Artykuł metodologiczny

Mysi przeszczep skóry o pełnej grubości

20.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55105

⸱

2 stycznia 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Sidney-Kimmel Comprehensive Cancer Center, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Liver and Transplantation Surgery, Chang-Gung Transplantation Institute, Chang-Gung Memorial Hospital, Chang-Gung University College of Medicine, 3Vascularized Composite Allotransplantation Laboratory, Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Johns Hopkins University School of Medicine

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Przeszczep skóry pełnej grubości myszy jest dobrze znanym modelem do badania odrzucenia w środowisku alloimmunologicznym. W tym miejscu przedstawiamy samouczek dotyczący każdego kroku związanego z wykonaniem przeszczepu skóry pełnej grubości BALB/c-->C57BL/6

.

Streszczenie

Przeszczep skóry na pełnej grubości myszy jest dobrze znanym modelem in vivo do badania odpowiedzi alloimmunologicznej i odrzucenia przeszczepu. Pomimo ograniczonego zastosowania u ludzi, przeszczep skóry u myszy jest szeroko stosowany w badaniach transplantacyjnych. Zabieg jest łatwy do nauczenia się i wykonania, nie wymaga delikatnych technik mikrochirurgicznych ani intensywnego szkolenia. Co więcej, odrzucenie przeszczepu w tym modelu następuje w bardzo powtarzalnej reakcji immunologicznej i jest łatwo monitorowane przez bezpośrednią inspekcję i badanie palpacyjne. Ponadto wtórny przeszczep skóry z użyciem przeszczepów skóry dopasowanych do dawcy lub od osób trzecich może być wykonywany na bardziej złożonych modelach przeszczepów jako alternatywna i nieskomplikowana metoda oceny tolerancji specyficznej dla dawcy. Powikłania są niewielkie i na ogół ograniczają się do znieczulenia, przedawkowania lub niewydolności oddechowej po zabiegu. Z drugiej strony niepowodzenie przeszczepu występuje często w wyniku złego przygotowania przeszczepu, nieprawidłowego ułożenia w łożu przeszczepu lub niewłaściwego umieszczenia bandaża. W tym artykule przedstawiamy protokół przeszczepu skóry o pełnej grubości u myszy oraz opisujemy ważne kroki niezbędne do udanego zabiegu.

Wprowadzenie

Transplantacja narządów jest leczeniem z wyboru dla pacjentów ze schyłkową niewydolnością narządów, a wyniki znacznie się poprawiły dzięki postępom w procedurach chirurgicznych i protokołach immunosupresyjnych. Jednak długotrwała immunosupresja wiąże się ze znacznymi skutkami ubocznymi, a opracowanie nowych strategii promujących tolerancję pozostaje celem współczesnych badań transplantacyjnych.

Liczne modele zwierzęce zostały opracowane do podstawowych badań w transplantacji, do badania mechanizmów odrzucania przeszczepów allogenicznych oraz do testowania metod immunosupresji w celu zapobiegania odrzuceniu przeszczepu i promowania długoterminowej tolerancji1-3. Modele mysie stały się podstawą badań immunologicznych ze względu na wyjątkową i szeroką dostępność przeciwciał diagnostycznych i terapeutycznych oraz dobrze zdefiniowanych szczepów wsobnych i transgenicznych. Przeszczep skóry to prosta procedura, która nie wymaga specjalnych umiejętności mikrochirurgicznych i może być łatwo monitorowana po operacji. Podsumowując, przeszczep skóry myszy jest wyjątkowym narzędziem do badania wielu aspektów związanych z odpowiedzią alloimmunologiczną, w tym dostarczania antygenu, transportu komórek i niszczenia tkanek podczas odrzucania przeszczepu4,5.

Tutaj pokazujemy krok po kroku procedurę przeszczepu skóry o pełnej grubości na modelu mysim i opisujemy ważne kroki niezbędne do pomyślnego wszczepienia przeszczepionej skóry.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem Opieki i Użytkowania Zwierząt Laboratoryjnych Narodowego Instytutu Zdrowia (NIH) i zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Johnsa Hopkinsa (JHUACUC). Poszczególne procedury zostały przeprowadzone zgodnie z zatwierdzonymi protokołami ACUC MO13M292 i MO13M370.

