Artykuł metodologiczny

Analiza białek wiążących czapeczki w komórkach ludzkich wystawionych na fizjologiczne warunki tlenowe

DOI:

10.3791/55112

⸱

28 grudnia 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Biology, University of Guelph

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokoły hodowli komórek ludzkich do analizy czynników inicjacji translacji, które wiążą 5' czapeczkę mRNA podczas fizjologicznych warunków tlenowych. Metoda ta wykorzystuje analog kapu m7GTP sprzężonego z agarozą i jest odpowiednia do badania czynników wiążących kap i ich oddziałujących partnerów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kontrola translacyjna jest centralnym punktem regulacji genów, szczególnie w okresach stresu komórkowego. Translacja zależna od czapeczki przez kompleks eIF4F jest zdecydowanie najczęstszą ścieżką inicjowania syntezy białek w komórkach eukariotycznych, ale obecnie pojawiają się specyficzne dla stresu odmiany tego kompleksu. Oczyszczanie białek wiążących czapeczkę za pomocą żywicy powinowactwa składającej się zm7GTP połączonego z agarozą (analog kapu 5' mRNA) jest użytecznym narzędziem do identyfikacji czynników zaangażowanych w regulację inicjacji translacji. Niedotlenienie (niski poziom tlenu) to stres komórkowy występujący podczas rozwoju płodu i progresji guza, który jest w dużym stopniu zależny od regulacji translacji. Co więcej, niedawno doniesiono, że dorosłe narządy ludzkie mają niższą zawartość tlenu (physioxia 1-9% tlenu), która jest bliższa niedotlenieniu niż otaczające powietrze, w którym rutynowo hoduje się komórki. Wraz z trwającą charakterystyką niedotlenionego kompleksu eIF4F (eIF4FH), rośnie zainteresowanie zrozumieniem zależnej od tlenu inicjacji translacji przez kap 5' mRNA. Niedawno opracowaliśmy metodę hodowli komórek ludzkich do analizy białek wiążących czapeczkę, które są regulowane przez dostępność tlenu. Protokół ten podkreśla, że hodowla komórek i liza powinny być przeprowadzane na stacji roboczej do hipoksji, aby wyeliminować narażenie na tlen. Komórki muszą być inkubowane przez co najmniej 24 godziny, aby płynne podłoże zrównoważyło się z atmosferą na stanowisku pracy. Aby uniknąć tego ograniczenia, do komórek można dodać wstępnie kondycjonowane (odtlenione) pożywki, jeśli wymagane są krótsze punkty czasowe. Niektóre białka wiążące kap wymagają interakcji z drugą zasadą lub mogą hydrolizować m7GTP, dlatego niektóre interaktory kapu mogą zostać pominięte w procesie oczyszczania. W tym protokole można podstawić agarozę do enzymatycznie opornych analogów kapu. Metoda ta pozwala użytkownikowi zidentyfikować nowe czynniki translacyjne regulowane tlenem, zaangażowane w translację zależną od czapeczki.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kontrola translacyjna staje się równie ważnym krokiem do regulacji transkrypcji w ekspresji genów, szczególnie w okresach stresu komórkowego1. Centralnym punktem kontroli translacji jest etap inicjacji ograniczający szybkość, w którym pierwsze etapy syntezy białek obejmują wiązanie eukariotycznego czynnika inicjacji 4E (eIF4E) z kapem 5' 7-metyloguanozyny (m7GTP) mRNA2. eIF4E jest częścią kompleksu trimerycznego o nazwie eIF4F, który obejmuje eIF4A, helikazę RNA i eIF4G, białko rusztowania wymagane do rekrutacji innych czynników translacyjnych i rybosom 40S3. W normalnych warunkach fizjologicznych zdecydowana większość mRNA ulega translacji poprzez mechanizm zależny od czapeczki, ale w okresach stresu komórkowego około 10% ludzkich mRNA zawiera 5' UTR, które mogą umożliwić niezależną od czapu inizację translacji1,4. Translacja zależna od czapek była historycznie synonimem eIF4F, jednak specyficzne dla stresu odmiany eIF4F stały się popularnym tematem5-8.

