Pochodzenie kultur eksplantatów opon mózgowo-rdzeniowych od pośmiertnych dawców ludzkiego mózgu

Podsumowanie

Protokół hodowli eksplantatów opon mózgowo-rdzeniowych z ludzkiego mózgu pośmiertnego jest technicznie solidnym i prostym sposobem na uzyskanie fibronektynowo-dodatnich fibroblastów opon mózgowych w ciągu 6-8 tygodni i kriokonserwację około 20-30 milionów komórek.

Streszczenie

Mimo że poczyniono znaczne postępy w klinicznej charakterystyce choroby Parkinsona, kilka badań donosi, że diagnoza choroby Parkinsona nie jest patologicznie potwierdzona nawet u 25% klinicznie zdiagnozowanych przypadków choroby Parkinsona. Dlatego tkanki pobrane od klinicznie zdiagnozowanych pacjentów z idiopatyczną chorobą Parkinsona mogą mieć wysoki wskaźnik błędnej diagnozy; stąd badania in vitro z takich tkanek w celu zbadania choroby Parkinsona jako modelu przedklinicznego mogą okazać się daremne.

Zbierając pośmiertne ludzkie opony mózgowe z potwierdzonym neuropatologicznym rozpoznaniem choroby Parkinsona i charakteryzujące się utratą komórek nigrostriatalnych i wewnątrzkomórkowymi inkluzjami białkowymi zwanymi ciałami Lewy'ego, można być pewnym, że klinicznie obserwowany parkinsonizm nie jest spowodowany innym procesem chorobowym (np. nowotworem, miażdżycą).

Ten protokół przedstawia sekcję i przygotowanie pośmiertnych ludzkich opon mózgowo-rdzeniowych do uzyskania kultury fibroblastów opon mózgowych. Ta procedura jest solidna i ma wysoki wskaźnik sukcesu. Wyzwaniem związanym z hodowlą jest bezpłodność, ponieważ pobieranie mózgu na ogół nie odbywa się w sterylnych warunkach. Dlatego ważne jest, aby uzupełnić pożywkę hodowlaną koktajlem penicyliny, streptomycyny i amfoterycyny B.

Pochodzenie fibroblastów opon mózgowych z potwierdzonych autopsją przypadków choroby Parkinsona stanowi podstawę do modelowania in vitro choroby Parkinsona. Fibroblasty opon mózgowych pojawiają się 3-9 dni po przygotowaniu próbki, a około 20-30 milionów komórek można poddać kriokonserwacji w ciągu 6-8 tygodni. Hodowla fibroblastów opon mózgowych jest jednorodna, a komórki wyrażają fibronektynę, powszechnie stosowany marker do identyfikacji opon mózgowych.

Wprowadzenie

Opony mózgowe składają się z trzech błon, które chronią mózg: opony twardej, pajęczynówki i opony mózgowej. Niedawno uznano, że opony mózgowe odgrywają również ważną rolę w rozwoju mózgu i homeostazie mózgu¹. Opony mózgowe pochodzą z komórek mezenchymalnych i wywodzących się z grzebienia nerwowego i co ciekawe, wykazano, że komórki progenitorowe znajdujące się w oponach mózgowych mogą dawać początek neuronom in vitro i po przeszczepieniu in vivo^2,3,4. Kultury opon mózgowo-rdzeniowych są również z powodzeniem stosowane jako warstwy żywicielskie, ponieważ posiadają one aktywność indukującą pochodzącą z komórek zrębu do różnicowania embrionalnych komórek macierzystych w neurony dopaminergiczne⁵. Co więcej, opony mózgowe mają potencjał do bezpośredniego różnicowania się w neurony, astrocyty i oligodendrocyty w warunkach niedokrwiennych⁶.

Dla tego protokołu, ludzkie pośmiertne próbki opon mózgowych są pobierane z pajęczynówki i pia mater, zbiorczo nazywanych leptomeningami, i są pozyskiwane jako część dawcy ludzkiego mózgu do celów badawczych. Sekcja mózgu jest wykonywana w ciągu 24 godzin od śmierci, a próbka opon mózgowo-rdzeniowych jest umieszczana w zimnym podłożu wzrostowym w celu dalszego przetwarzania w ciągu następnych 6-8 godzin, jak pokazano w tym protokole.

