Artykuł metodologiczny

Rozwikłanie funkcji efektora bakteryjnego od nienadającego się do uprawy patogenu roślinnego za pomocą drożdżowego sita dwuhybrydowego

11.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55150

⸱

20 stycznia 2017

 , 
1Department of Molecular Biology - Functional Genomics, Laimburg Research Centre

W tym artykule

Podsumowanie

Bakteryjne białka efektorowe są ważne dla skutecznego leczenia infekcji. Protokół ten opisuje eksperymentalną identyfikację białkowych partnerów wiążących bakteryjne białko efektorowe w jego naturalnym żywicielu roślinnym. Identyfikacja tych oddziaływań efektorowych za pomocą dwuhybrydowych badań przesiewowych drożdży stała się ważnym narzędziem w odkrywaniu strategii patogenności molekularnej.

Streszczenie

Odkrywanie molekularnych mechanizmów objawów choroby jest ważne dla zrozumienia patologii i rozwoju objawów w nauce o roślinach. Bakterie wyewoluowały różne strategie manipulowania metabolizmem gospodarza dla własnej korzyści. Ta manipulacja bakteryjna często łączy się z poważnymi objawami lub śmiercią dotkniętych roślin. Określenie konkretnych cząsteczek bakteryjnych odpowiedzialnych za manipulację gospodarzem stało się ważną dziedziną badań mikrobiologicznych. Po zidentyfikowaniu tych cząsteczek bakteryjnych, zwanych "efektorami", ważne jest wyjaśnienie ich funkcji. Prostym podejściem do określenia funkcji efektora jest zidentyfikowanie jego białkowego partnera wiążącego w naturalnym gospodarzu za pomocą badania przesiewowego drożdży dwuhybrydowych (Y2H). Zwykle gospodarz zawiera wielu potencjalnych partnerów wiążących, których nie można wystarczająco przewidzieć za pomocą żadnego algorytmu in silico. Jest to zatem najlepszy wybór do przeprowadzenia badania przesiewowego z hipotetycznym efektorem na całej bibliotece eksprymowanych białek gospodarza. Jest to szczególnie trudne, jeśli czynnik sprawczy jest nieuprawie jak fitoplazma. Protokół ten zawiera instrukcje krok po kroku dotyczące oczyszczania DNA z zakażonej fitoplazmą drzewiastej rośliny żywicielskiej, amplifikacji potencjalnego efektora, a następnie identyfikacji partnera interakcji molekularnej rośliny za pomocą badania przesiewowego Y2H. Mimo że ekrany Y2H są powszechnie stosowane, istnieje tendencja do zlecania tej techniki firmom biotechnologicznym, które oferują usługę Y2H za opłatą. Protokół ten zawiera instrukcje, jak wykonać Y2H w każdym przyzwoicie wyposażonym laboratorium biologii molekularnej przy użyciu standardowych technik laboratoryjnych.

Wprowadzenie

Drożdżowe dwuhybrydowe sita (Y2H) zostały opracowane około 27 lat temu1 i od tego czasu są szeroko stosowane w różnych dziedzinach do określania specyficznych interakcji białko-białko2,3,4,5,6,7,8,9,10,11. Fizyczna interakcja efektora bakteryjnego z białkiem docelowym gospodarza jest często warunkiem wstępnym funkcjonalnej manipulacji tym białkiem docelowym. Analiza tych interakcji przeniosła się na obszar zainteresowania wielu różnych sektorów biologii infekcji12,13,14,15,16,17,18. Zasada działania badania przesiewowego Y2H polega na tym, że interakcja dwóch białek prowadzi do odtworzenia funkcjonalnego czynnika transkrypcyjnego, który napędza ekspresję genów reporterowych. Znany efektor ("przynęta") jest translacyjnie połączony z domeną wiążącą DNA (DBD) czynnika transkrypcyjnego, a potencjalni partnerzy interakcji ("ofiara") są połączeni z domeną aktywacji (AD) odpowiedniego czynnika transkrypcyjnego. Ponieważ partner oddziałujący jest nieznany, biblioteka potencjalnych interaktorów jest klonowana do tak zwanej "biblioteki ofiar". Zwykle biblioteka ta jest tworzona przez klonowanie cDNA do odpowiedniego plazmidu ekspresji wektora ofiary kodującego AD, który jest kompatybilny z DBD zakodowanym jako wektor przynęty. W przypadku interakcji, odtworzone czynniki transkrypcyjne indukują ekspresję genów reporterowych, które na ogół umożliwiają selekcję wzrostu drożdży. Identyfikacja interaktorów odbywa się poprzez sekwencjonowanie plazmidu ofiary za pomocą starterów specyficznych dla plazmidu.

Bakterie rozwinęły różne strategie manipulowania i wykorzystywania metabolizmu swojego gospodarza lub unikania mechanizmów obronnych i wydzielania cząsteczek efektorowych za pośrednictwem różnych systemów wydzielania bakteryjnego19,20,21. Określenie partnerów wiążących te efektory bakteryjne jest zatem pierwszym krokiem w identyfikacji manipulowanego szlaku w gospodarzu. Prowadzi to do lepszego zrozumienia konkretnych mechanizmów patogenności.

Y2H są wykonywane w celu identyfikacji interakcji efektorowych bakterii podczas fitoplazmoz, a często, Y2H jest kluczowym początkowym eksperymentem dla dalszej charakterystyki mechanizmów molekularnej patogeniczności w badaniach fitoplazmy22,23. Jednak opis metody w większości publikacji jest raczej skąpy, a techniki te są często zlecane firmom biotechnologicznym. Aby zwrócić uwagę na wykonalność tej metody, protokół ten zawiera informacje krok po kroku w celu identyfikacji partnerów interakcji cząsteczki efektora bakteryjnego w jego naturalnym gospodarzu.

Pomimo szerokiego zastosowania i szybkiego podejścia do ekranów Y2H, nie można zapominać, że pewne interakcje mogą nie wystąpić w systemie drożdżowym. Wynika to z faktu, że komórka drożdży jest używana jako rodzaj "naczynia reakcyjnego in vivo" z pewnymi ograniczeniami biologicznymi. Kilku autorów omówiło zalety i wady Y2H i jego pochodnych11,24,25,26,27. Ogólne rozważania są takie, na przykład, że komórka drożdży może nie zapewniać odpowiedniej ekspresji genów, warunków (po)translacyjnych lub translokacyjnych dla odpowiednich badanych białek. Może to prowadzić do wyników fałszywie ujemnych na ekranie. Pozytywne interakcje mogą być z kolei artefaktami i mogą nie wystąpić w sytuacji naturalnej (np. w przypadku efektorów w odpowiednim gospodarzu). W związku z tym niezbędne jest potwierdzenie oddziaływań z heterologicznego systemu ekspresji drożdży za pomocą niezależnego testu interakcji w bliżej spokrewnionym systemie biologicznym.

W tym badaniu zidentyfikowano partnerów wiążących ATP_00189 efektorowe z nienadającego się do uprawy patogenu roślinnego Candidatus Phytoplasma mali (P. mali). Wyniki dostarczają ważnych informacji na temat mechanizmów molekularnych leżących u podstaw rozwoju objawów proliferacji jabłek28, choroby, która powoduje wysokie straty ekonomiczne w dotkniętych nią regionach uprawy jabłek w Europie29.

Protokół

1. Pobieranie próbek korzeni i liści z zakażonych jabłoni

Uwaga: DNA specyficzne dla patogenu może być oczyszczone z korzeni lub liści. Poniższa sekcja zawiera protokół pobierania próbek z obu.

  1. Do przygotowania DNA
    1. Pobieranie i przygotowanie próbek od korzeni
      1. Zidentyfikuj zainfekowane drzewa z objawami specyficznymi dla "proliferacji jabłek"30,31 i kontroluj drzewa, które są wolne od objawów. Za pomocą czystych sekatorów pokrój próbki korzeni o średnicy 0,5 - 1 cm i długości około 5 cm. Wytnij próbki z trzech różnych, odległych od siebie miejsc systemu korzeniowego i umieść je w odpowiednio oznakowanych plastikowych torebkach.
        1. Próbki należy przechowywać w chłodni ze schłodzonymi opakowaniami termicznymi i przechowywać w lodówce w temperaturze 4 °C do czasu dalszego przetwarzania.
          Uwaga: Architektura i struktura korzeni mogą się różnić w zależności od stanu fizjologicznego drzewa. Ważne jest, aby pobierać próbki w trzech różnych miejscach i nie pobierać zbyt cienkich korzonków. Próbki mogą być przechowywane przez kilka dni w temperaturze 4 °C, ale dłuższy czas przechowywania zwiększa ryzyko pleśnienia. Spleśniałe próbki nie mogą być używane do przygotowania DNA.
      2. Opłucz próbki korzeni wodą, aby usunąć glebę. Umieść je na sterylnej szalce Petriego i użyj wysterylizowanego skalpela, aby usunąć naskórek korzeniowy i korę.
        1. Wyczyść skalpel czystą, niestrzępiącą się chusteczką chusteczkową, zanurz go w 70% (v/v) roztworze etanolu i wysterylizuj termicznie nad otwartym ogniem (np. palnikiem Bunsena). Posiekać łyko skalpelem, posiekać je na małe kawałki i wsypać 30 - 100 mg posiekanego łyka do sterylnej probówki reakcyjnej o pojemności 2,0 ml. Próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C przez kilka miesięcy.
    2. Pobieranie i przygotowanie próbek z liści
      1. Zidentyfikuj zakażone i bezobjawowe drzewo kontrolne, zgodnie z opisem w kroku 1.1.1.1, i zbierz dziesięć nieuszkodzonych liści z każdego drzewa. Wystarczy jedno drzewo na warunek.
      2. Spłucz liście wodą i oczyść powierzchnie, spryskując 70% (v/v) roztworem etanolu. Umieść liście na sterylnej szalce Petriego i wytnij nerw środkowy (żyłę centralną) każdego liścia sterylnym skalpelem. Usuń naskórek i korę z nerwu środkowego, pokrój nerw środkowy na małe kawałki i podacz 100 mg tkanki nerwu środkowego do sterylnej probówki reakcyjnej o pojemności 2,0 ml. Próbki należy natychmiast wykorzystać do przygotowania DNA lub przechowywać w temperaturze -80 °C przez kilka miesięcy.
        Uwaga: Wygodne jest porcjowanie materiału roślinnego w porcjach po 100 mg i ostatecznie zamrożenie go do przechowywania. Każda podwielokrotność może być bezpośrednio wykorzystana do przygotowania DNA. Ważenie głęboko zamrożonego materiału roślinnego jest kłopotliwe, ponieważ zamrożony materiał roślinny ma tendencję do tworzenia kawałków.