Różne stresy komórkowe powodują tłumienie aktywności eIF4E przez ssaczy cel kompleksu rapamycyny 1 (mTORC1). Kinaza ta ulega upośledzeniu pod wpływem stresu, co skutkuje zwiększoną aktywnością jednego z jej celów, białka wiążącego 4E (4E-BP). Niefosforylowany 4E-BP wiąże się z eIF4E i blokuje jego zdolność do interakcji z eIF4G, powodując tłumienie translacji zależnej od czapeczki9,10. Co ciekawe, homolog eIF4E o nazwie eIF4E2 (lub 4EHP) ma znacznie mniejsze powinowactwo do 4E-BP11, co być może pozwala mu uniknąć represji za pośrednictwem stresu. Rzeczywiście, początkowo charakteryzowany jako represor translacji ze względu na brak interakcji z eIF4G12, eIF4E2 inicjuje translację setek mRNA, które zawierają elementy odpowiedzi na niedotlenienie RNA w ich 3' UTR podczas stresu hipoksyjnego6,13. Aktywacja ta jest osiągana poprzez interakcje z eIF4G3, motywem białka wiążącego RNA 4 i czynnikiem indukowanym hipoksją (HIF) 2α w celu utworzenia niedotlenionego kompleksu eIF4F lub eIF4FH6,13. Jako represor w normalnych warunkach, eIF4E2 wiąże się z GIGYF2 i ZNF59814. Kompleksy te zostały częściowo zidentyfikowane za pomocą żywic powinowactwa dom7GTP związanych z agarozą. Ta klasyczna metoda15 jest standardem w dziedzinie translacji i jest najlepszą i najczęściej stosowaną techniką izolowania kompleksów wiążących kap w testach pull down i wiązania in vitro 16-19. Ponieważ maszyneria translacyjna zależna od czapeczki staje się elastyczna i adaptowalna z wymiennymi częściami6-8,13, metoda ta jest potężnym narzędziem do szybkiej identyfikacji nowych białek wiążących kap zaangażowanych w reakcję na stres. Co więcej, różnice w eIF4F mogą mieć szerokie implikacje, ponieważ kilka systemów modeli eukariotycznych wydaje się wykorzystywać homolog eIF4E2 do reakcji na stres, takich jak A. thaliana20, S. Pombe21, D. melanogaster22 i C. elegans23.

Dowody sugerują, że zmiany w eIF4F mogą nie być ściśle ograniczone do warunków stresowych, ale być związane z normalną fizjologią24. Dopływ tlenu do tkanek (na końcach naczyń włosowatych) lub w tkankach (mierzony za pomocą mikroelektrod) waha się od 2-6% w mózgu25, 3-12% w płucach26, 3,5-6% w jelicie27, 4% w wątrobie28, 7-12% w nerkach29, 4% w mięśniach30 i 6-7% w szpiku kostnym31. Komórki i mitochondria zawierają mniej niż 1,3% tlenu32. Wartości te są znacznie bliższe hipoksji niż otaczające powietrze, w którym rutynowo hoduje się komórki. Sugeruje to, że to, co wcześniej uważano za procesy komórkowe specyficzne dla niedotlenienia, może być istotne w warunkach fizjologicznych. Co ciekawe, eIF4F i eIF4FH aktywnie uczestniczą w inicjacji translacji odrębnych pul lub klas mRNA w kilku różnych ludzkich liniach komórkowych wystawionych na działanie tlenu fizjologicznego lub "fizjeksji"24. Niski poziom tlenu napędza również prawidłowy rozwój płodu33, a komórki na ogół mają wyższe tempo proliferacji, dłuższą żywotność, mniej uszkodzeń DNA i mniej ogólnych reakcji na stres w fizjeksji34. W związku z tym eIF4FH jest prawdopodobnie kluczowym czynnikiem w ekspresji wybranych genów w warunkach fizjologicznych.

Tutaj udostępniamy protokół do hodowli komórek w stałych fizjologicznych warunkach tlenowych lub w dynamicznym zakresie fluktuacji, który jest prawdopodobnie bardziej reprezentatywny dla mikrośrodowisk tkankowych. Jedną z zalet tej metody jest to, że komórki są poddawane lizie w stacji roboczej do hipoksji. Często nie jest jasne, w jaki sposób przejście od niedotlenionej hodowli komórek do lizy komórek odbywa się w innych protokołach. Komórki są często najpierw usuwane z małego inkubatora do hipoksji przed lizą, ale ta ekspozycja na tlen może wpływać na szlaki biochemiczne, ponieważ odpowiedź komórkowa na tlen jest szybka (jedna lub dwie minuty)35. Niektóre białka wiążące kap wymagają interakcji z drugą zasadą lub mogą hydrolizować m7GTP, dlatego niektóre interaktory kapu mogą zostać pominięte w procesie oczyszczania. W tym protokole można podstawić agarozę do enzymatycznie opornych analogów kapu. Badanie aktywności i składu eIF4FH i innych odmian eIF4F za pomocą opisanej tutaj metody rzuci światło na skomplikowane mechanizmy ekspresji genów, które komórki wykorzystują w warunkach fizjologicznych lub reakcjach na stres.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowania do hodowli komórkowej

  1. Zakup dostępnych na rynku zapasów komórek ludzkich.
    UWAGA: Ten protokół wykorzystuje raka jelita grubego HCT116 i pierwotne ludzkie komórki nabłonka kanalików proksymalnych nerek (HRPTEC).
  2. Przygotować 500 ml pożywki do hodowli HCT116: Zmodyfikowana pożywka Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco/pożywka o wysokiej zawartości glukozy uzupełniona 7,5% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliną/streptomycyną (P/S).
  3. Przygotować 500 ml pożywki do hodowli HRPTEC: Pożywka dla komórek nabłonka uzupełniona 5% FBS, 1% suplementem wzrostu komórek nabłonkowych i 1% P/S.
  4. Przygotować 500 ml 1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS): 140 mM NaCl, 3 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 15 mM KH2PO4. Doprowadzić pH do 7,4 i sterylizować w autoklawie przez 40 minut w temperaturze 121 °C.

