Artykuł metodologiczny

Ładowanie barwnika wapniowego do zakończeń nerwowych żaby przez kikut nerwowy: przejściowa rejestracja wapnia w połączeniu nerwowo-mięśniowym żaby

DOI:

10.3791/55122

⸱

8 lipca 2017

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Biophysics of Synaptic Processes, Kazan Scientific Centre, Kazan Institute of Biochemistry and Biophysics, Russian Academy of Sciences, 2Open Laboratory of Neuropharmacology, Kazan Federal University, 3Department of Radiophotonics and Microwave Technologies, A.N. Tupolev Kazan National Research Technical University, 4Department of Medical and Biological Physics, Kazan State Medical University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy metodę ładowania barwnika wrażliwego na wapń przez pień nerwu żaby do zakończeń nerwowych. Przedstawiamy również protokół rejestracji i analizy szybkich stanów przejściowych wapnia w zakończeniach nerwów obwodowych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jedną z najbardziej realnych metod pomiaru presynaptycznego poziomu wapnia w presynaptycznych zakończeniach nerwowych jest zapis optyczny. Opiera się na zastosowaniu wrażliwych na wapń barwników fluorescencyjnych, które zmieniają swoją intensywność emisji lub długość fali w zależności od stężenia wolnego wapnia w komórce. Istnieje kilka metod barwienia komórek barwnikami wapniowymi. Najczęściej spotykane są procesy ładowania barwników przez mikropipetę lub wstępnej inkubacji z formami estrów acetoksymetylowych barwników. Jednak metody te nie mają pełnego zastosowania do połączeń nerwowo-mięśniowych (NMJ) ze względu na pojawiające się problemy metodologiczne. W tym artykule przedstawiamy metodę ładowania barwnika wrażliwego na wapń przez kikut nerwu żaby do zakończeń nerwowych. Ponieważ wnikanie zewnętrznego wapnia do zakończeń nerwowych i późniejsze wiązanie się z barwnikiem wapnia następuje w skali milisekundowej, konieczne jest użycie systemu szybkiego obrazowania w celu zarejestrowania tych interakcji. W tym miejscu opisujemy protokół rejestrowania stanu nieustalonego wapnia za pomocą szybkiej kamery CCD.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jony wapnia (Ca2+) uczestniczą w wielu neuronalnych procesach sygnalizacyjnych, w tym w inicjacji, utrzymaniu i plastyczności uwalniania mediatora1,2,3,4,5. Po nadejściu potencjału czynnościowego zewnątrzkomórkowy Ca2 + dostaje się do zakończenia nerwowego i inicjuje uwalnianie neuroprzekaźnika. W niektórych synapsach prąd wapnia może być mierzony bezpośrednio metodami elektrofizjologicznymi6,7,8. W przypadku połączenia nerwowo-mięśniowego (NMJ) nie można stosować bezpośredniego zacisku krosowego i dwuelektrodowego zacisku napięciowego ze względu na niewielki rozmiar zakończeń nerwowych.

Zapisy wewnętrznych prądów Ca2+ z zakończeń nerwowych w NMJ mogą być wykonywane za pomocą pośrednich metod elektrofizjologicznych9,10. Jednak metody te wymagają wstępnego leczenia synapsy blokerami kanałów jonowych sodu i potasu. Metody optyczne nie wymagają farmakologicznej separacji prądów jonowych w końcówce nerwowej i pozwalają na zapis napływuCa2+, wywołanego potencjałami czynnościowymi, a następnie podniesienia jonów Ca2+ w aksoplazmie11,12,13,14. Metody te opierają się na zapisach zmian fluorescencji określonych barwników wrażliwych na Ca2+ po związaniu wolnych jonów Ca2+ 15,16,17,18,19.

