Ten protokół opisuje procedurę chirurgiczną mającą na celu stworzenie modelu tętniczego nadciśnienia płucnego wywołanego przepływem (PAH) u szczurów oraz procedury analizy głównych hemodynamicznych i histologicznych punktów końcowych w tym modelu.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Chirurgia zastawkowa, cewnikowanie prawego serca i morfometria naczyniowa w modelu szczurzym dla tętniczego nadciśnienia płucnego wywołanego przepływem
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
W tym protokole, PAH jest indukowane przez połączenie wstrzyknięcia monokrotaliny (MCT) w dawce 60 mg/kg ze zwiększonym przepływem krwi w płucach przez zastawkę aortalno-kablastyczną (MCT+Flow). Zastawka jest tworzona przez wprowadzenie igły 18-G z aorty brzusznej do sąsiedniej żyły głównej. Wykazano, że zwiększony przepływ w płucach jest niezbędnym czynnikiem wyzwalającym ciężką postać TNP z odrębnymi fazami progresji choroby, charakteryzującymi się wczesnym przerostem przyśrodkowym, a następnie zmianami neointymalnymi i postępującą niedrożnością małych naczyń płucnych. Aby zmierzyć hemodynamikę prawego serca i płuc w tym modelu, cewnikowanie prawego serca wykonuje się poprzez wprowadzenie sztywnej kaniuli zawierającej elastyczny cewnik z końcówką kulkową przez prawą żyłę szyjną do prawej komory. Cewnik jest następnie wprowadzany do głównej i bardziej dystalnej tętnicy płucnej. Histopatologię układu krążenia płuc ocenia się jakościowo, oceniając naczynia przed- i wewnątrzzrazikowe na podstawie stopnia umięśnienia i obecności neointimy, a ilościowo, mierząc grubość ściany, stosunek ściany do światła i wynik zgryzu.
Wprowadzenie
Celem tej metody jest stworzenie powtarzalnego modelu ciężkiego, wywołanego przepływem tętniczego nadciśnienia płucnego u szczurów i zmierzenie jego głównych hemodynamicznych i histopatologicznych punktów końcowych.
Tętnicze nadciśnienie płucne (PAH) to kliniczny zespół, który obejmuje postępujący wzrost oporu naczyniowego płuc, prowadzący do niewydolności prawej komory i śmierci. W spektrum chorób nadciśnieniowych płuc (PH) TNP jest najcięższą postacią i pozostaje bez lekarstwa1. Arteriopatia leżąca u podstaw TNP charakteryzuje się typową formą przebudowy naczyń krwionośnych, która zamyka światło naczynia. Umięśnienie normalnych nieumięśnionych naczyń krwionośnych i przerost warstwy przyśrodkowej naczynia są uważane za wczesne zjawiska chorobowe w TNP, są również obserwowane w innych formach PH2 i są uważane za odwracalne3. Wraz z postępem PAH, warstwa wewnętrzna zaczyna się przebudowywać, ostatecznie tworząc charakterystyczne zmiany w neointymalnym wnętrzu2. Neointimalna przebudowa naczyń płucnych jest wyłączna dla PAH i jest obecnie uważana za nieodwracalną4.
Ponieważ PAH jest rzadką chorobą, postęp w jej patobiologicznym zrozumieniu i rozwój nowych terapii opierał się głównie na modelach zwierzęcych. Model monokrotaliny (MCT) u szczurów jest prostym modelem pojedynczego trafienia, który był i nadal jest często stosowany. MCT to toksyna, która powoduje uszkodzenie tętniczek płucnych i regionalne zapalenie5. 60 mg/kg MCT prowadzi do wzrostu średniego ciśnienia w tętnicy płucnej (mPAP), naczyniowego oporu płuc (PVR) i przerostu prawej komory (RVH) po 3 - 4 tygodniach6. Histomorfologia charakteryzuje się izolowanym przerostem przyśrodkowym bez zmian w obrębie neointimalu5. Model szczurzy MCT reprezentuje zatem umiarkowaną formę PH, a nie PAH, chociaż jest powszechnie przedstawiany jako ten drugi.
