Artykuł metodologiczny

Analiza korzystnego wpływu suplementów diety na funkcje bariery nabłonkowej jelit podczas eksperymentalnego zapalenia jelita grubego

DOI:

10.3791/55095

⸱

5 stycznia 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Biomedicine, Center for Research and Advanced Studies of the National Polytechnic Institute, 2Department of Physiology, Biophysics and Neurosciences, Center for Research and Advanced Studies of the National Polytechnic Institute, 3Department of Infectomics and Molecular Pathogenesis, Center for Research and Advanced Studies of the National Polytechnic Institute

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecne metody leczenia chorób zapalnych jelit (IBD) mają na celu złagodzenie objawów choroby, ale mogą powodować poważne skutki uboczne. W związku z tym badane są alternatywne strategie w modelach zapalenia jelita grubego u zwierząt. W tym miejscu wyjaśniamy, w jaki sposób analizowany jest korzystny wpływ suplementów diety na kliniczne objawy IBD w takim modelu zapalenia jelita grubego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Choroby zapalne jelit (IBD), w tym choroba Leśniowskiego-Crohna i wrzodziejące zapalenie jelita grubego, są przewlekłymi nawracającymi zaburzeniami jelit. Powodują poważne problemy, takie jak skurcze brzucha, krwawa biegunka i utrata masy ciała u osób dotkniętych chorobą. Niestety, nie ma jeszcze lekarstwa, a leczenie ma na celu jedynie złagodzenie objawów. Obecne metody leczenia obejmują leki przeciwzapalne i immunosupresyjne, które mogą powodować poważne skutki uboczne. Uzasadnia to poszukiwanie alternatywnych opcji leczenia, takich jak suplementy diety, które nie powodują skutków ubocznych. Przed zastosowaniem w badaniach klinicznych takie związki muszą zostać rygorystycznie przetestowane pod kątem skuteczności i bezpieczeństwa na modelach zwierzęcych. Wiarygodnym modelem eksperymentalnym jest model zapalenia jelita grubego z siarczanem dekstranu sodu (DSS) u myszy, który odtwarza wiele objawów klinicznych wrzodziejącego zapalenia jelita grubego u ludzi. Niedawno zastosowaliśmy ten model do przetestowania korzystnego działania suplementu diety zawierającego witaminy C i E, L-argininę i ω3-wielonienasycone kwasy tłuszczowe (PUFA). Przeanalizowaliśmy różne parametry choroby i stwierdziliśmy, że suplement ten był w stanie złagodzić powstawanie obrzęków, uszkodzenia tkanek, infiltrację leukocytów, stres oksydacyjny i produkcję cytokin prozapalnych, co prowadzi do ogólnej poprawy wskaźnika aktywności choroby. W tym artykule szczegółowo wyjaśniamy prawidłowe stosowanie suplementów diety przy użyciu modelu zapalenia jelita grubego DSS u myszy C57Bl/6, a także sposób oceny parametrów chorobowych, takich jak histologia, stres oksydacyjny i stan zapalny. Analiza korzystnego wpływu różnych suplementów diety może ostatecznie otworzyć nowe możliwości rozwoju alternatywnych strategii leczenia, które łagodzą objawy IBD i/lub przedłużają fazy remisji, nie powodując poważnych skutków ubocznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zapalenie jelita grubego to stan zapalny jelita grubego, który może powodować biegunkę i bóle brzucha. Zapalenie jelita grubego może być ostre, w odpowiedzi na infekcję lub stres, lub może rozwinąć się jako choroba przewlekła, taka jak wrzodziejące zapalenie jelita grubego (UC), które należy do grupy chorób zapalnych jelit (IBD). Chociaż objawy kliniczne WZJG zostały dobrze opisane, patogeneza jest nadal słabo poznana1. Eksperci zgadzają się, że WZJG jest chorobą wieloczynnikową, w której główną rolę odgrywają mutacje genetyczne i nieprawidłowe odpowiedzi immunologiczne2. Jednak czynniki środowiskowe, takie jak styl życia i odżywianie, również przyczyniają się do rozwoju i progresji choroby3.

Niestety, IBD nie jest uleczalne, ale istnieje wiele opcji leczenia, które mają na celu złagodzenie objawów klinicznych. Obecne metody leczenia obejmują leki przeciwzapalne, takie jak sulfasalazyna i kortykosteroidy; leki immunosupresyjne, takie jak azatiopryna; przeciwciała monoklonalne, które wychwytują cytokiny prozapalne, takie jak czynnik martwicy nowotworu-α (TNF-α), lub blokują cząsteczki adhezyjne, takie jak integryny, w celu zmniejszenia nadmiernej rekrutacji leukocytów; oraz inhibitory, które celują w kinazy, które wyzwalają szlaki prozapalne, takie jak kinaza janusowa (JAK)4. Nie wszyscy pacjenci reagują na wszystkie metody leczenia, dlatego strategie terapeutyczne muszą być zindywidualizowane5. Co więcej, większość z tych leków terapeutycznych zakłóca metabolizm i odpowiedź immunologiczną, często powodując poważne skutki uboczne. Z tego powodu zbadano alternatywne opcje leczenia.

