wisconsin, 5Deptarment of Anesthesiology, Clement J Zblocki Veteran Affairs Medical Center, 6Department of Medicine, Division of Cardiology, Medical College of Wisconsin

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy izolację macierzy zewnątrzkomórkowej serca od myszy kontrolnych C57Bl/6J, myszy o napiętej skórze i myszy o napiętej skórze leczonych peptydem hamującym IRF5. Opisujemy również badania rozszerzenia naczyń krwionośnych na izolowanych naczyniach od C57Bl / 6J, myszy o napiętej skórze i myszy o napiętej skórze leczonych peptydem hamującym IRF5.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Czynnik regulacyjny interferonu 5 (IRF5) jest kluczowy dla komórek, aby określić, czy reagują w sposób prozapalny czy przeciwzapalny. Zdolność IRF5 do przełączania komórek z jednej ścieżki na drugą jest bardzo atrakcyjna jako cel terapeutyczny. Zaprojektowaliśmy peptyd wabik IRF5D z oprogramowaniem do modelowania molekularnego do projektowania małych cząsteczek i peptydów.

IRF5D hamował IRF5, zmniejszał zmiany w macierzy zewnątrzkomórkowej i poprawiał rozszerzenie naczyń krwionośnych śródbłonka u myszy o napiętej skórze (Tsk/+). Kd IRF5D dla rekombinowanego IRF5 wynosi 3,72 ± 0,74 x 10-6 M, jak określono w eksperymentach wiązania przy użyciu eksperymentów interferometrii biowarstw. Proliferacja i apoptoza komórek śródbłonka (EC) pozostały niezmienione przy rosnącym stężeniu IRF5D (od 0 do 100 μg/ml, 24 h). Myszy Tsk/+ leczono IRF5D (1 mg/kg/d podskórnie, 21 d). Ekspresje IRF5 i ICAM były zmniejszone po leczeniu IRF5D. Funkcja śródbłonka uległa poprawie, co oceniano na podstawie rozszerzenia naczyń krwionośnych tętnic twarzowych u myszy Tsk / + leczonych IRF5D w porównaniu z myszami Tsk / + bez leczenia IRF5D. Jako czynnik transkrypcyjny IRF5 przemieszcza się z cytozolu do jądra. Translokację oceniano za pomocą immunohistochemii na miocytach serca hodowanych na różnych matrycach zewnątrzkomórkowych serca. Leczenie IRF5D myszy Tsk/+ spowodowało zmniejszenie liczby jąder IRF5 dodatnich w porównaniu ze zwierzętami bez leczenia IRF5D (50 μg/ml, 24 h). Odkrycia te pokazują ważną rolę, jaką IRF5 odgrywa w zapaleniu i zwłóknieniu u myszy Tsk/+.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Regulacja wzrostu i śmierci komórek odpowiedzi immunologicznych jest kluczowa dla roli rodziny czynników transkrypcyjnych regulujących interferon. Podkreśla się, że IRF5 ma kluczowe znaczenie dla regulacji odpowiedzi immunologicznej między typem 1, reakcją promującą stan zapalny, a odpowiedzią immunologiczną typu 2, odpowiedzią immunologiczną ukierunkowaną na naprawę tkanek. IRF5 jest kluczem w raku1, oraz autoimmunity2,3,4,5.

Mysz o napiętej skórze (Tsk/+) jest modelem zwłóknienia tkanek i twardziny spowodowanej mutacją duplikacyjną w genie fibryliny-1. Ta mutacja powoduje napięcie skóry i wzrost tkanki łącznej. U tych myszy rozwija się zapalenie mięśnia sercowego, zwłóknienie i wreszcie niewydolność serca5,6,7,8,9. Twardzina skóry jest autoimmunologiczną chorobą zwłóknieniową, która dotyka około 150 000 pacjentów w Stanach Zjednoczonych6. Cechami charakterystycznymi tej choroby są zwłóknienie narządów wewnętrznych, w tym serca7,8,9,10,11.

Charakter badania wymagał zaprojektowania peptydu hamującego. Wybrano podejście programowe zamiast tradycyjnego podejścia wykorzystującego wyświetlacz fagowy. Podejście oparte na oprogramowaniu jest łatwiejsze i mniej czasochłonne. Bank danych RCSB służy do identyfikowania odpowiednich miejsc wiązania12. Aby zbadać interakcję nowo zaprojektowanego peptydu z rekombinowanym białkiem i skupić się na parametrach wiązania, zastosowano technikę zwaną interferometrią biowarstw. Interferometria biowarstwowa to technika oparta na biosensorze, która określa powinowactwo, asocjację i dysocjację wiązania za pomocą biosensora i próbki wiążącej. Biosensor może być znakowany fluorescencyjnie, luminescencyjnie, radiometrycznie i kolorymetrycznie. Pomiar opiera się na dodawaniu lub uszczuplaniu masy, przypominającym asocjację i dysocjację13,14. Celem tego badania było zrozumienie roli IRF5 w zapaleniu i zwłóknieniu mięśnia sercowego. Celem było uzyskanie wglądu w rolę IRF5 w rozwoju zwłóknienia tkanek i twardziny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie to zostało przeprowadzone w ścisłej zgodności z zaleceniami zawartymi w Przewodniku dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych National Institutes of Health. Protokół został zatwierdzony przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (Protokół: AUA#1517). Wszystkie badania z udziałem myszy zostały przeprowadzone zgodnie z polityką PHS.

