Uprawa Caenorhabditis elegans w trzech wymiarach w laboratorium

Podsumowanie

Przedstawiamy prostą metodę budowy systemów hodowli nicieni 3D o nazwach NGT-3D i NGB-3D. Można je wykorzystać do badania sprawności i zachowań nicieni w siedliskach, które są bardziej podobne do naturalnych siedlisk Caenorhabditis elegans niż standardowe płytki hodowlane C. elegans w laboratorium 2D.

Streszczenie

Użycie modeli genetycznych, takich jak Caenorhabditis elegans, doprowadziło do przełomowych odkryć w biologii w ciągu ostatnich pięciu dekad. Większość tego, co wiemy o C. elegans, ogranicza się do laboratoryjnej hodowli nicieni, które niekoniecznie muszą odzwierciedlać środowisko, w którym normalnie żyją w naturze. Uprawa C. elegans w środowisku 3D, które jest bardziej podobne do matrycy 3D, którą robaki napotykają w zgniłych owocach i kompoście wegetatywnym w naturze, może ujawnić nowe fenotypy i zachowania, których nie zaobserwowano w 2D. Ponadto eksperymenty w 3D mogą sprawdzić, w jaki sposób fenotypy, które obserwujemy w 2D, są istotne dla robaka w naturze. W tym miejscu przedstawiono nową metodę, w której C. elegans rośnie i rozmnaża się normalnie w trzech wymiarach. Hodowla C. elegans w Nematode Growth Tube-3D (NGT-3D) może pozwolić nam zmierzyć sprawność reprodukcyjną szczepów C. elegans lub różne warunki w środowisku 3D. elegans. Przedstawiamy również nowatorską metodę, nazwaną Nematode Growth Bottle-3D (NGB-3D), do hodowli C. elegans w 3D do analizy mikroskopowej. Metody te pozwalają naukowcom badać biologię C. elegans w warunkach, które bardziej odzwierciedlają środowiska, z którymi spotykają się w naturze. Mogą nam one pomóc w zrozumieniu nadrzędnego ewolucyjnego znaczenia fizjologii i zachowania C. elegans, które obserwujemy w laboratorium.

Wprowadzenie

Badania nad nicieniem Caenorhabditis elegans w laboratorium doprowadziły do przełomowych odkryć w dziedzinie biologii w ciągu ostatnich pięciu dekad¹. C. elegans był pierwszym organizmem wielokomórkowym, którego genom został zsekwencjonowany w 1998 roku² i był nieoceniony w zrozumieniu wkładu poszczególnych genów w rozwój, fizjologię i zachowanie całego organizmu. Naukowcy starają się teraz lepiej zrozumieć, w jaki sposób geny te mogą przyczyniać się do przetrwania i sprawności reprodukcyjnej organizmów w ich naturalnym środowisku, zadając pytania dotyczące ekologii i ewolucji na poziomie genetycznym^3-5.

C. elegans po raz kolejny może dostarczyć doskonałego systemu do odpowiedzi na te pytania. Jednak niewiele wiadomo na temat biologii C. elegans w naturalnych siedliskach nicieni i nie ma obecnie metod symulacji kontrolowanych warunków naturalnych C. elegans w laboratorium. W laboratorium C. elegans jest hodowany na powierzchni płytek agarowych wysianych bakteriami E. coli ⁶. Jednak w naturze C. elegans i pokrewne nicienie można znaleźć rzadko zasiedlające gleby na całym świecie, ale szczególnie dobrze rozwijają się w gnijących owocach i materii wegetatywnej^7,8. Te trójwymiarowe (3D) złożone środowiska znacznie różnią się od prostych środowisk 2D, na które narażone są robaki w laboratorium.

Aby zacząć odpowiadać na pytania dotyczące biologii nicieni w bardziej naturalnym otoczeniu 3D, zaprojektowaliśmy trójwymiarowe siedlisko do laboratoryjnej hodowli nicieni, które nazwaliśmy Nematode Growth Tube 3D lub NGT-3D w skrócie⁹. Celem było zaprojektowanie systemu wzrostu 3D, który pozwala na porównywalny wzrost, rozwój i płodność ze standardowymi płytkami 2D z pożywką do wzrostu nicieni (NGM)¹⁰. System ten wspomaga rozwój bakterii i nicieni przez cały ich cykl życia w 3D, pozwala robakom swobodnie poruszać się i zachowywać w trzech wymiarach, a także jest łatwy i niedrogi w produkcji i użytkowaniu.