Alternatywne metody leczenia obejmują probiotyki i suplementy diety, które były stosowane w modelach zwierzęcych i badaniach klinicznych z różnym powodzeniem6,7. Niedawno odkryliśmy, że stosowanie różnych pojedynczych suplementów diety, takich jak witaminy przeciwutleniające lub ω3-wielonienasycone kwasy tłuszczowe (PUFA), jest gorsze niż stosowanie kombinacji takich suplementów w łagodzeniu objawów zapalenia jelita grubego i chorób sercowo-naczyniowych8,9. Badania te przeprowadzono na myszach, więc badania kliniczne muszą być przeprowadzone na ludziach, aby ustalić, czy te wyniki będą miały również zastosowanie u ludzi. Przed rozpoczęciem badań klinicznych należy ocenić skuteczność i bezpieczeństwo nowych opcji leczenia na modelach zwierzęcych.

Dla IBD, model siarczanu dekstranu sodu (DSS) jest szeroko stosowany do badania mechanizmów rozwoju choroby i korzystnego wpływu leków i suplementów diety6,10. W większości badań wywoływana jest tylko ostra choroba w okresie siedmiu dni; niemniej jednak objawy kliniczne obserwowane u tych zwierząt są bardzo podobne do tych obserwowanych u pacjentów z IBD (tj. krwawa biegunka, utrata masy ciała, dysfunkcja nabłonka i infiltracja komórek odpornościowych)10. DSS indukuje nadżerki błony śluzowej, powodując dysfunkcję bariery i zwiększoną przepuszczalność nabłonka jelitowego11. Dokładny mechanizm pozostaje nieznany. Jednak badanie sugeruje, że DSS oddziałuje z kwasami tłuszczowymi o średniej długości łańcucha, tworząc nanolipokompleksy, które są w stanie wniknąć do komórek nabłonka i indukować zapalne szlaki sygnałowe12. W tym artykule szczegółowo opisujemy, w jaki sposób indukuje się i analizuje zapalenie jelita grubego u myszy, w jaki sposób suplementy diety są stosowane przez zgłębnik, aby zapewnić stałą dawkę u każdego zwierzęcia oraz jak badany jest wpływ takich suplementów na różne objawy zapalenia jelita grubego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Wykorzystania w Cinvestav.

1. Przygotowanie wody pitnej DSS i indukcja zapalenia jelita grubego

  1. Przygotuj 3,5% w/v roztwór siarczanu dekstranu sodu (DSS) w autoklawowanej wodzie pitnej. DSS łatwo się rozpuszcza i nie jest wymagane filtrowanie końcowego roztworu.
    UWAGA: 7-dniowa terapia DSS wywołuje ciężkie zapalenie jelita grubego. W przypadku wywoływania łagodnego zapalenia jelita grubego zaleca się 3-4 dni leczenia. Dopóki woda pitna DSS pozostaje czysta, nie ma potrzeby jej wymiany. Jeśli jednak stanie się mętny, należy go wymienić.
  2. Zapisz masę wyjściową samców myszy. Upewnij się, że dziecko ma od 8 do 12 tygodni i waży od 21 do 25 g.
    UWAGA: Odpowiednie stężenie DSS musi być zoptymalizowane w każdym laboratorium. Wyniki mogą się znacznie różnić w zależności od warunków mieszkaniowych. Stężenia między 2,5 - 5% są zwykle zgłaszane jako wywołujące silne zapalenie jelita grubego u myszy C57Bl / 6J WT10. DSS różnych firm i różnych partii powinien zostać przetestowany, ponieważ wyniki mogą się również różnić w zależności od różnych źródeł DSS.
  3. Zapewnij wodę ad libitum i w razie potrzeby zastąp ją świeżą 3,5% wodą DSS.

2. Stosowanie suplementów diety przez Gavage

  1. Przygotuj "nadający się do karmienia" roztwór pożądanych suplementów diety w odpowiednim rozpuszczalniku. W tym badaniu użyliśmy mieszaniny zawierającej 200 mg/kg L-argininy, 83 mg/kg witaminy C, 46 mg/kg witaminy E, 77 mg/kg kwasu eikozapentaenowego (EPA) i 115 mg/kg kwasu dokozaheksaenowego (DHA) w roztworze 1:1 wody i oleju szafranowego.
  2. Napełnij strzykawkę o pojemności 1 ml podłączoną do igły do zgłębnika (15 G x 50 mm) mieszanką suplementów diety. Wytrzeć zewnętrzną część igły do zgłębnika, aby usunąć wszelkie związki znajdujące się poza igłą i zapewnić prawidłowe podanie dawki.
  3. Powstrzymaj mysz, chwytając jedną ręką podstawę ogona i mocno chwytając fałd skórny z tyłu szyi kciukiem i palcem wskazującym drugiej ręki. Umieść ogon między trzecim palcem a podstawą kciuka tej samej ręki, która trzyma szyję.
  4. Utrzymując mysz w pozycji pionowej, włóż igłę po lewej stronie pyska zwierzęcia i ostrożnie podążaj za podniebieniem, aby zlokalizować przełyk. Jeśli nie napotkasz oporu, przesuń igłę w kierunku żołądka.
    UWAGA: Przed kontynuowaniem sprawdź, czy zwierzę oddycha prawidłowo.
  5. Podawać mieszaninę powoli, wyjąć rurkę, powoli wyciągając strzykawkę, a następnie zwolnić przycisk myszy. Stosuj suplementy diety raz dziennie przez zgłębnik w trakcie eksperymentu z zapaleniem jelita grubego.