1. Projekt peptydu wabika

  1. Znajdź strukturę 3D IRF5 i oprzyj na niej projekt. Zaprojektuj 17 mer, określany jako IRF5D (ELDWDADDIRLQIDNPD), w którym asparaginian (D) jest podstawiony przez serynę (S) w celu naśladowania fosforylacji w IRF5 w 421 - 438 (ELSWSADSIRLQISNPD). Analiza 3D grup sulfhydrylowych i wiedza na temat mechanizmu aktywacji IRF5, tj. fosforylacji seryny, sugerowały, że jedną ze strategii celowania w IRF5 było wygenerowanie peptydu wabika. Zobacz rysunek 1. Aby zidentyfikować najlepszy region w strukturze 3D, użyj oprogramowania do modelowania molekularnego do projektowania małych cząsteczek i peptydów15.
    UWAGA: Krytycznym etapem w tym procesie jest dostępność struktury 3D białka docelowego i jego możliwych miejsc wiązania. Struktura 3D IRF5 dokładnie odzwierciedla, jak IRF5 dimeryzuje po fosforylacji. Zamiana asparaginianu na serynę lub treoninę jest zlecana na zewnątrz. Peptyd jest syntetyzowany oddzielnie, bez połączenia z IRF5.
  2. Replikuj domenę fosfo po prostu podstawiając D na S. Na podstawie oryginalnej sekwencji (ELSWSADSIRLQISNPD), utwórz nowy peptyd IRF5S z sekwencją aminokwasową Ac-ELDWDADDIRLQIDNPD-NH2 (IRF5D).

2. Interferometria biowarstw (BLI)

UWAGA: Oczyszczanie rekombinowanego IRF5 zostało zlecone na zewnątrz. 16

  1. Biotyna znakowana IRF5 w stosunku molowym 1:1 biotyny do liganda za pomocą odczynnika biotynylacyjnego zawierającego ogniwo o długim łańcuchu. Długie ogniwo łańcucha zapewni bardziej aktywną i jednorodną powierzchnię liganda.
    1. Dodać 1 ml 2 mg/ml IRF5 do 13 μl 20 mM odczynnika biotyny lub w razie potrzeby zwiększyć objętość. Inkubować na lodzie przez 2 godziny. Po znakowaniu użyj odsalającej kolumny wirowej, aby usunąć mieszaninę reakcyjną z znakowanego białka.
  2. Inkubować ligand znakowany biotyną za pomocą biosensorów przez 15 minut. Unikaj nadmiernego znakowania i dostosuj stosunek molowy 1:1. Po znakowaniu użyj odsalającej kolumny wirowej, aby usunąć mieszaninę reakcyjną z znakowanego białka.
  3. Inkubuj biosensory IRF5 znakowane biotyną przez 10 minut w różnych stężeniach peptydu wabiącego IRF5. Współczynniki asocjacji i dysocjacji zostały określone zgodnie z opisem10,17,18.

