Skuteczna izolacja funkcjonalnych wysp trzustkowych z trzustki noworodka myszy

Podsumowanie

Opisujemy tutaj protokół izolowania nienaruszonych wysepek od nowonarodzonych myszy. Trzustkę częściowo trawiono kolagenazą, a następnie myto i zbierano ręcznie. Od nowo narodzonych myszy można uzyskać od 20 do 80 klastrów wysp trzustkowych na trzustkę, które nadają się do kilku badań na wyspach trzustkowych.

Streszczenie

Protokoły izolacji wysp trzustkowych opartych na perfuzji z trzustki dużych ssaków są dobrze znane. Takie protokoły są chętnie przeprowadzane w wielu laboratoriach ze względu na duży rozmiar przewodu trzustkowego, który pozwala na gotowe wstrzyknięcie kolagenazy i późniejszą perfuzję tkanek. Natomiast izolacja wysp trzustkowych od małej trzustki, podobnie jak u nowonarodzonych myszy, jest trudna, ponieważ perfuzja nie jest łatwo osiągalna w małej trzustce. Tutaj opisujemy szczegółową prostą procedurę, która odzyskuje znaczną liczbę wysepek od nowo narodzonych myszy z pomocą wizualną. Świeżo wypreparowaną całą trzustkę trawiono 0,5 mg / ml kolagenazy dożylnej rozpuszczonej w zrównoważonym roztworze soli Hanksa (HBSS) w temperaturze 37 °C, w probówkach do mikrowirówek. Rurki były regularnie stukane, aby pomóc w dyspersji tkanek. Gdy większość tkanki została rozproszona na małe skupiska około 1 mm, lizaty przemyto trzy do czterech razy pożywką hodowlaną z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS). Skupiska wysp trzustkowych, pozbawione rozpoznawalnych tkanek groniastych, można następnie odzyskać pod stereoskopem preparacyjnym. Ta metoda pozwala odzyskać od 20 do 80 małych i dużych wysp trzustkowych na trzustkę nowo narodzonej myszy. Te wysepki są odpowiednie dla większości możliwych dalszych testów, w tym wydzielania insuliny, ekspresji genów i hodowli. Przedstawiono przykład testu wydzielania insuliny w celu walidacji procesu izolacji. Podłoże genetyczne i stopień trawienia są największymi czynnikami decydującymi o plonie. Preferowany jest świeżo przygotowany roztwór kolagenazy o wysokiej aktywności, ponieważ pomaga w izolacji endokrynologicznej i zewnątrzwydzielniczej. Obecność kationów [wapnia (^Ca2+) i magnezu (Mg²⁺)] we wszystkich roztworach oraz płodowej surowicy bydlęcej w pożywce do przemywania / pobierania jest niezbędna dla uzyskania dobrego plonu wysp trzustkowych o odpowiedniej integralności. Pomocna będzie również luneta sekcyjna o dobrym kontraście i powiększeniu.

Wprowadzenie

Izolowanie czystych wysp trzustkowych jest niezbędne do badania stymulowanego glukozą wydzielania insuliny (GSIS) komórek beta oraz do przeszczepu wysp trzustkowych od zmarłych dawców ^1-3. Konieczne jest również ustalenie ekspresji genów endokrynnych w komórkach wysp trzustkowych ^{4, 5}. W tym celu opracowano szczegółowe protokoły pozwalające na izolację wysp trzustkowych od dużej trzustki (⁶ i odniesienia w nich). Metody te opierają się na perfuzji enzymatycznej w celu dysocjacji tkanek kowatych od tkanek wysp trzustkowych, w połączeniu z separacją gradientową i ręcznym zbieraniem. W ten sposób izolację wysp trzustkowych od dużej trzustki można łatwo przeprowadzić w większości laboratoriów. Z drugiej strony nie istnieje szczegółowy protokół krok po kroku, który pozwoliłby na odizolowanie wysp trzustkowych, które są zbyt małe, aby można je było ulegać perfuzji.