U dzieci z PAH związanym z wrodzonym zastawką od lewej do prawej (PAH-CHD), zwiększony przepływ krwi w płucach jest uważany za główny czynnik powodujący rozwój zmian w obrębie neointimal7,8,9. U szczurów zwiększony przepływ krwi w płucach może być wywołany przez utworzenie zastawki między aortą brzuszną a żyłą główną, technika opisana po raz pierwszy w 199010. Alternatywą dla zwiększenia przepływu w płucach jest jednostronna pneumonektomia lub zespolenie podobojczykowe z tętnicą płucną11. Wady koncepcyjne tych modeli polegają na potencjalnym kompensacyjnym wzroście pozostałego płuca i aktywacji szlaku adaptacyjnego indukowanej przez pneumonektomię lub jatrogennym uszkodzeniu naczyń płucnych z powodu zespolenia tętnicy płucnej, przy czym oba te czynniki zakłócają skutki zwiększonego przepływu krwi w płucach.
Gdy powstaje zastawka aortalno-kawałowa i indukowany jest zwiększony przepływ krwi w płucach jako drugie uderzenie u szczurów leczonych MCT, pojawiają się charakterystyczne zmiany w neointimalen, a ciężka forma PAH i związana z nią niewydolność prawej komory (RVF) rozwijają się 3 tygodnie po zwiększonym przepływie12. Hemodynamiczna progresja PAH w tym modelu może być oceniana in vivo za pomocą echokardiografii i cewnikowania prawego serca. Histomorfologia naczyń, grubość ścianki naczynia, stopień niedrożności tętniczek i parametry niewydolności prawej komory stanowią filary charakterystyki ex vivo PAH.
Ta metoda opisuje szczegółowe protokoły operacji zastawki aortalno-kawitalnej (AC-shunt), cewnikowania prawego serca oraz jakościowej i ilościowej oceny histomorfologii naczyniowej.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Holenderską Centralną Komisję ds. Doświadczeń na Zwierzętach oraz Komisję ds. Opieki nad Zwierzętami w University Medical Center Groningen (NL). Wykorzystano szczury linii Wistar oraz Lewis o masie ciała od 180 do 300 g.
1. Zakwaterowanie i aklimatyzacja
- Po przybyciu do centralnego zwierzęcia, umieść szczury w klatkach po 5 osobników w grupie. W trakcie 7-dniowego okresu aklimatyzacji oswajaj szczury z kontaktem z człowiekiem, nie przeprowadzając żadnych procedur eksperymentalnych.
2. Przygotowanie i wstrzyknięcie sterylnej monokrotaliny
- Aby przygotować 1 mL roztworu monokrotaliny (MCT) o stężeniu 60 mg/mL, odważ 60 mg monokrotaliny do probówki o pojemności 2 mL. Dodaj 700 µL 0,9% NaCl. Dodaj 200 µL 1 M HCl. Podgrzej roztwór w probówce pod strumieniem ciepłej wody z kranu i wymieszaj na wirówce typu vortex. Użyj 6 N NaOH, aby doprowadzić pH do poziomu około 7,0. Podczas przygotowania MCT do wstrzyknięcia gryzoniom stosuj technikę sterylną.
- Wstrzyknij podskórnie w okolice karku 1 mL sterylnego roztworu MCT o stężeniu 60 mg/mL na kg masy ciała (0,3 mL 60 mg/mL MCT dla szczura o masie 300 g). UWAGA: Preferujemy nie stosować mniejszych objętości ze względu na większe ryzyko podania nieodpowiedniej dawki.
3. Operacja przeczynienia aortalno-kawnego
- Znieczulenie.
- Napełnić komorę indukcyjną mieszaniną 5% izofluranu i 100% O22 (przepływ: 1 l/min) i umieść szczura w komorze. Sprawdź głębokość znieczulenia, wykonując ucisk palca kończyny tylnej. Zważ szczura.
- Wygolić i oczyścić brzuch na obszarze o długości około 8 cm i szerokości 3 cm. Umieścić szczura na plecach na macie grzewczej (37 °C) przykryte sterylną matą.
- Umieść pysk w masce/lejku wentylacyjnym z 2–3% izofluranem/100% O22 (przepływ: 1 L/min). Sprawdzić głębokość znieczulenia, wykonując uciśnięcie palca tylnej łapy. Nałożyć maść do oczu, aby zapobiec ich wysychaniu podczas znieczulenia.
- Operacja zespolenia (shunt).
- Przetrzeć skórę chloreksydyną w celu dezynfekcji. Wstrzyknąć podskórnie buprenorfinę w dawce 0,01 mg/kg w celu zapewnienia przeciwbólowego działania pooperacyjnego.
- Do operacji należy użyć sterylnych narzędzi. Za pomocą ostrza skalpela nr 10 wykonać nacięcie wzdłuż linii pośrodkowej brzucha, zaczynając 1 cm poniżej przepony i prowadząc je w dół, aż do obszaru tuż nad narządami płciowymi.