1. Zbieranie skór od dawców

  1. Znieczulić mysz dawcę izofluranem (parownik indukcyjny w stężeniu 4%, utrzymanie w dawce 1 - 2% przez stożek myszy). Użyj odruchu wycofania szczypania palców u stóp, aby monitorować głębokość znieczulenia.
  2. Za pomocą elektrycznej maszynki do golenia ogol grzbiet zwierzęcia i zdezynfekuj go 10% jodowidonem (np. Betadine).
  3. Używając sterylnych nożyczek, rękawiczek i techniki aseptycznej, pobierz skórę pleców dawcy od biodra do szyi, z rozwarstwieniem na poziomie otoczki tkanki łącznej.
  4. Poddaj zwierzę eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy po pobraniu przeszczepu skóry.
  5. Pod mikroskopem oddziel tkankę łączną, tkankę tłuszczową i panniculus carnosus od skóry pleców za pomocą cienkich nożyczek do tenotomii. Panniculus carnosus to cienki, przezroczysty mięsień odpowiedzialny za drgania skóry.
  6. Korzystając z techniki sterylnych narzędzi, wytnij przeszczepy o wymiarach 15 mm x 15 mm z tylnej skóry na złoże przeszczepu o wymiarach 10 mm x 10 mm do 15 mm x 15 mm.
  7. Przechowuj szczepy na gazach nasączonych sterylną solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) na szalce Petriego na lodzie.
    UWAGA: Z jednej myszy dawcy można uzyskać 8 - 10 przeszczepów.

2. Przeszczep skóry biorcy

  1. Znieczulić mysz biorcę izofluranem (parownik indukcyjny w 4%, utrzymanie w dawce 1 - 2% przez stożek myszy). Użyj odruchu wycofania szczypania palców u stóp, aby monitorować głębokość znieczulenia.
  2. Podawać 0,02 mg/kg masy ciała buprenorfiny w celu złagodzenia bólu pooperacyjnego.
  3. Ogolić bok grzbietu zwierzęcia, w którym zostanie wprowadzony przeszczep i zdezynfekować 10% jodowidonem.
  4. Za pomocą nożyczek wytnij kwadrat skóry o wymiarach 10 mm x 10 mm do 15 mm x 15 mm. Wielkość ubytku powinna być nieco większa (10%) niż przeszczep. Wytnij tak powierzchownie, jak to możliwe. Zadbaj o zachowanie panniculus carnosus i naczyń. Panniculus carnosus można odróżnić od leżącej poniżej powięzi po jej ruchliwości i naczyniach krwionośnych, które biegną do niej powierzchownie.
  5. Umieść przeszczep na podłożu przeszczepu, unikając fałd wzdłuż krawędzi
    6. .
  6. Umieść 8 szwów na rogach i na środku każdej krawędzi. Dla każdego szwu przełóż igłę przez przeszczep, a następnie przez panniculus carnosus łożyska przeszczepu poniżej otaczającej skóry biorcy.
  7. Zdejmij maskę znieczulającą i pozwól zwierzęciu częściowo wyzdrowieć ze znieczulenia przed nałożeniem bandaża samoprzylepnego.
  8. Owiń mysz biorcy w samoprzylepny bandaż ze złożoną gazą na przeszczepie. Wykonaj bandaż, łącząc dwa bandaże, przecinając część klejącą jednego i umieszczając razem dwie podkładki chłonne.
  9. Uważnie monitoruj mysz podczas rekonwalescencji, aby upewnić się, że bandaż nie ogranicza ruchu klatki piersiowej i oddychania. Zdejmij bandaż, jeśli częstość oddechów zmniejszy się lub zwierzę zacznie sapać lub płytko oddychać.

3. Opieka pooperacyjna

  1. Podawać enrofloksacynę w dawce 5 mg/kg mc. po zabiegu chirurgicznym w celu zapobiegania zakażeniom.
  2. Umieść przeszczepioną mysz w czystej klatce na poduszce grzewczej do kuchenki mikrofalowej, aż w pełni wyzdrowieje ze znieczulenia.
  3. Obserwuj mysz przez 1 godzinę po operacji przed powrotem do pomieszczenia mieszkalnego.
  4. Siedem dni po zabiegu znieczulij mysz jak w kroku 2.1. Usuń bandaż, przecinając tylko brzuszną stronę bandaża.
  5. Obserwuj i badaj palpacyjnie przeszczep następnego dnia pod kątem oznak strupów, skurczów lub stwardnienia. Jeśli jest obecny, przeszczep mógł nie osiągnąć prawidłowego unaczynienia i należy go uznać za awarię techniczną.
  6. Codziennie monitoruj pod kątem oznak odrzucenia. Rozważ odrzucenie przeszczepów, gdy ≥90% tkanki przeszczepu staje się martwicze.
  7. Poddaj eutanazji odrzucone zwierzęta i zbierz je do analizy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Założenie opatrunku myszy biorcy jest istotnym etapem procedury. Przeszczep skóry umieszcza się na tułowiu biorcy, pomiędzy łopatką, biodrem a kręgosłupem (Rycina 1). Opatrunek wykonuje się z złożonej gazy oraz kombinacji dwóch plastikowych plastrów przylepnych. Myszy biorcy układa się graftem do dołu na gazie znajdującej się w centrum opatrunku. Używając dwóch zakrzywionych mikropincet, najpierw naciąga się dolną część opatrunku, a następnie górną część owija wokół myszy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Od czasu wprowadzenia przez Medawar, najpierw w badaniach na ludziach, a następnie u królików i myszy, przeszczep skóry jest nieocenionym modelem do badania allogenicznych odpowiedzi immunologicznych6,7. W tym manuskrypcie prezentujemy model wielkoskalowego, nieunaczynionego, pełnogrubego przeszczepu skóry z wykorzystaniem skóry górnej i dolnej części pleców. Do tej pory zgłoszono różne alternatywne metody, w tym wykorzystanie skóry ogona lub skóry ucha myszy jako źródła przeszczepionej tkanki8,9. M...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca została sfinansowana przez R01AI077610 grantu NIH.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Proste mikro kleszczeSigmaF4017
Zakrzywione mikro kleszczeAesculapBD333R
Zakrzywione nożyczki do tenotomii StevensAesculapBC905R
MayoSigmaS3146
Uchwyt na mikroigłyAesculapBM563R
Sterylna gazaCovidien
6-0 Nylonowy szewMWI31849
Plastikowe paski- PomocJohnson & JohnsonUzyskane z apteki
10 cm szalka PetriegoFisherbrandFB0875712
PBSJakość Biologiczna119069131
BuprenorfinaDEA Wymagany numer; Otrzymywany z apteki szpitalnej
EnrofloksacynaBayer Health Care186599
Nożyczki preparacyjne 441218