Badanie ekspresji genów i funkcji noworodkowych wysp trzustkowych jest ważne. Noworodki mają inne właściwości niż dorosłe pod względem wydzielania i proliferacji insuliny ^{7, 8}. Jednak izolowanie wysepek od nowo narodzonych zwierząt, zwłaszcza myszy, jest trudne ze względu na niewielki rozmiar nowo narodzonej trzustki. Rozmiar zapobiega zwykłemu procesowi perfuzji, gdy kolagenaza jest wstrzykiwana przez przewód trzustkowy. Rzeczywiście, w kilku artykułach przedstawiono badania w tym kierunku, z procedurami izolacji wspomaganymi enzymami lub nieenzymami ^{7, 9, 10}. Brakuje jednak szczegółowego opisu procesu izolacji wysepek za pomocą wizualną ^{7, 9}, co sprawia, że przeprowadzenie podobnych badań jest wyzwaniem dla większości badaczy.

Zbadaliśmy kilka różnych warunków, które dają wysokiej jakości wysepki od nowonarodzonych myszy. W tym miejscu przedstawiamy protokół, który ma pomóc naukowcom w poznaniu kluczowych szczegółów procesu izolacji wysepek. Protokół ten ma zastosowanie do trzustki myszy do drugiego tygodnia życia, po której można wykonać perfuzję w celu rutynowej izolacji wysp trzustkowych. Wyspy trzustkowe mogą być bezpośrednio wykorzystywane do oznaczania wydzielania insuliny i ekspresji genów.

Protokół

Wykorzystanie zwierząt odbywa się zgodnie z procedurami określonymi w protokole M/11/181 zatwierdzonym przez Vanderbilt Institutional Animal Care and Use Committee dla Gu. Myszy CD1 lub CBA/Bl6 zakupiono od komercyjnych dostawców i skrzyżowano w ośrodku dla zwierząt Vanderbilt w celu uzyskania myszy nowonarodzonych.

1. Przygotowanie myszy, roztworów podstawowych i sprzętu

1. Dla krzyżyka myszy: ustaw krzyżyk myszy i zapisz daty podłączenia, aby pomóc w planowaniu eksperymentów. Myszy CD1 zwykle rodzą około 19 dnia po kryciu. Użyj krzyżówek CD1 lub CBA/Bl6, aby uzyskać odpowiednio noworodki CD1 lub CBA/Bl6. Krzyżówki między tymi dwiema liniami wykorzystują samice CD1 i samce CBA/Bl6.
2. W przypadku kolagenazy: zważyć 200 mg kolagenazy typu IV za pomocą wagi o wysokiej precyzji. Przenieść do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Rozpuścić w 40 ml HBSS z Ca²⁺/Mg²⁺ (odpowiednio 1,26 i 0,5 mM) w celu uzyskania roztworu podstawowego o stężeniu 5 mg/ml.
   1. Pozostaw kolagenazę do rozpuszczenia na ~ 30 minut, delikatnie wstrząsając. Podwielokrotność roztworu należy podtrzymać i przechowywać w stanie zamrożonym w temperaturze -20 °C jako zapas, który pozostaje aktywny przez co najmniej jeden rok.
3. Autoklaw do sterylizacji kilku par pęset, nożyczek i końcówek P20 do preparowania i wybierania wysepek.
4. Dla 1 M zapasu glukozy: zważyć 9 g glukozy w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml, dodać 50 ml pożywki RPMI 1640 w celu rozpuszczenia glukozy. Przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia, ale nie dłużej niż 6 miesięcy.

2. Działające rozwiązania

UWAGA: W dniu izolacji wysepek przygotuj następujące odczynniki.

1. Dla roztworu roboczego kolagenazy typu IV: rozmrozić i rozcieńczyć wywar kolagenazy na lodzie. Dozuj 0.15 ml bulionu do każdej probówki o pojemności 1.7 ml do mikrofuge. Dodać 1,35 ml HBSS z Ca²⁺/Mg²⁺. Odwróć rurkę 5 razy. Pozostaw na lodzie na 15 minut.
   1. Wirować na wysokich obrotach przez 3 minuty w mikrowirówce. Przenieść supernatant do nowej probówki. Pozostaw na lodzie do czasu użycia. Wyrzuć probówkę z nierozpuszczalnymi zanieczyszczeniami.
2. Aby uzyskać kompletne pożywki RPMI 1640: dodaj 2,5 ml 1 M glukozy, 50 ml inaktywowanego termicznie FBS i 5 ml 100x Pen-strep do 500 ml pożywki RPMI 1640. Pozostaw na lodzie do czasu użycia.