2. Preparat DNA na bazie bromku cetyltrimetyloamoniowego (CTAB)

Uwaga: DNA można oczyścić za pomocą dowolnej metody oczyszczania DNA z materiału roślinnego opartej na kolumnie. W tej sekcji opisano metodę oczyszczania DNA opartą na CTAB. Oczyszczanie DNA odbywa się w oparciu o zmodyfikowany protokół opisany w innym miejscu32.

  1. Przygotuj następujące:
    1. Bufor CTAB: Rozpuścić 1% w/v bromku cetylotrimetyloamoniowego (CTAB, Mr: 364,45 g/mol), 100 mM trishydroksymetyloaminometanu (Tris, Mr: 121,14 g/ml), 1,4 M chlorku sodu (NaCl, Mr: 58,44 g/mol) i 20 mM soli disodowej kwasu etylenodiaminotetraoctowego (NaEDTA, Mr: 372,24 g/mol) w wodzie i dostosować do pH 8,0.
    2. Bufor N-lauroilsarkozyny: Rozpuść 10% w/v soli sodowej N-lauroilosarkozyny33 (Mr: 293,38 g/mol), 100 mM Tris i 20 mM NaEDTA w wodzie i dostosuj pH do 8,0.
    3. Bufor Tris-EDTA (TE): Rozpuść 10 mM Tris i 1 mM NaEDTA w wodzie i autoklaw roztworu.
    4. Roztwór octanu amonu: Przygotować 5 M roztwór octanu amonu (Mr: 77,0825 g/mol) w wodzie i sterylizować w autoklawie w temperaturze 120 °C i ciśnieniu 1,2 bara przez 20 minut.
  2. Zmieszać 30 - 100 mg świeżego lub mrożonego posiekanego materiału roślinnego (krok 1.1.2.2.) z 300 μl buforu CTAB, 30 μl buforu N-lauroilosarkozyny, 6 μl proteinazy K (10 μg/μl) i 12 μl 2-merkaptoetanolu34 (Mr: 78,13 g/mol). Wytrząsać przez 60 minut w temperaturze 60 °C. Przed kontynuowaniem pozwól mieszance ostygnąć do temperatury pokojowej.
  3. Dodać 360 μl roztworu octanu amonu i energicznie wymieszać. Pozostaw roztwór na 5 minut, a następnie odwiruj go przy 15 000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Przenieść supernatant do czystej fiolki i dodać 720 μl lodowatego izopropanolu35. Wytrącać DNA przez co najmniej 30 minut w temperaturze -20 °C.
  4. Odwirować mieszaninę przy 15 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant. Umyj granulat 500 μl lodowatego 70% etanolu i odwiruj go w temperaturze 15 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  5. Wyrzucić szwalisty sklarant etanolowy i natychmiast zanurzyć fiolkę na czystym ręczniku papierowym, aby usunąć resztki kropel. Upewnij się, że usunąłeś jak najwięcej płynu. Suszyć granulat na powietrzu przez 15-20 minut lub przez 2-3 minuty w wirówce próżniowej. Nie należy nadmiernie suszyć pelletu przez nadmierne nagrzewanie lub wydłużony czas parowania.
  6. Zawiesić osad w 700 μl buforu TE i ostatecznie ogrzać go do 37 °C, aby ułatwić rozpuszczenie. Dodać 10 μl RNAzy (10 μg/μl) i inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C, wytrząsając z prędkością 300 obr./min.
  7. Dodaj 700 μl chloroformu:alkoholu izoamylowego36 24:1 i dobrze wymieszaj. Odwirować mieszaninę o stężeniu 20 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i przenieść górną fazę supernatantu do nowej, czystej fiolki.
  8. Wytrącić DNA w supernatancie przez dodanie 700 μl 2-propanolu35 (izopropanol, Mr: 60,1 g/mol) i inkubować przez co najmniej 30 minut w temperaturze -20 °C. Odwirować mieszaninę w temperaturze 12 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.
  9. Przemyć granulat 500 μl 70% etanolu i odwirować przy 12 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Wysuszyć granulkę zgodnie z opisem w kroku 2.5. Rozpuścić go w 50 μl TE.

3. Wykrywanie DNA specyficznego dla Candidatus Phytoplasma mali metodą PCR

  1. Rozcieńczyć DNA oczyszczone z materiału roślinnego w stosunku 1:10 w wodzie wolnej od nukleaz i przeprowadzić PCR ze starterami specyficznymi dla patogenów37.
    1. Zweryfikuj obecność DNA specyficznego dla P. mali w materiale roślinnym, stosując ilościowy protokół PCR ze starterami i specyficznymi sondami dla fitoplazmy P. mali37. Sprawdź brak pozostałych członków fitoplazmy 16SrX, wykonując ten sam PCR z odpowiednimi sondami dla Cand. Prunorum i dla Cand. P. pyri DNA37.
      UWAGA: DNA z niezakażonego drzewa powinno być również badane, aby potwierdzić brak patogenu w tej kontroli. Na tym etapie ważne jest, aby w próbce nie było DNA z innych blisko spokrewnionych gatunków fitoplazmy, ponieważ zwiększyłoby to ryzyko amplifikacji efektora z gatunku fitoplazmy innego niż P. mali. Zakażenie mieszane inną blisko spokrewnioną fitoplazmą z grupy P. mali 16SrX wyklucza się poprzez analizę próbki za pomocą odpowiednich sond. Ponieważ oczekiwane wyniki powinny być ujemne dla innych fitoplazm 16SrX, ważne jest, aby uwzględnić odpowiednie kontrole pozytywne, które wskazują na skuteczność PCR.

4. Wzmacnianie potencjalnego genu efektorowego i subklonowanie do wektora przynęty Y2H

  1. Amplifikować fitoplazmatyczny atp_00189 genu (niezawierający części peptydu sygnałowego) P. mali za pomocą starterów 5ˈ-TCTCCTCCTAAAAAAAGATTCTA-3ˈ (do przodu) i 5ˈ-TATTATTTATTTTTTTTTTTTTTT-3ˈ (odwrotnie), z miejscami restrykcji dla EcoRI i SalI odpowiednio na końcach 5' i 3'. Oczyść produkt PCR za pomocą metody oczyszczania DNA opartej na kolumnie.
  2. Sklonuj amplikon do wektora przynęty Y2H pLexA-N za pomocą ligacji EcoRI i SalI.
    UWAGA: Tutaj 100 ng zlinearyzowanego wektora pLexA-N EcoRI i SalI połączono z 15 ng podobnie strawionego amplikonu atp_00189 PCR i ligazą 1 U T4. Ligację przeprowadzono w buforze zawierającym 40 mM Tris-HCl (pH 7,9 w 25 °C), 10 mM MgCl2, 10 mM ditiotreitolu (DTT, Mr: 154,25 g/mol) i 0,5 mM trifosforanu adenozyny (ATP, Mr: 507,18 g/mol) w łącznej objętości 10,0 μL w temperaturze 16 °C przez noc (14-20 h). Przeanalizuj DNA z niezainfekowanego drzewa za pomocą tych samych starterów, aby wykluczyć niespecyficzne wiązanie startera z DNA Malus x domestica.
  3. Przekształć 1 μl mieszaniny ligacyjnej w elektrokompetentne komórki E. coli i wybierz klony odporne na kanamycynę na płytkach Luria-Bertani (LB) uzupełnionych 50 μg/ml siarczanu kanamycyny38.
  4. Oczyść plazmidowe DNA z wybranych klonów bakteryjnych za pomocą minizestawu do przygotowania plazmidu opartego na kolumnie, postępując zgodnie z instrukcjami producenta, i sprawdź pomyślną integrację i orientację insertu poprzez sekwencjonowanie39.