2. Rozpoczęcie hodowli komórek

  1. Ostrożnie odessaj pożywkę z naczynia o gęstości 80-90%, nie naruszając komórek.
  2. Podniec 3-5 ml 1x PBS na szalkę hodowlaną, delikatnie kołysz każdą kolbą, aby pokryć powierzchnię naczynia i ostrożnie zasysaj 1x PBS. Powtórz przez drugie pranie 1x PBS.
  3. Podwielokrotność 3 ml 0,05% kwasu trypsyna-etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) do każdej szalki hodowlanej i delikatnie przetrząsnąć, aby równomiernie pokryć komórki trypsyną-EDTA. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 2-3 minuty.
  4. Przenieść oderwane komórki do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i wirować przy 4 000 x g przez 90 sekund.
  5. Zawiesić osad komórkowy w 1 ml kompletnego DMEM.
  6. Policz komórki za pomocą hemocytometru. Oblicz, ile niepirogennych i polistyrenowych naczyń do hodowli komórkowych o średnicy 100 mm jest potrzebnych do osiągnięcia początkowej gęstości wysiewu około 2,500-5,000 komórek nacm2.
  7. Wstępnie ogrzać kompletną pożywkę do hodowli komórkowych przygotowaną w krokach 1,2 lub 1,3 w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 30-45 minut.
  8. Odkazić pożywkę, butelkę i fiolkę z komórkami 70% etanolem. Od tego momentu wszystkie czynności powinny być wykonywane aseptycznie.
  9. Podaniec 6 ml kompletnego DMEM na tyle płytek do hodowli komórkowych o średnicy 100 mm, ile jest wymaganych do wykorzystania całej objętości zamrożonych komórek w ramach gęstości wysiewu podanej w kroku 2.6.
  10. Przenieść objętość zawiesiny komórek obliczoną w kroku 2.6 na każdą z szalek hodowlanych o średnicy 100 mm. Kołysz każdą płytkę ręcznie, aby równomiernie rozprowadzić komórki na powierzchni płytki.
  11. Umieścić naczynie do hodowli komórkowych o średnicy 100 mm z nasionami w inkubatorze w temperaturze 37 °C w atmosferze 5%CO2. Pozwól komórkom na inkubację co najmniej 24 godziny przed kolejnymi krokami.

3. Hodowla

  1. Obejrzyj każdą szalkę z kulturą komórkową pod mikroskopem, aby określić procent zbieżności komórek (% komórek pokrywających powierzchnię szalki). Włóż komórki z powrotem do inkubatora i wstępnie ogrzej kompletne podłoże i 1x PBS. Przejdź do następnego kroku, jeśli komórki są w 80-100% zlewne.
  2. Ostrożnie odessać zużytą pożywkę, nie naruszając komórek w każdym naczyniu hodowlanym.
  3. Podniec 3-5 ml 1x PBS na szalkę hodowlaną, delikatnie kołysz każdą kolbą, aby pokryć powierzchnię naczynia i ostrożnie zasysaj 1x PBS. Powtórz przez drugie pranie 1x PBS.
  4. Porcję 3 ml 0,05% trypsyny-EDTA do każdej szalki hodowlanej i delikatnie przetrząsnąć, aby równomiernie pokryć komórki trypsyną-EDTA. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 2-3 minuty.
  5. Podczas tej inkubacji należy podać 10 ml kompletnej pożywki do tylu szalek hodowlanych, ile potrzeba, aby uzyskać gęstość komórek 2 500-5 000 komórek na cm2.
  6. Gdy komórki oderwą się od płytki, szybko dodaj 3 ml 1x zdefiniowanego inhibitora trypsyny i delikatnie obracaj naczynie przez 1 minutę, aby upewnić się, że cała trypsyna-EDTA została zneutralizowana.
  7. Przenieść oderwane komórki do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i odstawić na bok. Dodaj 3 ml 1x PBS do naczynia, aby zebrać pozostałe komórki i przenieś je do tej samej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
  8. Granulować komórki, odwirowując 150 x g przez 5 minut.
  9. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 3 ml kompletnego podłoża.
  10. Policz komórki za pomocą hemocytometru i zasiewaj 150 mm szalki hodowlane zawierające 15 ml kompletnej pożywki, aby uzyskać gęstość komórek 2,500-5,000 komórek nacm2. Użyj dwóch 150 mm dla każdego testu wiązania czape.
    UWAGA: Dyfuzja tlenu do komórek przez ciekłe media zależy od objętości36. Zaleca się utrzymywanie stałej objętości pożywki między doświadczeniami, niezależnie od tego, czy używane są komórki przylegające, czy komórki w zawiesinie. Pożywki mogą być wstępnie kondycjonowane (inkubowane w stacji roboczej przez 24 godziny, jak omówiono w dyskusji), aby uniknąć tych zmian w dyfuzji.
  11. Umieścić szalki z kulturami nasion w inkubatorze w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 . Pozwól komórkom inkubować się przez co najmniej 24 godziny przed przejściem do następnych kroków.