3. Izolacja i trawienie trzustki

1. Eutanazja noworodków za pomocą izofluranu, a następnie dekapitacja zgodnie z zatwierdzonymi protokołami.
2. Połóż mysz brzuchem do góry. Spryskaj 70% etanolem do sterylizacji.
3. Podnieś skórę brzucha do góry pęsetą i przetnij warstwy skóry i mięśni wzdłuż linii środkowej nożyczkami, od okolicy narządów płciowych do klatki piersiowej. Otwiera to jamę brzuszną, aby odsłonić wszystkie narządy wewnętrzne.
4. Przenieś wszystkie narządy wewnętrzne do naczynia o średnicy 100 cm za pomocą pęsety. Zlokalizuj trzustkę, która jest rozproszonym narządem z częścią grzbietową, która przylega do żołądka i śledziony oraz częścią brzuszną, która przylega do dwunastnicy¹¹.
5. Dodaj HBSS do naczynia, aby zanurzyć narządy. W roztworze tkanki trzustki nie przylegają już do dwunastnicy, żołądka lub śledziony. Jest łatwo rozpoznawalny pod lunetą sekcyjną ze względu na typowy biały kolor. Za pomocą pęsety oderwij tkanki trzustki od otaczających tkanek i przenieś do nowego naczynia o średnicy 60 mm z HBSS.
6. Pokrój każdą trzustkę nożyczkami na kawałki mniejsze niż 5 mm w dowolnych wymiarach. Przenieść do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. W jednej probówce można strawić do pięciu trzustek (młodszych niż P7). W przypadku myszy P8-P16 użyj jednej rurki na trzustkę.
7. Dodaj 0,5 - 1 ml roztworu roboczego kolagenazy do każdej probówki (0,2 ml na każdą trzustkę P1-P7). Użyj 0,5 ml na każdą trzustkę P8-P16). Pozostawić probówkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C na maksymalnie 15 minut. Odwróć rurkę dwa razy co minutę.
8. Po ~ 5 minutach dotknij rurki, aby monitorować stan trawienia tkanki trzustki. Kontynuuj proces trawienia, aż większość tkanki trzustki pojawi się jako rozdrobnione skupiska komórek o średnicy < 2 mm. Lisat będzie wyglądał na mętny, co jest spowodowane normalną autolizą komórek groniastych.

4. Mycie lizatu

1. Wirować lizat przy 500 x g przez 10 s w mikrowirówce. Usunąć warstwę sklarowanego osadu za pomocą pipetmana P1,000. Supernatant powinien wydawać się mętny, ale pozbawiony skupisk komórek. Nie należy stosować aspiracji, która może szybko odessać fragmenty tkanki na dnie ze względu na obecność lepkiego DNA.
2. Dodaj 1 ml kompletnej pożywki RPMI 1640. Delikatnie postukaj w rurkę, aby ponownie zawiesić rozdrobniony lizat. Odwróć w górę i w dół 10 razy. Powtórz krok 4.1.
3. Powtórzyć krok 4.2 jeszcze dwa razy lub do momentu, gdy supernatant okaże się przezroczysty. Ponownie zawiesić umyte fragmenty trzustki w 1 ml kompletnego podłoża RPMI 1640.

5. Izolacja wysepek

UWAGA: Dla małej liczby trzustki, bezpośrednie ręczne zbieranie, jak poniżej (5.1), może być użyte do izolacji wysp trzustkowych. W przypadku dużej liczby trzustki (> 6) preferowana jest metoda opisana w ppkt 5.2.