W obecnym badaniu przedstawiamy krok po kroku metodę produkcji NGT-3D oraz oceny rozwoju i płodności robaków. Oprócz oceny sprawności robaków w 3D, staraliśmy się obrazować, nagrywać i oceniać zachowanie i fizjologię robaków w uprawie 3D. Tak więc, oprócz NGT-3D, przedstawiamy tutaj alternatywną metodę o nazwie Nematode Growth Bottle 3D lub NGB-3D, do obrazowania mikroskopowego C. elegans podczas hodowli 3D. Będzie to szczególnie ważne dla badania znanych zachowań zidentyfikowanych w 2D oraz identyfikacji nowych zachowań unikalnych dla uprawy 3D.

Protokół

1. Przygotowanie rozwiązań dla NGT-3D i NGB-3D

1. Przygotować następujące sterylne roztwory: 1 l 0,1454 M roztworu NaCl, 1 l 1 M CaCl₂, 1 l 1 M MgSO₄, bulion lizogeniczny (LB), 1 l 1 M buforu KPO₄ (108,3 g KH₂PO₄ i 35,6 g K₂HPO₄ i napełnić H₂O do 1 L). Produkcję NGM przy użyciu tych rozwiązań można znaleźć w poprzednim protokole¹⁰.
2. Roztwory autoklawu w temperaturze 121 °C, 15 min.
3. Przygotować 50 ml sterylnego roztworu cholesterolu o stężeniu 5 mg/ml. W stożkowej tubie o pojemności 50 ml wymieszaj 0,25 g cholesterolu i 50 ml 99,99% etanolu i dobrze wymieszaj. Nie sterylizować w autoklawie. Wysterylizuj roztwór cholesterolu za pomocą strzykawki o pojemności 50 ml z filtrem strzykawkowym 0,45 μm. Spowoduje to również usunięcie nierozpuszczonego cholesterolu.
4. (Opcjonalnie) Przygotować 10 ml 150 mM wywaru 2'-deoksy-5-fluorourydyny (FUdR). W stożkowej probówce o pojemności 15 ml wymieszać 0,3693 g FUdR i 10 ml wody destylowanej. Wstrząsnąć.

2. Przygotowanie kultury bakterii dla NGT-3D i NGB-3D

1. Zaszczepić 10 ml bulionu LB bakteriami. Standardową bakterią używaną do żerowania C. elegans jest szczep E. coli OP50.
2. Wyhodować inokulację bakteryjną w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wytrząsaniem przez noc.
3. W celu przygotowania do seryjnego rozcieńczania, podwielokrotność roztworu NaCl rozlać na sterylne stożkowe probówki o pojemności 15 ml. Na przykład podwielokrotność 9 ml do łącznie 7 probówek, aby uzyskać ^10-7 rozcieńczenie szczepu OP50 E. coli.
4. Używając sterylnej pipety o pojemności 1 000 μl, odpipetować 1 ml kultury bakteryjnej lub rozcieńczonej kultury bakteryjnej do sterylnej nowej probówki z 9 ml roztworu NaCl i dobrze wymieszać 10 ml mieszaniny. Powtarzaj tę czynność, aż do osiągnięcia pożądanego rozcieńczenia bakteryjnego.
   UWAGA: Pożądane rozcieńczenie bakterii zależy od rodzaju i stanu bakterii, a także dokładnych warunków eksperymentalnych. Na przykład rozcieńczenie ^10-6 - ^10-8 szczepu OP50 E. coli wystarczyło do wytworzenia od 1 do 200 kolonii bakteryjnych na 6,5 ml probówki NGT-3D. Robaki niezawodnie rozwijały się i rozmnażały normalnie, gdy liczba kolonii przekraczała 60, co następowało przy rozcieńczeniu ^10-6 - ^10-7. W przypadku NGB-3D należy użyć rozcieńczenia ^10-8.