4. Ekspozycja fizjologiczna

  1. Zobacz komórki pod mikroskopem. Aby uzyskać najlepsze wyniki, upewnij się, że komórki są zlewające się w 70-80% w przypadku 24-godzinnej ekspozycji, 50-60% zlewające się w przypadku 48-godzinnej ekspozycji i 40-50% zlewające się w przypadku 72-godzinnej ekspozycji.
  2. Umieść komórki w stacji roboczej do hipoksji na żądany czas (24, 48 lub 72 godziny w zależności od eksperymentu).
  3. Ustaw stację roboczą na odpowiednią physioxia.
    UWAGA: Na przykład ustawieniu 3%O2 towarzyszyłoby 5% CO2 i 92% N2.
    UWAGA: Jeśli pożądane są wahania tlenu w określonym zakresie czasowym, zaprogramuj harmonogram w przyrządzie lub ręcznie dostosuj ustawienia tlenu w żądanych odstępach czasu.
  4. Ustaw wilgotność na 60%. Atmosfera na stanowisku pracy jest jednak bardzo sucha, a media zauważalnie odparowują podczas długich eksperymentów (>48 godzin). Przechowywać rezerwę pożywki w kolbie do hodowli komórkowych w obrębie stacji roboczej (tak, aby pożywka była zrównoważona z atmosferą stacji roboczej) w celu uzupełnienia pożywki w szalkach do hodowli komórkowych.
    UWAGA: Każdy roztwór, który będzie oddziaływał z komórkami przed lizą (taki jak PBS i trypsyna-EDTA) powinien być wstępnie kondycjonowany przez 24 godziny przed użyciem w stacji roboczej do hipoksji, aby rozpuszczony tlen zrównoważył się z tlenem atmosferycznym36.
  5. Utrzymuj komórki w stacji roboczej do czasu lizy.

5. Przygotowanie do testu wiążącego kapsol

  1. Przygotuj 1x sól fizjologiczną buforowaną Tris (TBS).
    1. W 800 mldH2O rozpuścić 8,76 g NaCl i 6,05 g Tris Base.
    2. Doprowadzić roztwór do końcowego pH 7,4 przy użyciu 1 M HCl.
    3. Doprowadzić końcową objętość do 1 l za pomocą dH2O.
  2. Przygotować niedenaturujący bufor do lizy. Przygotować bufor do lizy w dniu testu wiązania czapeczki. Wykonać dodatkowy bufor do lizy, aby umyć puste kulki agarozy i kulki połączone agarozą C10 γ-aminofenylo-m7GTP (kroki 7.9 i 7.13).
    1. Do 7 mldH2O dodać 160 μl 5 M NaCl, 160 μl 1 M Tris-HCl pH 7,4, 40 μl 200 mM NaF, 40 μl 1 M MgCl2 i 40 μl 1 mM orthovanadan sodu.
    2. Dodać 40 μl leku Igepal do 7 ml roztworu. Odetnij końcówkę pipety, aby ułatwić pobieranie pipety, ponieważ jest ona bardzo lepka.
    3. Mieszać pipetując w górę i w dół lub wirując 7 ml roztworu, aż do rozpuszczenia całego Igepal.
    4. Zwiększyć końcową objętość roztworu do 8 ml i trzymać na lodzie.
  3. Przygotować 4x bufor do próbek dodecylosiarczanu sodu (SDS)-PAGE.
    1. W zlewce wymieszaj 16 ml 1 M Tris-HCl o pH 6,8, 12,64 ml glicerolu i 8 ml ditiotreitolu (DTT).
    2. Dodać 3,2 g SDS i 0,16 g błękitu bromofenolowego. Pozostawić proszek do całkowitego rozpuszczenia, mieszając go z mieszadłem magnetycznym.
    3. Porcjować do 1,5 ml probówek do mikrowirówek i przechowywać w temperaturze -20 °C.