3. Testy apoptozy i proliferacji

  1. Test proliferacji poprzez bioredukcję tetrazolu
    1. Podawać IRF5D rozcieńczony w PBS (1 mg/kg/d, wstrzyknąć objętość 20 μl w 20 g myszy) podskórnie za pomocą igły o rozmiarze 27 za pomocą standardowej techniki karbowania lub za pomocą samego PBS myszom Tsk/+ i C57Bl/6J przez 21 dni.
    2. Znieczulij myszy izofluranem (5%) i wykonaj zwichnięcie szyjki macicy. Wytnij serca, rozcinając klatkę piersiową wzdłuż mostka. Podnieś serce kleszczami i usuń serce.
    3. Zdaj płuca za pomocą buforu do lizy białek zawierającego 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 0,5% NP-40, 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50 mM NaF10 i określ stężenie białka za pomocą testu Bradforda19.
    4. Pokryj 96-dołkowe płytki matrycą serca C57Bl/6J wyizolowaną zgodnie z opisem w punkcie 7. Rozcieńczyć zawieszoną przez PBS matrycę serca C57Bl/6J do stężenia 20 μg/ml i dodać 30 μl serca C57Bl/6J do każdej studzienki. Pozostawić na noc w inkubatorze w temperaturze 37 °C.
    5. Hodowla ludzkich komórek żyły pępowinowej przy użyciu 500 ml śródbłonkowego podłoża podstawnego z 0,4% ekstraktem z mózgu bydlęcego, 0,1% kwasem askorbinowym, 0,1% hydrokortyzonem, 0,1% ludzkim naskórkowym czynnikiem wzrostu, 2% płodową surowicą bydlęcą i 0,1% gentamycyny/amfoterycyny B. Hoduj komórki na 96 dołkach przy 5% CO2 i 95% powietrzu w pomieszczeniu o gęstości 25 000 komórek na studzienkę. Stymulować wzrostem stężenia IRF5D w zakresie od 0 do 100 μg/ml do pożywki (objętości wynosiły od 0 do 50 μl/ml).
    6. Określ proliferację komórek po trzech dniach i oceń różnice w absorbancji na czytniku mikropłytek. Reakcja polega na bioredukcji związku tetrazolowego MTS. NADPH lub NADH jest wytwarzany przez enzymy dehydrogenazy w metabolicznie aktywnych komórkach.
    7. Ponieważ związek tetrazolowy MTS jest przechowywany w stanie zamrożonym w temperaturze -20 °C, należy go powoli rozmrażać przez około 90 minut w temperaturze pokojowej. Odpipetować pipetą 20 μl do każdego dołka na 96-dołkowej płytce i dodać do niej 100 μl pożywki hodowlanej. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 1 do 4 godzin w wilgotnej komorze o stężeniu 5%CO2.
    8. Odczyt absorbancji przy długości fali 490 nm.
  2. Test apoptozy poprzez aktywność kaspazy
    UWAGA: Konfiguracja doświadczalna jest taka sama jak powyżej w ppkt 3.1.1 do 3.1.5.
    1. Stymulować komórki rosnącym stężeniem IRF5D w zakresie 0 - 100 μg/ml do pożywki.
    2. Dodać detekcję zieleni do substratu kaspazy 3/7 do EC i inkubować go przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Ocenić fluorescencję na czytniku mikropłytek jednocześnie przy długości fali absorpcji/emisji 502/530 nm. Przeprowadź eksperymenty w pliku triplicate.
      UWAGA: Zielony środek fluorescencyjny to peptyd składający się z czterech aminokwasów związanych z barwnikiem wiążącym kwas nukleinowy. Odczynnik ten staje się fluorescencyjny po rozszczepieniu po aktywacji kaspazy 3 i 7. Ta fluorescencja jest mierzona. Zaletą jest zmniejszenie liczby etapów mycia.

4. Ocena ekspresji IRF5 i ICAM-1 w sercu

  1. Podawać IRF5D rozcieńczony w PBS (1 mg/kg/d, wstrzyknąć objętość 20 μl w 20 g myszy) podskórnie za pomocą igły o rozmiarze 27 za pomocą standardowej techniki karczowania lub za pomocą samego PBS myszom Tsk/+ i C57Bl/6J raz dziennie przez 21 dni.
  2. Znieczulij myszy izofluranem (5%) i wykonaj zwichnięcie szyjki macicy. Wytnij serca, rozcinając klatkę piersiową wzdłuż mostka. Podnieś serce kleszczami i usuń serce.
  3. Zdaj płuca za pomocą buforu do lizy białek zawierającego 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 0,5% NP-40, 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50 mM NaF10 i określ stężenie białka za pomocą testu Bradforda19.
    1. Wykonaj western blot na lizatach serc. Rozcieńczyć próbki do 25 μg białka całkowitego i objętości 40 μl buforem do próbek Laemmli zawierającym 5% merkaptoetanolu. Próbki należy umieścić na żelu TGX o stężeniu 4 - 15% przy napięciu 50 mV przez 5 minut. Zwiększ napięcie do 100 mV na 1 godzinę, aż skończy się czoło barwnika.
    2. Umieść żel w 1x buforze transferowym (25 mM Tris, 190 mM glicyny, 20% metanolu, w razie potrzeby dostosuj pH do 8,3) i inkubuj przez 10 - 15 minut.
    3. Zmontuj kanapkę transferową (gąbka, filtr, żel, membrana celulozowa, filtr, gąbka). Upewnij się, że pomiędzy nimi nie są uwięzione żadne bąbelki. Plama powinna znajdować się na katodzie, a żel na anodzie. Przenoszenie przez 1 godzinę w komorze chłodniczej przy natężeniu 100 mA.
    4. Następnego dnia opłucz blot, a następnie zablokuj tło w 5% odtłuszczonym mleku w proszku na 30 minut w temperaturze pokojowej. Przepłukać blot buforowaną solą fizjologiczną Tris zawierającą 5% Tween trzy razy przez 5 minut każde.
    5. Inkubować przez noc z pierwszorzędowymi przeciwciałami przy użyciu pierwszorzędowych przeciwciał poliklonalnych przeciwko IRF5 lub ICAM-1. Rozcieńczyć przeciwciała w buforowanym roztworze soli fizjologicznej Tris w rozcieńczeniu 1:1 000.
    6. Rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe w buforowanym roztworze soli fizjologicznej Tris i inkubować blot przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. W przypadku przeciwciał drugorzędowych należy użyć odpowiednio sprzężonej z peroksydazą chrzanową IgG przeciwko mysi (1:10 000) i anty-koziej peroksydazy chrzanu (1:10 000).
    7. Zastosuj chemiluminescencję do blot po wymieszaniu składników zgodnie z protokołem producenta i inkubuj przez 3 minuty w celu luminescencji interesujących pasm. Wystaw plamę na kliszę rentgenowską. Użyj ImageJ do pomiaru gęstości. Znormalizuj wartości gęstości do pasm kontrolnych10.