3. Wyznaczanie wskaźnika aktywności choroby

UWAGA: Wskaźnik aktywności choroby jest kombinacją wyników utraty wagi, krwawienia okołoodbytniczego i konsystencji stolca, które uzyskuje się codziennie13.

  1. Codziennie mierz masę ciała i przypisz wynik od 0 do 4 w zależności od procentu utraty wagi (0: 0%, 1: 1 - 5%, 2: 5 - 10%, 3: 10 - 20% i 4: > 20%).
    UWAGA: Utratę masy ciała określa się poprzez obliczenie procentowej różnicy między masą podstawową przed indukcją zapalenia jelita grubego DSS a rzeczywistą wagą.
  2. Aby określić poziom krwawienia okołoodbytniczego, pobierz świeżą próbkę kału i za pomocą dołączonych aplikatorów nałóż cienki rozmaz na szkiełko z zestawu do badania krwi utajonej w kale gwajakowym. Do każdej próbki należy użyć świeżego aplikatora.
    1. Zamknij pokrywę z przodu i otwórz okienko z tyłu prowadnicy. Nałóż dwie krople roztworu deweloperskiego na tył w przykładowej lokalizacji.
    2. Odczytaj wyniki po 30 sekundach. Każdy ślad niebieskiego koloru jest pozytywny dla krwi utajonej. Przypisz wynik od 0 do 4 (0: brak, 0,5 - 2,5: dodatni wynik testu na krew utajoną w kale gwajakowym (w zależności od siły sygnału) i 3 - 4: duże krwawienie).
      UWAGA: Jeśli krew w stolcu jest widoczna, nie trzeba wykonywać testu na krew utajoną w kale gwajakowym i przypisuje się wynik 3, 3,5 lub 4, w zależności od ilości widocznej krwi.
  3. Określ konsystencję kału, obserwując świeżą próbkę kału. Przypisz wynik od 0 do 4 (0: normalny/stały, 0,5 - 2,5: stolec o konsystencji pasty i 3 - 4: biegunka).

4. Określanie przepuszczalności nabłonka jelitowego in vivo za pomocą testu Evans Blue

  1. Znieczulić zwierzęta, wstrzykując im dootrzewnowo mieszaninę ketaminy (100 mg/kg masy ciała) i ksylazyny (13 mg/kg masy ciała) rozcieńczonej w roztworze soli fizjologicznej (0,9% NaCl) i ocenić głębokość znieczulenia, monitorując odruch odstawienia szczypania.
  2. Umieść znieczulone zwierzęta w pozycji leżącej na plecach i wykonaj laparotomię, aby odsłonić jelita.
  3. Zlokalizuj jelito ślepe i wykonaj małe nacięcie w bliższym segmencie okrężnicy wstępującej (najlepiej bezpośrednio przylegającej do jelita ślepego).
  4. Włóż igłę do karmienia (G22) i zabezpiecz ją ligaturą za pomocą zwykłej nici jedwabnej. Ostrożnie przepłucz obfity PBS przez rurkę, aby wypłukać cały kał z okrężnicy. Wkraplać niebieski roztwór Evansa (1,5% w/v w PBS) do jelita grubego, aż dotrze do odbytu.
  5. Inkubuj błękit Evansa przez 15 minut. Wypłucz barwnik, przepłukując probówkę dużą ilością PBS, aż wypłukanie okołoodbytnicze będzie czyste.
  6. Poddaj zwierzęta eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy.
  7. Wyciąć okrężnicę i ponownie przepłukać ją obfitym PBS. Spłucz raz 1 ml 6 mM N-acetylocysteiny w PBS, aby wyeliminować wszelkie barwniki przywierające do śluzu okrężnicy.
  8. Przeciąć okrężnicę wzdłuż i ponownie przepłukać ją PBS i 1 ml 6 mM N-acetylocysteiny.
  9. Zapisz wagę i długość. Aby wyekstrahować niebieski barwnik Evansa, umieść okrężnicę w 2 ml N,N-dimetyloformamidu na noc w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem. Zmierzyć stężenie barwnika spektrofotometrycznie przy długości fali 610 nm.