- Unieś jelito za pomocą patyczka bawełnianego, przykryj jelita sterylną, wilgotną gazą (0,9% NaCl) i przesuń je na lewą stronę ciała zwierzęcia.
- Za pomocą patyczków bawełnianych oddziel błony łączące aortę brzuszną i żyłę główną dolną z otaczającymi je tkankami.
UWAGA: Nie należy rozcinać błon znajdujących się pomiędzy aortą a żyłą główną. - Za pomocą pęsety anatomicznej usunąć okołonaczyniową tkankę tłuszczową aorty powyżej rozwidlenia, wyłącznie po prawej stronie aorty i tylko w miejscu, w którym zostanie wprowadzona igła.
- Za pomocą patyczków watnych oddziel aortę i żyłę główną na 2 mm powyżej miejsca wprowadzenia igły, aby stworzyć miejsce na zacisk Biemera.
- W tym obszarze należy najpierw założyć luźną ligaturę (szew 5-0) wokół aorty. Napiąć ligaturę, zakładając na nią kleszczyki Kochera, a następnie umieścić kleszczyki Kochera powyżej nacięcia (Rysunek 1A). Umieść zacisk Biemera bezpośrednio nad podwiązką (Rysuneke 1A).
- Za pomocą patyczka higienicznego uciśnij żyłę główną tak dystalnie, jak to możliwe, aby zablokować przepływ (Rysunek 1A). Zgiąć igłę (w tym protokole 18 G) pod kątem 45 stopni tak, aby otwór był skierowany na zewnątrz (Rysunek 1A).
- Pod kątem 90 stopni wprowadzić igłę do aorty, tuż powyżej rozwidlenia, tak aby otwór igły był skierowany w lewo (Rysunek 1A). Przesuń końcówkę igły w lewo i wprowadź ją do żyły głównej.
UWAGA: Końcówka igły powinna być teraz widoczna w żyle głównej (Rysunek 1B). - Użyj drugiego patyczka bawełnianego, aby wypchnąć pozostałą w aorcie krew z miejsca wkłucia w celu zapobiegania zakrzepicy. Osusz obszar wokół bocznego zespolenia (shuntu) za pomocą sterylnej gazy, aby klej mógł odpowiednio przywrzeć.
- Wyciągnij całkowicie igłę z aorty i natychmiast nanieś kroplę kleju tkankowego na miejsce nakłucia w aorcie. Upewnij się, że patyczek watny nie przykleił się do tkanki. Zwolnij zacisk na aorcie.
- Zweryfikuj działanie bocznikowania manualnie, pociągając za ligaturę na aorcie proksymalnie względem bocznika, a następnie ją puszczając. Rozluźnienie powinno spowodować zabarwienie żyły głównej dystalnie względem bocznika na jaskrawoczerwono oraz wytworzyć turbulencje w miejscu zespolenia bocznika.
UWAGA: Zaciśnięcie spowoduje powrót krwi w żyle głównej do ciemnoczerwonego koloru. - Umieść jelita z powrotem w organizmie zwierzęcia. Zamknij warstwę mięśniową i skórę za pomocą wchłanialnych szwów 4-0. Wentyluj zwierzę 100% O2.2 do wybudzenia z znieczulenia.
UWAGA: Nie należy pozostawiać zwierzęcia bez nadzoru do czasu odzyskania przez nie wystarczającej świadomości, aby mogło ono utrzymać pozycję grzbietową.
- Operacja pozorowana.
- Należy przeprowadzić wszystkie powyższe procedury z wyjątkiem wprowadzenia igły do aorty.
- Opieka pooperacyjna.
- Umieść szczura w pojedynczej klatce i włóż go do inkubatora w temperaturze 37 °C do następnego ranka.
- Około 6 h po zabiegu wstrzyknąć podskórnie buprenorfinę w dawce 0,01 mg/kg w celu zapewnienia przeciwbólowej opieki pooperacyjnej. Powtórzyć dawkę następnego ranka, jeśli u szczura wystąpią objawy dyskomfortu.
UWAGA: Przez pierwsze 3 dni po zabiegu szczury wykazują tendencję do zmniejszenia spożycia pokarmu i wody (jest to szczególnie istotne w przypadku mieszania paszy lub wody do picia z lekami). Większość szczurów wraca do normalnego zachowania 3 dni po operacji. W przeciwnym razie należy prowadzić ścisły monitoring. Utratę masy ciała przekraczającą 15% w ciągu 1 tygodnia uznaje się za nieprawidłową; takie osobniki należy poddać eutanazji poprzez upuszczenie całej objętości krwi krążącej w znieczuleniu.