5. Test na samoaktywację (autoaktywację) potencjalnego białka efektorowego

  1. Przygotuj następujące i pożywki wzrostowe:
    UWAGA: W nomenklaturze dla płytek selektywnych pod względem drożdży skróty brakujących aminokwasów w odpowiedniej pożywce są dzielone przez "-" przed skrótem. Na przykład płytki SD-trp-leu-his zawierają wszystkie aminokwasy oprócz trp, leu i his.
    1. 10x mieszanka do rezygnacji: Zważ 200 mg monochlorowodorku L-argininy (Mr: 210,66 g/mol), 300 mg L-izoleucyny (Mr: 131,17 g/mol), 269 mg L-lizyny monohydrat (Mr: 164,21 g/mol), 200 mg L-metioniny (Mr: 149,21 g/mol), 500 mg L-fenyloalaniny (Mr: 165,19 g/mol), 2 g L-treoniny (Mr: 119,12 g/mol), 300 mg L-tyrozyny (Mr: 181,19 g/mol), 200 mg L-uracylu (112,09 g/mol) i 1,5 g L-waliny (Mr: 117,15 g/mol). Rozpuść je w 1 l podwójnie destylowanej wody i autoklaw roztworu. Roztwór należy przechowywać w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Odpowiednią mieszankę dropout można również kupić w wersji premiksowej.
    2. 10x suplement L-adeniny: Zważ 100 mg soli półsiarczanu L-adeniny (ade, Mr: 184,17 g/mol) i rozpuść ją w 50 ml podwójnie destylowanej wody. Filtr wysterylizuj roztwór za pomocą filtra porowego 0,22 μm.
    3. 10x suplement L-histydyny: Zważyć 100 mg monochlorowodorku L-histydyny monohydratu (hisz, Mr: 209,63 g/mol) w 50 ml podwójnie destylowanej wody i przefiltrować, wysterylizować za pomocą filtra porów 0,22 μm.
    4. 10x suplement L-leucyny: Zważ 500 mg L-leucyny (leu, Mr: 113,17 g/mol) w 50 ml podwójnie destylowanej wody i przefiltruj ją za pomocą filtra porów 0,22 μm.
    5. 10x suplement L-tryptofanu: Zważ 100 mg L-tryptofanu (trp, Mr: 204,23 g/mol) w 50 ml podwójnie destylowanej wody i przefiltruj, wysterylizuj za pomocą filtra porów 0,22 μm.
    6. SD-trp-leu-his-ade-medium i płytki: Rozpuścić 0,67% w/v drożdżowej zasady azotowej (bez aminokwasów) i 2% w/v D-glukozy jednowodnej (Mr: 198,17 g/mol) w podwójnie destylowanej wodzie i autoklawie. W przypadku płytek agarowych dodać 2% w/v agaru (klasa mikrobiologiczna) przed autoklawowaniem.
    7. Aby przygotować selektywne płytki, dodaj 1x roztworu podstawowego aminokwasu do autoklawowanego podłoża Sd-trp-leu-his-ade. Przygotowując płytki, upewnij się, że agar jest schłodzony do ~ 50 °C przed dodaniem aminokwasów. Roztwory podstawowe należy utrzymywać w sterylnej formie.
    8. Pożywka YPAD: Rozpuść 1% w/v ekstraktu drożdżowego, 2% w/v peptonu (klasa mikrobiologiczna), 0,004% w/v soli hemissiarczanu adeniny (Mr: 184.17 g/mol) i 2% w/v monohydratu glukozy w podwójnie destylowanej wodzie i autoklawie. W przypadku płytek agarowych YPAD dodaj 2% w/v agaru przed autoklawowaniem. Do przygotowania 2x YPAD użyj dwukrotnych stężeń składników wymienionych powyżej.
      Uwaga: (Opcjonalnie) Ze względu na wysokie stężenie glukozy w pożywce, 2x pożywka YPAD staje się ciemnobrązowawa po autoklawowaniu. Alternatywnie można przygotować i wysterylizować roztwór podstawowy glukozy o stężeniu 40% (m/v), przepuszczając go przez filtr 0,22 μm. Wysterylizowany przez filtr roztwór podstawowy glukozy jest następnie dodawany do autoklawowanego 2x YPAD (bez glukozy) w sterylnych warunkach. Aby uniknąć błędów objętościowych, należy przygotować 2x YPAD, pamiętając, że następnie dodaje się 10x roztwór glukozy. Oznacza to, że np. zamiast 1 l pożywki przygotowuje się tylko 900 ml (zawierającego wszystkie składniki z wyjątkiem glukozy) i sterylizuje w autoklawie, a następnie dodaje się 100 ml podstawowego roztworu glukozy.
  2. Przemiana drożdży za pośrednictwem octanu litu do testowania samoaktywacji
    1. Szczep reporterski Saccharomyces cerevisiae NMY5140 (NMY51:MATahis3Δ200 trp1-901 leu2-3,112 ade2 LYS2::(lexAop)4-HIS3 ura3::(lexAop)8-lacZ ade2::(lexAop)8-ADE2 GAL4) z zamrożonego bulionu glicerolowego na płytce agarowej YPAD i inkubować go przez 48 godzin w temperaturze 30 °C. Pobrać kolonie z tej płytki i zaszczepić 50 ml pożywki YPAD. Pozwól drożdżom rosnąć i regularnie mierz OD600, aby monitorować wzrost.
    2. Pozwól drożdżom urosnąć do końcowego OD600 0,5-0,8. Osadzaj komórki, odwirowując je przy 700 x g przez 5 minut i ponownie zawieś w 2,5 ml podwójnie destylowanej, autoklawowanej wody.
    3. Przygotować sześć podwielokrotności ze 100 μl zawiesiny drożdży i dodać 240 μl 50% w/v glikolu polietylenowego 4000 (PEG, Mr: 3,500-4,000 g/mol), 36 μl 1 M dihydratu octanu litu (LiOAc, Mr: 102,02 g/mol) i 25 μl 2% w/v DNA plemników łososia (rozpuszczonego). Przygotuj wszystkie odczynniki z podwójnie destylowaną, sterylną wodą.
    4. Oznaczyć sześć fiolek zawierających zawiesinę drożdży od "a" do "f" i dodać następujący wektor plazmidowy DNA: kontrole negatywne: (a) 1,5 μg plazmidu przynęty z efektorem (pLexA-N-atp0018928), (b) 1,5 μg pustego plazmidu ofiary pGAD-HA41, (c) 1,5 μg pustego wektora przynęty pLexA-N41oraz d) 1,5 μg pustego wektora przynęty pLexA-N i 1,5 μg pustego plazmidu ofiary pGAD-HA; kontrole pozytywne: e) 1,5 μg plazmidu przynęty z dodatnią kontrolą DNA pLexA-p5341 i 1,5 μg plazmidu pozytywnej ofiary pACT-largeT41; oraz test samoaktywacji: f) 1,5 μg plazmidu przynęty z efektorem (pLexA-N-atp00189) i 1,5 μg plazmidu pustej ofiary pGAD-HA.
    5. Energicznie wymieszać reakcje i inkubować je przez 45 minut w temperaturze 42 °C w łaźni wodnej. Osadzać komórki przez 5 minut w temperaturze 700 x g i odrzucić supernatant. Ponownie zawiesić komórki w 250 μl 0,9% (w/v) roztworu chlorku sodu (NaCl, Mr: 48,44 g/mol) i rozprowadzić 50 μl na następujących selektywnych płytkach: SD-trp, Sd-leu, SD-trp-leu, SD-trp-leu-his i SD-trp-leu-his-ade.
    6. Inkubować płytki przez 3-4 dni w temperaturze 30 °C. Po pierwszym dniu inkubacji uszczelnij płytki plastikową folią parafinową, aby zapobiec wysychaniu płytek.
    7. Sprawdź wzrost drożdży na talerzach.

6. Przetestuj ekspresję efektora

  1. Przetestuj ekspresję efektora za pomocą Western blot42 z przeciwciałem przeciwko znacznikowi Lex-A, który jest sprzężony na N-końcu efektora, gdy jest wyrażony z pLexA-N.
    Uwaga: Weź pod uwagę, że translacyjnie skondensowany znacznik Lex-A dodaje około 24 kDa do rzeczywistej wagi białka będącego przedmiotem zainteresowania. Jest to ważne przy określaniu wielkości białka w Western blot.