5. Pobieranie tkanek

  1. Znieczulić zwierzęta, wstrzykując im dootrzewnowo mieszaninę ketaminy (100 mg/kg masy ciała) i ksylazyny (13 mg/kg masy ciała) rozcieńczonej w roztworze soli fizjologicznej (0,9% NaCl) i ocenić głębokość znieczulenia, monitorując odruch odstawienia szczypania.
  2. Poddaj zwierzęta eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy.
  3. Ułóż zwierzęta w pozycji leżącej na plecach i wykonaj laparotomię, aby odsłonić jamę brzuszną.
  4. Za pomocą nożyczek wypreparuj całą okrężnicę i zapisz jej długość.
  5. Ostrożnie przepłucz okrężnicę kilka razy schłodzonym PBS, aby usunąć kał. Zapisać masę tkanki i przygotować się do następujących eksperymentów, zgodnie z opisem w krokach 5.6 - 5.8.
  6. W przypadku izolacji RNA i testów mieloperoksydazy (MPO) należy odciąć próbkę tkanki o odpowiedniej wielkości (zwykle wystarcza 100 mg), umieścić ją w probówce i zatrzaskowo zamrozić w ciekłym azocie. Chusteczki należy przechowywać w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości.
  7. W celu barwienia immunofluorescencyjnego i oznaczania stresu oksydacyjnego (patrz poniżej) wytnij małą próbkę jelita grubego (0,5 - 1 cm) i zanurz ją w małych aluminiowych kubkach wypełnionych związkiem o optymalnej temperaturze cięcia (OCT). Umieść kubki na suchym lodzie i pozwól im powoli zamarznąć, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków. Zamrożone próbki tkanek można przechowywać w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości.
  8. W przypadku bułek szwajcarskich14 otwórz okrężnicę wzdłużnie i ostrożnie usuń kał za pomocą kleszczy. Zwiń go błoną śluzową skierowaną do wewnątrz, używając kleszczyków z cienką końcówką lub cienkiego, okrągłego drewnianego patyczka. Ostrożnie umieść go w kasecie do osadzania i przejdź do kroku 6.1.
    UWAGA: DSS wywołuje uszkodzenia w okrężnicy. Jednak rozkład uszkodzeń różni się od proksymalnej do dystalnej okrężnicy, przy czym większość uszkodzeń zwykle obserwuje się w dystalnej okrężnicy i odbytnicy. Dlatego zalecamy analizę histologii albo w dystalnej części jelita grubego, albo w szwajcarskich rolach całej okrężnicy.

6. Analiza histologii jelita grubego za pomocą barwienia hematoksyliny-eozyny

  1. Przygotowanie tkanek
    1. W celu analizy histologicznej zanurz szwajcarskie bułki lub małe kawałki tkanek z niektórych obszarów okrężnicy kontrolnej i leczonych myszy w 5 ml 10% formaldehydu przez 48 godzin w temperaturze pokojowej (RT), aby uzyskać prawidłowe utrwalenie.
      UWAGA: Wszystkie dalsze kroki w kroku 6 są wykonywane w RT, chyba że wskazano inaczej.
    2. Myj je wodą z kranu przez 18 godzin.
    3. Odwodnić je 15 ml 70% etanolu przez 1 godzinę, 96% przez 1 godzinę i absolutnym etanolem przez 1 godzinę. Powtórz każdy krok ze świeżym alkoholem przed przejściem do następnego stężenia.
    4. Kontynuować odwadnianie w mieszaninie 7,5 ml bezwzględnego etanolu i 7,5 ml bezwzględnego ksylenu przez 1 godzinę. Powtórzyć raz przed przekazaniem próbek do 15 ml bezwzględnego ksylenu przez 1 godzinę. Powtórzyć ten krok raz ze świeżym ksylenem.
  2. Osadzanie próbek tkanek jelita grubego w parafinie
    1. Zanurz próbki w 50 ml ciekłej parafiny na 17 godzin. Powtórz ten krok raz, ale tylko przez 3 godziny.
    2. Zanurz próbki w kostkach (plastikowa, kwadratowa forma, rozmiar: 22 x 22 x 22 mm) w 810 ml ciekłej parafiny.
    3. Pozostawić parafinę z próbkami tkanki jelita grubego do zestalenia się przez 24 godziny w temperaturze pokojowej.
  3. Cięcie przekrojów tkanek za pomocą mikrotomu
    1. Wyciąć próbki jelita grubego za pomocą mikrotomu, zgodnie z instrukcjami producenta, o grubości 5 μm.
    2. Zbierz kawałki w łaźni wodnej (1 l) zawierającej 0,3% żelatyny. Zapobiega to fałdowaniu się przekrojów poprzecznych tkanek. Odzyskaj skrawki tkanki i zamontuj je na szkiełkach podstawowych.
  4. Barwienie przekrojów tkanek hematoksyliną i eozyną
    1. Odparafinować próbki przez 18 godzin w temperaturze 60 °C w inkubatorze. W tym celu użyj stojaka na szklane prowadnice z uchwytem.
    2. Po odparafinowaniu zanurzyć szkiełka w 70 ml ksylenu absolutnego na 5 minut. Powtórzyć ten krok raz ze świeżym ksylenem.
    3. Przenieść próbki do 70 ml alkoholu bezwodnego na 1 minutę. Powtórzyć ten krok raz ze świeżym alkoholem.
    4. Próbki tkanki jelita grubego inkubować w 70 ml etanolu 96% przez 1 minutę. Powtórzyć ten krok raz ze świeżym alkoholem.
    5. Umyj próbki w wodzie z kranu dwa razy przez 2 sekundy.
    6. Inkubować tkanki w hematoksylinie Harrisa przez 7 minut.
    7. Umyj próbki w wodzie z kranu dwa razy przez 2 sekundy.
    8. Próbki inkubować w kwaśnym alkoholu (70 ml etanolu 70% i 700 μl 1 M kwasu solnego) przez 7 s.
    9. Umyj próbki w wodzie z kranu dwa razy przez 2 sekundy.
    10. Próbki tkanek inkubować w 70 ml węglanu litu (1 g węglanu litu w 100 ml wody destylowanej) przez 7 s.
    11. Umyj próbki w wodzie z kranu dwa razy przez 2 sekundy.
    12. Próbki inkubować w 70 ml etanolu 80% przez 1 minutę.
    13. Przenieść próbki do 70 ml Eozyny-Y na 15 s.
    14. Inkubuj je w 70 ml 96% etanolu przez 1 minutę. Powtórz ten krok raz ze świeżym alkoholem.
    15. Próbki tkanek inkubować w 70 ml absolutnego alkoholu etylowego (alkohol etylowy bezwodny) przez 1 minutę. Powtórzyć ten krok raz ze świeżym alkoholem.
    16. Próbki inkubować w 70 ml mieszaniny 35 ml alkoholu bezwodnego i 35 ml ksylenu bezwzględnego przez 1 minutę.
    17. Przenieść próbki do 70 ml ksylenu bezwzględnego na 1 minutę. Powtórzyć ten krok przez 5 minut w 70 ml świeżego ksylenu absolutnego.
    18. Dodać 80 μl żywicy syntetycznej do próbek tkanki jelita grubego, przykryć je szkiełkami nakrywkowymi i pozostawić do wyschnięcia na 24 godziny w temperaturze pokojowej. Na koniec przeanalizuj próbki za pomocą mikroskopii w jasnym polu8.

