Artykuł metodologiczny

Monitorowanie reaktywności i proliferacji astrocytów in vitro w warunkach podobnych do niedokrwiennych

DOI:

10.3791/55108

⸱

21 października 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neuroscience, School of Medicine, Universidad Central del Caribe, 2Department of Biochemistry, School of Medicine, Universidad Central del Caribe, 3Department of Pharmacology and Toxicology, Medical Sciences, Campus, University of Puerto Rico

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Udar niedokrwienny jest złożonym zdarzeniem, w którym trudno jest zbadać specyficzny wpływ astrocytów na dotknięty obszar mózgu narażony na tlen, deprywację glukozy (OGD). W artykule przedstawiono metodologię otrzymywania izolowanych astrocytów oraz badania ich reaktywności i proliferacji w warunkach OGD.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Udar niedokrwienny mózgu to złożony uraz mózgu spowodowany przez skrzeplinę lub zator utrudniający przepływ krwi do części mózgu. Prowadzi to do pozbawienia tlenu i glukozy, co powoduje awarię energetyczną i śmierć neuronów. Po udarze niedokrwiennym astrocyty stają się reaktywne i namnażają się wokół miejsca urazu w miarę jego rozwoju. W tym scenariuszu trudno jest zbadać specyficzny wkład astrocytów w obszar mózgu narażony na niedokrwienie. W związku z tym w niniejszym artykule przedstawiono metodologię badania pierwotnej reaktywności i proliferacji astrocytów w modelu in vitro środowiska podobnego do niedokrwienia, zwanego deprywacją glukozy tlenowej (OGD). Astrocyty wyizolowano od 1-4 dniowych nowonarodzonych szczurów, a liczbę niespecyficznych komórek astrocytarnych oceniono za pomocą selektywnego markera astrocytów Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) i barwienia jądrowego. Okres, w którym astrocyty są poddawane warunkowi OGD, można dostosować, a także procent tlenu, na który są narażone. Ta elastyczność pozwala naukowcom scharakteryzować czas trwania stanu podobnego do niedokrwiennego w różnych grupach komórek in vitro. W artykule omówiono ramy czasowe OGD, które indukują reaktywność astrocytów, morfologię przerostową i proliferację mierzoną za pomocą immunofluorescencji przy użyciu antygenu jądrowego komórki proliferującej (PCNA). Oprócz proliferacji, astrocyty poddają się stresowi energetycznemu i oksydacyjnemu oraz reagują na OGD poprzez uwalnianie rozpuszczalnych czynników do pożywki komórkowej. Pożywkę tę można zebrać i wykorzystać do analizy wpływu cząsteczek uwalnianych przez astrocyty w pierwotnych kulturach neuronalnych bez interakcji między komórkami. Podsumowując, ten pierwotny model hodowli komórkowej może być skutecznie wykorzystany do zrozumienia roli izolowanych astrocytów po uszkodzeniu.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Udar mózgu jest definiowany jako "ostra dysfunkcja neurologiczna pochodzenia naczyniowego z nagłym lub szybkim rozwojem objawów i oznak, odpowiadających zaangażowaniu ogniskowych obszarów w mózgu"1,2. Istnieją dwa rodzaje udaru: krwotoczny i niedokrwienny. Gdy dysfunkcja naczyń krwionośnych jest spowodowana tętniakiem lub nieprawidłowym funkcjonowaniem tętnic żylnych, któremu towarzyszy osłabienie z tylnym pęknięciem tętnicy, nazywa się to udarem krwotocznym3, który w większości przypadków prowadzi do śmierci. Kiedy skrzeplina lub zator utrudnia przepływ krwi, powodując tymczasowe pozbawienie tlenu i glukozy w obszarze mózgu, nazywa się to udarem niedokrwiennym4. Brak odżywienia komórek wokół dotkniętego obszaru lub niedokrwionego rdzenia prowadzi do zaburzenia równowagi homeostatycznej i metabolicznej, dysfunkcji energetycznej, śmierci neuronów i stanu zapalnego5, co może wywołać niepełnosprawność pacjentów na całe życie6.

Udar niedokrwienny to wieloczynnikowy uraz obejmujący kilka typów komórek, które reagują i wywierają swoje efekty w różnych punktach czasowych. Wiele interakcji tworzy trudne środowisko do badania zachowania poszczególnych komórek. Jak więc badać udział określonego typu komórek w tak złożonym środowisku? Przyjęty model niedokrwienia in vitro polega na wystawieniu komórek na działanie deprywacji tlenu i glukozy (OGD) przez pewien czas, po czym następuje przywrócenie komórek do normalnego środowiska. System ten symuluje udar niedokrwienny, po którym następuje reperfuzja krwi. W tej metodzie komórki lub tkanki są wystawione na działanie pożywki wolnej od glukozy w środowisku oczyszczonym z tlenu, przy użyciu specjalistycznej komory hipoksyjnej. Czas inkubacji OGD może wahać się od kilku minut do 24 godzin, w zależności od hipotezy, która ma być testowana. Badania wykazały, że w zależności od czasu wystąpienia OGD i normoksycznego środowiska, można osiągnąć określone fenotypy udaru (tj. ostre lub podprzewlekłe). Pierwotne izolowane astrocyty, wystawione na OGD z tylnym przywróceniem do warunków normoksyjnych, są dobrze zbadanym modelem komórkowym naśladującym udar in vitro7. Za pomocą OGD możliwe jest ujawnienie niezależnych mechanizmów molekularnych izolowanych komórek w środowisku podobnym do udaru.