Ca2+ wskaźniki mogą być ładowane do komórek różnymi metodami, w zależności od celu eksperymentu. Badacze stosują w kąpieli przepuszczalne dla membrany formy barwnika20,21, ładowanie za pomocą pipety krosowej22, lub mikroiniekcja23,24,25. Jednak wszystkie te metody mają pewne ograniczenia w przypadku NMJ ze względu na jego specyfikę w architekturze synaptycznej. W przypadku NMJ najwygodniejszą i najskuteczniejszą metodą jest załadowanie barwnika przez kikut nerwowy, metoda wypełniania do przodu26,27,28,29. Technika ta może być stosowana do ładowania różnych barwników fluorescencyjnych do zakończeń nerwów obwodowych. Metoda ta została z powodzeniem zastosowana w Drosophila class="xref">28, nerwu ruchowego jaszczurki 28 oraz zakończeń nerwu ruchowego żaby17,26,27,30. W zależności od badanego obiektu, szczegóły metodyczne mogą się różnić. Szklana mikropipeta może być stosowana do małych nerwów od larw28. Kilku badaczy opisało metodę27,28, w której świeżo odcięty koniec nerwu unerwiającego mięsień jest zanurzany w studzience wstępnie wypełnionej barwnikiem. Preparat pozostawia się następnie na kilka godzin, aby nasącznić barwnik. Barwnik jest wchłaniany przez aksony i transportowany do zakończeń nerwowych. W artykule opisano metodę ładowania wskaźnika fluorescencji do zakończeń nerwu ruchowego żaby przez kikut nerwowy. Nasz protokół wykorzystuje plastikową końcówkę pipety do inkubacji tkanki z barwnikiem. Opisujemy również, jak pozyskiwać i analizować stany przejściowe fluorescencjiCa2+.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eksperymenty zostały przeprowadzone na izolowanych preparatach nerwowo-mięśniowych mięśnia piersiowego skóry z żaby Rana ridibunda. Wielkość zwierząt obu płci wynosiła około 5-9 cm. Procedury doświadczalne przeprowadzono zgodnie z wytycznymi dotyczącymi wykorzystania zwierząt laboratoryjnych Kazańskiego Uniwersytetu Federalnego i Kazańskiego Uniwersytetu Medycznego, zgodnie z Przewodnikiem NIH dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych. Protokół eksperymentalny spełniał wymagania Dyrektywy Rady Wspólnot Europejskich 86/609/EWG i został zatwierdzony przez Komisję Etyczną Kazańskiego Uniwersytetu Medycznego.

1. Przygotowanie roztworów

  1. Przygotowanie roztworu Ringera.
    1. Przygotuj roztwór Ringera: 113,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 3,0 mM NaHCO3 i 1,8 mM CaCl2. Dostosuj pH do 7,2-7,4.
    2. Przygotować roztwór Ringera o niskiej zawartości Ca2+ i wysokiej zawartości Mg2+: 113,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 3,0 mM NaHCO3, 6,0 mM MgCl2, 0,9 mM CaCl2. Dostosuj pH do 7,2-7,4.
  2. Przygotowanie roztworu obciążającego barwnik.
    1. Przygotować roztwór na bazie wody zawierający HEPES-Na o stężeniu 10 mM (pH 7,2-7,4).
    2. Dodać 14 μl roztworu HEPES do fiolki z barwnikiem30.
      UWAGA: barwnik wskaźnikowy Ca2+ znajduje się w fiolce o pojemności 500 μl z 500 μg proszku.
    3. Zwiruj i odwiruj, aby dokładnie wymieszać.
    4. Rozcieńczyć roztwór, aby obniżyć końcowe stężenie wskaźnika Ca2+ do 30 mM. Unikać ekspozycji na światło i przechowywać w temperaturze -20 °C.

2. Procedura ładowania barwnika

  1. Wypreparuj mięsień piersiowy skóry kawałkiem nerwu piersiowego właściwego.
    UWAGA: Procedura sekcji jest dostępna do bezpłatnego pobrania artykułu autorstwa Blioch et al., 196831.
    1. Do procedury preparacji należy użyć dwóch cienkich kleszczyków i nożyczek do rogówki (patrz tabela materiałów). Przenieś wypreparowaną tkankę na pokrytą elastomerem silikonowym szalkę Petriego wstępnie wypełnioną roztworem Ringera i przymocuj tkankę drobnymi szpilkami ze stali nierdzewnej tak, aby była lekko rozciągnięta w naczyniu.
    2. Ponownie napełnić szalkę Petriego świeżą porcją roztworu Ringera. Usuń tkankę łączną. Nie uszkadzaj nerwu.
  2. Przygotuj pipetę do napełniania: za pomocą żyletki wytnij kawałek stożkowej części o długości ~2 mm standardowej plastikowej końcówki do pipety o pojemności 10 μl.
  3. Przygotuj kawałek plasteliny, aby zamontować pipetę napełniającą na szalce Petriego.
  4. Podłącz tylną część pipety napełniającej do plastikowej strzykawki za pomocą silikonowej rurki i plastikowych adapterów połączeniowych wykonanych z końcówek pipet.
  5. Przed przystąpieniem do ładowania barwnika należy usunąć roztwór Ringera z płytki Petriego za pomocą plastikowej pipety. Osuszyć preparat mięśniowo-nerwowy za pomocą cienkiej strzykawki; Zapobiegnie to rozcieńczeniu barwnika Ca2+ po kolejnym załadowaniu pipety napełniającej.
  6. Wyjmij fiolkę ze wskaźnikiem Ca2+ z zamrażarki i pozostaw do rozmrożenia w temperaturze pokojowej w ciemnym miejscu.
  7. Pod kontrolą stereomikroskopu z małym powiększeniem (10×) wykryj połączenie między mięśniem a nerwem. Za pomocą cienkiej pęsety i nożyczek przeciąć nerw piersiowy właściwy blisko powierzchni mięśnia (patrz krok 2.1). Pozostaw kikut nerwowy o długości około 2 mm.
  8. Zamocuj pipetę napełniającą przymocowaną do rurki i strzykawkę na szalce Petriego za pomocą plasteliny.
  9. Przesuń końcówkę pipety bliżej kikuta nerwowego.
  10. Nie ściskając go, delikatnie zassaj kikut nerwowy do końcówki pipety napełniającej.
  11. Wyjmij rurkę ssącą z końca pipety napełniającej.
  12. Ostrożnie usunąć nadmiar roztworu z pipety napełniającej za pomocą strzykawki z długą igłą (patrz Tabela Materiałów). Nie ściskaj kikuta nerwowego.
  13. Lekko podnieś w pionie końcówkę pipety do napełniania, trzymając kikut nerwu zassany w końcówce.
  14. Zaizoluj zasysaną część kikuta nerwowego od zewnętrznej strony końcówki pipety napełniającej za pomocą wazeliny.
  15. W razie potrzeby osuszyć kikut nerwowy izolowany w pipecie do napełniania: delikatnie odessać nadmiar roztworu z pipety napełniającej za pomocą strzykawki z długą igłą.
  16. Pobrać 0,5 μl roztworu obciążającego barwnik (patrz krok 1) za pomocą pipety z długą końcówką do pipet.
  17. Delikatnie włóż końcówkę pipety z roztworem ładującym do pipety napełniającej. Wyrzuć mieszaninę bezpośrednio na kikut nerwu.
  18. Uszczelnij otwarty koniec pipety napełniającej wazeliną.
  19. Dodać małą porcję roztworu Ringera do szalki Petriego, aby preparat był mokry.
  20. Preparat inkubować w temperaturze pokojowej w ciemnych i wilgotnych warunkach przez 5 godzin.
  21. Wyjąć pipetę napełniającą z roztworem napełniającym, przepłukać preparat roztworem Ringera i przechowywać przez noc w lodówce w temperaturze 8 °C.