7. Analiza składu połączeń za pomocą immunofluorescencji

  1. Przygotować tkankę zgodnie z opisem w kroku 5.7 i wyciąć przekroje o grubości 8 μm za pomocą kriostatu.
  2. Utrwalić i przepuszczalność przekrojów jelita grubego za pomocą 96% etanolu w temperaturze -20 °C przez 20 min.
    UWAGA: Wszystkie kolejne inkubacje powinny być przeprowadzane w temperaturze pokojowej, o ile nie zaznaczono inaczej, w wilgotnym ciemnym pudełku, aby zapobiec wysuszeniu i blaknięciu fluorochromu.
  3. Próbki należy wysuszyć na powietrzu, a następnie przepłukać je 3 razy po 5 minut za pomocą 1x PBS
  4. Próbki inkubować z roztworem blokującym (PBS zawierający 0,01% Tween i 2% BSA) przez 2 godziny.
  5. Usuń roztwór blokujący i płucz go PBS-0,01% Tween przez 10 minut.
  6. W tym czasie rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe do pożądanych stężeń w PBS-0,01% Tween.
  7. Usunąć roztwór myjący, nałożyć roztwór przeciwciał z poprzedniego kroku i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C w wilgotnym pudełku.
  8. Usunąć roztwór przeciwciała i przemyć 3 razy PBS-0,01% Tween przez 5 minut każdy i raz wodą dejonizowaną przez 10 minut, bardzo delikatnie mieszając.
  9. Podczas mycia odwirować sprzężone z fluorochromem, specyficzne dla gatunku przeciwciała drugorzędowe w temperaturze 14 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
  10. Rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe bez wytrącania się zgodnie ze wskazaniami dostawcy w PBS-0,01% Tween, zastosować je i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  11. Powtórz krok 7.8 i usuń roztwór myjący tak dokładnie, jak to możliwe.
  12. Odmierzyć pipetą 4 μl środka zapobiegającego blaknięciu na każdą próbkę na szkiełku.
  13. Przykryj próbki szkiełkiem nakrywkowym.
  14. Suszyć na powietrzu przez 1 godzinę.
  15. Uszczelnij suwak lakierem do paznokci. Preparaty można przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu dalszej analizy.
  16. Analiza na konfokalnym mikroskopie laserowym8.

8. Oznaczanie stresu oksydacyjnego przez utlenianie etydyny

  1. Po 7 dniach od wystąpienia zapalenia jelita grubego DSS należy przygotować tkankę zgodnie z opisem w kroku 5.7 i odciąć skrawki jelita grubego w kriostacie o grubości 5 μm. Umieścić przekroje poprzeczne na szkiełkach potraktowanych roztworem poli-L-lizyny i inkubować próbki z 5 μM dihydroetydydy (DHE) w wodzie o temperaturze 37 °C przez 30 minut w ciemności.
  2. Przemyć próbki PBS (pH 7,6) trzy razy przez 15 minut każdy, delikatnie mieszając w temperaturze pokojowej stężenia. Wysuszyć próbki na powietrzu i dodać kroplę pożywki montażowej w celu ochrony fluorescencji. Obserwuj fluorescencję utlenionego etydyny na laserowym skaningowym mikroskopie konfokalnym (40-krotne powiększenie, długość fali 568 nm).