Wraz ze wzrostem naszej wiedzy na temat biologii astrocytów, stało się oczywiste, że są one kluczowe dla utrzymania synaps i podtrzymania naprawy, rozwoju i plastyczności neuronów8. W normalnych warunkach astrocyty uwalniają i reagują na cytokiny, chemokiny, czynniki wzrostu i glioprzekaźniki, utrzymując równowagę metaboliczną i homeostazę w synapsach5,9. W ostrym zapaleniu układu nerwowego, takim jak udar niedokrwienny, komórki te mogą stać się reaktywne, wykazywać długotrwałą nadekspresję kwaśnego białka fibrylarnego gleju (GFAP) i wykazywać przerost w swojej morfologii5,10,11,12. Wraz z rozwojem zawału niedokrwiennego homeostaza zapewniana przez astrocyty ulega zmianie, w odniesieniu do prawidłowego wychwytu glutaminianu, metabolizmu energetycznego, wymiany aktywnych cząsteczek i aktywności przeciwutleniającej13.

Reaktywowane astrocyty namnażają się wokół tkanki zawału, podczas gdy leukocyty migrują w kierunku obszaru uszkodzonego14. Proliferację astrocytów można mierzyć za pomocą markerów, takich jak antygen jądrowy proliferacji komórek (PCNA), Ki67 i bromodeoksyurydyna (BrdU)15. Ta odpowiedź proliferacyjna jest generowana w sposób zależny od czasu i pomaga w tworzeniu blizny glejowej, szeregu nieodwracalnie reaktywnych astrocytów wzdłuż miąższu uszkodzonego miejsca po urazie9. Jedną z początkowych funkcji tej blizny jest ograniczenie wynaczynienia komórek odpornościowych z tego obszaru. Jednak badania wykazały, że blizna staje się fizyczną przeszkodą dla rozszerzania aksonów, ponieważ uwalniają cząsteczki hamujące wzrost aksonów i tworzą fizyczną barierę zapobiegającą rozszerzaniu się aksonów wokół uszkodzonego obszaru16. Niemniej jednak istnieją dowody naukowe wskazujące, że po urazie rdzenia kręgowego całkowite zapobieganie tworzeniu się blizn glejowych może upośledzać regenerację aksonów17. W związku z tym kontekst, w którym mierzona jest specyficzna odpowiedź astrocytowa, musi być rozważany w ramach badanego urazu.

Przedstawiona metodologia może być zastosowana do badania zindywidualizowanej funkcji astrocytów po niedoborze tlenu glukozy i może być modyfikowana w zależności od pytań, na które badacz chce odpowiedzieć. Na przykład, oprócz zmian morfologicznych i markerów wyrażanych w różnych czasach ODD, supernatanty z astrocytów wystawionych na działanie OGD mogą być dalej analizowane w celu zidentyfikowania rozpuszczalnych czynników uwalnianych przez te komórki lub wykorzystane jako pożywka kondycjonowana do oceny jej wpływu na inne komórki mózgowe. Takie podejście umożliwia badania nad reaktywnością astrocytów, które mogą prowadzić do wyjaśnienia czynników rządzących i modulujących ich odpowiedź w scenariuszu udaru niedokrwiennego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szczury po urodzeniu (Sprague Dawley) w wieku 1-4 dni są używane do izolowania kory mózgowej. Metodą eutanazji jest dekapitacja, zgodnie z wytycznymi NIH.

1. Przygotowanie narzędzi i materiałów do operacji

  1. Sterylizuj narzędzia w autoklawie (temperatura: 121 ºC, ciśnienie: 15 psi, czas: 30 minut) za pomocą stalowego pudełka lub torebki do sterylizacji z natychmiastowym uszczelnieniem. Zobacz materiały w Tabeli materiałów.

2. Kompletne przygotowanie DMEM

  1. W jednolitrowej zlewce zawierającej 700 ml autoklawowanej wody dodaj proszek Dulbecco's Modified Eagle's Medium w temperaturze pokojowej.
  2. Dodać 3,7 g/l wodorowęglanu sodu, a roztwór miesza się z mieszadłem magnetycznym.
  3. Ustaw pH do 7,4, za pomocą autoklawizowanej wody zwiększ objętość do 1 l, a następnie przefiltruj. Do celów hodowlanych uzupełnić żądaną objętość pożywki 10% FBS i 1% penicyliny/streptomycyny i ogrzać w temperaturze 37 °C. Zobacz materiały w Tabeli materiałów.
    nuta: pH dostosowano do 7,4 poprzez włożenie elektrody pH-metru do pożywki. Pożywkę należy mieszać, a następnie powoli dodawać 1M NaOH za pomocą zakraplacza.

3. Pierwotna hodowla astrocytów

Uwaga: Po wysianiu, pożywki komórkowe muszą być zmieniane co trzy dni i komórki mogą być hodowane aż do zbiegu (11-13 dni). Trzeciego dnia kilkakrotnie postukać w kolbę, aby usunąć komórki mikrogleju i komórki progenitorowe oligodendrocytów z hodowli, usunąć wszystkie "stare" pożywki, przemyć dwukrotnie 10 ml PBS, odessać PBS, a następnie dodać świeżą nową pożywkę. Zobacz materiały w Tabeli materiałów.