3. Wytwarzanie NGT-3D i NGB-3D (200 ml)

1. Po przygotowaniu kultury bakteryjnej wymieszać 0,6 g NaCl, 1 g granulowanego agaru i 0,5 g peptonu w kolbie o pojemności 500 ml. Włożyć mieszadło magnetyczne do kolby.
2. Dodać 195 ml wody destylowanej i przykryć wylot kolby folią aluminiową.
3. Autoklaw w temperaturze 121 °C przez 15 min.
4. Umieścić gorącą autoklalawowaną kolbę na płytce mieszającej i mieszać z umiarkowaną prędkością przez co najmniej 2 godziny. Schłodzić kolbę do temperatury 40 °C. Należy upewnić się, że kolba jest wystarczająco ochłodzona, ponieważ kontynuowanie pracy w wysokich temperaturach może prowadzić do zmętnienia gotowego agaru. Jednak niższe temperatury mogą spowodować przedwczesne stwardnienie agaru.
   1. (Opcjonalnie) Aby przyspieszyć proces chłodzenia, umieścić kolbę w łaźni wodnej o temperaturze 40 °C na 15 minut przed umieszczeniem na płytce mieszającej.
5. Gdy temperatura podłoża agarowego osiągnie 40 °C, dodać 200 μl 1 M CaCl₂, 200 μl 5 mg/ml roztworu cholesterolu, 200 μl 1 M_MgSO4 i 5 ml 1 M buforu KPO₄, gdy roztwór kontynuuje mieszanie do końcowych stężeń 1 mM CaCl₂, 5 μg/ml cholesterolu, 1 mM_MgSO4, 1 mM KPO₄.
   1. (Opcjonalnie) W przypadku testu żywotności NGT-3D dodać 80 μl 150 mM FUdR do końcowego stężenia 120 μM¹².
6. Dodać 6 ml 10 ml rozcieńczonej kultury bakteryjnej z kroku 2.4 bezpośrednio do kolby.
   1. (Opcjonalnie) W przypadku NGT-3D usuń 6 ml podłoża agarowego przed krokiem 3.6 i utrzymuj je w cieple oddzielnie. Podłoże to zostanie użyte do wykonania wolnej od bakterii warstwy wierzchniej.
7. Stosując sterylne procedury, dozuj pożywkę do sterylnej komory hodowlanej. Upewnij się, że pokrywa komory szczelnie się zamyka.
   1. (Opcjonalnie) Aby zapobiec tworzeniu się kolonii bakteryjnych na górnej powierzchni agaru, należy ułożyć warstwę wolnego od bakterii podłoża agarowego z kroku 3.6.1 na górze, zanim podłoże z kroku 3.7 całkowicie stwardnieje. Spowoduje to utworzenie strefy wolnej od bakterii w górnej części NGT-3D.
   2. W przypadku NGT-3D wlej 6,5 ml pożywki do przezroczystych plastikowych probówek o pojemności 8 ml, aby utworzyć warstwę agaru bakteryjnego, i ostrożnie dozuj 200 μl pożywki wolnej od bakterii na częściowo utwardzoną pożywkę 3D, aby utworzyć cienką warstwę wolną od bakterii na wierzchu.
   3. W przypadku NGB-3D wlej 65 ml pożywki do przezroczystej plastikowej butelki do hodowli komórkowych o średnicy 25 cm². Ilość ta powinna wypełnić korpus butelki z kulturą komórkową o średnicy 25 cm2.
8. Pozostaw komory pionowo w temperaturze pokojowej na jeden tydzień, aby kolonie bakteryjne mogły urosnąć do znacznych rozmiarów o średnicy co najmniej 1 mm.
   1. (Opcjonalnie) W przypadku testu żywotności w NGT-3D przykryj komory folią aluminiową, aby zapobiec degradacji światła FUdR.

4. Zmierz przydatność populacji robaków na NGT-3D (test względnej wielkości lęgu)

1. Wybierz ślimak etapowy L4 za pomocą platynowego drucianego kilofa i przenieś na wolną od bakterii płytkę NGM. Pozwól robakowi swobodnie poruszać się przez kilka minut, aby usunąć bakterie przyczepione do jego ciała.
2. Powtórz krok 4.1 i upewnij się, że robak jest wolny od bakterii. Generalnie wystarczą dwa powtórzenia 4,1.
3. Ostrożnie umieść czystego robaka na powierzchni nośnika 3D za pomocą platynowego drucianego szpikulca. Robak powinien w końcu dostać się do agaru do matrycy agarowej 3D.
4. Zamknij luźno pokrywę, pozwalając trochę powietrza dostać się do probówki, ale zapobiegając wysuszeniu podłoża agarowego.
5. Inkubować przez 96 godzin w temperaturze 20 °C.
6. Po 4 dniach szczelnie zamknij pokrywki i umieść komorę hodowlaną NGT-3D w łaźni wodnej o temperaturze 88 °C, aby stopić agar. Ciepło zabija robaki, ale ich ciała pozostają nienaruszone.
   UWAGA: Używając probówek o pojemności 8 ml do NGT-3D, zwykle wystarcza 20 - 30 minut inkubacji.
7. Za pomocą szklanej pipety przenieś stopioną pożywkę na plastikową szalkę Petriego o średnicy 9 cm. Nie zaleca się używania plastikowych pipet, ponieważ robaki często mogą się do nich przyklejać.
8. Używając transmisyjnego mikroskopu stereoskopowego, policz liczbę robaków w stadium L3, L4 i dorosłym. Nie licz robaków w stadium L2 i młodszych, ponieważ pokolenia F1 i F2 mogą być tutaj mylone. W związku z tym test ten jest testem względnej wielkości lęgu, a nie testem całkowitej wielkości lęgu.