9. Analiza rekrutacji leukocytów za pomocą testu MPO

  1. Po 7 dniach zapalenia jelita grubego DSS należy pobrać tkankę jelita grubego i homogenizować próbki (200 - 400 mg) z 1 ml buforu heksadecylotrimetyloamoniowego (HTAB) (0,5% HTAB w 50 mM buforze fosforanowym, pH 6,0) za pomocą homogenizatora na lodzie.
  2. Przepłukać końcówkę homogenizatora dwukrotnie 1 ml buforu HTAB, aby objąć całą tkankę lizatem, a następnie poddać ją sonikacji pięć razy przy 40% amplitudzie przez 10 s każda. Trzykrotnie zamrozić i rozmrozić w ciekłym azocie.
  3. Wirować przy 14 000 x g przez 15 minut i zebrać supernatant. Przygotować roztwór 2,2'-azyno-bis(kwasu 3-etylobenzotiazolino-6-sulfonowego) (ABTS) przez zmieszanie ABTS, 5 ml cytrynianu sodu (1 M w wodzie), 0,1 ml nadtlenku wodoru i 45 ml wody bidestylowanej.
  4. Zmieszać 0,1 ml każdego supernatantu z 0,1 ml roztworu ABTS w 96-dołkowej płytce z płaskim dnem. Po 10 minutach zmierzyć absorbancję przy 460 nm za pomocą spektrofotometru.

10. Ocena ekspresji cytokin prozapalnych metodą PCR

  1. Homogenizacja tkanek
    1. Homogenizować od 50 do 100 mg próbek tkanki jelita grubego w 1 ml kwaśnej mieszaniny tiocyjanianu guanidyny, fenolu i chloroformu przy użyciu homogenizatora mocy.
    2. Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
  2. Separacja faz
    1. Dodaj 0,2 ml chloroformu i energicznie wstrząsaj przez 30 s.
    2. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 30 minut.
    3. Wirować przy 12 000 x g przez 60 minut w temperaturze 4 °C.
    4. Przenieść górną fazę wodną do świeżej probówki (~500 μL).
  3. Wytrącanie i ponowne zawieszanie RNA
    1. Dodać 0,5 ml alkoholu izopropylowego i inkubować próbki w temperaturze 4 °C przez 60 minut.
    2. Wirować przy 12 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
    3. Całkowicie usunąć supernatant.
    4. Dodaj 1 ml etanolu 75% i wiruj.
    5. Wirować przy 12 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
    6. Usunąć supernatant.
    7. Pozostaw pozostały etanol do wyschnięcia na powietrzu przez 3-5 minut.
      UWAGA: Ważne jest, aby nie dopuścić do całkowitego wyschnięcia osadu RNA, ponieważ znacznie zmniejszy to jego rozpuszczalność.
    8. Ponownie rozpuścić osad w 0,3 ml wody uzdatnionej dietylowęglanem (DEPC). Natychmiast dokonać transkrypcji próbek RNA na cDNA (bardziej stabilne, patrz krok 10.5) lub przechowywać w temperaturze -80 °C.
  4. Kwantyfikacja RNA
    1. Rozcieńczyć 1 μl RNA w 99 μl wody uzdatnionej DEPC.
    2. Odczytać średnicę zewnętrzną przy 260 nm i 280 nm za pomocą spektrofotometru UV/VIS, aby określić stężenie i czystość próbki.
  5. Synteza cDNA
    1. Próbki RNA (1-5 μg) wymieszać z 1 μl Oligo(dT)12-18 (0,5 μg/μL) i wodą uzdatnioną DEPC (całkowita objętość 12 μL) w sterylnych probówkach wolnych od RNaz.
    2. Inkubować w temperaturze 70 °C przez 10 minut.
    3. Dodaj 2 μl 10x buforu PCR, 1 μl 50 mM MgCl2, 1 μl 10 mM mieszanki dNTP i 2 μl 0,1 M ditiotreitolu (DTT).
    4. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 5 minut.
    5. Dodać 1 μl odwrotnej transkryptazy i inkubować w temperaturze 42 °C przez 5 minut.
    6. Inkubować w temperaturze 70 °C przez 15 minut.
    7. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 15 minut. cDNA można przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu dalszego użycia.
  6. Metoda PCR
    1. Wymieszaj 2,5 μl 10x buforu PCR, 1,5 μl 25 mM MgCl2, 0,5 μl 10 mM mieszanki dNTP, 0,25 μl polimerazy Taq DNA, 0,25 μl każdego startera (10 μM) i cDNA (100 ng) oraz sterylną wodę do całkowitej objętości 25 μL.
    2. Próbki należy umieścić na 96-dołkowym termocyklerze. Aby zapobiec amplifikacji genomowego DNA, startery do przodu i do tyłu powinny znajdować się w różnych eksonach: IL1β-FW: GCAACTGTTCCTGAACTCAACT i IL1β-RE: TCTTTTGGGGTCCGTCAACT; IL6-FW: CCTTCCTACCCCAATTTCCAA oraz IL6-RE: AGATGAATTGGATGGTCTTGGTC; KC-FW: TGTCAGTGCCTGCAGACCAT oraz KC-RE: CCTGAGGGCAACACCTTCA; oraz Actin-FW: TATCCACCTTCCAGCAGATGT i Actin-RE: AGCTCAGTAACAGTCCGCCTA. Stosować następujące warunki PCR: 95 °C przez 5 minut, a następnie 30 cykli w temperaturze 95 °C przez 15 s, 58 °C przez 30 s i 72 °C przez 30 s, plus końcowe przedłużenie przez 10 minut w temperaturze 72 °C.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Suplementy diety mogą chronić przed zapaleniem jelita grubego DSS