  1. Sekcja mózgu nowonarodzonego szczura
    1. Wykonaj sekcję w kapturze do hodowli tkankowej. Uzyskaj 1-4 dniowe nowonarodzone młode szczura (2 mózgi szczurów stosuje się na 75 cm2 kolbę).
    2. Przygotuj trzy szalki Petriego o średnicy 60 mm i odpipetuj 5 ml kompletnego DMEM na każdej.
      nuta: Można je podzielić w następujący sposób: #1 dla każdego mózgu szczura, #2 dla wszystkich kory mózgów i #3 dla wszystkich łuszczonych kory mózgowych (bez opon mózgowych).
    3. Chwyć szczeniaka i spryskaj go 70% etanolem. Odetnij mu głowę i wyrzuć ciało do małego pojemnika na odpady stanowiące zagrożenie biologiczne.
    4. Za pomocą pęsety do mikropreparowania przytrzymaj głowę i przetnij skórę na czubku głowy, aby odsłonić czaszkę.
    5. Kolejną parą nożyczek wykonaj nacięcie w kształcie litery "T", zaczynając od tyłu czaszki w kierunku nosa. Użyj kleszczy, aby delikatnie usunąć czaszkę.
    6. Usuń odsłonięty mózg za pomocą pęsety i umieść mózg na jednej z szalek Petriego uprzednio wypełnionych pożywką.
    7. Do kolejnych kroków użyj innego zestawu sterylnych narzędzi.
    8. Użyj kleszczy do mikropreparacji, aby delikatnie umieścić jeden mózg na odwróconej pokrywie szalki Petriego o średnicy 60 mm. Kiedy szalka Petriego jest umieszczona na sterylnej gazie, możliwe jest wyraźne oglądanie mózgu i łatwiejsze jest przeprowadzenie sekcji.
    9. Ustabilizuj mózg za pomocą kleszczy do mikropreparowania i oddziel półkulę mózgową, delikatnie drażniąc wzdłuż szczeliny linii środkowej ostrym końcem kleszczy do mikropreparowania.
    10. Odchyl i obierz korę, pozostawiając białą istotę, i przenieś ją na szalkę Petriego, wcześniej oznaczoną #2. Powtórz procedurę dla wszystkich mózgów, łącząc wszystkie wypreparowane kory mózgowe na szalce Petriego oznaczonej #2.
    11. Wyjmij hipokamp spod każdej kory i wyrzuć go.
    12. Użyj pęsety do mikropreparowania i 60 mm Petriego, aby delikatnie oderwać opony mózgowe od poszczególnych płatów korowych i umieścić je na szalce Petriego oznaczonej #3.
  2. Dysocjacja tkanek: metoda homogenizatora i blendera
    1. Wlać tkankę/pożywkę (obrane korowe części mózgu) do sterylnego worka blendera i dodać tyle pożywki, aby całkowita objętość w woreczku wynosiła 5 ml.
    2. Umieść torebkę w blenderze homogenizatora, pozostawiając około 2 cm torebki widoczne nad zamkniętymi drzwiczkami. Dysocjacja komórek odbywa się w ciągu 2,5 minuty z dużą prędkością.
      nuta: Alternatywnie można to zrobić, zamykając torbę i delikatnie uderzając nią zlewką w kapturze. Upewnij się, że używasz szmatki między torbą a zlewką, aby uniknąć tarcia.
    3. Wlej zawiesinę komórek do sita o oczkach numer 60, a następnie przefiltrowany przepływ przelej na sito numer 100, pozwalając mu przefiltrować grawitacyjnie.
    4. Używając probówek o pojemności 15 ml, odwirować zawiesinę komórek o stężeniu 200 x g w wirówce klinicznej (najlepiej z obrotowym wirnikiem kubełkowym) przez 5 minut.
    5. Odlać supernatant do zlewki, a następnie za pomocą pipety serologicznej ponownie zawiesić i rozdzielić osad komórek w maksymalnie 5 ml pożywki.
  3. Zliczanie komórek
    1. Za pomocą mikropipety zebrać 100 μl zawiesiny komórek w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i dodać 100 μl błękitu trypanowego.
    2. Wprowadzić 10 μl zebranej zawiesiny do hemocytometru i policzyć wszystkie komórki, które są żywotne w czterech rogach kwadratu.
    3. Wzory do obliczania gęstości komórek przed przygotowaniem kolb są następujące:
      figure-protocol-1
      figure-protocol-2
    4. Dodać co najmniej 500 000 komórek na kolbę o średnicy 25cm2. Odpipetować do 5 ml DMEM do każdej kolby. Mieszanina nie powinna sięgać do szyjki kolby. Umieścić je w inkubatorze o temperaturze 37 °C przy 5% CO2 na 3 dni, a następnie zmienić podłoże.
  4. Techniki oczyszczania astrocytów: zmiana pożywki, strategie mechaniczne i chemiczne
    nuta: Tempo metabolizmu astrocytów jest wysokie w porównaniu z innymi typami komórek, dlatego w warunkach niedoboru składników odżywczych komórki te wykazują niskie wskaźniki przeżycia po kilku dniach. W przeciwieństwie do astrocytów, mikroglej nie jest dotknięty deprywacją żywieniową i namnaża się w takich środowiskach18. Aby utrzymać zmniejszoną liczbę komórek mikrogleju, autorzy zmieniają pożywki do hodowli komórek astroglejowych co 3 dni. Ta ciągła zmiana w pożywkach komórkowych zmniejszy również populację mikrogleju, która może rosnąć na wierzchu monowarstwy komórek astrocytarnych w kolbie19.
    1. Za pomocą pipety Pasteura odessać pożywkę z nieprzylegającymi komórkami mikrogleju z każdej z kolb. Wszelkie pozostałości należy przemyć kroplami do każdej z kolb za pomocą sterylnie przefiltrowanego PBS (5 ml/kolbę).
    2. Dodawać sterylnie przefiltrowany DMEM (z antybiotykiem i płodową surowicą bydlęcą) kroplami do każdej kolby (5 ml / kolbę). Delikatnie mieszaj okrężnymi ruchami, aby pokryć całą powierzchnię.
    3. Umieścić komórki w inkubatorze o temperaturze 37 °C przy 5% CO2 przez 8-10 dni, aż kolby osiągną zlewność (>95% pokrycia płytki).
      >nuta: Kilka protokołów wykazało, że gdy astrocyty osiągają zbieg, metody mechaniczne, takie jak potrząsanie kulturą od 2 do 24 godzin, prowadzą do oderwania komórek, które leżą na tych astrocytach, głównie komórek mikrogleju i komórek prekursorowych19,20.
    4. Komórki nieastrocytarne są redukowane w hodowli przez wykonywanie wytrząsania orbitalnego z prędkością 180 obr./min przez 30 minut. Po usunięciu komórek z supernatantu, świeże podłoże jest pipetowane do kolby (~15 ml).
    5. Aby wyeliminować komórki progenitorowe oligodendrocytów, zwiększ prędkość wytrząsania do 200 obr./min przez 6 godzin21,22,23 , odsysaj supernatant i pipetuj świeże podłoże.
      nuta: Aby zmniejszyć obecność mikrogleju w kulturach, dwie metody chemiczne mogą być stosowane sekwencyjnie (nie równocześnie) w metodologii pierwotnej hodowli komórek: cytozyna arabinozynowa (Ara-C) i ester metylowy L-leucyny (LME)24.
    6. Natychmiast po osiągnięciu zbiegu komórek (100%), 3-4 dni po mechanicznym usunięciu mikrogleju, komórki te można leczyć 8 μM antymitotycznego związku cytozyny arabinozyny (Ara-C) w DMEM przez 5 dni (codziennie zmieniać na świeże Ara-C w DMEM).
      nuta: Moment na dodanie Ara-C jest krytyczny, ponieważ związek ten jest lekiem antymitotycznym, który zmniejsza liczbę szybko dzielących się komórek, takich jak microglea19,25 i fibroblasts26. W przeciwieństwie do mikrogleju, astrocyty przestają się namnażać poprzez hamowanie kontaktu27.
    7. Odczekaj 2 dni, aż komórki zregenerują się po leczeniu Ara-C.
    8. Aby jeszcze bardziej zmniejszyć zanieczyszczenie mikrogleju, po osiągnięciu przez komórki zbieżności, należy użyć 50 mM estru metylowego L-leucyny (LME) w DMEM utrwalonego na pH 7,4, przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
      nuta: LME przenika przez błonę komórek i organelli, a po hydrolizie wytworzona L-leucyna gromadzi się w lizosomach tych komórek. Nagromadzenie tego aminokwasu prowadzi do osmotycznego pęcznienia i pękania lizosomów28,29. LME jest bardzo skuteczna w eliminowaniu mikrogleju w porównaniu z innymi komórkami20,30.