7. Ekran Y2H

  1. Umieść NMY51 przekształcony w pLexA-atp00189 (efektor) na świeżej płytce SD-trp i pozwól mu rosnąć przez 2 - 3 dni w temperaturze 30 °C, aż pojawią się czerwone kolonie.
  2. Zaszczepić 3 ml pożywki SD-trp w małej kolbie do wytrząsania z czerwoną kolonią z płytki agarowej i inkubować przez noc w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem przy 120-150 obr./min.
  3. Zaszczepić 20 ml SD-trp w kolbie do wytrząsania z 1 ml kultury na noc i pozostawić do wzrostu przez 8 godzin.
  4. Dostosować kulturę do OD600 = 0,2 przez dodanie pożywki SD-trp i zaszczepić 2x 100 ml w kolbach wstrząsających po 10 ml kultury starterowej każda. Rosnąć przez noc z wytrząsaniem w temperaturze 30 °C.
    Uwaga: Upewnij się, że drożdże nie osiągną OD600 > 0,5 i rozcieńczyć świeżym SD-trp.
  5. Zmierz OD600 i granulkę 120 OD600 "jednostek". Na przykład, jeśli mierzony jest OD600 1,2, odwiruj 100 ml, wyrzuć supernatant i ponownie zawieś osad w 800 ml wstępnie podgrzanego 2x YPAD w kolbie wytrząsającej z magnetycznym mieszadłem.
    1. Odwirować 2 ml porcji, usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w wodzie. Upewnij się, że OD600 zawiesiny drożdży wynosi od 0,15 do 0,2. Jeśli nie, dostosuj za pomocą 2x YPAD lub dodaj więcej drożdży z nocnej kultury.
      Uwaga: 2x YPAD jest ciemnobrązowy i może wpływać na wyniki pomiaru OD. Dlatego konieczne jest ponowne zawieszenie komórek drożdży w wodzie przed określeniem OD. Alternatywnie, 2x YPAD można przygotować poprzez osobną sterylizację glukozy, jak opisano w kroku 5.1.8 uwaga, co zapobiega ciemnemu zabarwieniu podłoża.
  6. Inkubować pozostałą kulturę drożdży w kolbie wytrząsającej o odpowiedniej wielkości (800 ml w kolbie o pojemności 2 l lub podzielić 2 x 400 ml na dwie kolby wytrząsające o pojemności 1 l) i inkubować w temperaturze 30 °C, 120-150 obr./min. Mierz OD600 mniej więcej co 1.5 godziny, aż do osiągnięcia OD600 0.6 (trwa 4 - 6 godzin). W międzyczasie przygotuj rozwiązania opisane w kolejnym kroku.
  7. Przemiana za pośrednictwem octanu litu
    1. Rozpuść 2% w/v DNA plemników łososia w wodzie i gotuj 500 μl przez 5 minut w łaźni wodnej w temperaturze 100 °C. Umieść probówkę na lodzie na 2 minuty i powtórz etap podgrzewania. Trzymaj DNA na lodzie do czasu dalszego użycia.
    2. Przygotuj następujące mieszanki:
      1. Mieszanina TE/LiOAC: Wymieszaj 3,08 ml 1 M LiOAC, 3,08 ml 100 mM Tris/10 mM EDTA (pH: 7,5) i 21,84 ml sterylnej podwójnie destylowanej wody.
      2. Mieszanina PEG/LiOAc: Połącz 4,2 ml 1 M LiOAc, 4,2 ml mM Tris/10 mM EDTA (pH: 7,5) i 33,6 ml 50% (w/v) PEG 4000.
    3. Odwirować 800-mililitrową kulturę drożdży (OD600 = 0,6) przy 700 x g przez 5 minut, aby osadzać komórki. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 200 ml sterylnej, podwójnie destylowanej wody. Ponownie zagnieździć komórki o masie 700 x g przez 5 minut i wyrzucić supernatant. Uwaga: W razie potrzeby podzielić zawiesinę na kilka fiolek w celu odwirowania. Objętości cieczy w ppkt 7.7.3. oraz 7.7.4. odnoszą się do całego osadu pochodzącego z 800 ml zawiesiny.
    4. Zawiesić osad w 16 ml mieszaniny TE/LiOAc (patrz krok 7.7.1.1); odwirowywać w temperaturze 700 x g przez 5 minut i wyrzucić supernatant. Zawiesić osad w 9,6 ml mieszanki TE/LiOAC.
    5. Przygotować następujące mieszaniny reakcyjne w odpowiednich rozmiarach polipropylenowych naczyń reakcyjnych: 12 fiolek z 7 μg wektora bibliotecznego pGAD-HA-cDNA, 100 μl 2% DNA plemników łososia (patrz krok 7.7) i 2,5 ml mieszanki PEG/LiOAc. Dodać 600 μl zawiesiny komórek drożdży z kroku 7.10 do każdej z 12 fiolek i energicznie mieszać przez 1 min.
    6. Inkubować mieszaninę reakcyjną przez 45 minut w temperaturze 30 °C w łaźni wodnej i mieszać energicznie co 15 minut. Dodać 160 μl DMSO do każdej fiolki i energicznie mieszać. Inkubować mieszaninę przez kolejne 20 minut w temperaturze 42 °C.
    7. Osadzać komórki w granulkach o gramaturze 700 x g przez 5 minut, wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić każdą osadkę w 3 ml 2x YPAD. Zebrać wszystkie komórki (w sumie 36 ml z 12 fiolek) w kolbie do wytrząsania o pojemności 100 ml i inkubować drożdże przez 90 minut w temperaturze 30 °C i 120 obr./min.
    8. Osadzać komórki przez 5 minut w temperaturze 700 x g i odrzucić supernatant. Zawiesić osad w 4,5 ml sterylnego 0,9% (w/v) NaCl i dobrze wymieszać, ostrożnie pipetując w górę i w dół za pomocą 10-mililitrowej pipety serologicznej. Pobrać 50 μl i przygotować dziesięciokrotne rozcieńczenia w 0,9% NaCl od 1:10 do 1:1,000. Umieścić 100 μl każdego rozcieńczenia na 90-milimetrowych płytkach Petriego zawierających agar SD-trp-leu.
    9. Resztę nierozcieńczonej zawiesiny drożdży rozprowadzić na szalkach Petriego o średnicy 16 x 150 mm z agarem SD-trp-leu-his-ade. Dodaj 3-AT do podłoża, aby zmniejszyć samoaktywację. Inkubować płytki SD-trp-leu przez trzy dni i płytki SD-trp-leu-his-ade przez cztery dni w temperaturze 30 °C.
      UWAGA: Klony, które pojawiają się na selektywnych płytkach, są (potencjalnymi) oddziałującymi parami i przenoszą kodowanie plazmidu pGAD-HA dla partnera oddziałującego z przynętą.
    10. Określić skuteczność transfekcji, zliczając kolonie różnych seryjnych rozcieńczeń na płytkach selekcyjnych SD-trp-leu. Przenieś każdy klon, zbierając i rozpylając kolonię sterylną końcówką pipety na świeżych płytkach SD-trp-leu-his-ade-selective plates. Inkubować płytki przez 24 godziny w temperaturze 30 °C. Powtarzać ten etap codziennie, aż do uzyskania całkowitej liczby pięciu pasaży.

8. Analiza klonów z płytek selektywnych

  1. Przygotować jedną sterylną probówkę reakcyjną o pojemności 2 ml z 1 ml SD-trp-leu-his-ade dla każdego klonu pod sterylnym kapturem. Wybij otwór w każdej tubie gorącą igłą i przykryj otwór kawałkiem gazoprzepuszczalnego uszczelniacza. Zaszczepić każdą fiolkę świeżym materiałem kolonijnym z jednego klonu (etap 7.17; użyć klonów po 5tym pasażu) i inkubować przez 24 godziny w temperaturze 30 °C, wstrząsając z prędkością 150 obr./min.
    UWAGA: Ważne jest, aby pobrać klony ze świeżej płytki, ponieważ drożdże pobrane z płytek przechowywanych przez kilka dni w temperaturze 4 °C nie rosną wystarczająco w ciągu 24 godzin w płynnym podłożu.
  2. Drożdże osadzać przez 5 minut w temperaturze 4 000 x g i wyrzucić supernatant. Zawiesić osad w odpowiednim buforze do respensji (z odpowiedniego zestawu do miniprzygotowania plazmidowego DNA) i przenieść go do świeżej probówki reakcyjnej o pojemności 2,0 ml. Dodać 100 μl przemytych kwasem kulek szklanych (o średnicy od 425 do 600 μm) i energicznie mieszać przez 5 minut.
  3. Dodaj odpowiedni bufor do lizy i przystąp do oczyszczania plazmidu za pomocą mini zestawu do przygotowania plazmidu, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Odeluj plazmidowe DNA za pomocą 50 μl wody.
  4. Użyj DNA z kroku 8.3 do reakcji sekwencjonowania ze starterem specyficznym dla plazmidu ofiary, GAL4ADseq41 5'- ACCACTACAATGGATGATG -3'.
  5. Zweryfikuj interakcję za pomocą de novo co-transforming43,44 przynęty i wektora ofiary. Transformowane drożdże należy wybrać na płytkach selekcyjnych SD-trp-leu-his-ade.

Wyniki

Przed przeprowadzeniem właściwego przesiewu Y2H należy sprawdzić, czy przynęta nie wykazuje samoaktywacji. Osiąga się to poprzez transformację wektora ekspresyjnego przynęty wraz z pustym wektorem biblioteki ofiar oraz sprawdzenie wzrostu na płytkach selekcyjnych.

Aby przeanalizować, czy białko fitoplazmalne ATP_00189 wykazuje samoaktywację, przeprowadzono test samoaktywacji zgodnie z opisem w sekcji 5. Plazmid przynęty (bait) komplementuje auksotrofię trp, a plazmid ofiary (prey) auksotrofię leu szczepu S. cerevisiae NMY5140. Pomyślna kotransformacja charakteryzuje się zatem wzrostem na pożywkach selekcyjnych pozbawionych trp i leu. Interakcja białka przynęty i białka ofiary prowadzi do komplementacji auksotrofii his i ade szczepu NMY51. Jeśli występuje samoaktywacja wywołana przez przynętę w przypadku braku interakcji, drożdże rosną na pożywkach selekcyjnych pozbawionych his i ade. Może wystąpić silna lub słaba samoaktywacja. Silna samoaktywacja przynęty charakteryzuje się wzrostem kotransformowanych drożdży na pożywkach selekcyjnych pozbawionych trp-leu-his-ade. Słaba samoaktywacja prowadzi do wzrostu na pożywkach pozbawionych trp-leu-his, ale nie na pożywkach pozbawionych trp-leu-his-ade. Odpowiednie kontrole pozytywne są niezbędne do interpretacji wyników testu samoaktywacji. Podsumowanie oczekiwanych wyników testu samoaktywacji oraz ich interpretacja przedstawione są w Tabeli 1 i zilustrowane na Rysunku 1.

figure-results-1
Rysunek 1: Przykład testów samoaktywacji przynęty przed przeprowadzeniem screeningu Y2H. S. cerevisiae NMY51 został współtransformowany oddziałującą przynętą (pLEX-p53) i ofiarą (pACT-largeT) jako kontrolą pozytywną (lewy panel: a-c), słabo samoaktywującą się przynętą oraz pustym wektorem biblioteki ofiar (środkowy panel: d-f) oraz przynętą nieaktywującą się samoistnie oraz pustym wektorem biblioteki ofiar (prawy panel: g-i). Współtransformowane drożdże hodowano na płytkach SD pozbawionych trp i leu (górny panel: a, d, g), trp, leu i his (środkowy panel: b, e, h) oraz trp, leu, his i ade (dolny panel: c, f, i). Selekcja na pożywce pozbawionej trp i leu stanowi kontrolę pozytywną udanej współtransformacji, ponieważ wektor przynęty kompensuje aukstrofię trp, a wektor ofiary aukstrofię leu szczepu NMY51 (wzrost na SD-trp-leu). W przypadku oddziaływania między przynętą a ofiarą lub samoaktywacji przynęty, ekspresja genów reporterowych w NMY51 zostaje uruchomiona i kompensuje aukstrofię his i ade (wzrost na SD-trp-leu-his-ade). Słaba samoaktywacja charakteryzuje się wzrostem na płytkach SD-trp-leu-his (środkowy panel, d-f). Słaba samoaktywacja przynęty musi zostać zredukowana przed analizą przynęty w screeningu Y2H, np. poprzez dodanie 3-AT do pożywek selekcyjnych. Brak aminokwasów oznaczono symbolem „-“ w nazwie odpowiedniej pożywki. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

pLexA-N-atp00189brakkoloniebrak wzrostubrak wzrostubrak wzrostubrak wzrostu
brakpGAD-HAbrak wzrostukoloniebrak wzrostubrak wzrostubrak wzrostu
pLexA-Nbrakkoloniebrak wzrostubrak wzrostubrak wzrostubrak wzrostu
pLexA-NpGAD-HAkoloniekoloniekoloniebrak wzrostubrak wzrostu
pLexA-p53pACT-largeTkoloniekoloniekoloniekoloniekolonie
pLexA-N-atp00189pGAD-HAkoloniekoloniekoloniebrak wzrostubrak wzrostu