5. Ocena liczby komórek zapalnych po zahamowaniu IRF5

  1. Podawać IRF5D rozcieńczony w PBS (1 mg / kg / d) podskórnie za pomocą igły o rozmiarze 27 za pomocą standardowej techniki zagniatania lub za pomocą samego PBS myszom Tsk/+ i C57Bl/6J przez 21 dni.
  2. Znieczulij myszy izofluranem (5%) i wykonaj zwichnięcie szyjki macicy. Wytnij serca, rozcinając klatkę piersiową wzdłuż mostka. Podnieś serce kleszczami i usuń serce. Zatrzaskowo zamroź i przechowuj wycięte serca do czasu analizy.
  3. Zamontuj zamrożone serca na uchwytach na chusteczki odpowiednie dla używanego kriostatu. Wytnij zamrożone skrawki o grubości 10 μm na kriostacie do immunohistochemii.
  4. Zamrożone skrawki utrwalić 1% paraformaldehydem w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Przepuszczalność skrawków za pomocą 0,5% Triton-X 100 w PBS przez 5 min.
    Uwaga: Paraformaldehyd jest regulowanym czynnikiem rakotwórczym i należy obchodzić się z nim ostrożnie.
  5. Rozcieńczyć anty-królik CD64, marker monocytów/makrofagów 1:200 w PBS. Nakładać na stałe sekcje i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
  6. Myć szkiełka w PBS przez 5 minut trzy razy w temperaturze pokojowej.
  7. Rozcieńczyć NIMP przeciw szczurom, pierwszorzędowy marker neutrofili w stosunku 1:200 w PBS. Nakładać na stałe sekcje i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
  8. Myć szkiełka przez 5 minut trzykrotnie PBS w temperaturze pokojowej.
  9. Rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe anty-królicze Alexa 488 sprzężone i anty-szczurze Alexa 488 sprzężone 1:200 w PBS.
  10. Zastosować sprzężone przeciwciała anty-królicze Alexa 488 i anty-szczurze Alexa 488 sprzężone na skrawki odpowiednio przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Objętość przeciwciała zmienia się w zależności od wielkości przekroju. Kwota powinna hojnie pokryć sekcję. W większości przypadków objętość wynosi od 100 do 200 μl.
  11. Użyj 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) jako barwnika jądrowego w rozcieńczeniu 1:1,000 w PBS. Dodaj 1 μl do 1 ml PBS i użyj DAPI w ostatnim etapie prania. Dodaj wodny nośnik montażowy do szkiełka nakrywkowego i umieść go na szkiełku.
  12. Analizuj fluorescencyjnie znakowane skrawki za pomocą mikroskopii konfokalnej przy użyciu obiektywu olejowego 40X. Dla CD64 i NIMP należy stosować fale wzbudzenia o długości 488 i długości emisji większe niż 530 nm. DAPI był wzbudzany 360 nm i emitowany przy 460 nm w kolorze niebieskim. Rozróżnij monocyty/makrofagi i neutrofile (n = 10 obrazów na przeciwciało, od 3 różnych myszy w każdej grupie) na podstawie ich innego znakowania i policz je. Wyraź dane jako liczbę zliczonych komórek.