4. Hodowla astrocytów na płytkach 6-dołkowych

  1. Powlekanie szkiełek nakrywkowych poli-D-lizyną
    1. Umieścić po jednym szkiełku nakrywkowym na każdą szalkę Petriego o średnicy 35 mm, następnie dodać 100 μl rozcieńczonego roztworu poli-D-lizyny do każdego szkiełka nakrywkowego i odczekać 1 godzinę.
    2. Usuń poli-D-lizynę i umyj dwukrotnie 2 ml sterylnej wody.
    3. Usuń wodę i poczekaj, aż szkiełka nakrywkowe wyschną wewnątrz kaptura. Szkiełka nakrywkowe należy przechowywać w temperaturze -20 °C do dwóch tygodni.
      nuta: Zamrozić rozcieńczony roztwór poli-D-lizyny; Może być przechowywany do dwóch tygodni.
  2. Trypsynizacja
    1. Za pomocą pipety Pasteura odessać pożywkę z kolb. Dodać 5 ml/kolbę sterylnie przefiltrowanego PBS, aby delikatnie wypłukać komórki.
    2. Odessać PBS, a następnie dodać 5 ml / kolbę sterylnie przefiltrowanego 0,25% trypsyny i 0,5 mM roztworu EDTA. Umieścić kolbę w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 na 10 minut.
      nuta: Podczas inkubacji komórek ogrzej 5 ml / kolbę świeżego kompletnego DMEM w temperaturze 37 °C.
    3. Po 10 minutach inkubacji należy zamieszać, aby upewnić się, że wszystkie komórki zostały podniesione z kolby. Szybko dodaj 5 ml ciepłego kompletnego DMEM do każdej kolby, aby zneutralizować trypsynę.
    4. Delikatnie odpipetuj komórki kilka razy w górę i w dół, aby rozbić wszelkie "grudki". Przenieść zawieszone komórki z dwóch kolb do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
    5. Wirować przez 5 minut przy 200 x g, aby zebrać osad komórkowy. Zawiesić osad w 500 μl pożywki i przystąpić do umieszczania komórek w kolbach.
      nuta: Przykłady analiz, które należy wykonać na komórkach: 1) Reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-PCR) w celu analizy ekspresji genów; 2) Western blot do oceny ekspresji białka; 3) Analiza cytometrii przepływowej w celu ilościowego określenia liczby interesujących neuronalnych komórek progenitorowych i białek; 4) Immunofluorescencja w celu analizy ekspresji i lokalizacji białek.
  3. Wysiewanie astrocytów
    1. Po potraktowaniu pierwszorzędowych astrocytów trypsyną (patrz 4.2), zebrać 100 μl zawiesiny komórkowej w probówce mikrowirówki o pojemności 1,5 ml i dodać 100 μl 0,5% błękitu trypanowego.
    2. Dodać 10 μl zebranej zawiesiny w błękitu trypanowym do hemocytometru i policzyć wszystkie komórki, które są zdolne do życia.
    3. Korzystając ze wzorów podanych w kroku 3.3, należy obliczyć gęstość komórek przed przygotowaniem kolb.
    4. Przygotuj naczynia wielodołkowe, dodając do każdego dołka jedno sterylne szkiełko nakrywkowe pokryte poli-D-lizyną. Odpipetować 50 000 komórek i napełnić resztę objętości w każdym naczyniu wielodołkowym świeżą pożywką (około 2 ml).
    5. Umieścić szalki wielodołkowe w inkubatorze o temperaturze 37 °C przy 5% CO2 i po 5-7 dniach astrocyty mogą rosnąć i pokrywać całą powierzchnię szkiełek nakrywkowych.