Tabela 1: Oczekiwane wyniki w teście samoaktywacji przynęty. Transformacja S. cerevisiae NMY51 skutkuje różnicami w wzroście na pożywkach selekcyjnych, zależnie od charakterystyki współtransformowanych przynęty (bait) i ofiary (prey). Wzrost na płytkach selekcyjnych oceniano po transformacji różnych kombinacji wektorów (a-f) po 72 h inkubacji w 30 °C. Słaba samoaktywacja charakteryzuje się wzrostem drożdży na podłożu SD-trp-leu-his, a silna samoaktywacja wzrostem na płytkach selekcyjnych SD-trp-leu-his-ade w obecności partnera interakcji. Zakodowany w pLexA-N efektor fitoplazmy ATP_00189 nie wykazuje samoaktywacji, co objawia się brakiem możliwości wzrostu szczepu NMY51 transformowanego wektorem przynęty w warunkach braku his i ade.

W zależności od zastosowanej przynęty, przesiew Y2H może przynieść liczne klony drożdży rosnące na płytkach selekcyjnych. Wszystkie klony muszą zostać poddane analizie i sprawdzone pod kątem możliwych redundancji. Nawet w przypadku użycia znormalizowanej biblioteki cDNA, istnieje duże prawdopodobieństwo, że białko oddziałujące jest reprezentowane w wielu różnych klonach. W zależności od zastosowanej techniki klonowania biblioteki, możliwe jest również, że w niektórych wektorach ofiary wstawiono jedynie fragmenty pełnego genu. Dlatego zaleca się amplifikację de novo (z cDNA) i subklonowanie pełnej długości genu białka oddziałującego, a następnie sprawdzenie interakcji w analizie Y2H typu jeden-do-jednego (Rycina 2).

figure-results-2
Rysunek 2: Przykład oddziaływania między przynętą a ofiarą w eksperymencie Y2H. Przeprowadzono przesiewanie metodą dwuhybrydowego systemu drożdżowego (Y2H), a następnie oczyszczono plazmidy z klonów wykazujących pozytywne oddziaływanie. Sekwencjonowano wektor ofiary, co pozwoliło na zidentyfikowanie partnerów oddziaływania gospodarza Malus x domestica: MdTCP24 i MdTCP25. Jako kontrolę negatywną równolegle zsubklonowano MdTCP34 (dla którego nie zidentyfikowano żadnego partnera w przesiewaniu biblioteki Y2H). Pełne długości genów namnożono z cDNA jabłoni, zsubklonowano do wektora ofiary (wyrażającego ko-cistronicznie domenę aktywacji AD) i poddano ko-transformacji de novo z wektorem przynęty wyrażającym bakteryjny efektor ATP_00189 sprzężony z domeną wiążącą DNA (BD). Rysunek pochodzi z opracowania 28. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

W badaniu przesiewowym Y2H potencjalne białko efektorowe ulega koekspresji z różnymi hipotetycznymi białkami oddziałującymi (krok 7). Każdy rosnący klon drożdży zawiera przynętę, ale (potencjalnie) inny interaktor. Oddziałujące białka są kodowane w bibliotece cDNA, która jest klonowana do plazmidów ofiar. Przynęta i plazmidy ofiary kocystronycznie kodują część czynnika transkrypcyjnego drożdży. W przypadku fizycznej interakcji między przynętą (efektorem) a interaktorem zakodowanym przez plazmid ofiary, dwie części czynnika transkrypcyjnego (domena wiążąca DNA i domena aktywacji) są łączone i indukowana jest ekspresja genu reporterowego. Drożdże są w stanie rosnąć na płytkach selekcyjnych SD zubożonych w histydynę i adeninę. Rodzaj biblioteki cDNA ofiary zależy od efektora przesiewowego i musi być odpowiednio dobrany. Wektor ofiary i przynęty, a także szczep drożdży muszą być kompatybilne. W tym badaniu przesiewowym domena wiążąca DNA LexA i domena aktywacji Gal4 zostały użyte jako kompatybilne jednostki czynnika transkrypcyjnego drożdży. Biblioteka cDNA może być skonstruowana indywidualnie, wykonana na zamówienie lub uzyskana komercyjnie. Przygotowanie biblioteki zdobyczy cDNA nie jest częścią tego protokołu. W tym protokole wykorzystano samodzielnie skonstruowaną, znormalizowaną bibliotekę cDNA z RNA liści Malus x domestica i sklonowano ją do pGAD-HA41. Szczep drożdży wyrażający efektor (przynętę) poddano transformacji za pomocą biblioteki zdobyczy, a klony wybrano na płytkach selekcyjnych SD zubożonych w histydynę i adeninę. Aby wyekstrahować plazmidowe DNA z kolonii drożdży, zaleca się mini zestaw plazmidu DNA oparty na kolumnie dla bakterii w połączeniu z etapem mechanicznego rozrywania przy użyciu szklanych kulek w celu poprawy lizy drożdży (krok 8). W tym oczyszczaniu plazmidu przynęta i wektor ofiary zostaną oczyszczone jednocześnie w stosunkowo niskich stężeniach. Jednak ilość plazmidowego DNA jest wystarczająca do zidentyfikowania partnera interakcji poprzez sekwencjonowanie bez wcześniejszej propagacji plazmidu (krok 8.4). Alternatywnie, DNA oczyszczone w kroku 8.4 może zostać przekształcone w kompetentną E. coli i wyselekcjonowane z opornością na antybiotyki, w której pośredniczy wektor ofiary (np. ampicylina w przypadku pGAD-HA). Wybrane kolonie E. coli zawierają tylko plazmid biblioteki pGAD-HA, a za pomocą tych klonów można przeprowadzić wysokowydajne oczyszczanie plazmidu.

Udana transformacja konstruktów pLexA-N i pGAD-HA uzupełnia auksotrofię tryptofanu i leucyny NMY51. Interakcja między efektorem a białkiem (kodowanym na pGAD-HA) prowadzi do aktywacji układu reporterowego w szczepach NMY51. W przypadku samoaktywacji, NMY51 transformowany efektorem wyrażającym pLexA-N w połączeniu z wektorem pustej biblioteki pGAD-HA rośnie na selektywnych płytkach pozbawionych trp-leu-his-ade, z powodu niepożądanej aktywacji systemu reporterowego NMY5140. Samoaktywacja może być słaba i może wystąpić przy braku trp-leu-his, lub aktywacja może być silna i charakteryzować się wzrostem na płytkach trp-leu-his-ade41. Samoaktywacja może spowodować ogromne tło fałszywie dodatnich klonów na rzeczywistym ekranie Y2H. Aby tego uniknąć, należy przeprowadzić test samoaktywacji z przynętą, w którym wektor wyrażający efektor jest współprzekształcany z wektorem pustej biblioteki. W tym środowisku eksperymentalnym nie wolno indukować ekspresji genu reporterowego. Jeśli w badaniu widoczna jest samoaktywacja (tj. wzrost na selektywnych płytkach), pożywkę można uzupełnić różnymi stężeniami 3-amino-1,2,4-triazolu45 (3-AT). 3-AT jest inhibitorem dehydratazy imidazolelicerofosforanowej (HIS3), enzymu ważnego podczas biosyntezy histydyny46. Suplementacja 3-AT może zmniejszyć słabe efekty samoaktywacji podczas badań przesiewowych Y2H47,48. Należy badać różne stężenia 3-AT. W tym protokole zastosowano 1 - 40 mM 3-AT. Najniższe stężenie, które prowadzi do zahamowania samoaktywacji, powinno być następnie stosowane w sicie Y2H. Selektywne płytki testu samoaktywacji można ocenić tylko wtedy, gdy płytki SD-trp-leu kotransformacji zawierają wystarczającą liczbę klonów. Jako wskazówkę≥ wystarczy 500 kolonii na 90 mm (średnicy) szalki Petriego. W celu określenia dokładnej skuteczności transfekcji zaleca się przygotowanie seryjnych rozcieńczeń drożdży przekształconych i rozprowadzenie ich na płytkach SD-trp-leu.

Aby zmniejszyć samoaktywację, efektor można sklonować do pLexA-C, wektora ekspresji przynęty, który łączy znacznik LexA z C-końcem białka. Orientacja znacznika Lex-A może tłumić samoczynną aktywację24. Jednak nie w każdym przypadku możliwe jest ograniczenie lub zniesienie samoaktywacji. Tworzenie się czerwonych lub czerwonawych kolonii wskazuje na słabą lub fałszywie dodatnią interakcję. Gen reporterowy ade2 NMY51 jest aktywowany tylko wtedy, gdy dochodzi do interakcji białko-białko, co z kolei blokuje akumulację czerwonego barwnika w tym szczepie drożdży40. W przypadku braku interakcji, NMY51 są czerwonawe, podczas gdy kolonie zawierające silne interakcje są białe. Obserwacja koloru kolonii na płytkach selekcyjnych stanowi zatem kolejną ważną wskazówkę do oceny, czy poszczególne kolonie są prawdziwymi, czy fałszywie dodatnimi interaktorami.