3. Przygotowanie tkanki do mikroskopii

  1. Zamontuj preparat w komorze pokrytej elastomerem silikonowym i przymocuj go stalowymi mikroigłami tak, aby był lekko rozciągnięty.
  2. Przepłukać tkankę porcją świeżego roztworu Ringera.
  3. Użyj elektrody ssącej do stymulacji nerwu; konstrukcja elektrody jest dostępna do bezpłatnego pobrania artykułu Kazakov et al., 201532. Umieść końcówkę elektrody blisko odciętego końca nerwu i zassaj kikut nerwu do otworu elektrody.
  4. Zamontuj komorę przygotowawczą na stoliku mikroskopu. Umieść sondę temperatury oraz odpalacze wlotowe i wylotowe w komorze.
  5. Podłącz przewód zasilający do elementu Peltiera.
  6. Aby przelać preparat, użyj prostego systemu napędzanego grawitacją. Aby usunąć nadmiar roztworu, włącz perfuzyjną pompę ssącą.
  7. Włączyć regulator termiczny.
  8. Ustaw regulator temperatury na 20 °C.
  9. Zamontuj osłonę chroniącą przed promieniowaniem ultrafioletowym.
  10. Podłącz elektrodę drucianą stymulującą do stymulatora elektrycznego i obserwuj skurcze mięśni pod mikroskopem za pomocą soczewki obiektywowej 4x.
  11. Napełnij system perfuzyjny roztworem Ringera o niskiej zawartości Ca2+ i wysokiej zawartości Mg2+.
    UWAGA: To rozwiązanie stosuje się w celu zapobiegania skurczom mięśni. Spadek stężenia wapnia zewnętrznego i wzrost magnezu zewnętrznego powodują zmniejszenie amplitudy stanów nieustalonychCa2+. Jednak w oparciu o wcześniejsze doświadczenia, 0,9 mM CaCl2 i 6 mM MgCl2 są nadal wystarczające, aby niezawodnie określić amplitudę stanów nieustalonych Ca2+. Warto wspomnieć, że istnieje kilka innych sposobów na zmniejszenie skurczów mięśni bez obniżania stężenia Ca2+. Na przykład, użycie d-tubokuraryny lub alfa-bungarotoksyny, specyficznych blokerów nikotynowych receptorów acetylocholiny, całkowicie lub częściowo zablokuje skurcze mięśni17,27,28,30. Jednak dodatek tych toksyn może również wpływać na presynaptyczne wejście wapnia33. Aby tego uniknąć, można użyć μ-konotoksyny GIIIA27.
  12. Włączyć pompę i rozpocząć superfuzję preparatu roztworem Ringera o niskim stężeniuCa2+ i wysokimMg2+.
  13. Przełącz się na 40× soczewkę obiektywową w mikroskopie.
  14. Włącz monochromator (patrz tabela materiałów).
  15. Wybierz długość fali emisji 488 nm i ciągły tryb oświetlenia w oprogramowaniu sterującym monochromatorem.
  16. W dużym powiększeniu w trybie fluorescencji upewnij się, że zakończenia nerwowe zostały załadowane barwnikiem.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Nerw i zakończenia z załadowanym wskaźnikiem Ca2+. (A) Nerw wypełniony wskaźnikiem Ca2+ po procedurze ładowania. Podziałka = 200 μm. (B) Zakończenia nerwowe wypełnione wskaźnikiem Ca2+. Podziałka = 20 μm. (C) Fluorescencja wskaźnika Ca2+ jest wyraźnie widoczna w zakończeniu nerwowym. Podziałka = 20 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Pozostawić preparat do zrównoważenia przez co najmniej 30 minut w roztworze o niskiej zawartościCa2+ i wysokiej zawartościMg2+.

