Tutaj prezentujemy protokoły hodowli komórek ludzkich do analizy czynników inicjacji translacji, które wiążą 5' czapeczkę mRNA podczas fizjologicznych warunków tlenowych. Metoda ta wykorzystuje analog kapu m7GTP sprzężonego z agarozą i jest odpowiednia do badania czynników wiążących kap i ich oddziałujących partnerów.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Analiza białek wiążących czapeczki w komórkach ludzkich wystawionych na fizjologiczne warunki tlenowe
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Kontrola translacyjna jest centralnym punktem regulacji genów, szczególnie w okresach stresu komórkowego. Translacja zależna od czapeczki przez kompleks eIF4F jest zdecydowanie najczęstszą ścieżką inicjowania syntezy białek w komórkach eukariotycznych, ale obecnie pojawiają się specyficzne dla stresu odmiany tego kompleksu. Oczyszczanie białek wiążących czapeczkę za pomocą żywicy powinowactwa składającej się zm7GTP połączonego z agarozą (analog kapu 5' mRNA) jest użytecznym narzędziem do identyfikacji czynników zaangażowanych w regulację inicjacji translacji. Niedotlenienie (niski poziom tlenu) to stres komórkowy występujący podczas rozwoju płodu i progresji guza, który jest w dużym stopniu zależny od regulacji translacji. Co więcej, niedawno doniesiono, że dorosłe narządy ludzkie mają niższą zawartość tlenu (physioxia 1-9% tlenu), która jest bliższa niedotlenieniu niż otaczające powietrze, w którym rutynowo hoduje się komórki. Wraz z trwającą charakterystyką niedotlenionego kompleksu eIF4F (eIF4FH), rośnie zainteresowanie zrozumieniem zależnej od tlenu inicjacji translacji przez kap 5' mRNA. Niedawno opracowaliśmy metodę hodowli komórek ludzkich do analizy białek wiążących czapeczkę, które są regulowane przez dostępność tlenu. Protokół ten podkreśla, że hodowla komórek i liza powinny być przeprowadzane na stacji roboczej do hipoksji, aby wyeliminować narażenie na tlen. Komórki muszą być inkubowane przez co najmniej 24 godziny, aby płynne podłoże zrównoważyło się z atmosferą na stanowisku pracy. Aby uniknąć tego ograniczenia, do komórek można dodać wstępnie kondycjonowane (odtlenione) pożywki, jeśli wymagane są krótsze punkty czasowe. Niektóre białka wiążące kap wymagają interakcji z drugą zasadą lub mogą hydrolizować m7GTP, dlatego niektóre interaktory kapu mogą zostać pominięte w procesie oczyszczania. W tym protokole można podstawić agarozę do enzymatycznie opornych analogów kapu. Metoda ta pozwala użytkownikowi zidentyfikować nowe czynniki translacyjne regulowane tlenem, zaangażowane w translację zależną od czapeczki.
Wprowadzenie
Kontrola translacyjna staje się równie ważnym krokiem do regulacji transkrypcji w ekspresji genów, szczególnie w okresach stresu komórkowego1. Centralnym punktem kontroli translacji jest etap inicjacji ograniczający szybkość, w którym pierwsze etapy syntezy białek obejmują wiązanie eukariotycznego czynnika inicjacji 4E (eIF4E) z kapem 5' 7-metyloguanozyny (m7GTP) mRNA2. eIF4E jest częścią kompleksu trimerycznego o nazwie eIF4F, który obejmuje eIF4A, helikazę RNA i eIF4G, białko rusztowania wymagane do rekrutacji innych czynników translacyjnych i rybosom 40S3. W normalnych warunkach fizjologicznych zdecydowana większość mRNA ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowania do hodowli komórkowej
- Zakup dostępnych na rynku zapasów komórek ludzkich.
UWAGA: Ten protokół wykorzystuje raka jelita grubego HCT116 i pierwotne ludzkie komórki nabłonka kanalików proksymalnych nerek (HRPTEC). - Przygotować 500 ml pożywki do hodowli HCT116: Zmodyfikowana pożywka Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco/pożywka o wysokiej zawartości glukozy uzupełniona 7,5% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliną/streptomycyną (P/S).
- Przygotować 500 ml pożywki do hodowli HRPTEC: Pożywka dla komórek nabłonka uzupełniona 5% FBS, 1% suplementem wzrostu komórek nabłonkowych i 1% P/S.