Ostatecznie konieczne jest dostosowanie lub zmiana niektórych ustawień testu w odniesieniu do charakteru przynęty i charakterystyki interakcji. Do tej pory opracowano szereg ulepszeń i technik pochodnych powszechnego Y2H, aby umożliwić analizę dość trudnych interakcji białek w różnych systemach gospodarza. Przegląd autorstwa Stynena i wsp.49 omawia i opisuje różne aspekty Y2H, jego ulepszenia i adaptacje, a tym samym dostarcza przydatnych informacji o tym, jak wybrać odpowiedni test interakcji.

Badania przesiewowe Y2H i techniki pochodne stały się szeroko stosowane w różnych dziedzinach badawczych, wszędzie tam, gdzie wymagana jest identyfikacja interakcji białek binarnych. Nawet jeśli przeprowadzane są krytyczne kontrole, takie jak testy samoaktywacji przynęty i retransformacje jeden do jednego zidentyfikowanych białek oddziałujących na siebie, Y2H jest podatny na dawanie fałszywych wyników 26,50,51. Drożdże jako model nie nadają się do wszystkich badań interakcji. Drożdże niekoniecznie stanowią środowisko komórkowe, które wspiera odpowiednią modyfikację potranslacyjną i fałdowanie dla każdego białka24. Ponadto w ustawieniu Y2H białka są nadmiernie eksprymowane, a ich ekspresja nie jest kontrolowana przez ich naturalny promotor. Y2H zmusza partnerów interakcji białkowych do jądra, które niekoniecznie jest ich naturalnym subkomórkowym miejscem docelowym. Natywne warunki komórkowe interakcji mogą zatem nie być odzwierciedlone przez drożdże i mogą prowadzić do wyników fałszywie ujemnych lub fałszywie dodatnich. Większość Y2H opiera się na komplementacji auksotrofii drożdży jako zasadzie selektywnej. Ta selekcja żywieniowa charakteryzuje się wysoką czułością, ale kosztem zmniejszonej selektywności w porównaniu z innymi (np. chromatogennymi testami reporterowymi)49. Jeżeli dla określonego efektora występuje nieredukowalna samoaktywacja (patrz wyżej) lub inne ograniczenia, Y2H nie jest odpowiednim testem25. W Tabeli 1 i Rysunku 1 przedstawiono oczekiwane wyniki testu samoaktywacji. Brak rzeczywistych interakcji (tj. wyników fałszywie ujemnych) może być spowodowany toksycznością białek, nieprawidłowym przetwarzaniem białek translacyjnych, steryczną przeszkodą interakcji, niedostatecznie reprezentowanymi partnerami interakcji w bibliotece ofiar, lokalizacją błony przynęty lub brakującymi składnikami niezbędnymi do interakcji24.

Zaleca się de novo amplifikację pełnej długości genu zidentyfikowanego białka oddziałującego z cDNA, subklonowanie go do pGAD-HA i przeprowadzenie testu interakcji jeden do jednego poprzez przekształcenie wygenerowanego konstruktu pGAD-HA w szczep NMY51 wykazujący ekspresję przynęty. Jest to konieczne, ponieważ obserwowany interaktor obecny w bibliotece ofiar może być tylko fragmentem większego białka. Jednak informacje dotyczące odpowiedniego genu o pełnej długości są dostępne tylko wtedy, gdy dostępne są znaczne dane dotyczące sekwencji genomicznej i transkryptomicznej. Opisany tutaj protokół transformacji dla testu samoaktywacji może być zastosowany do takiego testu jeden do jednego, a interakcja między przynętą a interaktorem musi być odtwarzalna.

Interakcje zidentyfikowane na ekranie Y2H muszą być zawsze potwierdzone inną, niezależną techniką. Ta niezależna technika musi być bliższa naturalnym ustawieniom rzeczywistej interakcji białko-białko. W przypadku efektora fitoplazmatycznego ATP_00189 interakcję z czynnikami transkrypcyjnymi TCP Malus x domestica zweryfikowano w planta z dwucząsteczkową komplementacją fluorescencyjną (BiFC) w protoplastach Nicotiana benthamiana 28 (nieobjętych tym protokołem). Efektorowy ATP_00189 białkowy pochodził od patogenu roślinnego P. mali. In planta W związku z tym wybrano BiFC do weryfikacji ATP_00189 interakcji z czynnikami transkrypcyjnymi Malus x domestica zidentyfikowanymi wcześniej w Y2H28. BiFC to test interakcji białko-białko, który nie wymaga subkomórkowej translokacji oddziałujących białek do jądra w celu aktywacji systemu reporterowego52. Co więcej, maszyneria ekspresji i modyfikacji in planta naśladuje środowisko naturalnej interakcji między efektorem bakteryjnym rośliny a jej gospodarzem roślinnym. Jednak globalny ekran przy użyciu BiFC nie jest wykonalny.

W protokole jest kilka kroków, które należy dokładnie przeanalizować. Podczas amplifikacji genu będącego przedmiotem zainteresowania (krok 4) ważne jest, aby wykluczyć, że startery wiążą się z DNA rośliny. W związku z tym DNA z roślin niezakażonych musi być włączone jako kontrola ujemna. Sekwencja genu będącego przedmiotem zainteresowania nie może zawierać miejsc restrykcyjnych EcoRI i SalI, które są wykorzystywane do kierunkowego klonowania insertu. Jeśli sekwencja zawiera te miejsca, należy wybrać różne enzymy restrykcyjne do klonowania. Transformacja drożdży jest centralną metodą podczas tego protokołu. Skuteczność transfekcji zależy od kompetencji komórek drożdży, ich żywotności, stanu wzrostu i jakości odczynnika do transfekcji53,54. W przypadku proponowanego protokołu zdecydowanie zaleca się stosowanie drożdży ze świeżych płytek nie starszych niż dwa tygodnie (przechowywanych w temperaturze 4 °C) podczas przeprowadzania przemian. Często wzrost przekształconych drożdży jest opóźniony, gdy selektywne płynne kultury są inokulowane koloniami ze starych płytek agarowych. Pomocne jest również użycie płynnej kultury starterowej jako inokulum do właściwych eksperymentów, a nie używanie drożdży bezpośrednio z płytki. Niska skuteczność transfekcji ofiary do drożdży wykazujących ekspresję przynęty może prowadzić do niedostatecznej reprezentacji niektórych białek ofiary (potencjalnych interaktorów), a tym samym może zniekształcić całe sito. W tym protokole dobrze zadziałała skuteczność transfekcji drożdży wynosząca ~150 000 cfu/μg transfekowanego DNA w Y2H.