4. Opracowanie PAH
UWAGA: W niniejszym protokole zwierzę jest uśmiercane poprzez odbarczenie krążącej objętości krwi podczas znieczulenia.
- Uśmiercenie zwierząt 1 dzień po operacji (MF8) w celu analizy wczesnych odpowiedzi komórkowych i funkcjonalnych na zwiększony przepływ krwi w płucach (np. nadekspresja genów lub wczesne czynniki transkrypcyjne).
- Uśmiercenie zwierząt 1 tydzień po operacji (MF14) w celu analizy fenotypu naczyniowego PAH we wczesnym stadium (hipertrofia błony środkowej bez zmian neointimalnych).
- Uśmiercenie zwierząt 2 tygodnie po operacji (MF21) w celu analizy fenotypu naczyniowego PAH w stadium zaawansowanym (wyraźna hipertrofia błony środkowej i tworzenie neointimy) z lekkim wzrostem RVP i mPAP.
- Uśmiercenie zwierząt 3 tygodnie po operacji (MF28) w celu analizy fenotypu naczyniowego PAH w stadium końcowym (wyraźne zamknięcie neointimalne) oraz silnym wzrostem RVP i mPAP. W tym stadium często występują kliniczne objawy niewydolności prawej komory.
- Uśmiercenie zwierząt po 28. dniu (MF-RVF) w przypadku wystąpienia związanej z PAH niewydolności prawej komory (RVF), definiowanej klinicznie jako duszność, silna letargia i utrata masy ciała (< 10% w ciągu 1 tygodnia). Eutanazję szczurów przeprowadza się w momencie wystąpienia jednego z tych objawów. Często u szczurów objawy te rozwijają się między 28. a 35. dniem i, w przypadku braku nadzoru, zwierzęta w tym odstępie czasu giną samoistnie.
5. Cewnikowanie prawego serca
- Znieczulenie.
- Napełnić komorę indukcyjną mieszaniną 5% izofluranu i 100% O22 (przepływ: 1 l/min) i umieść szczura w komorze. Sprawdź głębokość znieczulenia, wykonując test uszczypnięcia palca tylnej łapy. Zważ szczura.
- Wygolić i oczyścić skórę w okolicy szyi po prawej stronie brzusznej u szczura, a w przypadku protokołu echokardiografii – również klatkę piersiową oraz górną część brzucha.
- Umieść szczura na plecach na macie grzewczej (37 °C) i umieścić pysk w masce/lejku wentylacyjnym z 2–3% izofluranem/100% O22 (przepływ: 1 l/min). Pysk powinien być skierowany w stronę badacza.
- Sprawdź głębokość znieczulenia. Zachowaj ostrożność w przypadku szczurów z ciężką nadciśnieniem płucnym. Jeśli częstość akcji serca spadnie, zmniejsz głębokość znieczulenia. Zaleca się przeprowadzenie wszystkich pomiarów w ciągu 20 min. Nałóż maść do oczu, aby zapobiec ich wysychaniu podczas znieczulenia.
- Protokół echokardiograficzny.
- Wykonaj badanie echokardiograficzne zgodnie z protokołem opisanym przez Brittaina. i wsp. w JoVE13.
- Protokół cewnikowania.
UWAGA: W niniejszym protokole zastosowano sztywny kaniula z zakrzywioną pod kątem 20 stopni końcówką, służącą do prowadzenia 15-centymetrowego silikonu cewnik z kulką 2 mm od końcówki. Igła 20-G igła z otworem lekko zagiętym do wewnątrz, służy do wprowadzenia kaniuli do prawej żyły szyjnej (patrz lista materiałów). W niniejszym protokole można wykorzystać szczury kontrolne oraz szczury na dowolnym etapie progresji nadciśnienia płucnego (PAH).- Zdezynfekuj szyję chloreksydyną. Wykonaj nacięcie o długości 1,5 cm za pomocą ostrza skalpela nr 10 w prawej, brzusznej części szyi, od prawej obojczyka do kości żuchwy.
- Rozszerzyć tkankę za pomocą nożyczek. Używając pęsety, delikatnie rozsunąć tkankę, aż pojawi się żyła szyjna. Wypreparować błony wokół żyły szyjnej za pomocą pęsety anatomicznej.
- Napięcie żyły szyjnej wywołuje się poprzez założenie luźnej ligatury (szew 5-0) wokół naczynia. Następnie zwiększa się napięcie i przytwierdza ligaturę taśmą do maski wentylacyjnej (Rysunek 2A).
- Za miejscem wprowadzenia kaniuli załóż luźną ligaturę wokół naczynia, którą należy zacisnąć po wprowadzeniu kaniuli in situ aby zapobiec wyciekom i spadkowi ciśnienia.