Ten protokół opisuje sekcję i przygotowanie próbek ludzkich opon mózgowych do opracowania pierwotnej hodowli komórek opon mózgowo-rdzeniowych pacjenta. Tkankę kroi się na 25-30 kawałków o wymiarach około 3 mm x 3 mm. Trzy kawałki umieszcza się w każdym 6-dołkowym dołku pokrytym żelatyną i przytrzymuje okrągłymi szklanymi szkiełkami nakrywkowymi. Rozwarstwienie opon mózgowych trwa około 25-35 minut. Głównym wyzwaniem związanym z tą kulturą jest bezpłodność, ponieważ pobieranie, transport i sekcja mózgu na ogół nie są wykonywane w sterylnych warunkach. Dlatego ważne jest, aby uzupełnić pożywkę hodowlaną koktajlem penicyliny, streptomycyny i amfoterycyny B oraz użyć szalek wielodołkowych do oddzielenia fragmentów tkanek hodowlanych.

Wzrost fibroblastów opon mózgowych następuje zwykle w ciągu pierwszego tygodnia. Pożywka jest zmieniana co dwa do trzech dni, aż komórki zlewają się, a komórki są enzymatycznie pasażowane. Fibroblasty opon mózgowo-rdzeniowych są kriokonserwowane w ilości 1 miliona komórek na ml / fiolkę w pożywce do kriokonserwacji. Dzięki temu protokołowi w ciągu 6-8 tygodni można uzyskać 20-30 milionów fibroblastów opon mózgowych w celu kriokonserwacji. Dalsze zastosowania tych fibroblastów opon mózgowych są podstawowymi hodowlami do badań nad chorobami, bezpośrednim różnicowaniem neuronów lub wyprowadzaniem indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z opon mózgowo-rdzeniowych w celu zrozumienia mechanizmów choroby i opracowania leków.

Protokół

Rejestracja dawcy mózgu zawiera dokumentację zarejestrowanego zamiaru oddania mózgu. Zgoda na autopsję w celu pobrania tkanek jest udzielana przez najbliższą krewną, zgodnie z prawem. Badania naukowe z wykorzystaniem pobranych próbek autopsyjnych są oceniane przez instytucjonalną komisję rewizyjną (IRB) w celu zapewnienia zgodności z przepisami ustawy o przenośności i odpowiedzialności w ubezpieczeniach zdrowotnych (HIPAA).

UWAGA: Próbki opon mózgowych są pobierane przez specjalistę mózgu lub neuropatologa podczas sekcji mózgu i są przechowywane w stożkowych probówkach o pojemności 50 ml zawierających 25-30 ml pożywki wzrostowej opon mózgowych. Próbka jest przechowywana w temperaturze 4 °C do czasu przygotowania próbki. Przetwarzanie powinno być przeprowadzone tak szybko, jak to możliwe, ponieważ żywotność komórek zmniejsza się wraz z upływem czasu post mortem.

1. Przygotowanie przed rozpoczęciem sekcji opon mózgowo-rdzeniowych

UWAGA: Kroki 1.1 - 1.3 są do wykonania wewnątrz komory bezpieczeństwa biologicznego.

1. Przygotuj pożywkę wzrostową opon mózgowych, łącząc 375 ml zmodyfikowanej pożywki Eagle firmy Dulbecco, 100 ml płodowej surowicy bydlęcej, 5 ml 10 ml 10 mM aminokwasów endogennych, 5 ml 200 ml L-alanylo-L-glutaminy, 5 ml 100 mM pirogronianu sodu, 5 ml 10 000 U/ml penicyliny/streptomycyny i 5 ml 250 μg/ml amfoterycyny B w 500 ml filtra. Przefiltruj i wymieszaj. Używaj nośnika przez okres do czterech tygodni.
2. Przed rozpoczęciem preparacji umieść wszystkie materiały w komorze bezpieczeństwa biologicznego: 4x szalki Petriego, 2x płytki 6-dołkowe, 2x skalpele, 15-20 sterylizowanych 15-milimetrowych szkiełek nakrywkowych, sól fizjologiczna z buforem fosforanowym (PBS), pipety serologiczne, pipety aspiracyjne.
3. Dodać 1 ml sterylnego, autoklawizowanego 0,1% roztworu żelatyny do każdego dołka na 6-dołkowej płytce. Odstaw talerz na 30-60 min. Przygotuj 2 płytki 6-dołkowe.