Przeciwzapalne i antyoksydacyjne suplementy diety, takie jak witamina C, witamina E, źródło tlenku azotu (NO) L-arginina i ω3-wielonienasycone kwasy tłuszczowe (ω3-PUFA), były stosowane z różnym powodzeniem w modelach zwierzęcych w celu łagodzenia objawów chorób zapalnych3,6,15. Niedożywienie, stres oksydacyjny i produkcja cytokin prozapalnych mogą wywoływ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby można było stosować suplementy diety w badaniach klinicznych, korzyści i bezpieczeństwo takich suplementów muszą być dokładnie ocenione in vivo w badaniach na zwierzętach. W przypadku zapalenia jelita grubego ustalono kilka odpowiednich modeli zwierzęcych, które przypominają kliniczne objawy IBD, w tym modele chemiczne wykorzystujące DSS, TNBS lub kwas octowy; modele nokautujące (KO), takie jak IL10-KO; i zapalenie jelita grubego wywołane przez komórki odpornościowe za pomocą adoptywnego transferu limfocytów...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez granty z Meksykańskiej Rady ds. Nauki i Technologii (Conacyt, 207268 i 233395 dla Michaela Schnoora). KFCO jest laureatem stypendium Conacyt (396260) w celu uzyskania tytułu magistra.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,3% żelatyny Bioxon158
10% formaldehydJ.T. Baker2106-03
96-dołkowa płytka z płaskim dnemCorning3368
Absolutny etanol J.T. Baker9000-03
Ksylen absolutnyJ.T. Baker9490-03
ABTSSigma AldrichH5882
Albumina surowicy bydlęcejSigma-Aldrich9048-46-8
ColoScreenHelena Laboratories5072
Corabion (uprzejmie dostarczone przez Merck, Naucalpan, Meksyk)Merck
Siarczan dekstranu Sól sodowaAffymetrix9011-18-1(MWW 40 000-50 000)
DihydroethidiumLife TechnologyD11347
Eozyna-Y J.T. BakerL087-03
Evans niebieskiSigma-Aldrich314-13-6
Karmienie  igłaCadence Science Inc.9921
Stojak na szkiełka z uchwytemMikroskopia elektronowa70312-16
Szkiełkapodstawowe Corning2947
Hematoksylina Harrisa Sigma-AldrichH3136
Hexadecyltrimethyammonium (HTAB)Sigma AldrichH6269
Histosette (kaseta do zatapiania)SimportM498.2
Kwas solny 1 MJ.T. Baker9535-62
Nadtlenek wodoruSigma AldrichH3410
KetaminaPiSA AgropecuariaQ-7833-028
Parafina płynna Paraplast39501-006
Węglan litu Sigma-Aldrich2362
N,N,N-dimetyloformamidJ.T. Baker68-12-2
N-acetylocysteinaSigma-AldrichA9165
Kostki plastikoweMikroskopia elektronowa70181
Roztwór poli-L-lizynySigma-Aldrich25988-63-0
Pryzmat 5 statystyczny oprogramowanieGraphPad SoftwarePrism 5
Roztwór soli 0,9% NaClCS PiSAQ-7833-009
Cytrynian soduSigma-AldrichW302600
Żywica syntetyczna Poly Mont7987
Polimeraza DNA TaqInvitrogen11615-010
Tissue-tek. Związek O.C.TSakura Finetek4583
Strzykawka tuberkulinowaBD Plastipak305945
Tween 20Sigma-Aldrich9005-64-5
VECTASHIELD Antifade Podłoże montażowe z DAPIVector LaboratoriesH-1200
KsylazynaPiSA AgropecuariaQ-7833-099