4. Przechwytywanie wideo za pomocą cyfrowej kamery CCD

Uwaga: Szczegóły przechwytywania sygnałów fluorescencyjnych są specyficzne dla każdego typu mikroskopu i kamery, ale kluczową kwestią jest szybkość przechwytywania obrazu.

  1. Użyj 1 kHz jako minimalnej częstotliwości przechwytywania dla nagrań pojedynczych stanów nieustalonych Ca2+ w NMJ.
    UWAGA: Do obrazowania fluorescencyjnego niezbędne są szybkie cyfrowe kamery CCD (patrz Tabela materiałów). Do synchronizacji kamery, monochromatora i stymulatora wykorzystano tu system akwizycji danych oraz oprogramowanie (patrz tabela materiałów). Krótko mówiąc, protokół ten umożliwia generowanie impulsów synchronizacyjnych na wyjściach cyfrowych systemu akwizycji danych w celu otwarcia migawki, przechwycenia sygnału wideo i zainicjowania stymulacji. Wszystkie parametry czasowe można ustawić w protokołach i/lub na aparatach. Typowy protokół to seria 500 klatek zarejestrowanych z częstotliwością 1 kHz (80 x 80 pikseli). Oświetlenie światłem wzbudzającym może wybielić wskaźnik Ca2 + i fotouszkodzić tkankę komórkową. Dlatego unikaj długich ekspozycji na światło wzbudzające. W tym protokole migawka jest otwarta tylko na czas potrzebny do uchwycenia wideo. Zdobądź dwadzieścia serii na określone zakończenie nerwowe. Celem jest monitorowanie tych samych miejsc w grupie kontrolnej i po podaniu leku.
  2. Pod obiektywem 4X mikroskopu użyj reżimu jasnego pola, aby uwidocznić gałęzie mięśniowe i nerwowe.
  3. Przełącz się na soczewkę obiektywową 40X i korzystając z reżimu epifluorescencji i długości fali wzbudzenia 488 nm, poszukaj zakończeń nerwowych obciążonych barwnikiem. Zidentyfikuj obszar zakończenia nerwowego będący przedmiotem zainteresowania.
  4. Na tubusie trójokularowym mikroskopu wybierz poziomy wymiany ścieżki światła: 100% światła do kamery.
  5. Uruchom oprogramowanie do akwizycji obrazu z kamery CCD.
  6. W trybie "Na żywo" znajdź zwrot z inwestycji i dostosuj ostrość.
  7. Wybierz ustawienia menu "Zmień".
  8. Użyj "Konfiguracji podstawowej" przy 1,000 klatkach na sekundę (fps), z rozdzielczością 80 x 80.
  9. Ustaw liczbę ramek wejściowych na 500.
  10. Wpisz nazwę eksperymentu.
  11. Wybierz "Wyzwalacz zewnętrzny".
  12. Ustaw czas przed wyzwoleniem na 10 ms.
  13. Ustaw liczbę powtórzeń na 20.
  14. W oprogramowaniu sterującym monochromatorem wybierz długość fali emisji 488 nm i tryb "zewnętrznego oświetlenia wyzwalacza".
  15. Uruchom oprogramowanie do akwizycji danych.
  16. Załaduj protokół stymulacji.
  17. Przed nagraniem wideo uchwyć ciemną klatkę za pomocą oprogramowania do akwizycji wideo.
  18. Uruchom protokół stymulacji.
  19. Wybierz ROI i sprawdź nagrany sygnał.

5. Analiza danych

NoOTE: Do analizy danych użyj oprogramowania kamery CCD i ImageJ; dane są reprezentowane jako krzywa w programie arkusza kalkulacyjnego. W oprogramowaniu kamery CCD wykonaj średnio 20 powtórzeń i wyeksportuj wyniki do pliku pomocniczego ImageJ. W ImageJ wybierz ROI i tło. Odejmij tło od zwrotu z inwestycji. Przedstaw dane jako stosunek: (ΔF/F0 -1) x 100%, gdzie ΔF to intensywność fluorescencji podczas stymulacji, a F0 to intensywność fluorescencji w spoczynku.