2. Przygotowanie próbki opon mózgowo-rdzeniowych

UWAGA: Kroki 2.1 - 2.3 są do wykonania wewnątrz komory bezpieczeństwa biologicznego.

1. Dodać około 10 ml PBS do sterylnego 10-centymetrowego naczynia do hodowli tkankowej i umieścić w nim próbkę opon mózgowych. Za pomocą kleszczy delikatnie umyj opony mózgowe oponami mózgowymi PBS, aby usunąć krew.
2. Przenieść opony mózgowe do nowego 10-centymetrowego naczynia do hodowli tkankowej zawierającego 10 ml świeżego PBS i kontynuować mycie. W razie potrzeby powtórz czynność, aby usunąć jak najwięcej krwi.
3. Za pomocą dwóch skalpeli pokrój tkankę opon mózgowo-rdzeniowych na kawałek o wymiarach około 6 cm x 6 cm.
4. Umieść pokrywkę na naczyniu hodowlanym i przenieś do mikroskopu preparacyjnego w poziomym okapie z przepływem laminarnym.

3. Sekcja tkanki opon mózgowych

UWAGA: Kroki 3.1 - 3.3 należy wykonać wewnątrz poziomego okapu z przepływem laminarnym za pomocą mikroskopu preparacyjnego.

1. Usuń naczynia krwionośne z obszaru na elemencie opon mózgowo-rdzeniowych (krok 2.3) wystarczająco dużych, aby utworzyć co najmniej 20-25 kawałków o wymiarach 3 mm x 3 mm. Przytrzymaj opony mózgowe na miejscu jednym skalpelem, a drugim delikatnie i płytko skrobanie, aby oddzielić naczynia.
2. Wytnij małe kwadraty tkanki z przygotowanego regionu. Pokrój w procesie krokowym, najpierw robiąc większe kawałki, a następnie krojąc je na mniejsze części.
3. Użyj jednego skalpela, aby przytrzymać tkankę na miejscu, a drugiego skalpela, aby przeciąć tkankę ruchem kołyszącym. Ze względu na konsystencję tkanki trudno jest dosunąć skalpele do siebie. Spowoduje to tylko rozerwę tkankę i spowoduje postrzępione krawędzie.
4. Kontynuuj krojenie kawałków na pół, aż będzie około 20-25 kawałków 3 mm x 3 mm.

4. Przenoszenie wypreparowanych fragmentów opon mózgowych na płytki hodowli tkankowych

UWAGA: Krok 4 należy wykonać w komorze bezpieczeństwa biologicznego.

1. Odessać żelatynę z płytki 6-dołkowej (od kroku 1.3). Dodaj 1 ml pożywki wzrostowej opon mózgowych do każdej studzienki. Za pomocą sterylnych kleszczy umieść 3-4 kawałki biopsji w każdej studzience.

5. Umieszczanie nakrywek na elementach opon mózgowych

UWAGA: Kroki 5.1 - 5.2 należy wykonać w poziomym okapie z przepływem laminarnym za pomocą mikroskopu preparacyjnego.

1. Przykryj kawałki 1-2 sterylnymi okrągłymi szkiełkami nakrywkowymi o średnicy 15 mm na studzienkę.
2. Mocno dociśnij kleszczemi, aby upewnić się, że kawałki dotykają dna talerza. Pozwala to na przymocowanie kawałków tkanki do dna studni.
3. Umieścić płytkę 6-dołkową w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .

6. Utrzymanie hodowli komórkowej

UWAGA: Kroki 6.1 - 6.3 są do wykonania wewnątrz komory bezpieczeństwa biologicznego. Z szalkami hodowlanymi należy obchodzić się ostrożnie, ponieważ szkiełka nakrywkowe nie powinny się przesuwać i przemieszczać kawałków opon mózgowych.

1. Po 2 dniach w hodowli dodaj dodatkowy 1 ml świeżej pożywki wzrostowej opon mózgowych do każdej studzienki.
2. W dniu 7 ostrożnie odessać pożywkę i dodać 2 ml świeżej pożywki do każdej studzienki.
3. Po 9 dniu kontynuuj zmianę pożywki wzrostowej co drugi dzień, aż kultura stanie się zlewna.

7. Przejście

UWAGA: Wszystkie kroki należy wykonać w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Gdy fibroblasty opon mózgowych wyemigrują z fragmentów tkanki oponowej i zaczną rosnąć w kierunku krawędzi naczynia hodowlanego, rozwiń fibroblasty opon mózgowych do większego naczynia hodowlanego.