6. Rozszerzenie naczyń krwionośnych zależne od komórek po zahamowaniu IRF5

  1. Znieczulenie myszy kontrolnych C57Bl/6J i myszy Tsk/+ z leczeniem peptydowym i bez niego za pomocą mieszaniny ketaminy (80 - 100 mg / kg) / ksylazyny (10 - 12,5 mg / kg). Mieszaninę ketaminy i ksylazyny wstrzyknąć dootrzewnowo. Ogranicz mysz ręcznie.
    1. Użyj igły o rozmiarze 25 lub mniejszej. Wbić igłę w prawy dolny kwadrant brzucha. Przed wstrzyknięciem należy wyjąć tłok, aby upewnić się, że igła nie dostanie się do naczynia krwionośnego lub jelita.
  2. Po osiągnięciu wystarczającego poziomu znieczulenia zabezpiecz mysz w pozycji leżącej, przetrzyj sierść gazikiem nasączonym alkoholem i za pomocą nożyczek otwórz klatkę piersiową i wyjmij serce.
    UWAGA: Wykrwawienie spowoduje eutanazję myszy i ułatwi sekcję poprzez zmniejszenie ciśnienia w naczyniach krwionośnych, minimalizując w ten sposób krwawienie podczas przecinania naczyń krwionośnych.
    1. Otwórz skórę za pomocą nożyczek, przecinając od boku klatki piersiowej do kości szczęki, uważając, aby nie naruszyć leżących poniżej tkanek w kierunku przedniej części szczęki.
    2. Wypreparuj tętnicę twarzową, usuwając otaczającą ją tkankę miękką.
    3. Uwaga: Nie uszkadzaj naczynia ani nie szarp za tętnicę twarzową, trzymając odsłoniętą tkankę skąpaną w buforze MOPS (2,0 mM CaCl2·2H2O, 0,02 mM EDTA, 5,0 mM glukozy, 4,7 mM KCl, 1,17 mM MgSO4·7H2O, 3,0 mM MOPS, 145 mM NaCl, 1,2 mM NaH2PO4·H2O, 2,0 mM kwasu pirogronowego), aby zapobiec wysuszeniu. Wykonuj pod lornetkowym mikroskopem preparacyjnym stereoskopowym z zoomem stereoskopowym (powiększenie od 3,5x do 45x) i światłowodowym źródłem światła.
  3. Odizoluj tętnicę twarzową.
    1. Chwyć twarz proksymalnie do pierwszego rozwidlenia i dystalnie do miejsca, w którym tętnica zostanie przecięta. Przeciąć tętnicę od tętnicy macierzystej, tętnicy szyjnej zewnętrznej. Usuń tętnice twarzowe od myszy kontrolnych, myszy Tsk / + z leczeniem IRF5D i bez niego.
    2. Trzymając tętnicę w kleszczach, odetnij dwie gałęzie wychodzące z powięzi, umożliwiając delikatne uniesienie naczynia, podczas gdy wszelkie nieprzecięte otaczające tkanki można zidentyfikować i odciąć.
    3. Kontynuuj w ten sposób, aż dojdzie do rozwidlenia, przecinając obie tętnice potomne, aby uwolnić naczynie. Nie ma potrzeby zaciskania naczyń przed cięciem ze względu na zmniejszenie ciśnienia w układzie naczyniowym po usunięciu serca. Umieść naczynie w buforze MOPS, podczas gdy druga tętnica twarzowa jest wycinana i izolowana.
    4. Naczynia należy kaniulować, przywiązując je do szklanych pipet o średnicy końcówki 125 - 175 μm. Wstępnie załadować szklane pipety i zbiorniki buforowe buforem MOPS.
      Przestroga: Nie dopuścić do tworzenia się pęcherzyków powietrza w pipetach.
    5. Przymocuj naczynia do pipet za pomocą szwów ocznych.
  4. Zamontuj komory naczyń na odwróconym mikroskopie trójokularowym z mocowaniem kamery wideo. Przepuść wideo przez system pomiarowy suwmiarki wideo w celu pomiarów naczyń na ekranie. 20
    1. Zwiększ ich ciśnienie w dwuetapowym procesie. Najpierw, gdy zbiorniki wypełnione MOPS znajdują się na wysokości nad naczyniem równej ciśnieniu 20 mmHg, należy ręcznie otworzyć zawory odcinające w przewodach zbiornika do naczynia. Sprawdź naczynie pod kątem oznak przeciekania wokół wiązań i na całej długości naczynia. Po drugie, podnieś zbiorniki do 60 mmHg i ponownie sprawdź naczynie.
    2. Po osiągnięciu ciśnienia 60 mmHg pozwól naczyniom zrównoważyć się przez 30 minut.
  5. Aby ocenić rozszerzenie naczyń krwionośnych w odpowiedzi na acetylocholinę (10-7 do 10-4 M), należy wstępnie zwęzić naczynie do średnicy 50 - 75% jego maksymalnej średnicy za pomocą 1 - 3,0 x 10-8 do 10-7 M U46619. Po pozostawieniu naczynia do ustabilizowania się przez 6 minut, dodawać acetylocholinę do kąpieli w 2-minutowych krokach, tak aby końcowe stężenia w kąpieli wynosiły 10-7, 10-6, 10-5, 10-4. Zmierz rozszerzenie naczyń krwionośnych we wszystkich trzech grupach.