5. Protokół OGD dla astrocytów pierwotnych

  1. Przygotowanie pożywki OGD
    1. Uzupełnij zmodyfikowaną glukozę Eagle's Eagle's firmy Dulbecco o 3,7 g/l wodorowęglanu sodu i 1% penicyliny/streptomycyny. Patrz materiały w Tabeli 4.
    2. Usunąć 20 ml pożywki wolnej od glukozy, bulgocząc 95% N2/5% CO2 przez 10 minut przy przepływie 15 l/min (wskazanym przez przepływomierz), wkładając pipetę serologiczną do instalacji gazowej w pożywce.
      nuta: Po oczyszczeniu pożywki z tlenu dostosować pH do 7.4 (patrz uwaga do kroku 2.1).
    3. Przefiltrować oczyszczone medium wolne od glukozy za pomocą systemu filtrów probówkowych o pojemności 50 ml.
      nuta: Przygotuj świeżą pożywkę OGD dla każdego eksperymentu, bulgocząc 95% N2/5% CO2 przed użyciem, aby upewnić się, że komórki są wystawione na działanie środowiska oczyszczonego z tlenu.
  2. Procedura doświadczalna
    1. Wewnątrz kaptura do hodowli tkankowej usunąć pożywkę astrocytów z wcześniej przygotowanych szkiełek nakrywkowych (patrz krok 4.3.5) i dwukrotnie przemyć komórkowym PBS, aby usunąć glukozę z komórek.
    2. Dodaj 2 ml pożywki OGD do każdej studzienki i umieść szalki wielodołkowe w komorze hipoksji ze zdjętymi pokrywkami.
    3. Podłączyć mieszaninę gazów do zaworu wejściowego i pozostawić zawór wylotowy otwarty. Przepłukać komorę mieszaniną gazów 95% N2/5% CO2 o stężeniu 15 l/min przez 5 minut.
    4. Zatrzymaj przepływ gazu i najpierw zamknij zacisk na zaworze wylotowym, a następnie zamknij zacisk na rurce zaworu wlotowego gazu.
      nuta: Upewnij się, że nie ma wycieku gazu, przykrywając uszczelkę komory wodą z mydłem. Jeśli uszczelka jest bezpieczna, nie powinny tworzyć się pęcherzyki.
    5. Umieścić całą komorę w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C na 1 godzinę lub 6 godzin w OGD.
    6. Po upływie czasu inkubacji odessać pożywkę OGD i ostrożnie odpipetować 2 ml kompletnego DMEM do każdej studzienki o długości 4,67cm2 na proces normoksyczny przez 24 godziny.

6. Protokół przygotowania pierwotnej immunofluorescencji astrocytów

Uwaga: Aby ocenić czystość astrocytów, różne typy komórek mózgowych, takie jak neurony, mikroglej i oligodendrocyty, mogą być wykrywane za pomocą immunofluorescencji przy użyciu różnych markerów komórkowych. Markery proliferacji, PCNA i jodek propidyny (PI) mogą być stosowane na pierwotnych astrocytach narażonych na OGD, a następnie w warunkach normoksycznych. Zobacz materiały w Tabeli materiałów.

  1. Preparat immunofluorescencyjny
    nuta: Jest to ogólny protokół immunofluorescencyjny, można wykonać drobne modyfikacje w celu uzyskania optymalnego sygnału (np. dłuższe okresy inkubacji, temperatura inkubacji). Każdy marker z tabeli 1 może być używany zgodnie z protokołem producenta.
    1. Aby ocenić żywotność komórek, komórki można inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C z PI (5 μM w pełnym DMEM) i dwukrotnie przemywać 2 ml PBS przez 5 minut. Komórki, które wykazują barwienie PI, są mniej żywotne.
      nuta: Użyj komórek poddanych działaniu metody 5.2.6.
    2. Aby utrwalić komórki po barwieniu PI, dodaj 2 ml 4% formaliny na 4,67 cm2 studzienkę, przez 20 minut w temperaturze 4 °C. W przypadku próbek oznaczonych PCNA preferowanym roztworem utrwalającym jest metanol podawany przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
      ostrożność: Formalina i metanol są toksyczne.
      nuta: Zawsze sprawdzaj konkretne protokoły przeciwciał każdej firmy.
    3. Myj komórki 2 ml PBS przez 5 minut i powtórz ten krok 3 razy.
    4. Inkubować komórki w roztworze blokującym (0,5% niejonowy środek powierzchniowo czynny, 10% FBS w PBS) przez 30 minut w temperaturze pokojowej z delikatnym wstrząsaniem.
    5. Myj komórki 2 ml PBS przez 5 minut, powtórz mycie 3 razy.
    6. Inkubować w temperaturze 4 °C, przez noc (16 godzin), z przeciwciałem pierwszorzędowym (PCNA, GFAP) w roztworze 1% FBS w PBS.
    7. Usuń pierwszorzędowy roztwór przeciwciała, przepłucz komórki 2 ml PBS przez 5 minut i powtórz ten krok 3 razy.
    8. Inkubować z przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z fluoroforem w roztworze 1% FBS w PBS, przez 1 godzinę, w temperaturze pokojowej.
    9. Myj komórki 2 ml PBS przez 5 minut, powtórz ten krok 3 razy. Dodaj 1 μg/ml DAPI (4',6'-diamidino-2-fenyloindol) przez 5 minut, aby wybarwić jądra komórkowe.
    10. Umyj komórki 2 ml PBS przez 5 minut, powtórz ten krok dwa razy i trzymaj w PBS.
    11. Przygotować szkiełka nakrywkowe na szkiełku mikroskopowym za pomocą podłoża montażowego.
  2. Mikroskop konfokalny
    1. Po ustawieniu mikroskopu połóż szkiełko nakrywkowe stroną do dołu na stoliku mikroskopu.
    2. Korzystając z oprogramowania, wybierz wiązkę laserową o długości fali 543 nm dla przeciwciała sprzężonego z GFAP-Cy3.