Bibliografia

  1. Furtmuller, G. J., et al. Orthotopic Hind Limb Transplantation in the Mouse. J Vis Exp. , (2016).
  2. Oh, B., et al. A Novel Microsurgical Model for Heterotopic, En Bloc Chest Wall, Thymus, and Heart Transplantation in Mice. J Vis Exp. , (2016).
  3. Oberhuber, R., et al. Murine cervical heart transplantation model using a modified cuff technique. J Vis Exp. , e50753(2014).
  4. Jones, T. R., Shirasugi, N., Adams, A. B., Pearson, T. C., Larsen, C. P. Intravital microscopy identifies selectins that regulate T cell traffic into allografts. J Clin Invest. 112, 1714-1723 (2003).
  5. Celli, S., Albert, M. L., Bousso, P. Visualizing the innate and adaptive immune responses underlying allograft rejection by two-photon microscopy. Nat Med. 17, 744-749 (2011).
  6. Medawar, P. B. The behaviour and fate of skin autografts and skin homografts in rabbits: A report to the War Wounds Committee of the Medical Research Council. J Anat. 78, 176-199 (1944).
  7. Billingham, R. E., Brent, L., Medawar, P. B., Sparrow, E. M. Quantitative studies on tissue transplantation immunity. I. The survival times of skin homografts exchanged between members of different inbred strains of mice. Proc R Soc Lond B Biol Sci. 143, 43-58 (1954).
  8. Garrod, K. R., Cahalan, M. D. Murine skin transplantation. J Vis Exp. , (2008).
  9. Schmaler, M., Broggi, M. A., Rossi, S. W. Transplantation of tail skin to study allogeneic CD4 T cell responses in mice. J Vis Exp. , e51724(2014).
  10. Bergstresser, P. R., Toews, G. B., Gilliam, J. N., Streilein, J. W. Unusual numbers and distribution of Langerhans cells in skin with unique immunologic properties. J Invest Dermatol. 74, 312-314 (1980).
  11. Chen, H. D., Silvers, W. K. Influence of Langerhans cells on the survival of H-Y incompatible skin grafts in rats. J Invest Dermatol. 81, 20-23 (1983).
  12. Chong, A. S., Alegre, M. L., Miller, M. L., Fairchild, R. L. Lessons and limits of mouse models. Cold Spring Harb Perspect Med. 3, a015495(2013).
  13. Mayumi, H., Nomoto, K., Good, R. A. A surgical technique for experimental free skin grafting in mice. Jpn J Surg. 18, 548-557 (1988).
  14. McFarland, H. I., Rosenberg, A. S. Skin allograft rejection. Curr Protoc Immunol. Chapter 4, (2009).
  15. Lee, C. F., et al. Preventing Allograft Rejection by Targeting Immune Metabolism. Cell reports. 13, 760-770 (2015).
  16. Pollizzi, K. N., Powell, J. D. Integrating canonical and metabolic signalling programmes in the regulation of T cell responses. Nat Rev Immunol. 14, 435-446 (2014).
  17. Pearce, E. L., Poffenberger, M. C., Chang, C. H., Jones, R. G. Fueling immunity: insights into metabolism and lymphocyte function. Science. 342, 1242454(2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Odrzucenie przeszczepumodel mysiodpowied alloimmunologicznaprzeszczepy zgodne z dawcprzeszczepy od os b trzecichterapia metabolicznaprotok immunosupresjiprze ycie przeszczepuzak adanie opatrunku

Powiązane artykuły