6. Liza komórek

  1. Przygotować niedenaturujący bufor do lizy i przechowywać na lodzie w dniu próby wiązania czapeczek.
  2. Podgrzej 1x PBS i trypsynę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 30 min.
  3. Porcję 980 μl buforu do lizy do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml dla każdego przeprowadzanego testu wiązania czapeczek.
  4. Dodać 10 μl chlorowodorku 4-(2-aminoetylo)fluorku benzenesulfonylu i 10 μl 100-krotnego koktajlu inhibitorów proteazy do 980 μl buforu do lizy. Trzymaj na lodzie.
  5. Wyrzuć pożywkę z każdej płytki o średnicy 150 mm do pojemnika na odpady w stacji roboczej do hipoksji.
  6. Umyj komórki 3-4 ml ciepłego 1x PBS i wylej cały płyn.
  7. Dodaj 1 ml ciepłej 0,05% trypsyny-EDTA do każdego naczynia i odstaw na 2 minuty lub do momentu, gdy komórki przestaną przylegać do płytki.
  8. Za pomocą pipety przenieść komórki jednej płytki do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Powtórz w razie potrzeby, aby każda płytka komórek została przeniesiona do oddzielnej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.
  9. Odwirować probówki mikrowirówkowe o pojemności 1,5 ml o pojemności 6 000 x g przez 90 sekund w celu osadzenia komórek.
  10. Zassać trypsynę za pomocą pipety, nie naruszając osadu. Jeśli osad zostanie naruszony, należy ponownie odwirować probówkę mikrowirówkową o pojemności 1,5 ml przy 6 000 x g przez 90 sekund.
  11. Umyj komórki ciepłym 1x PBS, delikatnie pipetując 200 μl PBS do probówki tuż nad osadem. Ponownie odwirować, jeśli osad zostanie naruszony.
  12. Zassać PBS bez naruszania osadu.
  13. Odpipetować 500 μl z 1 ml przygotowanego roztworu buforowego do lizy na pierwszy osad komórkowy. Zawiesić osad w całości, pipetując w górę iw dół.
  14. Połączyć zawieszone komórki z drugą osadką komórkową i ponownie zawiesić drugą osadkę, pipetując w górę i w dół. Powtarzaj ten proces, aż wszystkie granulki zostaną połączone i ponownie zawieszone dla każdej próbki.
  15. Połączyć lizat z pozostałymi 500 μl buforu do lizy w probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.
  16. Usuń próbki ze stacji roboczej do hipoksji.
    UWAGA: Po dodaniu buforu do lizy wszystkie kolejne kroki należy wykonać w powietrzu otoczenia, ponieważ stacja robocza do hipoksji jest ustawiona na 37 °C, a kolejne kroki należy wykonać w niskiej temperaturze (4 °C lub na lodzie).
  17. Poddać komórki lizie za pomocą delikatnego mieszania, obracając próbki w temperaturze 4 °C przez 1,5-2 godziny.
  18. Odwirować zlizane komórki przy 12 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia resztek komórkowych.
  19. Przenieść lizat do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml i wyrzucić osad.
  20. Zarezerwuj porcję (5-10%) supernatantu do wykorzystania jako kontrola wejściowa lizatu komórkowego do przyszłej analizy western blot.

7. Test wiązania czapek

  1. Dla każdej próbki przenieść 50 μl ślepej zawiesiny kontrolnej kulki agarozy i 50 μl zawiesiny kulek agarozy połączonej γ-aminofenylo-m7GTP C10 do oddzielnych probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Użyj nożyczek, aby usunąć końcówkę pipety, aby ułatwić zbieranie gnojowicy z kulek.
    2. Granulki osadzać
  2. przez odwirowanie gnojowicy o stężeniu 500 x g przez 30 sekund.
  3. Ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić kulki w 500 μl TBS.
  4. Powtórz kroki 7.2 i 7.3. Granulki osadzać w masie 500 x g przez 30 sekund i usunąć supernatant.
  5. Przenieść supernatant zawierający lizat z etapu 6.19 do probówki mikrowirówki o pojemności 1,5 ml zawierającej ślepe kulki agarozy.
    UWAGA: Puste kulki agarozy działają jako etap wstępnego oczyszczania w celu usunięcia białek z lizatu, które niespecyficznie oddziałują z kulką.
  6. Inkubować przez 10 minut w temperaturze 4 °C, delikatnie mieszając.
  7. Puste kulki agarozy osadzać przez odwirowanie przy 500 x g przez 30 sekund.
  8. Przenieść lizat do probówki mikrowirówki o pojemności 1,5 ml zawierającej kulki połączone agarozą C10 γ-aminofenylo-m7GTP.
  9. Przemyć puste kulki agarozy przez ponowne zawieszenie kulek w 500 μl buforu do lizy, granulowanie kulek przez odwirowanie przy 500 x g przez 30 sekund i odrzucenie supernatantu. Powtórz to cztery razy, w sumie pięć prań.
  10. Ponownie zawiesić ślepe kulki agarozy w 1x buforze próbki SDS-PAGE i gotować kulki przez 90 sekund w temperaturze 95 °C. Przechowywać w temperaturze -20 °C do przyszłej analizy western blot w celu zaobserwowania, czy białko będące przedmiotem zainteresowania wiąże się niespecyficznie z kulką.
  11. Inkubować lizat z kulkami połączonymi z agarozą C10 γ-aminofenylo-m7GTP, delikatnie mieszając przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C w celu wychwycenia białek wiążących czapeczkę.
  12. Granulki połączone z agarozą C10 γ-aminofenylo-m7GTP należy osadzać, odwirowując przy 500 x g przez 30 sekund. Odrzucić supernatant.
  13. Umyj kulki połączone agarozą C10 γ-aminofenylo-m7GTP, powtarzając krok 7.9.
  14. Ponownie zawiesić kulki w 600 μl buforu do lizy.
  15. Dodać GTP do końcowego stężenia 1 mM.
  16. Inkubować kulki połączone z agarozą C10 γ-aminofenylo-m7+ 1 mM GTP z delikatnym mieszaniem przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C. Uwaga: Spowoduje to dysocjację białek, które niespecyficznie oddziałują z m7GTP (tj. Oddziałują również z niemetylowanym GTP).
  17. Granulki połączone z agarozą C10 γ-aminofenylo-m7GTP przez odwirowanie przy 500 x g przez 30 sekund.
  18. Przenieść supernatant do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i dodać 200 μl 4x buforu do próbek SDS-PAGE (50 mM Tris-HCl, 100 mM DTT, 2% SDS, 0,1% błękitu bromofenolowego i 10% glicerolu). Przechowywać próbkę kontrolną GTP w temperaturze -20 °C do przyszłej analizy western blot37. Umyj koraliki, powtarzając krok 7.9.
  19. Ponownie zawiesić kulki w 1x buforze próbek SDS-PAGE (50 mM Tris-HCl, 100 mM DTT, 2% SDS, 0,1% błękitu bromofenolowego i 10% glicerolu) i gotować w temperaturze 95 °C przez 90 sekund. Frakcję związaną z m7GTP przechowywać w temperaturze -20 °C do przyszłej analizy western blot37.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analiza zdolności wiązania czapek w odpowiedzi na tlen eIF4E i eIF4E2 w kolumnie powinowactwa m7GTP