7. Test żywotności komórek

  1. Trypsynizuj i określ ilościowo astrocyty, wykonując kroki 4.3 i 4.4.
  2. Dodaj1x10 4 komórki/studzienki do 96-dołkowych płytek i wyhoduj je do zbiegu.
  3. Stosując metodologię z kroku 5, poddaj 96-dołkowe płytki hodowlanej działaniu normoksycznego 1 h OGD lub 6 h OGD.
  4. Po leczeniu OGD do wszystkich komórek dodaje się pożywkę normoksyjną na 24 godziny i mierzy się żywotność za pomocą testu odczynnikowego MTT (należy stosować zgodnie z instrukcjami producenta).
  5. Z roztworu MTT o stężeniu 5 mg/ml dodać 10% całkowitej objętości do każdego dołka i inkubować przez 3 godziny w temperaturze 37 °C z odczynnikiem MTT.
  6. Usunąć pożywkę i ponownie zawiesić kryształy za pomocą 200 μl sultlenku dimetylu. Odczytać płytkę w spektrofotometrze przy 570 nm.
    nuta: Zmniejszona absorbancja w stosunku do komórek kontrolnych będzie korelować z mniejszą żywotnością.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jednym z głównych problemów pierwotnej hodowli astrocytów jest obecność innych komórek, takich jak neurony, oligodendrocyty, fibroblasty i mikroglej. W Rysunek 1, izolowane komórki z kory szczura miały zmiany w pożywce co 3 dni i były albo nieleczone, albo leczone dodatkiem LME przez 1 godzinę. 24 godziny później, komórki były wybarwione immunologicznie na GFAP i przeciwbarwione DAPI. Nieleczone komórki wykazywały średnio 39% komórek nie-GFAP-dodatnich, podczas gdy k...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten opisuje izolację astrocytów od kory szczura. W tej metodzie kluczowe znaczenie ma zmniejszenie zanieczyszczenia innymi typami komórek, takimi jak mikroglej, oligodendrocyty i fibroblasty. Aby zmniejszyć liczbę mikrogleju, można podjąć kilka kroków: zmianę pożywki, wytrząsanie orbitalne i zabiegi chemiczne. Po potwierdzeniu czystości hodowli za pomocą immunofluorescencji przy użyciu selektywnych markerów komórkowych lub dla najbardziej widocznych zanieczyszczeń komórkowych można przeprowadzić eksperymenty. Na...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy pragną podziękować Paoli López Pieraldi za pomoc techniczną. A.H.M. jest wdzięczna za granty 8G12MD007600 i U54-NS083924, które wsparły tę publikację. Dziękujemy NIH-NIMHD-G12-MD007583 dotację za wsparcie obiektu. D.E.R.A. jest wdzięczna za stypendium zapewnione przez NIHNIGMS-R25GM110513. Jesteśmy wdzięczni za korzystanie ze Wspólnego Obszaru Oprzyrządowania oraz za pomoc dr Priscili Sanabrii w korzystaniu z Zakładu Obrazowania Optycznego programu RCMI w ramach grantu G12MD007583. Ponadto chcemy podziękować Jose Padilli za jego wyjątkową rolę w kręceniu i montażu protokołu wizualnego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Instrumenty do chirurgii - Krok 1
Nożyce operacyjne 5,5"Roboz CompanyRS-6812Narzędzia używane do dekapitacji szczurów.
Kleszcze zakrzywione 7"  Roboz CompanyRS-5271Przytrzymuje skórę szczura podczas usuwania czaszki.
Nożyczki do mikropreparacji 4"  Roboz CompanyRS-5882Tnie zarówno skórę, jak i czaszkę szczura.
Kleszczyki mikropreparacyjne 4" kątowe, drobno ostre Roboz CompanyRS-5095Przytrzymuje skórę szczura podczas usuwania czaszki.
Kleszcze mikropreparacyjne 4" lekko zakrzywione 0,8Roboz CompanyRS-5135Narzędzie służące do oddzielania kory.
Pęseta do mikropreparacjiFirma RobozRS-4972Peeling opon mózgowych.
Mikroskop preparacyjnyOlympusSZX16Ważny przy usuwaniu opony mózgowej z kory mózgowej.
DMEM Przygotowanie - krok 2
Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł" s Średni (DMEM)GibCo. Firma11995-065Wspomaga wzrost komórek.
Wodorowęglan soduSigma-Aldrich CompanyS7277Suplement do pożywek do hodowli komórkowych.
Płodowa surowica bydlęca (FBS)GibCo. Firma10437-010Surowica-suplement do hodowli komórkowych.
Penicylina-Streptomycyna GibCo. Firma15140-148Hamuje rozwój bakterii w hodowli komórkowej.
System filtracyjny 1L z porami 0,22umCorning431098
Hodowla astrocytów - krok 3
Pipety serologiczne 5 mlVWR89130-896Do pipetowania DMEM do pojemników z komórkami.