- Przygotować 500 ml 1x só....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Analiza zdolności wiązania czapeczki eIF4E i eIF4E2 w odpowiedzi na tlen za pomocą kolumny powinowactwa m7GTP
Rysunki 1 i 2 przedstawiają analizy western blot typowego oczyszczania powinowactwa m7GTP dwóch głównych białek wiążących czapeczkę w odpowiedzi na wahania poziomu tlenu w dwóch ludzkich liniach komórkowych: pierwotnych ludzkich komórkach nabłonkowych cewek proksymalny.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Analiza białek wiążących kapu w komórkach ludzkich wystawionych na fizjologiczne warunki tlenowe może pozwolić na identyfikację nowych czynników inicjacji translacji regulowanych tlenem. Powinowactwo tych czynników do kapu 5' mRNA lub innych białek związanych z czapem można zmierzyć na podstawie siły ich asocjacji z kulkami agarozy połączonymi z m7GTP. Jednym z zastrzeżeń tej techniki jest to, że mierzy ona potencjał wiązania czapeczek białek po lizie, ale jest wykonywana w warunkach niedenaturujących, które u.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Radę Nauk Przyrodniczych i Inżynierii Kanady oraz Ministerstwo Badań i Innowacji Ontario.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| γ-aminofenylo-m7GTP agaroza C10-koraliki połączone | Jena Bioscience | AC-1555 | m7GTP |
| 100 mm | Corning | 877222 | 10-centymetrowa naczynie hodowlane 150 |
| mm | Thermofisher | 130183 | 15 cm naczynie hodowlane |
| AEBSF Chlorowodorek | ACROS Substancje organiczne | A0356829 | AEBSF |
| Koraliki agarozowe | Jena Bioscience | AC-0015 | Kontrola kulek agarozy |
| Bromofenol Blue | Fisher | BP112-25 | Składnik bufora ładującego SDS-PAGE |
| 1,5 ml Probówki wirówkowe | FroggaBio | 1210-00S | Służy do odwirowywania małych objętości |
| 15 ml Stożkowe probówki wirówkowe | Fisher | 1495970C | Stosowany w hodowli komórek pierwotnych |
| Zdefiniowany inhibitor trypsyny | Fisher | R007100 | DTI |
| Dithiothreitol | Fisher | BP172-25 | DTT |
| Pożywka z komórek nabłonkowych (kompletny zestaw) | ScienCell | 4101 | Zawiera suplementy surowicy i czynnika wzrostu) |
| Glicerol | Fisher | BP229-1 | Składnik bufora ładującego SDS-PAGE |
| 100 mM 5'-trifosforan guanozyny, 1 ml | Jena Bioscience | 272076-0251M | GTP |
| HCT116 rak jelita grubego | ATCC | CCL-247 | Ludzka linia komórkowa raka |
| Ludzkie komórki nabłonka kanalików proksymalnych nerki | ATCC | PCS-400-010 | HRPTEC |
| Hyclone DMEM / High Glucose GE | Life Sciences | SH30022.01 | Standardowe podłoża do hodowli komórek ludzkich |
| Roztwór hyklonu penicyliny i streptomycyny | GE Nauki Przyrodnicze | SV30010 | Antybiotykowy składnik DMEM |
| H35 HypOxystation | Hypoxygen | N/A | Stacja robocza do hipoksji |
| Igepal CA-630 | MP Biomedicals | 2198596 | Składnik detergentowy buforu do lizy |
| Fosforan monopotasowy | Fisher | P288-500 | KH2PO4 |
| Chlorek potasu | Fisher | P217-500 | KCl |
| Chlorek magnezu | Fisher | M33-500 | MgCl2 |
| Chlorek sodu | Fisher | BP358-10 | NaCl |
| Fluorek sodu | Fisher | 5299-100 | NaF (składnik inhibitora fosfatazy buforu do lizy) |
| Fosforan disodowy | Fisher | 5369-500 | Na2HPO4 |
| Premium Grade płodowa surowica bydlęca | 1500-500 | ||
| FBS Koktajl inhibitorów proteazy (100x) | Sygnalizacja komórkowa | 58715 | Składnik buforu do lizy |
| Dodecylosiarczan sodu | Fisher | BP166-100 | SDS |
| Ortowanadan sodu | Sigma | 56508 | Na3VO4 |
| Tris Base | Fisher | BP152-5 | Składnik |
| 0,05% Trypsyna-EDTA (1x) | Life Technologies | 2500-067 | Trypsyna stosowana do odłączania przylegających komórek |
Bibliografia
- Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
- Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. Regulation of translation initiation in eukaryotes: mechanisms and biological targets. Cell. 136 (4), ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