  1. W oprogramowaniu do akwizycji kamery CCD kliknij File > Average Files (Plik Średnia pliki). Wybierz pliki i uśrednij je.
  2. Zapisz uśredniony plik jako plik .fit, klikając "Zapisz jako plik dopasowania".
  3. Uruchom oprogramowanie ImageJ. Wykonaj następujące czynności:
  4. Kliknij opcję Obraz> dostosować jasność/kontrast >.
  5. Kliknij pozycję Stosy obrazów > > narzędzia > sortowanie stosów.
  6. Kliknij Narzędzia do analizy > > menedżera ROI.
  7. Przeciągnij i upuść uśredniony plik .fit do okna ImageJ.
  8. Powiększ okno, aby uzyskać lepszy widok.
  9. Przesuwając kursor, zaznacz ostatnią klatkę i usuń ją (jest to ciemna ramka)
  10. Wybierz prostokątny zwrot akcji nad obszarem, który ma być tłem. Dodaj go do menedżera ROI
  11. Zmierz tło, klikając Więcej > Multi Measure. Zwróć uwagę na wartość ŚREDNIA. Skopiuj dane, wyeksportuj je do programu arkusza kalkulacyjnego i oblicz średnią wartość progu dla współczynnika.
  12. Odejmij próg od stosów, klikając Przetwarzaj > Główny > Odejmij. Wprowadź uśrednioną wartość progu.
  13. Wybierz prostokątny obszar zwrotu wokół zakończenia nerwowego. Dodaj go do menedżera ROI.
  14. Zmierz, klikając pozycję Więcej > Multi Measure. Zwróć uwagę na wartość ŚREDNIA. Skopiuj i wyeksportuj go do programu do obsługi arkuszy kalkulacyjnych.
  15. Uśrednij przesunięcie sygnałów.
    UWAGA: Wykorzystaj pierwsze kilkadziesiąt punktów demonstrujących fluorescencję barwnika bazowego bez stymulacji; To jest fluorescencja w spoczynku.
  16. Podziel sygnały przez fluorescencję w spoczynku.
  17. Odejmij "1" i pomnóż przez 100%.
  18. Wykreśl sygnał i oblicz amplitudę stanu nieustalonego Ca2+.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Po załadowaniu barwnikiem i stymulacji nerwu ruchowego, w zakończeniach nerwowych można wykryć wzrost amplitudy sygnału fluorescencyjnego (Ca2+ przejściowy) (patrz Rysunek 2). Parametry stanów nieustalonych Ca2+ przedstawiono w tabeli 1. Ilościowo parametry stanów nieustalonych Ca2+ zmierzone w naszym badaniu są zbliżone do danych uzyskanych przez innych naukowców w synapsach zwierząt zmiennocieplnych15,34. Parametry stanów nieustalonychCa2+ zależą od szybkości wiązania Ca2+ z barwnikiem i późniejszej dysocjacji. Szybkość wnikania Ca2+ do zakończenia nerwowego, interakcja z barwnikiem i dyfuzja w cytoplazmie wpływają na czas narastania stanu przejściowego Ca2+. Czas zaniku sygnału fluorescencyjnego zależy od powinowactwa barwnika, szybkości interakcji Ca2+ z wewnątrzkomórkowymi oraz usuwania przez pompy jonowe35. Analiza amplitudy stanów nieustalonychCa2+ może być wykorzystana do zbadania wpływu różnych substancji na wejście wapnia, który uczestniczy w uwalnianiu neuroprzekaźników33.

figure-results-1
Rysunek 2: Uśredniony stan przejściowy Ca2+ zmierzony w żabie NMJ. Stan przejściowy Ca2+ został obliczony na podstawie średniej sygnałów z 13 żabich NMJ. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Szczyt ΔF/F (%)Czas narastania: 20%-80% (ms)τ (ms)
12,6 ±1,1 (n = 13)4,6 ±0,5 (n = 13)115,3 ±8,3 (n = 13)

Tabela 1: Uśrednione parametry stanu przejściowego Ca2+. Dane przedstawiono jako średnią ± SE; n to liczba pomiarów w różnych NMJ. Szczyt ΔF/F jest uśrednioną amplitudą ΔF/F.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W niniejszej pracy przedstawiono metodę przeprowadzania ładowania barwnika wrażliwego naCa2+ do zakończeń nerwowych żaby przez kikut nerwu. Pod koniec procedury ładowania wszystkie zakończenia w bliższej części nerwu mają znaczny poziom fluorescencji. Oszacowano, że stężenie wewnątrzkońcowe sondy waha się od 40 do 150 μM17.

Procedura inkubacji przebiega w dwóch etapach: w temperaturze pokojowej, a następnie w niższej temperaturze w lodówce. Ważne jest, aby kontrolować czas inkubacji tkanek z barwnikiem w temperaturze pokojowej. W zależności od rzeczywistej długości kikuta nerwowego, konkretnego barwnika i temperatury, czas inkubacji może się różnić. W przypadku prześwietlenia zakończenia w częściach proksymalnych w pobliżu kikuta nerwowego mogą być przeciążone. Jednak w środkowej części nerwu nadal można znaleźć zakończenia, które są zadowalająco obciążone. Podczas długiej inkubacji w lodówce barwnik jest równomiernie rozprowadzany na zakończeniach nerwowych.