- Używając uchwytów pęsety, lekko zagnij końcówkę igły 20-G tak, aby otwór był skierowany do wewnątrz, co pozwoli na wprowadzenie kaniuli wraz z cewnikiem.
- Wprowadź końcówkę igły 20 G do żyły i szybko umieść kaniulę z cewnikiem wewnątrz naczynia. Wyjmij igłę, a następnie zaciśnij ligature przygotowaną w kroku 5.3.4.
- Wprowadź kaniulę z cewnikiem do żyły szyjnej. Końcówka kaniuli jest wygięta pod kątem 20 stopni (patrz krok 5.3.5). Przesuń kaniulę pod obojczykiem i posuń ją nieco dalej, aby wejść do prawego przedsionka (Rycina 2C).
- Aby wprowadzić kaniulę do prawej komory, skieruj jej końcówkę w lewo, w stronę serca (Rycina 2D). Na monitorze przyłóżkowym powinna pojawić się krzywa ciśnienia w prawej komorze (RV), odpowiadająca Rysunek 2D.
- Gdy krzywa ciśnienia w prawej komorze jest stała, zapisz skurczowe i rozkurczowe ciśnienie w prawej komorze 1 (sRVP1/dRVP1).
- Przesuń końcówkę kaniuli w lewo i w górę. Wsuń cewnik do wnętrza kaniuli (Rycina 2E).
- Wprowadź cewnik do głównej tętnicy płucnej (PA). Podczas przechodzenia przez zastawkę płucną nie powinno być odczuwalnego oporu.
UWAGA: W momencie wprowadzenia cewnika do głównej tętnicy płucnej ciśnienie rozkurczowe wzrośnie. Na monitorze przyłóżkowym powinna pojawić się krzywa ciśnienia w tętnicy płucnej, odpowiadająca Rysunek 2E. - Gdy krzywa ciśnienia w tętnicy płucnej jest stała, zapisz skurczowe, rozkurczowe i średnie ciśnienie w tętnicy płucnej 1 (sPAP1, dPAP1, mPAP1).
- Wsuń cewnik dalej do wnętrza kaniuli, aż kulka na jego końcówce zakilnuje się w tętnicy płucnej. Obserwuj spadek krzywej ciśnienia na monitorze przy łóżku pacjenta, aż stanie się ona zgodna z krzywą ciśnienia zaklinowania w Rysunek 2F.
- Gdy krzywa ciśnienia zaklinowania jest stała, zapisz skurczowe, rozkurczowe i średnie ciśnienie zaklinowania.
- Powoli wycofaj cewnik, a następnie zmierz i zapisz wartości sPAP2, dPAP2, mPAP2, sRVP2 oraz dRVP2 wyświetlane na monitorze przyłóżkowym.
- Po wprowadzeniu do prawej komory (RV), należy lekko wycofać kaniulę i cewnik, aby zmierzyć średnie ciśnienie w prawym przedsionku (RAP). Krzywa powinna odpowiadać krzywej RAP w Rycina 2A.
UWAGA: W niniejszym protokole szczury są uśmiercane po zakończeniu procedury kaniulacji poprzez pobranie całkowitej objętości krwi krążącej w warunkach znieczulenia.
6. Ocena morfologii i morfometria
UWAGA: W niniejszym protokole zwierzę jest uśmiercane poprzez odbarczenie krążącej objętości krwi podczas znieczulenia. W protokole tym można wykorzystać szczury w dowolnej fazie progresji PAH oraz grupę kontrolną.
- Po uśmierceniu zwierzęcia należy wyciąć płuca, przecinając tchawicę około 5 mm powyżej rozwidlenia oskrzeli oraz naczynia łączące płuca z sercem. Płuca należy umieścić w zimnej soli fizjologicznej. Następnie należy wypreparować lewe płuco i przeciąć lewy oskrzele główne w miejscu rozwidlenia.
- Napełnić strzykawkę o pojemności 50 ml 4-procentową paraformaldehydem, przymocować do niej rurkę z kaniulą i zawiesić strzykawkę około metra nad stołem roboczym. Wprowadzić kaniulę do lewego oskrzela głównego, aby pasywnie wypełnić płuco paraformaldehydem. Z paraformaldehydem należy obchodzić się ostrożnie.
- Inkubować lewe płuco w paraformaldehydzie przez 48 h.
- Odwodnij lewe płuco, inkubując je kolejno w 70% etanolu (1 h), 80% etanolu (1 h), 90% etanolu (1 h), 100% etanolu (3 h), ksylolu (2 h) oraz parafinie (2 h).