Pipety serologiczne 10 mlVWR89130-898Do pipetowania DMEM do pojemników z komórkami.
Pipety serologiczne 25 mlVWR89130-900Do pipetowania DMEM do pojemników z komórkami.
Probówka stożkowa wirówki 15 mlSanta Cruz Biotechnologysc-200250
Probówka z bezpiecznym zamkiem 1,5 mlEppendorf022363204
Końcówki barierowe 200 uLSanta Cruz Biotechnologysc-201725
Końcówki barierowe 1 mlSanta Cruz Biotechnologysc-201727
Pomarańczowa torba Biohazard 14 x 19"VWR14220-048
Szalki Petriego 60 mmFalcon351007
Sterylne gazikiHoneywell Safety89133-086
Stomacher 80 BiomasterSewar Lab System030010019Trójcier tkanki mózgowej.
Stomacher 80 Blender Sterylne workiSewar Lab SystemBA6040Sterylna torba do homogenizatora komórek stomachera.
Zlewka 400mLPyrex1000
Sterylne sito dysocjacyjne komórek, siatka #60 Sigma-Aldrich CompanyS1020Aby uzyskać jednolitą zawiesinę jednokomórkową.
Sterylne sito dysocjacyjne komórek, siatka #100Sigma-Aldrich CompanyS3895Aby uzyskać jednolitą zawiesinę jednokomórkową.
Mikroskop z odwróconymi fazamiNikonEclypse Ti-SSprawdź komórki pod kątem zanieczyszczenia lub nieprawidłowego wzrostu komórek.
75cm2 sterylne kolbyFalcon353136
Płytka wielodołkowaFalcon353046
Szkiełka nakrywkowe Micro (szkiełka nakrywkowe), 18mm, okrągłe
Bright-LineSigma-AldrichZ359629
Pipety PasteuraFisher Scientific13-678-20D
Alkohol etylowy Sigma-Aldrich CompanyE7023
Chlorowodorek estru metylowego L-leucyny 98% (LME)Sigma-Aldrich CompanyL1002Wspomaga eliminację komórek mikrogleju w pierwotnej kulturze astrocytów korowych.
Cytozyna β-D-arabinofuranozyd (Ara-C)Sigma-Aldrich CompanyC1768
Bromowodorek poli-D-lizyny, mol wt 70,000-150,000Sigma-Aldrich CompanyP0899
Trypsyna/EDTAGibCo. Firma15400-054
Trypan BlueSigma-Aldrich CompanyT8154
Bufor fosforanowy w tabletkach soli fizjologicznej (PBS)Calbiochem524650
Sterylna wodaSigma-Aldrich CompanyW3500
  Przygotowanie podłoża OGD - etap 5
Probówka stożkowa wirówki 50 mlVWR89039-658
Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s średnio wolna glukozaSigma-Aldrich CompanyD5030Wspomaga wzrost komórek.
Wodorowęglan soduSigma-Aldrich CompanyS7277Suplement do pożywek do hodowli komórkowych.
Penicylina-Streptomycyna GibCo. Firma15140-148Hamuje rozwój bakterii w hodowli komórkowej.
200mM  L-glutamina GibCo. Firma25030-081Aminokwas, który wspomaga wzrost komórek.
Tabletki z buforem soli fizjologicznej (PBS)Calbiochem524650
System filtracyjny 50 ml z porem 0,22umCorning430320
Stożkowa probówka wirówkowa 50 mlVWR89039-658
Pojedynczy przepływomierz Billups-RothenbergSMF3001Pomiar przepływu gazu podczas przedmuchiwania tlenem.
Komora inkubatora hipoksji StemCell27310Generuje środowisko hipoksyjne dla hodowli komórkowej.
Identyfikowalny miernik tlenu rozpuszczonegoVWR21800-022
95% mieszaniny gazów N2 / 5% CO2Lindeoczyszcza środowisko z tlenu.
pierwotna immunofluorescencja astrocytów - etap 6< / silny>
bufor fosforanowy w tabletkach soli fizjologicznej (PBS)Calbiochem524650
Roztwór formaliny Neutralny bufor 10%Sigma-AldrichHT501128Roztwór stosowany do utrwalania komórek.
Metanol FisherA4544Roztwór stosowany do naprawy komórek.
Niejonowy środek powierzchniowo czynny (Triton X-100)Sigma-AldrichT8787
Płodowa surowica bydlęca (FBS)GibCo. Firma10437-010Surowica-suplement do hodowli komórkowych.
Sygnalizacja komórkowaanty-NeuN24307Wykrywa dojrzałe neurony, służy do walidacji kultury astrocytów.
Sygnalizacja komórkowaanty-PCNA2586Wykrywa proliferujące komórki.
Jodek propidyny (PI)Sigma-Aldrich CompanyP4170Barwienie apoptozą.
Anti-Olig1AbcamAB68105Wykrywa dojrzałe oligodendrocyty.
Anti-Iba1+Wako016-20001Wykrywa komórki mikrogleju.
Anty-GFAP sprzężony z Cy3 Sigma-Aldrich CompanyC9205Wykrywa reaktywne astrocyty w leczonych komórkach.
Alexa Fluor 488Molecular Probe Life TechnologyA1101Przeciwciało wtórne przeciw myszy.
Alexa Fluor 555Sonda molekularna Life TechnologyA21428Przeciwciało wtórne przeciwko królikowi.
4',6'-diamidino-2-fenyloindol (DAPI)Sigma-Aldrich CompanyD9542Barwienie jądrowe.
Mikroskop konfokalnyOlympus
Hemacytometr Firma