Znajomość wad i wad techniki Y2H oraz interpretacja wyników w sposób krytyczny i odpowiedni jest niezbędna do wyciągnięcia prawidłowych wniosków. Testy Y2H i ich pochodne są stosowane od wielu lat i przeszły wiele ulepszeń i adaptacji w odniesieniu do różnych cech przynęty, subkomórkowej lokalizacji interakcji, oczekiwanych partnerów wiążących i innych czynników, które mogą być wymagane do interakcji (patrz Y3H 55,56,57). Ostatnio opracowano ekrany Y2H oparte na tablicach, które pozwalają na zautomatyzowaną, wysokoprzepustową analizę wielu przynęt przeciwko milionom zdobyczy58. Przyszłość najprawdopodobniej leży w automatyzacji i wysokoprzepustowym podejściu do tego testu, aby umożliwić wyjaśnienie złożonych szlaków sygnałowych i interakcji w różnych dziedzinach badań.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Dziękujemy Christine Kerschbamer, Thomasowi Letschce, Sabine Oettl, Margot Raffeiner i Florianowi Senonerowi z Centrum Badawczego w Laimburgu oraz Mirelle Borges Dias Schnetzer z Dualsystems Biotech AG za wsparcie techniczne i Julii Strobl za korektę manuskryptu. Prace te zostały wykonane w ramach projektu APPL2.0 i zostały częściowo sfinansowane przez Autonomiczną Prowincję Bolzano/Bolzano z Włoch oraz Konsorcjum Jabłek Południowego Tyrolu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Bromek cetylotrimetyloamoniowy (CTAB)ApplichemA6284do otrzymywania DNA
Trishydroxymethylaminomethane (Tris)ApplichemA2264do pożywki i buforu
Chlorek sodu (NaCl)ApplichemA2942do pożywki i buforu
Kwas etylenodiaminotetraoctowy Sól disodowa (NaEDTA)ApplichemA2937do pożywki i buforu
Sól sodowa N-lauroilosarkozynyApplichemA7402do preparatu DNA
octan amonu Sigma-Aldrich (Fluka)9688do otrzymywania DNA
2-merkaptoetanolApplichemA1108do otrzymywania DNA
Izopropanol (2-propanol)A3928do otrzymywania DNA
EtanolSigma-Aldrich (Fluka)51976do otrzymywania DNA
RNAzyApplichemA2760do otrzymywania DNA
Chloroform:Izoamyl 24:1AplikacjaA1935do przygotowania DNA
Korekta polimerazy (np. iProof)Bio-Rad203433do PCR
EcoRIThermo ScientificER0271do klonowania
SalIThermo ScientificER0641do klonowania
Zestaw do oczyszczania DNA oparty na kolumnie (np. QIAquick)Qiagen28104do klonowania
siarczanu kanamycynyApplichemA1493do selekcji mikrobiologicznej
3-Amino-1,2,4-Triazole (3-AT)Sigma-AldrichA8056do testu samoaktywacji
Monochlorowodorek L-argininy AplikacjaA3680do hodowli drożdży
L-izoleucyna AplikacjaA3642do hodowli drożdży
Monohydrat L-lizyny AplikacjaA3448do hodowli drożdży
L-Metionina AplikacjaA3897do hodowli drożdży
L-fenyloalaniny AplikacjaA3464do hodowli drożdży
L-treoniny AplikacjaA3946do hodowli drożdży
L-tyrozyna ApplichemA3401dla kultur drożdży
L-UracileApplichemA0667dla kultur drożdży
L-walina AplikacjaA3406do hodowli drożdży
Sól półsiarczanu L-adeniny AplikacjaA1596do kultur drożdży
0,22 i mikro; m Filtr porówSartorius16541do sterylnej filtracji
Monochlorowodorek L-histydynyApplichemA3719do hodowli drożdży
L-Leucyna AplikacjaA3496do hodowli drożdży
L-Tryptofan AplikacjaA3410do hodowli drożdży
Baza azotowa drożdży Sigma-Aldrich51483do hodowli drożdży
D-Glukoza Monohydrat ApplichemA1349do hodowli drożdży
AgarFisher ScientificBP2641-1do hodowli drożdży i bakterii
PeptoneApplichemA2208do hodowli drożdży
Glikol polietylenowy 4000 (PEG)ApplichemA1249do przemiany drożdży
Octan litu dwuwodny (LiOAc)ApplichemA3478do przemiany drożdży
DNA plemników łososia AplikacjaA2159do transformacji drożdży
Przeciwciało przeciwko znacznikowi Lex-A (np. region wiążący DNA anty-LexA)Millipore06-719do plazmidu Western blot
Zestaw miniprep (np. GenElute Plasmid Miniprep Kit)Sigma-Aldrich350 złdo oczyszczania plazmidu z drożdży i bakterii
Koraliki szklane myte kwasemSigma-AldrichG8772do oczyszczania plazmidu z drożdży
Ampicillin Sodium SaltApplichemA0839do selekcji mikrobiologicznej
Ekstrakt z drożdżyApplichemA1552do hodowli drożdży
Koncentrator próżniowy wirówka (np. Koncentrator 5301)EppendorfZ368245 (Sigma)do przygotowania DNA
Wektor przynęty (np. pLexA-N)Systemy dualneP01004
wektora zdobyczy Y2H (np. pGAD-HA)Systemy dualneP01004dla wektora
kontroli zdobyczy Y2H (np. pLexA-p53)Systemy dualneP01004dla wektora
przynęty kontrolnej Y2H (np. pACT-largeT)Systemy dualneP01004dla Y2H
Elektrokompetentne E. coli (e.g. MegaX DH10B T1R Electrocomp Cells)InvitrogenC640003do klonowania
szczepu reporterowego drożdży (NMY51:MATahis3Δ 200 trp1-901 leu2-3,112 ade2 LYS2::(lexAop)4-HIS3 ura3::(lexAop)8-lacZ ade2::(lexAop)8-ADE2 GAL4, np. NMY51)DualsystemsP01004dla Y2H
Folia parafinowa z tworzywa sztucznego (np. Parafilm M)Sigma-AldrichP7793-1EAdo hodowli drożdży i bakterii
Uszczelniacz przepuszczający gaz (np. BREATHseal)Greiner676 051do hodowli drożdży
Cykler do PCR (np. Termocykler T100)1861096 Bio-Rad
cyklera PCR do PCR (np. Dotykowy system wykrywania PCR w czasie rzeczywistym CFX96)1855195 Bio-Raddo ilościowej
mikrowirówki PCR (np. Wirówka 5417 R)Eppendorf5417 Rogólne wyposażenie laboratoryjne
Wirówka (np. Wirówka 5804 R)Eppendorf5804 Rogólny sprzęt laboratoryjny
Woda wolna od nukleaz (bez DNAzy, bez RNAse, bez proteazy)5Prime2500010do PCR i prac DNA
ScalpellSwann-Morton0301do przygotowania DNA
Sterylny filtr (0,22 &mikro; m; Polieterosulfon)VWR-International514-0073 (europejski numer katalogowy)do hodowli drożdży i bakterii
szalki Petriego Ø 90 mm Greiner Bio-One633180do hodowli drożdży i bakterii
szalki Petriego Ø 150 mm Fotometr Greiner Bio-One639161do hodowli drożdży
(np. BioPhotometer)Eppendorf550507804do hodowli drożdży
Fotometr Kuwetymarki759015do hodowli drożdży
Kąpiel wodna (np. Kąpiel wodna Memmert WB7)MemmertWB7do przemiany drożdży
Western Blot SprzętBio-Raddiversedo wykrywania białek
dNTPs5Prime2201210do klonowania
kolb Shaker (Erlenmeyer) (100 ml; 1,000 ml; 2,000 mL) i oddychających zatyczek bawełnianych (np. Termosy Duran Erlenmeyer z wąską szyjką)Sigma AldrichZ232793, Z232858, Z232866do hodowli drożdży i bakterii
Inkubator z wytrząsaniem (np. GFL 3031)GFL3031do hodowli drożdży i bakterii
Spoiwodo inkubatoraKB 53 (E3.1)do hodowli drożdży i bakterii
Kostkarka do lodu (np. Kostkarka do lodu IF 825)OmniwashIF 825ogólny sprzęt laboratoryjny
0,2 mL, 1,5 ml i 2,0 ml Fiolki reakcyjne (polipropylen)Eppendorf0030.124.332 (0,2 ml); 0030.123.328 (1,5 ml); 0030.123.344 (2,0 ml)ogólny sprzęt laboratoryjny
Pipety i jednorazowe końcówki do pipet (różne objętości: 10 - 1,000 &mikro; L)Eppendorfróżnorodnyogólny sprzęt laboratoryjny
RozrzutnikSigma-AldrichSPR-L-S01do hodowli drożdży i bakterii
Wytrząsarka wirowa (np. MS 3 Minishaker)IKA3617000ogólny sprzęt laboratoryjny
T4-LigaseThermo FisherEL0011do klonowania
Lodówka (4 ° C) (np. Liebherr Medline FKEX 5000)Liebherr81.767.580.4ogólny sprzęt laboratoryjny
Zamrażarka (-20 ° C) (np. Liebherr Comfort Professional G5216)Ogólny sprzęt laboratoryjnyLiebherrG5216
Cylinder z podziałką (np. Marka)Sigma AldrichZ327352; Z327417; Z327441   Ogólny sprzęt laboratoryjny
Pipety serologiczne (np. Fisherbrand)Thermo FisherS55701do hodowli drożdży i bakterii
Pipetor mechaniczny (np. Pipetboy acu 2)Integra-Biosciences155000ogólny sprzęt laboratoryjny
Kuwety do elektroporacji (1 mm)Molecular Bio Products5510-11do transformacji
bakteriiElektroporator (np. Eporator)Eppendorf4309000019do transformacji bakterii
System obrazowania żelem i plamami (np. ChemiDoc MP System)Bio-Rad1708280ogólne wyposażenie
laboratoryjne Stożkowe probówki wirówkowe (polipropylen) (50 ml)VWR-International 525-0403 (europejski numer katalogowy)ogólne wyposażenie
laboratoryjne Stożkowe probówki wirówkowe (polipropylen) (13 ml)BD Falcon352096ogólne wyposażenie laboratoryjne
Ditiothreitol (DTT; 1 M)Thermo ScientificP2325do ligacji
adenozynotrifosforanu (ATP, np. Roztwór ATP (10 mM))Ambion AM8110G (dystrybuowany przez Thermo Scientific)do podwiązania
Dropout mix bez histydyny, leucyny, tryptofanu i adeniny (DO, np. Syntetyczne suplementy drożdżowe Drop-out Medium)Sigma-AldrichY2021 Sigma do hodowli drożdży (gotowa mieszanka)
dla do ilościowego