5. Obraz i zapis zachowania robaka na NGB-3D

1. Wybierz robaka etapowego L4 za pomocą platynowego drucianego wykałacza i usuń wszelkie bakterie przyklejone do powierzchni, przenosząc go na wolną od bakterii płytkę NGM i pozwalając mu swobodnie poruszać się przez kilka minut.
2. Powtórz krok 5.1, aby upewnić się, że robak jest wolny od bakterii.
3. Ostrożnie umieść czystego robaka na środku powierzchni agaru NGB-3D w pobliżu szyjki butelki za pomocą platynowego drucianego szpikulca. Robak powinien w końcu dostać się do agaru do matrycy agarowej 3D.
4. Zamknij luźno pokrywę, pozwalając trochę powietrza dostać się do probówki, jednocześnie zapobiegając wysuszeniu podłoża agarowego.
5. Zobrazuj lub nagraj robaka pod transmisyjnym stereoskopowym mikroskopem preparacyjnym. Dostosuj ostrość, gdy robak porusza się po matrycy 3D.

Wyniki

Budowa NGT-3D to prosty i nieskomplikowany protokół, którego wynikiem jest wypełniona agarem probówka z małymi koloniami bakterii rozmieszczonymi w całym agarze (Rysunek 1A). Robaki mogą swobodnie przemieszczać się przez matrycę agarową, znajdując i zjadając kolonie bakterii. Aby potwierdzić, czy C. elegans może się rozmnażać i normalnie rosnąć w NGT-3D, porównaliśmy płodność i rozwój larw w 3D ze standardowymi płytkami 2D NGM. W teście względnej wielkości lęgu d...

Dyskusja

Laboratoryjna hodowla C. elegans przy użyciu klasycznych pożywek dla nicieni miała kluczowe znaczenie dla setek ważnych odkryć, które dostarczyły badania nad C. elegans . W tym miejscu przedstawiamy nowe metody hodowli C. elegans w środowisku, które dokładniej odzwierciedla ich naturalne trójwymiarowe siedliska. Chociaż do obserwacji C. elegans w 3D¹³ zastosowano inne metody, jest to pierwszy protokół, który pozwala na hodowlę robaków w stałej matrycy 3D. Dwie pokazane tutaj...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Rosół LB, Miller (Luria-Bertani)	Difco	224620
Chlorek sodu	DAEJUNG	7548-4400	58,44 MW
Agar, granulowany	Difco	214530
Peptone	Bacto	211677
Chlorek wapnia, dwuwodny	Bio Basic	CD0050	2*H2O; 147,02 MW
Cholesterol	Bio Basic	CD0122	386,67 MW
Alkohol etylowy	B& J	RP090-1	99,99%; 46,07 MW
Siarczan magnezu, bezwodny	Bio Basic	MN1988	120,37 MW
Fosforan potasu, jednozasadowy, bezwodny	Bio Basic	PB0445	136,09 MW
2'-deoksy-5-fluorourydyna	Tokio Przemysł chemiczny	D2235	246,19 MW
Fosforan potasu, dwuzasadowy, bezwodny	Bio Basic	PB0447	174,18 MW
Wielofunkcyjne probówki	Stockwell Scientific	ST.8570	ml
Zamknięcia probówek	Stockwell Scientific	ST.8575
Kolba do hodowli komórkowych	SPL Lifescience	70125	25 cm2
Research Mikroskop stereoskopowy	Nikon	SMZ18
Głowica kolorowego aparatu o wysokiej rozdzielczości	Nikon	DS-Fi2
Jednostka sterująca oparta na komputerze	Nikon	DS-U3
NIS-Elements Badania podstawowe, oprogramowanie do obrazowania mikroskopowego	Nikon	MQS32000