Nasze własne obserwacje33,35, jak również dane innych badaczy30, dowodzą braku jakiegokolwiek istotnego wpływu procedury obciążenia na amplitudę odpowiedzi postsynaptycznej lub na częstotliwość miniaturowych potencjałów płytek końcowych. Dobra trwałość została udokumentowana w załadowanych preparatach. Jest kilka ważnych punktów, na które chcielibyśmy zwrócić uwagę. Bardzo ważne jest, aby umieścić kikut nerwowy w roztworze ładującym barwnik w ciągu kilku minut po wycięciu, aby barwnik mógł dostać się do aksonów przeciętego nerwu; Opóźnienia mogą powodować nieefektywne obciążenie, prawdopodobnie z powodu ponownego uszczelnienia aksonów nerwowych27,36. Niektórzy badacze zanurzają kikut nerwu w 100 mM EDTA (chelator Ca2 + i Mg2 +) natychmiast po wycięciu nerwu, aby zapobiec ponownemu uszczelnieniu przeciętych aksonów. Bufor usuwa się po 1-2 minutach i zastępuje roztworem barwiącym37. Użycie studzienki z wazeliną zamiast plastikowej rurki do procedury załadunku pozwala na użycie krótszego kikuta nerwowego. Przy zastosowaniu tego podejścia nerw jest przecinany po zanurzeniu go w roztworze HEPES z barwnikiem, a aksony nie zamykają się ponownie z powodu braku jonów dwuwartościowych w roztworze barwnika27,28.

W naszym badaniu zamiast dekstranu użyliśmy rozpuszczalnej w wodzie formy soli wskaźnika Ca2+ . Koniugaty dekstranu dyfundują w aksonie wolniej niż tworzy się sól. Jednak zastosowanie koniugatu dekstranu zmniejsza podział barwnika na przedziały i obchodzenie się z nim przez nerwy i NMJ. Konjugat dekstranu Calcium Green 1-3,000 MW ma dobrą szybkość dyfuzji i wykazuje zmniejszoną kompartmentalizację38.

Bardzo ważne jest, aby unikać długiego okresu fluorescencyjnego oświetlenia tkanki, ponieważ wpływa to na jej zdrowie i przeżycie. Używamy optyki Nomarskiego w kanale światła widzialnego do poszukiwania zakończeń nerwowych. Podczas nagrania ograniczamy oświetlane pole za pomocą przysłony.

Warto zauważyć, że ta metoda ładowania jest odpowiednia tylko dla preparatów, które mogą wytrzymać długie inkubacje. Aby skrócić czas ładowania barwnika, gdy badania są prowadzone na bardziej delikatnych tkankach (np. synapsach zwierząt stałocieplnych), konieczne jest zmniejszenie długości kikuta nerwowego i użycie mikropipet do ładowania29,39.

Ta technika ładowania dobrze nadaje się do obrazowania zmian w cytozolowym Ca2 +, ze wskaźnikami fluorescencyjnymi zarówno pod wpływem stymulacji pojedynczego nerwu, jak i rytmicznej aktywności synaptycznej 17,27,35. Analiza amplitudy przejściowej Ca2+ może być wykorzystana do zbadania wpływu różnych substancji na wnikanie wapnia, który uczestniczy w uwalnianiu neuroprzekaźników33.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie zostało przeprowadzone w ramach Programu Konkurencyjnego Rozwoju Rządu Rosyjskiego Uniwersytetu Federalnego w Kazaniu oraz grantu od Rosyjskiej Fundacji Badań Podstawowych (16-04-01051; 16-34-00817; 15-04-02983). Dziękujemy czterem anonimowym recenzentom za pomocne komentarze do wcześniejszych wersji manuskryptu. Wyrażamy naszą wdzięczność Yuliyi Aratskaya za nagranie głosu. Jesteśmy wdzięczni dr Wiktorowi Iljinowi za wiele pomocnych komentarzy i pomoc w ostatecznej redakcji manuskryptu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Wskaźnik Ca2 +Sondy molekularne, USAOregon Green 488 Sól sześciopotasowa BAPTA-1, O6806500 μ g
Elastomer silikonowyDow Corning, USASylgard 184 elastomer
PipetaBiohit, Rosja7202100,5-10 i mikro; L
Końcówka do pipetFisher Scientific, USA02-707-17510µ L
Końcówka do pipetBiohit, Rosja78134910µ L
ŻyletkaFisher Scientific, USA12-640
Minutien PinsDrobne narzędzia do cięcia, Kanada26002-20
Mini-nożyczki rogówkoweMT MEDI CORP, KanadaS-1111
Kleszcze jubilerskieMT MEDI CORP, KanadaF-9610
Kleszcze jubilerskieMT MEDI CORP, KanadaF-9611
Modelowanie glinalokalny producentmoże zostać zastąpiony przez dowolnego lokalnego producenta
Wazelinalokalny producentmoże zostać zastąpiony przez dowolnego lokalnego producenta
Microspin FV 2400 Biosan, LatvaBS-010201-AAA
Multi-spin MSC 3000Biosan, LatvaBS-010205-AAN
Jednorazowe igły podskórneBbraun100 Sterican0,4 razy; 40mm
Syryngelokalny producent0,5 ml
HEPES Sigma-Aldrich, USAH0887Mikroskop 100 ml
, BX51Olympus, Japonia
System akwizycji danych Molecular Devices, USAOprogramowanie Digitdata 1550
Molecular Devices, USAOprogramowanie pClamp, protokół w wersji 10można pobrać ze strony: http://kpfu.ru/portal/docs/F_230007060/Video.capture.with.
RedShirt.Neuro.CCD.camera.pro
Wanna i regulator temperatury kąpieliEksperymentalny konstruktormoże być zastąpiony przez dowolną komorę z regulacją temperatury. Na przykład z https://www.warneronline.com/ 
MonochromatorTill Photonics, NiemcyPolychrome Vnie jest już dostępny, można go zastąpić innym    stabilne źródło światła Oprogramowanie
sterujące monochromatoremTill Photonics, NiemcyPolycon
Cyfrowa kamera CCDObrazowanie Redshirt, USANeuro CCD SMQ
Model 2100 Izolowany stymulator impulsówAM Systems, USA
Oprogramowanie akwizycyjne do kamery CCDRedshirt, USAOprogramowanie
ImageJNational Institutes of Health, USAhttp://rsb.info.nih.gov/ij/download.html
Program arkuszy kalkulacyjnychMicrosoft, USAMicrosoft Office Excel 
488 nm Turbo SM