- Zatopić lewe płuco w parafinie, tak aby wnęka płuca była skierowana w stronę kasety.
- Barw miejsce woskowe, 4-µm przekroje płuc barwione metodą Verhoeffa lub metodą Elastica-van Gieson, zgodnie z instrukcjami producenta29Upewnij się, że blaszki sprężyste są dobrze zróżnicowane (tak jak w Rycina 3). Przeskanuj barwione przekroje przy 40-krotnym powiększeniu.
- Podziel płuco na 4 kwadranty. W każdym kwadrancie znajdź 10 naczyń o średnicy zewnętrznej < 50 µm (wewnątrzacinarne) oraz 10 naczyń o średnicy zewnętrznej > 50 µm (przedacinarne). Wykonać zdjęcia (2 x 40 zdjęć na płucę). Przypadkowo przybliżyć obraz do 20-krotnego powiększenia i sfotografować każde naczynie w tym polu widzenia, aby zminimalizować błąd selekcji.
- Wyklucz naczynia, których stosunek największej do najmniejszej średnicy wynosi > 2, niepełny kształt okrągły lub zapadnięcie się więcej niż jednej czwartej ściany naczynia.
UWAGA: Przykład wykluczonego naczynia pokazano w Rycina 3b Przygotuj każde zdjęcie w tym samym powiększeniu (40X) i dołącz pasek skali. - Otwórz program ImageJ oraz pierwszy obraz. Narysuj linię prostą na pasku skali na obrazie, aby ustawić skalę za pomocą opcji „Analiza" i Ustaw skalę." Dla "znana odległośćużyj wartości z paska skali na zdjęciu. Użyj mikrometrów (µm)µm) jako jednostkę długości. Ustaw skalę na globalną.
- Używając „zaznaczenia swobodne," narysuj linię na wewnętrznej krawędzi obszaru luminalnego (Rycina 3), oraz zastosowanie pomierz" (ctrl m), aby zmierzyć ten obszar. Następnie narysuj linię wokół zewnętrznej błony sprężystej (Rycina 3) w celu pomiaru całkowitej powierzchni naczyń.
- Oblicz średnicę wewnętrzną i zewnętrzną (
) przy użyciu 
. - Oblicz grubość ścianki za pomocą
. - Oblicz stosunek grubości ściany do światła naczynia za pomocą
. - Oblicz wynik niedrożności za pomocą
. - Oceń stopień umięśnienia naczynia (brak umięśnienia, umięśnienie częściowe lub całkowite) (Rycina 3B).
UWAGA: Naczynia z podwójną blaszka sprężystą obejmującą ponad połowę obwodu definiuje się jako całkowicie umięśnione. Naczynia z podwójną blaszką sprężystą obejmującą mniej niż połowę obwodu definiuje się jako częściowo umięśnione. - Oceń naczynie pod kątem obecności neointimy (tak lub nie) (Rysunek 3C).
UWAGA: Naczynia bez wyraźnie zdefiniowanej wewnętrznej błony sprężystej, połączone z (często ekscentrycznym) zamknięciem światła, definiuje się jako zmiany neointimalne.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Reprezentatywne wyniki przedstawiono na Rysunku 4. Przedstawione wyniki obrazują charakterystykę MCT+FLOW u szczurów linii Lewis w następujących grupach: kontrolnej (n = 3), MF8 (n = 5), MF14 (n = 5), MF28 (n = 5) oraz MF-RVF (n = 10). Analizy statystyczne przeprowadzono przy użyciu jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) z korekcją Bonferroniego.
Podanie 60 mg/kg MCT oraz zwiększony przepływ krwi w płucach p...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Metoda ta opisuje zabieg chirurgiczny zastawki aortalno-kawstawnej u szczurów wstępnie leczonych MCT w celu wytworzenia TNP indukowanego przepływem oraz techniki oceny głównych hemodynamicznych i histopatologicznych punktów końcowych, które charakteryzują TNP i ten model.