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Goldstein, L. B., Bertels, C., Davis, J. N. Interrater reliability of the NIH stroke scale. Arch Neurol. 46 (6), 660-662 (1989).
  2. Hinkle, J. L., Guanci, M. M. Acute ischemic stroke review. J Neurosci Nurs. 39 (5), 285-293 (2007).
  3. Kassner, A., Merali, Z. Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in Stroke. Stroke. 46 (11), 3310-3315 (2015).
  4. Moskowitz, M. A., Lo, E. H., Iadecola, C. The science of stroke: mechanisms in search of treatments. Neuron. 67 (2), 181-198 (2010).
  5. Ben Haim, L., Carrillo-de Sauvage, M. A., Ceyzeriat, K., Escartin, C. Elusive roles for reactive astrocytes in neurodegenerative diseases. Front Cell Neurosci. 9, 278(2015).
  6. Broderick, J., et al. Guidelines for the Management of Spontaneous Intracerebral Hemorrhage in Adults 2007 Update: A Guideline From the American Heart Association/American Stroke Association Stroke Council, High Blood Pressure Research Council, and the Quality of Care and Outcomes in Research Interdisciplinary Working Group: The American Academy of Neurology affirms the value of this guideline as an educational tool for neurologists. Stroke. 38 (6), 2001-2023 (2007).
  7. Wang, R., et al. Oxygen-glucose deprivation induced glial scar-like change in astrocytes. PLoS One. 7 (5), e37574(2012).
  8. Sofroniew, M. V. Reactive astrocytes in neural repair and protection. The Neuroscientist. 11 (5), 400-407 (2005).
  9. Sofroniew, M. V., Vinters, H. V. Astrocytes: biology and pathology. Acta neuropathologica. 119 (1), 7-35 (2010).
  10. Souza, D. G., Bellaver, B., Souza, D. O., Quincozes-Santos, A. Characterization of adult rat astrocyte cultures. PLoS One. 8 (3), e60282(2013).
  11. Puschmann, T. B., et al. HB-EGF affects astrocyte morphology, proliferation, differentiation, and the expression of intermediate filament proteins. J Neurochem. 128 (6), 878-889 (2014).
  12. Robinson, C., Apgar, C., Shapiro, L. A. Astrocyte Hypertrophy Contributes to Aberrant Neurogenesis after Traumatic Brain Injury. Neural Plast. , 1347987(2016).
  13. Brekke, E., Berger, H. R., Wideroe, M., Sonnewald, U., Morken, T. S. Glucose and Intermediary Metabolism and Astrocyte-Neuron Interactions Following Neonatal Hypoxia-Ischemia in Rat. Neurochem Res. , (2016).
  14. Cekanaviciute, E., et al. Astrocytic transforming growth factor-beta signaling reduces subacute neuroinflammation after stroke in mice. Glia. 62 (8), 1227-1240 (2014).
  15. Zhu, Z., et al. Inhibiting cell cycle progression reduces reactive astrogliosis initiated by scratch injury in vitro and by cerebral ischemia in vivo. Glia. 55 (5), 546-558 (2007).
  16. Bovolenta, P., Wandosell, F., Nieto-Sampedro, M. Neurite outgrowth over resting and reactive astrocytes. Restor Neurol Neurosci. 2 (4), 221-228 (1991).
  17. Anderson, M. A., et al. Astrocyte scar formation aids central nervous system axon regeneration. Nature. 532 (7598), 195-200 (2016).
  18. Hao, C., Richardson, A., Fedoroff, S. Macrophage-like cells originate from neuroepithelium in culture: characterization and properties of the macrophage-like cells. Int J Dev Neurosci. 9 (1), 1-14 (1991).
  19. Saura, J. Microglial cells in astroglial cultures: a cautionary note. J Neuroinflammation. 4, 26(2007).
  20. Giulian, D., Baker, T. J. Characterization of ameboid microglia isolated from developing mammalian brain. J Neurosci. 6 (8), 2163-2178 (1986).
  21. Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. J Vis Exp. (71), (2013).
  22. Armstrong, R. C. Isolation and characterization of immature oligodendrocyte lineage cells. Methods. 16 (3), 282-292 (1998).
  23. McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85 (3), 890-902 (1980).
  24. Pont-Lezica, L., Colasse, S., Bessis, A. Depletion of microglia from primary cellular cultures. Methods Mol Biol. 1041, 55-61 (2013).
  25. Svensson, M., Aldskogius, H. Synaptic density of axotomized hypoglossal motorneurons following pharmacological blockade of the microglial cell proliferation. Exp Neurol. 120 (1), 123-131 (1993).
  26. Wong, V. K., Shapourifar-Tehrani, S., Kitada, S., Choo, P. H., Lee, D. A. Inhibition of rabbit ocular fibroblast proliferation by 5-fluorouracil and cytosine arabinoside. J Ocul Pharmacol. 7 (1), 27-39 (1991).
  27. Nakatsuji, Y., Miller, R. H. Density dependent modulation of cell cycle protein expression in astrocytes. J Neurosci Res. 66 (3), 487-496 (2001).
  28. Reeves, J. P. Accumulation of amino acids by lysosomes incubated with amino acid methyl esters. J Biol Chem. 254 (18), 8914-8921 (1979).
  29. Thiele, D. L., Kurosaka, M., Lipsky, P. E. Phenotype of the accessory cell necessary for mitogen-stimulated T and B cell responses in human peripheral blood: delineation by its sensitivity to the lysosomotropic agent, L-leucine methyl ester. J Immunol. 131 (5), 2282-2290 (1983).
  30. Hamby, M. E., Uliasz, T. F., Hewett, S. J., Hewett, J. A. Characterization of an improved procedure for the removal of microglia from confluent monolayers of primary astrocytes. J Neurosci Methods. 150 (1), 128-137 (2006).
  31. Corvalan, V., Cole, R., de Vellis, J., Hagiwara, S. Neuronal modulation of calcium channel activity in cultured rat astrocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (11), 4345-4348 (1990).
  32. Butler, I. B., Schoonen, M. A., Rickard, D. T. Removal of dissolved oxygen from water: A comparison of four common techniques. Talanta. 41 (2), 211-215 (1994).
  33. Tasca, C. I., Dal-Cim, T., Cimarosti, H. In vitro oxygen-glucose deprivation to study ischemic cell death. Methods Mol Biol. 1254, 197-210 (2015).
  34. Wu, D., Yotnda, P. Induction and testing of hypoxia in cell culture. J Vis Exp. (54), (2011).
  35. Rivera-Aponte, D., et al. Hyperglycemia reduces functional expression of astrocytic Kir4. 1 channels and glial glutamate uptake. Neuroscience. 310, 216-223 (2015).
  36. Berger, R., Garnier, Y., Pfeiffer, D., Jensen, A. Lipopolysaccharides do not alter metabolic disturbances in hippocampal slices of fetal guinea pigs after oxygen-glucose deprivation. Pediatric research. 48 (4), 531-535 (2000).
  37. Anderson, T. R., Jarvis, C. R., Biedermann, A. J., Molnar, C., Andrew, R. D. Blocking the anoxic depolarization protects without functional compromise following simulated stroke in cortical brain slices. Journal of neurophysiology. 93 (2), 963-979 (2005).
  38. Jarvis, C. R., Anderson, T. R., Andrew, R. D. Anoxic depolarization mediates acute damage independent of glutamate in neocortical brain slices. Cerebral Cortex. 11 (3), 249-259 (2001).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Izolacja astrocyt wdeprywacja tlenu i glukozypierwotna hodowla astrocyt wimmunofluorescencja GFAPtest proliferacji PCNAkora noworodka szczuradysocjacja tkankikomora hipoksjiproliferacja kom rekastrocyty reaktywne

Powiązane artykuły