Rysunki 1 i 2 przedstawiają western blot typowego dla m7GTP powinowactwa oczyszczanie dwóch głównych białek wiążących czapeczkę w odpowiedzi na wahania tlenu w dwóch ludzkich liniach komórkowych: pierwotnych ludzkich komórkach nabłonka kanalików proksymalnych nerki (HRPTEC) w F<...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analiza białek wiążących kapu w komórkach ludzkich wystawionych na fizjologiczne warunki tlenowe może pozwolić na identyfikację nowych czynników inicjacji translacji regulowanych tlenem. Powinowactwo tych czynników do kapu 5' mRNA lub innych białek związanych z czapem można zmierzyć na podstawie siły ich asocjacji z kulkami agarozy połączonymi z m7GTP. Jednym z zastrzeżeń tej techniki jest to, że mierzy ona potencjał wiązania czapeczek białek po lizie, ale jest wykonywana w warunkach niedenaturujących, które u...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Radę Nauk Przyrodniczych i Inżynierii Kanady oraz Ministerstwo Badań i Innowacji Ontario.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
γ-aminofenylo-m7GTP agaroza C10-koraliki połączoneJena BioscienceAC-1555m7GTP
100 mmCorning87722210-centymetrowa naczynie hodowlane 150
mmThermofisher13018315 cm naczynie hodowlane
AEBSF ChlorowodorekACROS Substancje organiczneA0356829AEBSF
Koraliki agarozoweJena Bioscience AC-0015Kontrola kulek agarozy
Bromofenol BlueFisherBP112-25Składnik bufora ładującego SDS-PAGE
1,5 ml Probówki wirówkoweFroggaBio1210-00SSłuży do odwirowywania małych objętości
15 ml Stożkowe probówki wirówkoweFisher1495970CStosowany w hodowli komórek pierwotnych
Zdefiniowany inhibitor trypsynyFisherR007100DTI
DithiothreitolFisherBP172-25DTT
Pożywka z komórek nabłonkowych (kompletny zestaw)ScienCell4101Zawiera suplementy surowicy i czynnika wzrostu)
GlicerolFisherBP229-1Składnik bufora ładującego SDS-PAGE
100 mM 5'-trifosforan guanozyny, 1 mlJena Bioscience272076-0251MGTP
HCT116 rak jelita grubegoATCCCCL-247Ludzka linia komórkowa raka
Ludzkie komórki nabłonka kanalików proksymalnych nerkiATCCPCS-400-010HRPTEC
Hyclone DMEM / High Glucose GELife SciencesSH30022.01Standardowe podłoża do hodowli komórek ludzkich
Roztwór hyklonu penicyliny i streptomycynyGE Nauki PrzyrodniczeSV30010Antybiotykowy składnik DMEM
H35 HypOxystationHypoxygenN/AStacja robocza do hipoksji
Igepal CA-630MP Biomedicals2198596Składnik detergentowy buforu do lizy
Fosforan monopotasowyFisherP288-500KH2PO4
Chlorek potasuFisherP217-500KCl
Chlorek magnezuFisherM33-500MgCl2
Chlorek soduFisherBP358-10NaCl
Fluorek soduFisher5299-100NaF (składnik inhibitora fosfatazy buforu do lizy)
Fosforan disodowyFisher5369-500Na2HPO4
Premium Grade płodowa surowica bydlęca1500-500
FBS Koktajl inhibitorów proteazy (100x)Sygnalizacja komórkowa58715Składnik buforu do lizy
Dodecylosiarczan soduFisherBP166-100SDS
Ortowanadan soduSigma56508Na3VO4
Tris BaseFisherBP152-5Składnik
0,05% Trypsyna-EDTA (1x)Life Technologies2500-067Trypsyna stosowana do odłączania przylegających komórek
Półka hodowlana