1. Przed rozpoczęciem pasażowania należy pokryć naczynie hodowlane 1% żelatyną przez 15-30 minut.
2. Odessać pożywkę z naczynia 6-dołkowego i przepłukać komórki za pomocą 2 ml PBS.
3. Dodać 1 ml trypsyny/EDTA do każdego dołka i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5-10 minut. Na tym etapie nie jest konieczne usuwanie szkiełek nakrywkowych ani tkanki opony mózgowej.
4. Gdy komórki zostaną zaokrąglone i zaczną się odłączać, dodaj 2 ml pożywki hodowlanej.
5. Pipetuj komórki w górę i w dół, aby całkowicie rozbić wszystkie grudki i przenieś roztwór komórkowy do większej płytki hodowlanej.
6. Użyj proporcji 1:3 do 1:4, aby połączyć komórki z trzech 6-dołkowych szalek w jedną naczynie hodowlaną T75.
7. Gdy komórki fibroblastów opon mózgowych zbiegają się w kolbach hodowlanych T75, trypsynizują komórki i kriokonserwują w pożywce do kriokonserwacji w ilości 1x10⁶ komórek / ml na fiolkę. Jedna kolba hodowlana T75 ze zlewającymi się fibroblastami opon mózgowych zawiera około 5-7 milionów komórek.

8. Charakterystyka fibroblastów opon mózgowych za pomocą barwienia immunologicznego

UWAGA: Przed rozpoczęciem procedury przygotuj 4% roztwór paraformaldehydu, 5% normalną surowicę kozią w PBS (bufor blokujący), 0,3% Triton X-100 w PBS (bufor permeabilizacyjny), pierwszorzędowe i drugorzędowe roztwory przeciwciał oraz 1 μg/ml Hoechst 33342 rozcieńczony w PBS z 10 mg/ml bulionu.

1. Wysiew od 15 000 do 30 000 fibroblastów opon mózgowych w 8-dołkowym szkiełku pośrednim pokrytym 0,1% żelatyną.
2. Po 24 godzinach od przyłączenia komórek utrwal je w 100 μl 4% paraformaldehydu na studzienkę przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Umyj studzienki 3 razy za pomocą 1x PBS.
3. Przepuszczalność komórek za pomocą 150 μl 0,3% Triton X-100 przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Umyj studzienki 3 razy za pomocą 1x PBS.
4. Dodać 200 μl roztworu blokującego (PBS + 5% normalnej surowicy koziej) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
5. Odessać roztwór blokujący i dodać 150 μl pożądanych przeciwciał pierwszorzędowych rozcieńczonych w roztworze blokującym. Do podwójnego barwienia należy przygotować robocze rozcieńczenia pierwszorzędowych przeciwciał w oddzielnych probówkach wirówkowych na lodzie w następujący sposób:
   1. Przygotować rozcieńczenie anty-fibronektyny w stosunku 1:300 + rozcieńczenie anty-nestyny w roztworze blokującym w stosunku 1:200. Przygotować rozcieńczenie anty-SERPINH1 1:250 + rozcieńczenie anty-TUJ1 w stosunku 1:1,000 w roztworze blokującym. Przygotować rozcieńczenie anty-SERPINH1 1:250 + rozcieńczenie anty-SOX2 w roztworze blokującym 1:100
6. Inkubować w temperaturze 4 °C przez noc.
7. Umyj studzienki 3 razy za pomocą 1x PBS.
8. Przygotować robocze rozcieńczenie w stosunku 1:400 znakowanych fluorescencyjnie przeciwciał drugorzędowych kozich anty-królików (zielony; Ex/Em² 495/519 nm) i kozioł anty-mysz (czerwony; Ex/Em² 590/617 nm) w roztworze blokującym i dodać 100 μl do każdego dołka. Inkubować przez 1 godzinę w ciemności, w temperaturze pokojowej. Następnie umyj studzienki raz za pomocą 1x PBS.
9. Dodać 100 μl z 1 μg/ml Hoechst 33342 (niebieski; Ex/Em² 358/461 nm) do każdego dołka i inkubować w ciemności przez 3 minuty. Umyj studzienki 3 razy 1x PBS, pozostawiając końcowe płukanie 1x PBS w studzience i przykryj szkiełko folią aluminiową.
10. Analizuj komórki pod mikroskopem fluorescencyjnym.

