Wykrywanie stabilnych aberracji międzychromosomowych za pomocą wielokrotnej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (mFISH) i kariotypowania spektralnego (SKY) u napromieniowanych myszy

Rupak Pathak; Igor Koturbash; Martin Hauer-Jensen

doi:10.3791/55162

Method Article

Wykrywanie stabilnych aberracji międzychromosomowych za pomocą wielokrotnej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (mFISH) i kariotypowania spektralnego (SKY) u napromieniowanych myszy

DOI:

10.3791/55162

⸱

January 11th, 2017

Rupak Pathak¹ , Igor Koturbash² , Martin Hauer-Jensen¹^,³

¹Division of Radiation Health, Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, University of Arkansas for Medical Sciences, ²Department of Environmental Health, Fay W. Boozman School of Public Health, University of Arkansas for Medical Sciences, ³Surgical Service, Central Arkansas Veterans Healthcare System

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niniejszy protokół opisuje przydatność wielokrotnej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (mFISH) i kariotypowania spektralnego (SKY) w identyfikacji stabilnych międzychromosomowych aberracji w komórkach szpiku kostnego myszy po ekspozycji na promieniowanie całego ciała.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Promieniowanie jonizujące (IR) wywołuje liczne stabilne i niestabilne aberracje chromosomowe. Niestabilne aberracje, w których morfologia chromosomów jest znacznie upośledzona, można łatwo zidentyfikować za pomocą konwencjonalnych technik barwienia chromosomów. Jednak wykrywanie stabilnych aberracji, które obejmują wymianę lub translokację materiału genetycznego bez znaczącej modyfikacji morfologii chromosomów, wymaga wyrafinowanych technik malowania chromosomów, które opierają się na hybrydyzacji in situ fluorescencyjnie znakowanych sond DNA, technice malowania chromosomów popularnie znanej jako fluorescencja in situ hybrydyzacja (FISH). Sondy FISH mogą być specyficzne dla całego chromosomu/chromosomów lub precyzyjnego podregionu na chromosomie/chromosomach. Metoda ta nie tylko pozwala na wizualizację stabilnych aberracji, ale może również umożliwić wykrycie chromosomu lub określonej sekwencji DNA biorącej udział w tworzeniu się określonej aberracji. W cytogenetyce dostępnych jest wiele technik malowania chromosomów; tutaj omówiono dwie bardzo czułe metody, wielokrotną fluorescencję hybrydyzacji in situ (mFISH) i kariotypowanie spektralne (SKY), w celu identyfikacji stabilnych aberracji międzychromosomowych, które tworzą się w komórkach szpiku kostnego myszy po ekspozycji na promieniowanie całego ciała. Chociaż obie techniki opierają się na znakowanych fluorescencyjnie sondach DNA, metoda wykrywania i proces akwizycji obrazu sygnałów fluorescencyjnych są różne. Te dwie techniki były stosowane w różnych obszarach badawczych, takich jak biologia radiacyjna, cytogenetyka nowotworów, retrospektywna biodozymetria promieniowania, cytogenetyka kliniczna, cytogenetyka ewolucyjna i cytogenetyka porównawcza.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dwie najbardziej niezawodne metody identyfikacji indukowanych promieniowaniem aberracji międzychromosomowych to wielokrotna fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (mFISH), która pozwala na malowanie dwóch lub więcej chromosomów jednocześnie, oraz kariotypowanie spektralne (SKY), które nadaje odrębny kolor każdej homologicznej parze chromosomów w genomie. W przeciwieństwie do aberracji niestabilnych, aberracje stabilne mają charakter trwały i mogą rozprzestrzeniać się przez kilka pokoleń w napromienianych populacjach¹ i są uważane za krytyczne "sygnatury" molekularne zmian cytogenetycznych wywołanych promieniowaniem². Badania przeprowadzone....