7. Izolacja macierzy zewnątrzkomórkowej serca

  1. Znieczulenie myszy kontrolnych C57Bl/6J i myszy Tsk/+ z i bez leczenia peptydowego izofluranem (5%) i wykonać zwichnięcie szyjki macicy. Wytnij serca, rozcinając klatkę piersiową wzdłuż mostka. Podnieś serce kleszczami i usuń serce.
  2. Wyjmij serduszka do zlewki i dodaj 15 ml hipertonicznego 1% dodecylosiarczanu sodu (SDS). Mieszać serca w 1% roztworze SDS przez 18 godzin w temperaturze pokojowej w celu rozbicia komórek, dodając mieszadło do 1% roztworu SDS i umieszczając zlewkę na płytce mieszającej.
    Uwaga: Należy pamiętać, że macierz zewnątrzkomórkowa rozpadnie się, jeśli pozostanie zbyt długo w roztworze hipertonicznym. I odwrotnie, jeśli serca nie są wystarczająco długo poruszane w roztworze hipertonicznym, komórki nie rozpuszczą się prawidłowo, a w zlewce pozostaną resztki komórek.
  3. Prać przez 30 min w 15 ml 0,5% Triton X-100. Następnie myć przez 15 minut 15 ml PBS. Decellularyzacja każdego serca z osobna.
  4. Zamrozić matrycę zewnątrzkomórkową w ciekłym azocie i sproszkować zamrożoną macierz zewnątrzkomórkową serca za pomocą wstępnie schłodzonego moździerza i tłuczka.
  5. Sporządzić zawiesinę sproszkowanej matrycy w PBS zawierającym 1% antybiotyku. Dodawana objętość w większości przypadków wynosi 300 μL. Sonikuj zawiesinę przez 30 - 60 s na lodzie na wysokim ustawieniu.
    UWAGA: Bardzo ważne jest, aby próbka była zimna. Należy pamiętać, że zawiesina jest bardzo lepka ze względu na wysoką zawartość glikanów białkowych.
  6. Określ stężenie białka za pomocą testu Bradforda.
    UWAGA: Upewnij się, że w zawiesinie znajduje się antybiotyk i środek przeciwgrzybiczy. Penicylina/Streptomycyna są najczęściej stosowane i zalecane.

8. Ocena translokacji jądrowej za pomocą immunohistochemii

  1. Do powlekania naczyń i szkiełek należy użyć końcowego stężenia 20 μg/ml macierzy zewnątrzkomórkowej serca w PBS. Odpipetować 500 μl roztworu macierzy zewnątrzkomórkowej serca do naczynia o średnicy 100 mm w celu pokrycia i 150 μl końcowego roztworu macierzy zewnątrzkomórkowej na szkiełko.
  2. Hamować IRF5, dodając IRF5D w stężeniu 50 μg/ml przez 24 godziny do miocytów serca noworodków szczurów w hodowli. Kontrolne hodowle miocytów należy pozostawić nieleczone.
  3. Oceń transport IRF5 z cytozolu do jądra za pomocą immunofluorescencji i przeanalizuj za pomocą mikroskopii konfokalnej. Zidentyfikuj zielone oznakowanie dla IRF5, zidentyfikuj niebieską plamę DAPI dla jądra
  4. Zastosuj pierwszorzędowe przeciwciało anty-IRF5. Pierwszorzędowe przeciwciało zastosowano w rozcieńczeniu 1:200 w PBS. Inkubować szkiełka przez 30 minut w temperaturze 37 °C, a następnie wykonać trzy 5-minutowe etapy mycia. Przeciwciałem drugorzędowym było kozie przeciwciało IgG znakowane kozią przeciwciałem IgG znakowanym Alexa 488.
  5. Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe w stosunku 1:1,000 w PBS. Inkubować przeciwciało drugorzędowe przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Osiągnąć barwienie jądrowe za pomocą DAPI. Rozcieńczyć DAPI w stosunku 1:1,000 w PBS. Umyj szkiełka w sumie 3 razy przez 5 minut i dodaj DAPI do trzeciego i ostatniego kroku mycia.
  6. Uchwyć transport za pomocą mikroskopii konfokalnej i zmierz intensywność fluorescencji w jądrach i cytozolu, jak opisano wcześniej10. Zidentyfikuj zielone oznakowanie dla IRF5, zidentyfikuj niebieską plamę DAPI dla jądra. Komórki, które mają niebieskie jądra z zielonym oznakowaniem, zawierają aktywowany IRF5, który był transportowany z cytozolu do jądra. Gdy IRF5 nie jest aktywowany, w cytozolu znajduje się zielone oznakowanie.
  7. Analizuj fluorescencyjnie znakowane komórki za pomocą mikroskopii konfokalnej przy użyciu obiektywu olejowego 40X. Dla IRF5 należy użyć długości fali wzbudzenia 488 nm i długości fali emisji większej niż 530 nm. Do wizualizacji DAPI należy użyć długości fali wzbudzenia 360 nm i długości fali emisji 460 nm.