1. Bezpośrednia kompletacja ręczna:
   1. Przenieś lizat z kroku 4.3 na szalkę o średnicy 60 mm. Dodaj 5 ml kompletnej pożywki RPMI 1640. Przynieś pod mikroskop preparacyjny.
   2. Ustaw oświetlenie jasnego pola w mikroskopie. Dostosuj natężenie światła do ~ 50% mocy maksymalnej. W tym stanie wysepki pojawiają się jako lekko różowe skupiska, podczas gdy komórki groniaste jako ciemne skupiska o nieregularnym kształcie (ryc. 1A). Zalecane jest powiększenie ~ 50X (łączące moc obiektywu i okularu), aby zapewnić najlepszy sposób jednoczesnej wizualizacji wysepek i otworu końcówki pipety podczas wybierania.
   3. Zbieraj wysepki za pomocą końcówki do pipet P20, unikając tworzenia się grona zrazisk. Dozować frakcje wzbogacone w wysepki do nowej płytki o średnicy 60 mm z kompletnymi pożywkami RPMI (rysunek 1B).
   4. Powtórz proces ręcznego zbierania jeszcze dwa razy. Pozostaw czyste wysepki w nowym naczyniu o średnicy 60 mm z 4 ml kompletnej pożywki RPMI (Rysunek 1C).
2. Wirowanie gradientowe:
   1. Przygotować probówkę wirówkową o pojemności 15 ml, która jest wstępnie załadowana 2 ml polisacharozy i ditrizoinianu sodu o gęstości 1,077 g/ml. Pozostaw tubkę na lodzie do czasu użycia.
   2. Przenieść zawiesinę z kroku 4.3 na wierzch roztworu polisacharozy i ditrizoinianu sodu za pomocą pipety Pasteura. Nie naruszaj dolnej warstwy. Do każdej probówki o pojemności 15 ml można załadować tkanki z maksymalnie 10 noworodków lub 2 trzustki P17.
   3. Obracać rurkę przy ~ 600 x g w wirniku obrotowym przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Stosować ustawienia hamowania.
   4. Po odwirowaniu przenieś pożywkę i warstwy międzyfazowe (należy pamiętać, że w idealnych warunkach pracy wysepki będą znajdować się w interfazie między polisacharozy a pożywką hodowlaną po odwirowaniu) do nowej probówki o pojemności 15 ml. Dodaj 10 ml pożywki, delikatnie, ale dokładnie wymieszaj.
   5. Wirować frakcję wzbogaconą w wyspy o masie 300 x g przez 5 minut. Usunąć płyn myjący. Powtórz pranie jeszcze raz z pełnymi mediami RPMI. Ponownie zawiesić granulki w podłożu o pojemności 4 ml, które zawiera głównie wysepki i kanały (rysunek 1D).
   6. Ręcznie wybierz wysepki, jak opisano w sekcji 5.1.

6. Testy GSIS na izolowanych wysepkach

1. Inkubować wyspy trzustkowe z etapu 5.1.4 w kompletnych pożywkach RPMI przez 2 godziny w inkubatorze do hodowli tkankowych o temperaturze 37 °C.
2. Użyj pipety, aby usunąć RPMI pod mikroskopem preparacyjnym. Dodaj 3 ml roztworu KRB z 2,8 mM glukozy do płytki³. Zakręć 10 razy, aby umyć wysepki. Usuń rozwiązania KRB.
   1. Powtórz proces prania raz. Inkubować wyspy trzustkowe w 3 ml roztworu KRB w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę w inkubatorze.
3. Podwielokrotność 1 ml KRB do każdego dołka na płytce 12-dołkowej. Podgrzej bulion i płytkę KRB do temperatury 37 °C w inkubatorze.
4. Przemyć wysepki dwukrotnie wstępnie podgrzanym KRB, jak w ppkt 6.2. Przenieś 10 wysepek do każdej studzienki wstępnie podgrzanych talerzy. Inkubować w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
5. Po 45 minutach pobrać 50 μl supernatantu. Zawiera roztwór insuliny wydzielany pod podstawową glukozą.
6. Dodać 32 μl 500 mM glukozy. Zakręć płytką 20 razy, aby wymieszać roztwór. Inkubować w inkubatorze o temperaturze 37 °C. Obracaj płytką 5 razy raz na 5 minut.
7. Po 45 minutach pobrać 50 μl supernatantu. Jest to insulina wydzielana pod wysokim poziomem glukozy.
8. Przenieść wszystkie wysepki do probówki o pojemności 1,5 ml. Zamrażać w temperaturze -20 °C przez 30 min. Rozmrażać w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Powtórz proces zamrażania i rozmrażania.
9. Dodaj 0,5 ml 70% etanolu z 20 mM HCl. Pozostaw na noc. Jest to insulina pozostawiona w wyspach trzustkowych.
10. Użyj konwencjonalnego testu ELISA do oznaczenia poziomu insuliny, opisanego wcześniej³.