Wyniki

Po pomyślnym przeprowadzeniu protokołu przetwarzania oponopajęczynicy, wzrost fibroblastów oponowych jest po raz pierwszy obserwowany od trzech do dziewięciu dni po sekcji, choć może to zależeć od długości okresu pośmiertnego dla mózgu. Rysunek 1 przedstawia hodowle fibroblastów oponowych od czterech różnych dawców. Rysunek 1A pokazuje fragment oponopajęczynicy przytrzymany szkiełkiem nakrywkowym (ciemna linia ukośna) oraz wzrost fibroblastów wokół tkanki...

Dyskusja

Protokół ten opisuje prosty i solidny protokół uzyskiwania posiewu fibroblastów opon mózgowych z ludzkich pośmiertnych opon mózgowo-rdzeniowych pobranych w połączeniu z dawstwem mózgu. Istnieje bardzo niewiele opisów protokołów wyprowadzania kultur komórkowych z pośmiertnego materiału ludzkiego. Dwa badania opisują hodowle fibroblastów pochodzących ze skóry ^7,8,9, jedno badanie opisuje próbki opony twardej¹⁰

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Szalki Petriego Corning	Fisher Scientific	351029
Nunc 6-dołkowa płytka	Fisher Scientific	14-832-11
Szkiełka nakrywkowe 15 mm	Fisher Scientific	12-545-83 15CIR-1D
Skalpele, ostrze sterylne, nr 15	Miltex	4-415
Kleszczyki precyzyjne	Fisher Scientific	16-100-122
Pipety serologiczne	Fisher Scientific	13-678-11E
Pipety Pasteura	Fisher Scientific	22-230490
Żelatyna	Sigma	G1890-100G
Bufor fosforanowy Sól fizjologiczna	Fisher Scientific	SH30264.02
Jednostka filtrująca Corning 500 ml	Fisher Scientific	430770	Połącz składniki mediów i filtr.
Kolby do hodowli komórek nunc z nasadkami filtrującymi, T175 cm2	Thermo Scientific	178883
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Growth Media
Hyclone DMEM	Fisher Scientific	SH30081.02
Hyclon FBS	Fisher Scientific	SH30910.03
MEM Roztwór aminokwasów endogennych (100x)	Thermo Fisher	11140-050
Suplement GlutaMAX (100x)	Thermo Fisher	35050-061
Pirogronian sodu (100 mM)	Thermo Fisher	11360-070
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/mL)	Thermo Fisher	15140-122
Amfoterycyna B (żółty roztwór/250 i mikro; g/ml)	Fisher Scientific	BP264520
Bambanker Freeze 120 ml	Fisher Scientific	NC9582225
Nazwa	Company	Numer katalogowy	Komentarze
>Fibronectin Staining
Zjeżdżalnie studzienne 8-studzienne	Fisher Scientific	1256518
20% paraformaldehydu	Mikroskopia elektronowa	15713
Triton X-100	Sigma	T8787
100% glicerol	BioRad	9455
100% normalna surowica kozia	Fisher Scientific	101098-382
Przeciwciało anty-fibronektyny [F1]	Abcam	ab32419	1:300 rozcieńczenie w roztworze blokującym
Anti-SERPINH1	Sigma	S5950-200ul	1:250 rozcieńczenie w roztworze blokującym
Anti-SOX2	Millipore	MAB4343	1:100 w roztworze blokującym
Anti-Nestin	Millipore	MAB5326	1:200 rozcieńczenie w roztworze blokującym
Anti-TUJ1	Covance	MMS-435P	rozcieńczenie 1:1,000 w roztworze blokującym
Alexa Fluor 488 antykrólik	Thermo Fisher	A11029	rozcieńczenie 1:400 w roztworze blokującym; (kanał zielony; Ex/Em2 495/519 nm)
Alexa Fluor 555 przeciw myszom	Thermo Fisher	A21424	rozcieńczenie 1:400 w roztworze blokującym; (kanał czerwony; Ex/Em2 590/617 nm)
Hoechst 33342 bejca	Thermo Fisher	H3570	rozcieńczyć do końcowego stężenia 1,0 μ g/ml; (kanał niebieski; Ex/Em2 358/461 nm)
Dostawcy są sugestiami, można również korzystać z podobnych produktów od alternatywnych dostawców.

zakrzywione