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
  2. Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. Regulation of translation initiation in eukaryotes: mechanisms and biological targets. Cell. 136 (4), 731-745 (2009).
  3. Gingras, A. C., Raught, B., Sonenberg, N. eIF4 initiation factors: effectors of mRNA recruitment to ribosomes and regulators of translation. Annu Rev Biochem. 68, 913-963 (1999).
  4. Weingarten-Gabbay, S., et al. Comparative genetics. Systematic discovery of cap-independent translation sequences in human and viral genomes. Science. 351 (6270), (2016).
  5. Andreev, D. E., et al. Oxygen and glucose deprivation induces widespread alterations in mRNA translation within 20 minutes. Genome Biol. 16, 90(2015).
  6. Ho, J. J., et al. Systemic Reprogramming of Translation Efficiencies on Oxygen Stimulus. Cell Rep. 14 (6), 1293-1300 (2016).
  7. Shatsky, I. N., Dmitriev, S. E., Andreev, D. E., Terenin, I. M. Transcriptome-wide studies uncover the diversity of modes of mRNA recruitment to eukaryotic ribosomes. Crit Rev Biochem Mol Biol. 49 (2), 164-177 (2014).
  8. Ho, J. J., Lee, S. A Cap for Every Occasion: Alternative eIF4F Complexes. Trends Biochem Sci. , (2016).
  9. Lin, T. A., et al. PHAS-I as a link between mitogen-activated protein kinase and translation initiation. Science. 266 (5185), 653-656 (1994).
  10. Richter, J. D., Sonenberg, N. Regulation of cap-dependent translation by eIF4E inhibitory proteins. Nature. 433 (7025), 477-480 (2005).
  11. Tee, A. R., Tee, J. A., Blenis, J. Characterizing the interaction of the mammalian eIF4E-related protein 4EHP with 4E-BP1. FEBS Lett. 564 (1-2), 58-62 (2004).
  12. Rom, E., et al. Cloning and characterization of 4EHP, a novel mammalian eIF4E-related cap-binding protein. J Biol Chem. 273 (21), 13104-13109 (1998).
  13. Uniacke, J., et al. An oxygen-regulated switch in the protein synthesis machinery. Nature. 486 (7401), 126-129 (2012).
  14. Morita, M., et al. A novel 4EHP-GIGYF2 translational repressor complex is essential for mammalian development. Mol Cell Biol. 32 (17), 3585-3593 (2012).
  15. Webb, N. R., Chari, R. V., DePillis, G., Kozarich, J. W., Rhoads, R. E. Purification of the messenger RNA cap-binding protein using a new affinity medium. Biochemistry. 23 (2), 177-181 (1984).
  16. Kiriakidou, M., et al. An mRNA m7G cap binding-like motif within human Ago2 represses translation. Cell. 129 (6), 1141-1151 (2007).
  17. Mazza, C., Segref, A., Mattaj, I. W., Cusack, S. Large-scale induced fit recognition of an m(7)GpppG cap analogue by the human nuclear cap-binding complex. EMBO J. 21 (20), 5548-5557 (2002).
  18. Nojima, T., Hirose, T., Kimura, H., Hagiwara, M. The interaction between cap-binding complex and RNA export factor is required for intronless mRNA export. J Biol Chem. 282 (21), 15645-15651 (2007).
  19. Pabis, M., Neufeld, N., Shav-Tal, Y., Neugebauer, K. M. Binding properties and dynamic localization of an alternative isoform of the cap-binding complex subunit CBP20. Nucleus. 1 (5), 412-421 (2010).
  20. Ruud, K. A., Kuhlow, C., Goss, D. J., Browning, K. S. Identification and characterization of a novel cap-binding protein from Arabidopsis thaliana. J Biol Chem. 273 (17), 10325-10330 (1998).
  21. Ptushkina, M., et al. A second eIF4E protein in Schizosaccharomyces pombe has distinct eIF4G-binding properties. Nucleic Acids Res. 29 (22), 4561-4569 (2001).
  22. Cho, P. F., et al. A new paradigm for translational control: inhibition via 5'-3' mRNA tethering by Bicoid and the eIF4E cognate 4EHP. Cell. 121 (3), 411-423 (2005).
  23. Dinkova, T. D., Keiper, B. D., Korneeva, N. L., Aamodt, E. J., Rhoads, R. E. Translation of a small subset of Caenorhabditis elegans mRNAs is dependent on a specific eukaryotic translation initiation factor 4E isoform. Mol Cell Biol. 25 (1), 100-113 (2005).