9. Statystyki

  1. Przeprowadzanie analizy wariancji (ANOVA) dla powtarzanych pomiarów w obrębie grup i między nimi. Postępuj zgodnie z ANOVA z modyfikacją testu t-Students przez Bonferroniego. Wyraż dane jako błąd standardowy średniej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wyniki przedstawione na rysunku 1 pokazują, jak zaprojektować peptyd. Rysunek 1, w lewym górnym rogu, pokazuje region (między 2 żółtymi strzałkami, aminokwasy (aa) 425-436) w IRF5, który jest fosforylowany przez szereg kinaz. Rysunek 1, w prawym górnym rogu, pokazuje żółty owal, w którym wiąże się fosforylowana domena IRF5. Struktura dimeryczna 3DSH została obrócona, aby obserwować szczelinę lub dolinę na lewo od Helix 2 (aa303-312). W t...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem było zaprojektowanie inhibitora IRF5 w celu wyjaśnienia roli IRF5 w stanach zapalnych, zwłóknieniu i funkcji naczyniowej w sercach myszy Tsk/+. Wyniki wskazują, że IRF5D nie indukował proliferacji ani apoptozy. Ponadto zmniejszył się stan zapalny i poprawiła się funkcja naczyń krwionośnych. Dane te sugerują, że IRF5 odgrywa ważną mechanistyczną rolę w rozwoju stanu zapalnego i zwłóknienia w sercu myszy Tsk / + i że może służyć jako cel terapeutyczny.

Pierwszym krokiem było zaprojektowani...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez granty NIH HL-089779 (DW), HL-112270 (KAP) i HL-102836 (KAP) oraz Cimphoni Life Sciences (część wynagrodzenia DW). Autorzy dziękują Meghann Sytsma za redakcję rękopisu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
  Triton X 100Sigma AldrichX100- 100ml
kozie przeciwciało anty-mysie IgG znakowane Alexa 488 Thermo FisherA11001
Bardford odczynnikThermo Fisher23200Pierce 
BiosensoryForte-BioMR18-0009
CD64 (H-250)Santa Cruz Biotechnologiessc-15364
Podłoże CellEvent Caspase-3/7 ThermoFisher/Life TechnologiesC10427
CellTiter AQueous One Solution Zestaw do oznaczania proliferacji komórekPromegaG3580Promega
DAPI (4&,6-diamidino-2-fenyloindol)Thermo FisherD-1306rozcieńczenie 1:1,000 w PBS
osło anty szczury Alexa 488Thermo FisherA-212081:1,000 rozcieńczenie w PBS
ECL plusGE healthcare/AmershamRPN2133Po wielu próbach i błędach wróciliśmy do tego mikroskopu
Eclipse TE 200-U z oprogramowaniem do skanowania laserowego EZ C1Koza Nikon
anty królik Alexa 488Thermo FisherA-11008Rozcieńczenie 1:1,000 w PBS
HRP  anty-kozieSanta Cruz Biotechnologiessc-516086!:10,000 rozcieńczenie w TBS
HRP osło anty-myszySanta Cruz Biotechnologiessc-23151:10,000 rozcieńczenie w TBS
ICAM-1Santa Cruz Biotechnologiessc-15111:200 rozcieńczenie w
PBS IRF5 przeciwciało (H56)Santa Cruz Biotechnologiessc-98651
Czytnik mikropłytek Elx800Marker
NIMPSanta Cruz Biotechnologiessc-133821Rozcieńczenie 1:200 w PBS
Octet REDForte Biowiążące białko-białko
Projekt peptydu  Oprogramowanie Medit SARCSB.org
Synteza rekombinowanego białka IRF5TopGene Technologiesekspresja białek, usługa syntezy
dodecylowo-fosforan soduSigma Aldrich436143detergent
KetaminaAptekaHarmonogram III substancja kontrolowana, wymagane wskazanie 
KsylazynaMedVet
3,5X-45X Trójokularowy mikroskop stereoskopowy z zoomem preparacyjnym z lampami LED na gęsiej szyiAm ScopeSKU: SM-1TSX-L6W
Kolumny odsalające ZebaThermofisher2161515
Endothelial Basal Media EBM Bullet kitZestaw LonzaCC-3124zawiera suplementy wzrostu
VIA-100K  Boeckeler Instruments
4 - 15% TGX żelBio-Rad5671081
Oprogramowanie MedSuMoMedit, Palaiseau, Francja
Laemmli BufferBioRad
przeciwciało neutrofili Biotek