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Llinás, R., Sugimori, M., Silver, R. B. Microdomains of high calcium concentration in a presynaptic terminal. Science. 256, 677-679 (1992).
  2. Augustine, G. J. How does calcium trigger neurotransmitter release? Curr Opin Neurobiol. 11, 320-326 (2001).
  3. Burnashev, N., Rozov, A. Presynaptic Ca2+ dynamics, Ca2+ buffers and synaptic efficacy. Cell Calcium. 37, 489-495 (2005).
  4. Schneggenburger, R., Neher, E. Presynaptic calcium and control of vesicle fusion. Curr Opin Neurobiol. 15, 266-274 (2005).
  5. Pang, Z. P., Südhof, T. C. Cell biology of Ca2+-triggered exocytosis. Curr Opin Cell Biol. 22, 496-505 (2010).
  6. Borst, J. G., Sakmann, B. Calcium influx and transmitter release in a fast CNS synapse. Nature. 383, 431-434 (1996).
  7. Borst, J. G., Sakmann, B. Calcium current during a single action potential in a large presynaptic terminal of the rat brainstem. J Physiol. 506, 143-157 (1998).
  8. Yazejian, B., DiGregorio, D. A., Vergara, J. L., Poage, R. E., Meriney, S. D., Grinnell, A. D. Direct measurements of presynaptic calcium and calcium-activated potassium currents regulating neurotransmitter release at cultured Xenopus nerve-muscle synapses. J Neurosci. 17, 2990-3001 (1997).
  9. Molgó, J., Mallart, A. Effects of Anemonia sulcatatoxin II on presynaptic currents and evoked transmitter release at neuromuscular junctions of the mouse. Pflugers Arch. 405 (4), 349-353 (1985).
  10. Slutsky, I., Rashkovan, G., Parnas, H., Parnas, I. Ca2+-independent feedback inhibition of acetylcholine release in frog neuromuscular junction. J Neurosci. 22 (9), 3426-3433 (2002).
  11. Haugland, R. P. Indicators for Ca2+, Mg2+, Zn2+ and other metal ions. Handbook of fluorescent probes and research products. Gregory, J. , MolecularProbes. Eugene,Oregon. 771-826 (2002).
  12. Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J Biol Chem. 260 (6), 3440-3450 (1985).
  13. Tsien, R. Y. Fluorescent indicators of ion concentrations. Methods Cell Biol. 30, 127-156 (1989).
  14. Adams, S. R. How calcium indicators work. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (3), (2010).
  15. DiGregorio, D. A., Vergara, J. L. Localized detection of action potential-induced presynaptic calcium transients at a Xenopus neuromuscular junction. J Physiol. 505, 585-592 (1997).
  16. Sabatini, B. L., Regehr, W. G. Optical measurement of presynaptic calcium currents. Biophys J. 74, 1549-1563 (1998).
  17. Suzuki, S. Ca2+ dynamics at the frog motor nerve terminal. Pflug Arch Eur J Phisiol. 440, 351-365 (2000).
  18. Sabatini, B. L., Oertner, T. G., Svoboda, K. The life cycle of Ca2+ ions in dendritic spines. Neuron. 33, 439-452 (2002).
  19. Luo, F., Dittrich, M., Stiles, J. R., Meriney, S. D. Single-pixel optical fluctuation analysis of calcium channel function in active zones of motor nerve terminals. J Neurosci. 31, 11268-11281 (2011).
  20. Regehr, W. G. Monitoring presynaptic calcium dynamics with membrane-permeant indicators. Imaging in neuroscience and development: a laboratory manual. Yuste, R., Konnerth, A. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. 307-314 (2005).
  21. Macleod, G. T. Topical Application of Indicators for Calcium Imaging at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction. Cold Spring Harb Protoc. 2012 (7), 786-790 (2012).
  22. Eilers, J., Konnerth, A. Dye loading with Patch Pipettes. Cold Spring Harb Protoc. 2009 (4), 277-281 (2009).
  23. Coleman, W. L., Bill, C. A., Simsek-Duran, F., Lonart, G., Samigullin, D., Bykhovskaia, M. Synapsin II and calcium regulate vesicle docking and the cross-talk between vesicle pools at the mouse motor terminals. J Physiol. 586 (19), 4649-4673 (2008).