  24. Timpano, S., Uniacke, J. Human Cells Cultured Under Physiological Oxygen Utilize Two Cap-binding Proteins to Recruit Distinct mRNAs for Translation. J Biol Chem. , (2016).
  25. Dings, J., Meixensberger, J., Jager, A., Roosen, K. Clinical experience with 118 brain tissue oxygen partial pressure catheter probes. Neurosurgery. 43 (5), 1082-1095 (1998).
  26. Le, Q. T., et al. An evaluation of tumor oxygenation and gene expression in patients with early stage non-small cell lung cancers. Clin Cancer Res. 12 (5), 1507-1514 (2006).
  27. Muller, M., et al. Effects of desflurane and isoflurane on intestinal tissue oxygen pressure during colorectal surgery. Anaesthesia. 57 (2), 110-115 (2002).
  28. Brooks, A. J., Eastwood, J., Beckingham, I. J., Girling, K. J. Liver tissue partial pressure of oxygen and carbon dioxide during partial hepatectomy. Br J Anaesth. 92 (5), 735-737 (2004).
  29. Muller, M., et al. Renocortical tissue oxygen pressure measurements in patients undergoing living donor kidney transplantation. Anesth Analg. 87 (2), 474-476 (1998).
  30. Richardson, R. S., et al. Human skeletal muscle intracellular oxygenation: the impact of ambient oxygen availability. J Physiol. 571 (Pt 2), 415-424 (2006).
  31. Harrison, J. S., Rameshwar, P., Chang, V., Bandari, P. Oxygen saturation in the bone marrow of healthy volunteers. Blood. 99 (1), 394(2002).
  32. Gleadle, J., Ratcliffe, P. Hypoxia. , John Wiley & Sons, Ltd. Chichester. (2001).
  33. Gluckman, E., et al. Hematopoietic reconstitution in a patient with Fanconi's anemia by means of umbilical-cord blood from an HLA-identical sibling. N Engl J Med. 321 (17), 1174-1178 (1989).
  34. Parrinello, S., et al. Oxygen sensitivity severely limits the replicative lifespan of murine fibroblasts. Nat Cell Biol. 5 (8), 741-747 (2003).
  35. Jewell, U. R., et al. Induction of HIF-1alpha in response to hypoxia is instantaneous. FASEB J. 15 (7), 1312-1314 (2001).
  36. Newby, D., Marks, L., Lyall, F. Dissolved oxygen concentration in culture medium: assumptions and pitfalls. Placenta. 26 (4), 353-357 (2005).
  37. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  38. Haghighat, A., Mader, S., Pause, A., Sonenberg, N. Repression of cap-dependent translation by 4E-binding protein 1: competition with p220 for binding to eukaryotic initiation factor-4E. EMBO J. 14 (22), 5701-5709 (1995).
  39. Pyronnet, S., et al. Human eukaryotic translation initiation factor 4G (eIF4G) recruits mnk1 to phosphorylate eIF4E. EMBO J. 18 (1), 270-279 (1999).
  40. Okumura, F., Zou, W., Zhang, D. E. ISG15 modification of the eIF4E cognate 4EHP enhances cap structure-binding activity of 4EHP. Genes Dev. 21 (3), 255-260 (2007).
  41. Kedersha, N., et al. Evidence that ternary complex (eIF2-GTP-tRNA(i)(Met))-deficient preinitiation complexes are core constituents of mammalian stress granules. Mol Biol Cell. 13 (1), 195-210 (2002).
  42. Gu, M., et al. Insights into the structure, mechanism, and regulation of scavenger mRNA decapping activity. Mol Cell. 14 (1), 67-80 (2004).
  43. Szczepaniak, S. A., Zuberek, J., Darzynkiewicz, E., Kufel, J., Jemielity, J. Affinity resins containing enzymatically resistant mRNA cap analogs--a new tool for the analysis of cap-binding proteins. RNA. 18 (7), 1421-1432 (2012).
  44. Joshi, B., Cameron, A., Jagus, R. Characterization of mammalian eIF4E-family members. Eur J Biochem. 271 (11), 2189-2203 (2004).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Cap binding ProteinsOxygen RegulationHypoxia Workstationm7GTP Agarose BeadsAffinity PurificationWestern Blot AnalysisCell Lysis ProtocolPhysiological Oxygen ConditionsTranslation Initiation FactorsGTP Wash Specificity

Powiązane artykuły