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bi, X., et al. Loss of interferon regulatory factor 5 (IRF5) expression in human ductal carcinoma correlates with disease stage and contributes to metastasis. Breast Cancer Res. 13 (6), 111(2011).
  2. Dideberg, V., et al. An insertion-deletion polymorphism in the interferon regulatory Factor 5 (IRF5) gene confers risk of inflammatory bowel diseases. Hum Mol Genet. 16 (24), 3008-3016 (2007).
  3. Graham, R. R., et al. A common haplotype of interferon regulatory factor 5 (IRF5) regulates splicing and expression and is associated with increased risk of systemic lupus erythematosus. Nat.Genet. 38 (5), 550-555 (2006).
  4. Krausgruber, T., et al. IRF5 promotes inflammatory macrophage polarization and TH1-TH17 responses. Nat. Immunol. 12 (3), 231-238 (2011).
  5. Eames, H. L., Corbin, A. L., Udalova, I. A. Interferon regulatory factor 5 in human autoimmunity and murine models of autoimmune disease. Transl Res. 167 (1), 167-182 (2016).
  6. Mayes, M. D., et al. Immunochip analysis identifies multiple susceptibility Loci for systemic sclerosis. Am J Hum Genet. 94 (1), 47-61 (2014).
  7. Dimitroulas, T., et al. Micro-and Macrovascular Treatment Targets in Scleroderma Heart Disease. Curr Pharm Des. , (2013).
  8. Botstein, G. R., LeRoy, E. C. Primary heart disease in systemic sclerosis (scleroderma): advances in clinical and pathologic features, pathogenesis, and new therapeutic approaches. Am Heart J. 102 (5), 913-919 (1981).
  9. Oram, S., Stokes, W. The heart in scleroderma. Br Heart J. 23 (3), 243-259 (1961).
  10. Xu, H., et al. 4F decreases IRF5 expression and activation in hearts of tight-skin mice. PLoS One. 7 (12), 52046(2012).
  11. Steen, V. The heart in systemic sclerosis. Curr.Rheumatol.Rep. 6 (2), 137-140 (2004).
  12. Deshpande, N., et al. The RCSB Protein Data Bank: a redesigned query system and relational database based on the mmCIF schema. Nucleic Acids Res. 33, Database issue D233-D237 (2005).
  13. Concepcion, J., et al. Label-free detection of biomolecular interactions using biolayer interferometry for kinetic characterization. Comb Chem High Throughput Screen. 12 (8), 791-800 (2009).
  14. Matthew, A. Current biosensor technologies in drug discovery. Drug Discovery. , 69(2006).
  15. Doppelt-Azeroual, O., Moriaud, F., Adcock, S. A., Delfaud, F. A review of MED-SuMo applications. Infect Disord Drug Targets. 9 (3), 344-357 (2009).
  16. Kim, S., Jang, J., Yu, J., Chang, J. Single mucosal immunization of recombinant adenovirus-based vaccine expressing F1 protein fragment induces protective mucosal immunity against respiratory syncytial virus infection. Vaccine. 28 (22), 3801-3808 (2010).
  17. Frenzel, D., Willbold, D. Kinetic Titration Series with Biolayer Interferometry. PloS one. 9 (9), 106882(2014).
  18. Ou, J., et al. L-4F, an apolipoprotein A-1 mimetic, dramatically improves vasodilation in hypercholesterolemia and sickle cell disease. Circulation. 107 (18), 2337-2341 (2003).
  19. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal.Biochem. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  20. Bauer, P. M., et al. Compensatory phosphorylation and protein-protein interactions revealed by loss of function and gain of function mutants of multiple serine phosphorylation sites in endothelial nitric-oxide synthase. J.Biol.Chem. 278 (17), 14841-14849 (2003).
  21. Weihrauch, D., et al. An IRF5 Decoy Peptide Reduces Myocardial Inflammation and Fibrosis and Improves Endothelial Cell Function in Tight-Skin Mice. PLoS One. 11 (4), 0151999(2016).
  22. Hoogenboom, H. R., et al. Antibody phage display technology and its applications. Immunotechnology. 4 (1), 1-20 (1998).
  23. Roehm, N. W., Rodgers, G. H., Hatfield, S. M., Glasebrook, A. L. An improved colorimetric assay for cell proliferation and viability utilizing the tetrazolium salt XTT. J Immunol Methods. 142 (2), 257-265 (1991).
  24. Van Tonder, A., Joubert, A. M., Cromarty, A. D. Limitations of the 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assay when compared to three commonly used cell enumeration assays. BMC Res Notes. 8 (1), 1(2015).
  25. Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat Med. 14 (2), 213-221 (2008).
  26. Ou, J., et al. L-4F, an apolipoprotein A-1 mimetic, dramatically improves vasodilation in hypercholesterolemia and sickle cell disease. Circulation. 107 (18), 2337-2341 (2003).
  27. Weihrauch, D., et al. Effects of D-4F on vasodilation, oxidative stress, angiostatin, myocardial inflammation, and angiogenic potential in tight-skin mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 293 (3), 1432-1441 (2007).
  28. Roy, S., P, P. IRF-5 - A New Link to Autoimmune Diseases. Autoimmune Disorders - Pathogenetic Aspects. Mavragani, C. , 35(2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

peptyd inhibicyjny IRF5rozwarstwienie t tnicy twarzowejizolacja ECM sercapomiar rozszerzenia naczyinterferometria warstwy biologicznejimmunohistochemiametoda Bradforda

Powiązane artykuły