Wyniki

W optymalnych warunkach przedstawiona metoda pozwala na uzyskanie od 20 do 80 wysepek z każdej małej trzustki mysiej. Liczba ta zależy od tła genetycznego, wieku myszy oraz wielkości wyizolowanych wysepek. Wśród powszechnie stosowanych linii, myszy nieinbredne CD1 i inbredne C57BL/6J dają mniej wysepek o mniejszym rozmiarze niż hybrydy CD1 i C57BL/6 lub komercyjne myszy B6CBAF1/J. Bezpośrednie wybieranie ręczne zazwyczaj pozwala na uzyskanie mniejszej liczby wysepek, co prawdopodobnie wyn...

Dyskusja

Tutaj przedstawiamy protokół krok po kroku dotyczący izolacji wysp trzustkowych, które są zbyt małe do konwencjonalnej perfuzji. Oczekuje się, że uzyska wyspy trzustkowe gotowe do wszystkich badań opartych na wyspach trzustkowych, takich jak oczyszczanie komórek beta, analiza ekspresji genów, dojrzewanie komórek beta wysp trzustkowych, proliferacja, reakcje komórek na stres, przeżycie komórek, metabolizm i funkcjonalne utrzymanie GSIS itp. Będzie to, zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, pierwszy szczegółowy protokó...

Materiały

^2+<2+

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kolagenaza Typ IV	Sigma Aldrich, St Louis, VA	MT21020CV
	>/Mg2+	Cellgro, Manassas, VA	Jeśli HBSS bez Casup2+/sup/Mg2+, można dodać do CaClsub>2 i MgSO4 Odpowiednio 1,26 i 0,5 mM.
RPMI 1640 bez glukozy	Thermo Fisher Scientific/Life Technologies, Waltham, MA	11879-020	Glukoza musi być dodawana do określonych poziomów, aby nie przeszkadzać w późniejszym wykorzystaniu wysp.
Glukoza	Sigma Aldrich, St Louis, MO	G-7021
roztwór polisacharozy i diatrizoinianu sodu	Sigma Aldrich, St Louis, MO	Histopaque-10771
Stereoskop	Carl-Zeiss, Oberkochen, Niemcy	Stemi2000
Stereoskop	Leica, Wetzlar, Niemcy	Leica M165
	Eppendorf, Hauppauge, NY	Wirówka 5417C
	Eppendorf, Hauppauge, NY	Wirówka 5810R
15 ml probówki wirówkowe	VWR, Radnor, PA	89039-666
50-mL probówki wirówkowe	VWR, Radnor, PA	89039-658
Waga precyzyjna	VWR, Radnor, PA	VWR-225AC
Rurki do mikrofugi	VWR, Radnor, PA	87003-294
Pipetman P1000	Fisher Scientific,  Waltham, MA	F123602
Pipetman P20	Fisher Scientific,  Waltham, MA	F123600
Talerz 100 x 15 mm	VWR, Radnor, PA	25384-088
Talerz 60 x 15 mm	VWR, Radnor, PA	25384-168
Płytki 12-dołkowe	VWR, Radnor, PA	665-180
Nożycowe	narzędzia naukowe, Foster City, CA	14080-11
Pęseta	Drobne narzędzia naukowe, Foster City, CA	5708-5
Myszy CD1	Charles River Laboratories, Wilminton, MA	CD-1
C57BL/6J	Laboratorium Jacksona, Farmington, CT	C57BL/6J
B6CBAF1/J	Laboratorium Jacksona, Farmington, CT	B6CBAF1/J

Jeśli uzyskano HBSS bez Ca</Mg Mikrowirówka