Bibliografia

  1. Fields, S., Song, O. -K. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).
  2. Dombrosky-Ferlan, P. -M., Corey, S. -J. Yeast two-hybrid in vivo association of the Src kinase Lyn with the proto-oncogene product Cbl but not with the p85 subunit of PI 3-kinase. Oncogene. 14, 2019-2024 (1997).
  3. Singh, R. Rice Mitogen-Activated Protein Kinase Interactome Analysis Using the Yeast Two-Hybrid System. Plant Physiol. 160, 477-487 (2012).
  4. Lee, H. -J., et al. Interaction of NADPH oxidase 1 with Toll-like receptor 2 induces migration of smooth muscle cells. Cardiovasc. Res. 99, 483-493 (2013).
  5. Del Bene, F., Tessmar-Raible, K., Wittbrodt, J. Direct interaction of geminin and Six3 in eye development. Nature. 427 (6976), 745-749 (2004).
  6. Kumar, A., Godwin, J. -W., Gates, P. -B., Garza-Garcia, A. -A., Brockes, J. -P. Molecular Basis for the Nerve Dependence of Limb Regeneration in an Adult Vertebrate. Science. 318 (5851), 772-777 (2007).
  7. Park, S. -Y., et al. Abscisic Acid Inhibits Type 2C Protein Phosphatases via the PYR/PYL Family of START Proteins. Science. 324 (5930), 1068-1071 (2009).
  8. Selyunin, A. S., et al. The assembly of a GTPase-kinase signalling complex by a bacterial catalytic scaffold. Nature. 469 (7328), 107-111 (2011).
  9. Uetz, P., et al. Herpesviral Protein Networks and Their Interaction with the Human Proteome. Science. 311 (5758), 239-242 (2006).
  10. Ushioda, R., Hoseki, J., Araki, K., Jansen, G., Thomas, D. Y., Nagata, K. ERdj5 Is Required as a Disulfide Reductase for Degradation of Misfolded Proteins in the ER. Science. 321 (5888), 569-572 (2008).
  11. Young, K. -H. Yeast two-hybrid: so many interactions, (in) so little time. Biol. Reprod. 58, 302-311 (1998).
  12. Krachler, A. M., Woolery, A. R., Orth, K. Manipulation of kinase signaling by bacterial pathogens. J. Cell Biol. 195 (7), 1083-1092 (2011).
  13. Hewezi, T., Baum, T. J. Manipulation of Plant Cells by Cyst and Root-Knot Nematode Effectors. Mol. Plant Microbe Interact. 26 (1), 9-16 (2012).
  14. McGhie, E. J., Brawn, L. C., Hume, P. J., Humphreys, D., Koronakis, V. Salmonella takes control: effector-driven manipulation of the host. Curr. Opin. Microbiol. 12 (1), 117-124 (2009).
  15. Kay, S., Bonas, U. How Xanthomonas type III effectors manipulate the host plant. Curr. Opin. Microbiol. 12 (1), 37-43 (2009).
  16. Navarro-Garcia, F., Serapio-Palacios, A., Ugalde-Silva, P., Tapia-Pastrana, G., Chavez-Dueñas, L. Actin Cytoskeleton Manipulation by Effector Proteins Secreted by Diarrheagenic Escherichia coli Pathotypes. Biomed. Res. Int. 2013, 22(2013).
  17. Bhat, B. S., Shanaz, E. Effectors-Role in Host-Pathogen Interaction. J. Agr. Env. Sci. 3 (2), 265-285 (2014).
  18. Bhavsar, A. P., Guttman, J. A., Finlay, B. B. Manipulation of host-cell pathways by bacterial pathogens. Nature. 449 (7164), 827-834 (2007).
  19. Natale, P., Brüser, T., Driessen, A. -J. -M. Sec- and Tat-mediated protein secretion across the bacterial cytoplasmic membrane-Distinct translocases and mechanisms. Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes. 1778 (9), 1735-1756 (2008).
  20. Costa, T. R. D., et al. Secretion systems in Gram-negative bacteria: structural and mechanistic insights. Nat Rev Micro. 13 (6), 343-359 (2015).
  21. Tseng, T. -T., Tyler, B. M., Setubal, J. C. Protein secretion systems in bacterial-host associations, and their description in the Gene Ontology. BMC Microbiol. 9 (1), 1-9 (2009).
  22. MacLean, A. M., et al. Phytoplasma effector SAP54 hijacks plant reproduction by degrading MADS-box proteins and promotes insect colonization in a RAD23-dependent manner. PLoS Biol. 12 (4), e1001835(2014).
  23. Sugio, A., Kingdom, H. N., MacLean, A. M., Grieve, V. M., Hogenhout, S. A. Phytoplasma protein effector SAP11 enhances insect vector reproduction by manipulating plant development and defense hormone biosynthesis. Proc Natl Acad Sci. 108 (48), 1254-1263 (2011).
  24. van Criekinge, W., Beyaert, R. Yeast Two-Hybrid: State of the Art. Biol Proced Online. 2 (1), 1-38 (1999).
  25. Bruckner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D., Schlattner, U. Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology. Int. J. Mol. Sci. 10 (6), 2763-2788 (2009).
  26. Serebriiskii, I., Estojak, J., Berman, M., Golemis, E. A. Approaches to Detecting False Positives in Yeast Two-Hybrid Systems. Biotech. 28 (2), 328-336 (2000).
  27. Golemis, E. A., Serebriiskii, I., Law, S. F. The yeast two-hybrid system: criteria for detecting physiologically significant protein-protein interactions. Curr. Issues Mol. Biol. 1 (1-2), 31-45 (1999).
  28. Janik, K., Mithöfer, A., Raffeiner, M., Stellmach, H., Hause, B., Schlink, K. An effector of apple proliferation phytoplasma targets TCP transcription factors - a generalized virulence strategy of phytoplasma. Mol. Plant Pathol. , (2016).
  29. Strauss, E. Microbiology. Phytoplasma research begins to bloom. Science. 325 (5939), 388-390 (2009).
  30. Kartte, S., Seemüller, E. Variable response within the genus Malus to the apple proliferation disease. J. Plant Dis. Protect. 95 (1), 25-34 (1988).
  31. Bovey, R. Observations and experiments on apple proliferation disease. Phytopath. Mediterr. 2 (3), 111-114 (1963).
  32. Schlink, K., Reski, R. Preparing High-Quality DNA From Moss (Physcomitrella patens). Plant. Mol. Biol. Rep. 20, 423(2002).
  33. Applichem. N-Lauroylsarcosine sodium salt. , https://www.applichem.com/fileadmin/datenblaetter/A7402_en_GB.pdf (2015).
  34. Applichem. 2-Mercaptoethanol. , https://www.applichem.com/fileadmin/datenblaetter/A1108_en_GB.pdf (2015).
  35. Applichem. 2-Propanol. , https://www.applichem.com/fileadmin/datenblaetter/A3928_en_GB.pdf (2015).
  36. Applichem. Chloroform:Isoamyl alcohol (24:1). , https://www.applichem.com/fileadmin/datenblaetter/A3928_en_GB.pdf (2015).
  37. Mehle, N., Nikolić, P., Gruden, K., Ravnikar, M., Dermastia, M. Real-time PCR for specific detection of three phytoplasmas from the apple proliferation group. Methods Mol. Biol. 938, 269-281 (2013).
  38. Applichem. Kanamycin sulfate. , https://www.applichem.com/fileadmin/datenblaetter/A1493_en_GB.pdf (2015).
  39. Smith, L. M., et al. Fluorescence detection in automated DNA sequence analysis. Nature. 321 (6071), 674-679 (1986).
  40. Lentze, N., Auerbach, D. Membrane-Based Yeast Two-Hybrid System to Detect Protein Interactions. Current Protocols in Protein Science. , Wiley Interscience. 1917-1952 (2008).
  41. Dualsystems Biotech AG. DUALhubrid Kit - Manual P01004 B06. www.dualsystems.com. , 1-44 (2012).
  42. Kurien, B. -T., Scofield, R. -H. Protein Blotting and Detection. , Humana Press. (2009).
  43. Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nat. Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).
  44. Yeast Transformation and Cloning. , JoVE Science Education Database. Cambridge, MA (USA). (2016).
  45. Sigma-Aldrich. 3-Amino-1,2,4-triazole. , http://www.sigmaaldrich.com/MSDS/MSDS/DisplayMSDSPage.do?country=IT&language=EN-generic&productNumber=A8056&brand=SIGMA&PageToGoToURL=http%3A%2F%2Fwww.sigmaaldrich.com%2Fcatalog%2Fproduct%2Fsigma%2Fa8056%3Flang%3Dit (2016).
  46. Ames, B. -N. The Biosynthesis of Histidine: d-erythro-Imidazole-Glycerol Phosphate Dehydrase. J. Biol. Chem. 228, 131-143 (1957).
  47. Joung, J. -K., Ramm, E. -I., Pabo, C. -O. A bacterial two-hybrid selection system for studying protein-DNA and protein-protein interactions. Prot Natl Acad Sci. 97, 7382-7387 (2000).
  48. Brennan, M. -B., Struhl, K. Mechanisms of Increasing Expression of a Yeast Gene in Escherichia coli. J. Mol. Biol. 136, 333-338 (1980).
  49. Stynen, B., Tournu, H., Tavernier, J., van Dijck, P. Diversity in genetic in vivo methods for protein-protein interaction studies: from the yeast two-hybrid system to the mammalian split-luciferase system. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 76 (2), 331-382 (2012).
  50. Hengen, P. -H. Methods and reagents: False positives from the yeast two-hybrid system. Trends Biochem Sci. 22 (1), 33-34 (1997).
  51. Vidalain, P. -O., Boxem, M., Ge, H., Li, S., Vidal, M. Increasing specificity in high-throughput yeast two-hybrid experiments. Methods. 32 (4), 363-370 (2004).
  52. Pattanaik, S., Werkman, J. -R., Yuan, L. Bimolecular Fluorescence Complementation as a Tool to Study Interactions of Regulatory Proteins in Plant Protoplasts. Plant Transcription Factors: Methods and Protocols. Yuan, L., Perry, E. S. , Humana Press. Totowa, NJ. 185-193 (2011).
  53. Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K., Kimura, A. Transformation of Intact Yeast Cells Treated with Alkali Cations. J. Bacteriol. 153 (1), (1983).
  54. Kawai, S., Hashimoto, W., Murata, K. Transformation of Saccharomyces cerevisiae and other fungi. Bioeng Bugs. 1 (6), 395-403 (2010).
  55. Bernstein, D. -S., Buetr, N., Stumpf, C., Wickens, M. Analyzing mRNA-protein complexes using a yeast three-hybrid system. Methods. 26, 123-141 (2002).
  56. Stumpf, C. -R., Opperman, L., Wickens, M. Analysis of RNA-Protein Interactions Using a Yeast Three-Hybrid System. Methods Enzymol. 449, 295-315 (2008).
  57. Cottier, S., et al. The yeast three-hybrid system as an experimental platform to identify proteins interacting with small signaling molecules in plant cells: potential and limitations. Front. Plant Sci. 2, 1-12 (2011).
  58. Häuser, R., Stellberger, T., Rajagopala, S. V., Uetz, P. Array-Based Yeast Two-Hybrid Screens: A Practical Guide. Two Hybrid Technologies: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. , 21-38 (2012).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Efektor fitoplazmyoddzia ywanie bia ko bia kooczyszczanie DNAamplifikacja genu efektoraklonowanie wektora przyn tytransformacja dro d ywysiew na pod o a selekcyjneprzenoszenie koloniioczyszczanie plazmid w

Powiązane artykuły