  24. Macleod, G. T. Direct Injection of Indicators for Calcium Imaging at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction. Cold Spring Harb Protoc. 2012 (7), 797-801 (2012).
  25. Talbot, J. D., David, G., Barrett, E. F., Barrett, J. N. Calcium dependence of damage to mouse motor nerve terminals following oxygen/glucose deprivation. Exp Neurol. 234 (1), 95-104 (2012).
  26. Peng, Y. Y., Zucker, R. S. Release of LHRH is linearly related to the time integral of presynaptic Ca2+ elevation above a threshold level in bullfrog sympathetic ganglia. Neuron. 10, 465-473 (1993).
  27. Tsang, C. W., Elrick, D. B., Charlton, M. P. alpha-Latrotoxin releases calcium in frog motor nerve terminals. J Neurosci. 20 (23), 8685-8692 (2000).
  28. Newman, Z., Malik, P., Wu, T. Y., Ochoa, C., Watsa, N., Lindgren, C. Endocannabinoids mediate muscarine-induced synaptic depression at the vertebrate neuromuscular junction. Eur J Neurosci. 25 (6), 1619-1630 (2007).
  29. Macleod, G. T. Forward-filling of dextran-conjugated indicators for calcium imaging at the drosophila larval neuromuscular junction. Cold Spring Harb Protoc. 2012 (7), 3440-3450 (2012).
  30. Wu, L. G., Betz, W. J. Nerve activity but not intracellular calcium determines the time course of endocytosis at the frog neuromuscular junction. Neuron. 17 (4), 769-779 (1996).
  31. Blioch, Z. L., Glagoleva, I. M., Liberman, E. A., Nenashev, V. A. A study of the mechanism of quantal transmitter release at a chemical synapse. J Physiol. (1), 11-35 (1968).
  32. Kazakov, A., Aleksandrov, M., Zhilyakov, N. V., Khaziev, E. F., Samigullin, D. V. A simple suction electrode for electrical stimulation of biological objects. Mezhdunarodnyj nauchno-issledovatel'skij zhurnal. 40 (9), In Russian 13-16 (2015).
  33. Khaziev, E. Acetylcholine-induced inhibition of presynaptic calcium signals and transmitter release in the frog neuromuscular junction. Front Physiol. 7 (621), 1-10 (2016).
  34. Bélair, E. L., Vallée, J., Robitaille, R. Long-term in vivo modulation of synaptic efficacy at the neuromuscular junction of Rana pipiens frogs. J Physiol. 569 (1), 163-178 (2005).
  35. Samigullin, D., Fatikhov, N., Khaziev, E., Skorinkin, A., Nikolsky, E., Bukharaeva, E. Estimation of presynaptic calcium currents and endogenous calcium buffers at the frog neuromuscular junction with two different calcium fluorescent dyes. Front Synaptic Neurosci. 6 (29), 1-10 (2015).
  36. Angleson, J. K., Betz, W. J. Intraterminal Ca2+ and spontaneous transmitter release at the frog neuromuscular junction. J Neurophysiol. 85 (1), 287-294 (2001).
  37. Shahrezaei, V., Cao, A., Delaney, K. R. Ca2+ from one or two channels controls fusion of a single vesicle at the frog neuromuscular junction. J Neurosci. 26 (51), 13240-132499 (2006).
  38. Troncone, L. R., et al. Promiscuous and reversible blocker of presynaptic calcium channels in frog and crayfish neuromuscular junctions from Phoneutria nigriventer spider venom. J Neurophysiol. 90 (5), 3529-3537 (2003).
  39. Samigullin, D. V., Khaziev, E. F., Zhilyakov, N. V., Sudakov, I. A., Bukharaeva, E. A., Nikolsky, E. E. Calcium transient registration in response to single stimulation and during train of pulses in mouse neuromuscular junction. BioNanoSci. 7 (1), 162-166 (2016).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Obci anie barwnikiem wapniowymrejestracja optycznaszybka kamera CCDroztw r do obci ania barwnikiemsekcja kikuta nerwuobrazowanie fluorescencyjneanaliza danych

Powiązane artykuły