Krytyczne kroki w ramach protokołu i rozwiązywanie problemów
Zabiegi chirurgiczne i pooperacyjne. Podczas operacji zastawki aortalno-kawowej najważniejszym etapem jest rozwarstwienie aorty i żyły głów...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
To badanie było wspierane przez Holenderską Inicjatywę Badań nad Układem Sercowo-Naczyniowym, Holenderską Fundację Serca, Holenderską Federację Uniwersyteckich Centrów Medycznych, Holenderską Organizację Badań i Rozwoju Zdrowia oraz Królewską Holenderską Akademię Nauk (CVON nr. 2012-08, PHAEDRA, The Sebald fund, Stichting Hartekind).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Shunt Surgery | |||
| Sterylne rękawiczki | |||
| Duratears Maść do oczu | Alcon | 10380 | |
| Chlorko-heksydyna | |||
| Waciki | |||
| Klej do tkanek histoakrylowych | B. Braun Medical | 1050052 | |
| Silkam 5-0 szwy czarne niewchłanialne | B. Braun Medical | F1134027 | |
| Safil 4-0 szwy fioletowe wchłanialne | B. Braun Medical | ||
| 18 G igła | Luer | NN1838R końcówka BD | wygięta pod kątem 45 stopni |
| Gazy 10 x 10 cm | Paul Hartmann | 407825 | |
| Temgesic Buprenorphine | RB Pharmaceuticals | 5429 | podskórne iniekcja |
| Chlorek sodu 0,9% | |||
| Maska wentylacyjna Ostrze | |||
| Szczura Skalpel | |||
| Biemer zacisk 18 mm, 5 mm otwór | AgnTho | 64-562 | |
| Mata | |||
| Zacisk | |||
| Kocher Maszynka do | |||
| Mikroskop | Leica | ||
| Cewnikowanie prawego serca | |||
| Sterylne rękawiczki | chirurgiczne | ||
| Maść do oczu | Duratears | ||
| Chlorek-Heksydyna | |||
| Waciki | |||
| Gazy 10 x 10 cm | Paul Hartmann | 407825 | |
| Silkam 5-0 szwy czarne niewchłanialne | B. Igła do F1134027 | ||
| Braun 20 G | Luer | Końcówka lekko wygięta do wewnątrz | |
| Kaniula 20 G | Luer | do wprowadzenia cewnika, końcówka wstępnie uformowana w 20 stopniach | |
| Cewnik silastyczny o długości 15 cm kulka | 0,5 mm 2 mm od końcówki | ||
| Przetwornik ciśnienia | Ailtech | ||
| Monitor przyłóżkowy Cardiocap/5 | Datex-Ohmeda Maszynka | ||
| golenia | |||
| 10 ml Strzykawka | |||
| Chlorek sodu 0,9% | do płukania | ||
| Morphology | |||
| 50 mL Strzykawka | |||
| 4% Formaldehyd | |||
| 18 G kaniula z rurką | |||
| Zestaw do barwienia Verhoef | Sigma-Aldrich | HT254 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/ht254?lang=en®ion=US |
| Cyfrowy skaner slajdów | Hamamatsu | C9600 | |
| ImageJ | |||
| Elastyczny (barwienie tkanki łącznej) | Abcam | ab150667 | http://www.abcam.com/elastic-connective-tissue-stain-ab150667.html http://www.abcam.com/ps/products/150/ab150667/documents/ab150667-Elastic%20Stain%20Kit%20(strona internetowa).pdf |
Bibliografia
- Hoeper, M. M., Bogaard, H. J., Condliffe, R., et al. Definitions and diagnosis of pulmonary hypertension. J Am Coll Cardiol. 62, D42-D50 (2013).
- Stacher, E., Graham, B. B., Hunt, J. M., et al. Modern age pathology of pulmonary arterial hypertension. Am J Respir Crit Care Med. 186 (3), 261-272 (2012).
- Levy, M., Maurey, C., Celermajer, D. S., et al. Impaired apoptosis of pulmonary endothelial cells is associated with intimal proliferation and irreversibility of pulmonary hypertension in congenital heart disease. J Am Coll Cardiol. 49 (7), 803-810 (2007).
- Sakao, S., Tatsumi, K., Voelkel, N. F. Reversible or irreversible remodeling in pulmonary arterial hypertension. Am J Respir Cell Mol Biol. 43 (6), 629-634 (2010).
- Gomez-Arroyo, J. G., Farkas, L., Alhussaini, A. A., et al. The monocrotaline model of pulmonary hypertension in perspective. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302 (4), L363-L369 (2012).
- Jones, J. E. Serial noninvasive assessment of progressive pulmonary hypertension in a rat model. Am J Physiol - Heart Circ Physiol. 283 (1), 364-371 (2002).
- Hoffman, J. I., Rudolph, A. M., Heymann, M. A. Pulmonary vascular disease with congenital heart lesions: Pathologic features and causes. Circulation. 64 (5), 873-877 (1981).
- van Albada, M. E., Berger, R. M. Pulmonary arterial hypertension in congenital cardiac disease--the need for refinement of the evian-venice classification. Cardiol Young. 18 (1), 10-17 (2008).