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Souza, H. S., Fiocchi, C. Immunopathogenesis of IBD: current state of the art. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 13, 13-27 (2016).
  2. Xavier, R. J., Podolsky, D. K. Unravelling the pathogenesis of inflammatory bowel disease. Nature. 448, 427-434 (2007).
  3. Neuman, M. G., Nanau, R. M. Inflammatory bowel disease: role of diet, microbiota, life style. Transl Res. 160, 29-44 (2011).
  4. Lowenberg, M., D'Haens, G. Next-Generation Therapeutics for IBD. Current Gastroenterol Rep. 17, 21(2015).
  5. Bernstein, C. N. Does everyone with inflammatory bowel disease need to be treated with combination therapy. Curr Opin Gastroenterol. , (2016).
  6. Nanau, R. M., Neuman, M. G. Nutritional and probiotic supplementation in colitis models. Dig Dis Sci. 57, 2786-2810 (2012).
  7. Yamamoto, T. Nutrition and diet in inflammatory bowel disease. Curr Opin Gastroenterol. 29, 216-221 (2013).
  8. Vargas Robles, H., et al. Experimental Colitis Is Attenuated by Cardioprotective Diet Supplementation That Reduces Oxidative Stress, Inflammation, and Mucosal Damage. Ox Med Cell Longev. , 8473242(2016).
  9. Vargas-Robles, H., Rios, A., Arellano-Mendoza, M., Escalante, B. A., Schnoor, M. Antioxidative diet supplementation reverses high-fat diet-induced increases of cardiovascular risk factors in mice. Ox Med Cell Longev. 2015, 467471(2015).
  10. Perse, M., Cerar, A. Dextran sodium sulphate colitis mouse model: traps and tricks. J Biomed Biotechnol. 2012, 718617(2012).
  11. Chassaing, B., Aitken, J. D., Malleshappa, M., Vijay-Kumar, M. Dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis in mice. Curr. Protoc. Immunol. 104, Unit 15 25(2014).
  12. Laroui, H., et al. Dextran sodium sulfate (DSS) induces colitis in mice by forming nano-lipocomplexes with medium-chain-length fatty acids in the colon. PLoS One. 7, 32084(2009).
  13. Mennigen, R., et al. Probiotic mixture VSL#3 protects the epithelial barrier by maintaining tight junction protein expression and preventing apoptosis in a murine model of colitis. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296, 1140-1149 (2009).
  14. Park, C. M., Reid, P. E., Walker, D. C., MacPherson, B. R. A simple, practical 'swiss roll' method of preparing tissues for paraffin or methacrylate embedding. J Microsc. 145, 115-120 (1987).
  15. Shen, W., Gaskins, H. R., McIntosh, M. K. Influence of dietary fat on intestinal microbes, inflammation, barrier function and metabolic outcomes. J Nutr Biochem. , (2013).
  16. Bruewer, M., et al. Interferon-gamma induces internalization of epithelial tight junction proteins via a macropinocytosis-like process. FASEB J. 19, 923-933 (2005).
  17. Fournier, B. M., Parkos, C. A. The role of neutrophils during intestinal inflammation. Muc Immunol. 5, 354-366 (2012).
  18. Yan, Y., et al. Temporal and spatial analysis of clinical and molecular parameters in dextran sodium sulfate induced colitis. PLoS One. 4, 6073(2009).
  19. Maxwell, J. R., Viney, J. L. Overview of mouse models of inflammatory bowel disease and their use in drug discovery. Curr Prot Pharmacol, S.J. Enna. , Chapter 5, Unit 5.57 (2009).
  20. Ostanin, D. V., et al. T cell transfer model of chronic colitis: concepts, considerations, and tricks of the trade. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296, 135-146 (2009).
  21. Randhawa, P. K., Singh, K., Singh, N., Jaggi, A. S. A review on chemical-induced inflammatory bowel disease models in rodents. Kor J Physiol Pharmacol. 18, 279-288 (2014).
  22. Whittem, C. G., Williams, A. D., Williams, C. S. Murine Colitis modeling using Dextran Sulfate Sodium (DSS). JoVE. , (2010).
  23. Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nat Prot. 2, 541-546 (2007).
  24. Naydenov, N. G., et al. Nonmuscle Myosin IIA Regulates Intestinal Epithelial Barrier in vivo and Plays a Protective Role During Experimental Colitis. Sci Rep. 6, 24161(2016).
  25. Sumagin, R., Robin, A. Z., Nusrat, A., Parkos, C. A. Transmigrated neutrophils in the intestinal lumen engage ICAM-1 to regulate the epithelial barrier and neutrophil recruitment. Muc Immunol. 7, 905-915 (2014).
  26. Laukoetter, M. G., et al. JAM-A regulates permeability and inflammation in the intestine in vivo. J Exp Med. 204, 3067-3076 (2007).
  27. Viennois, E., Chen, F., Laroui, H., Baker, M. T., Merlin, D. Dextran sodium sulfate inhibits the activities of both polymerase and reverse transcriptase: lithium chloride purification, a rapid and efficient technique to purify RNA. BMC Res Notes. 6, 360(2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Model zapalenia jelita grubego indukowanego DSSpodawanie suplement w ywieniowychprzepuszczalno nab onka jelitowegoanaliza stresu oksydacyjnegoocena histologicznaekstrakcja b kitu Evansamikroskopia konfokalnabarwienie hematoksylin i eozynwska nik aktywno ci chorobypomiar d ugo ci jelita grubego

Powiązane artykuły