- Dickinson, M. G., Bartelds, B., Borgdorff, M. A., Berger, R. M. The role of disturbed blood flow in the development of pulmonary arterial hypertension: Lessons from preclinical animal models. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 305 (1), L1-L14 (2013).
- Garcia, R., Diebold, S. Simple, rapid, and effective method of producing aortocaval shunts in the rat. Cardiovasc Res. 24 (5), 430-432 (1990).
- Okada, K., Tanaka, Y., Bernstein, M., Zhang, W., Patterson, G. A., Botney, M. D. Pulmonary hemodynamics modify the rat pulmonary artery response to injury. A neointimal model of pulmonary hypertension. Am J Pathol. 151 (4), 1019-1025 (1997).
- van Albada, M. E., Schoemaker, R. G., Kemna, M. S., Cromme-Dijkhuis, A. H., van Veghel, R., Berger, R. M. The role of increased pulmonary blood flow in pulmonary arterial hypertension. Eur Respir J. 26 (3), 487-493 (2005).
- Brittain, E. Echocardiographic assessment of the right heart in mice. JVis Exp. (e81), (2013).
- Dickinson, M. G., Bartelds, B., Molema, G., et al. Egr-1 expression during neointimal development in flow-associated pulmonary hypertension. Am J Pathol. 179 (5), 2199-2209 (2011).
- Borgdorff, M. A., Bartelds, B., Dickinson, M. G., Steendijk, P., de Vroomen, M., Berger, R. M. Distinct loading conditions reveal various patterns of right ventricular adaptation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 305 (3), H354-H364 (2013).
- Ruiter, G., de Man, F. S., Schalij, I., et al. Reversibility of the monocrotaline pulmonary hypertension rat model. Eur Respir J. 42 (2), 553-556 (2013).
- van Albada, M. E., Bartelds, B., Wijnberg, H., et al. Gene expression profile in flow-associated pulmonary arterial hypertension with neointimal lesions. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 298 (4), L483-L491 (2010).
- Dickinson, M. G., Kowalski, P. S., Bartelds, B., et al. A critical role for egr-1 during vascular remodelling in pulmonary arterial hypertension. Cardiovasc Res. 103 (4), 573-584 (2014).
- van der Feen, D. E., Dickinson, M. G., Bartelds, M. G., et al. Egr-1 identifies neointimal remodeling and relates to progression in human pulmonary arterial hypertension. Jheart lung transplant. 35 (4), 481-490 (2016).
- Rungatscher, A. Chronic overcirculation-induced pulmonary arterial hypertension in aorto-caval shunt. Microvasc Res. 94, 73-79 (2014).
- O'Blenes, S. B., Fischer, S., McIntyre, B., Keshavjee, S., Rabinovitch, M. Hemodynamic unloading leads to regression of pulmonary vascular disease in rats. J Thorac Cardiovasc Surg. 121 (2), 279-289 (2001).
- Sakao, S., Taraseviciene-Stewart, L., Lee, J. D., Wood, K., Cool, C. D., Voelkel, N. F. Initial apoptosis is followed by increased proliferation of apoptosis-resistant endothelial cells. FASEB J. 19 (9), 1178-1180 (2005).
- Spiekerkoetter, E. FK506 activates BMPR2, rescues endothelial dysfunction, and reverses pulmonary hypertension. J Clin Invest. 123 (8), 3600-3613 (2013).
- Nickel, N. P., Spiekerkoetter, E., Gu, M., et al. Elafin reverses pulmonary hypertension via caveolin-1-dependent bone morphogenetic protein signaling. Am J Respir Crit Care Med. 191 (11), 1273-1286 (2015).
- Meloche, J., Potus, F., Vaillancourt, M., et al. Bromodomain-containing protein 4: The epigenetic origin of pulmonary arterial hypertension. Circ Res. 117 (6), 525-535 (2015).
- Happé, C. M. Pneumonectomy combined with SU5416 induces severe pulmonary hypertension in rats. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 310 (11), L1088-L1097 (2016).
- Ranchoux, B., Antigny, F., Rucker-Martin, C., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition in pulmonary hypertension. Circulation. 131 (11), 1006-1018 (2015).
- de Raaf, M. A. SuHx rat model: Partly reversible pulmonary hypertension and progressive intima obstruction. Eur Respy J. 44 (1), 160-168 (2014).
- Elastic (Connective Tissue Stain) Instructions for Use. , Available from: http://www.abcam.com/ps/products/150/ab150667/documents/ab150667-Elastic%20Stain%20Kit%20(website).pdf (1506).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