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie badania na zwierzętach zostały przeprowadzone w ścisłej zgodności z zaleceniami zawartymi w Przewodniku dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych National Institutes of Health. Protokół dotyczący zwierząt został zatwierdzony przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu Nauk Medycznych w Arkansas. Wszystkie zwierzęta były trzymane w standardowym, klimatyzowanym pomieszczeniu w temperaturze 20 ± 2 °C z 10-15 godzinnymi cyklami świeżego powietrza i swobodnym dostępem do standardowej karmy i wody dla gryzoni. Po przyjeździe myszy zostały poddane kwarantannie przez 1 tydzień i otrzymały certyfikowaną karmę dla gryz....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Napromienianie całego ciała wywołuje liczne aberracje chromosomowe w komórkach szpiku kostnego napromieniowanych myszy. Obecny protokół jest zoptymalizowany pod kątem mitotycznego zatrzymania komórek szpiku kostnego in vivo po ekspozycji na promieniowanie, pobierania komórek szpiku kostnego z tylnych nóg napromieniowanych myszy, izolacji komórek jednojądrzastych szpiku kostnego przez wirowanie w gradionym gradionym gęstości, przygotowania rozprzestrzeniania się komórek metafazy, .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O sukcesie mFISH i SKY decyduje kilka kluczowych etapów. Pierwszym i najważniejszym krokiem jest optymalizacja leczenia kolchicyną w celu mitotycznego zatrzymania in vivo komórek jednojądrzastych szpiku kostnego. Stężenie kolchicyny i czas leczenia indywidualnie lub wspólnie określają indeks mitotyczny, a także kondensację chromosomów - dwa ważne warunki skutecznego malowania chromosomów. Wysokie stężenie kolchicyny lub dłuższy czas leczenia prowadzi do wysoce zagęszczonych chromosomów, niekompatybilnych dla pra.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez Arkansas Space Grant Consortium i National Space Biomedical Research Institute przez National Aeronautics and Space Administration, granty NNX15AK32A (RP) i RE03701 (MH-J) oraz P20 GM109005 (MH-J) oraz US Veterans Administration (MH-J). Dziękujemy Christopherowi Fettesowi, koordynatorowi programu na Wydziale Zdrowia Środowiskowego i Zawodowego na Uniwersytecie Nauk Medycznych w Arkansas, za pomoc redakcyjną w przygotowaniu manuskryptu.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number
Formamid	Sigma-Aldrich	221198-100ML
Bufor SSC 20 razy; Koncentrat	Sigma-Aldrich	S6639-1L
SKY Odczynnik laboratoryjny do	obrazowania spektralnego stosowanego	FPRPR0030/M40
CAD - Zestaw do wykrywania skoncentrowanych przeciwciał	Stosowane obrazowanie spektralne	FPRPR0033
pojedynczych farb Dostosowane - 3 kolory; Chromosom 1 myszy: czerwony, chromosom 2 myszy: zielony, chromosom 3 myszy: Aqua	Applied Spectral Imaging	FPRPR0182/10
Szkiełka nakrywkowe	Fisher Scientific	12-545B
Tween 20	Fisher Scientific	BP337-100
Kwas solny, 37%, Acros Organics	Fisher Scientific	AC45055-0025
Witraże szklane Fisherbrand z zakrętką	Fisher Scientific	08-816
KaryoMAX roztwór chlorku potasu	Life Technologies	10575-090
Szkiełka mikroskopowe Fisherbrand Superfrost Plus	Fisher Scientific	12-550-15
Colcemid w proszku	Fisher Scientific	50-464-757
Histopaque-1083	Sigma-Aldrich	10831
Shepherd Mark I, model 25¹³⁷Cs grzejnik	J. L. Shepherd & Associates	Model 484B
Strzykawka 1 ml	BD Biosciences	647911
Alkohol etylowy, 200 Proof	Fisher Scientific	MEX02761
PBS, (1x PBS Liq.), bez wapnia i magnezu	Fisher Scientific	ICN1860454
Surowica bydlęca	Fisher Scientific	10-437-010
Metanol	Fisher Scientific	A454SK-4
Lodowaty kwas octowy	Fisher Scientific	AC295320010
Mikroskop Zeiss Zeiss		AXIO Imager.Z2

na myszy płodu

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kodama, Y., et al. Stable chromosome aberrations in atomic bomb survivors: results from 25 years of investigation. Radiat Res. 156, 337-346 (2001).
Lucas, J. N. Cytogenetic signature for ionizing radiation. Int J Radiat Biol. 73, 15-20....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Wykrywanie stabilnych aberracji międzychromosomowych za pomocą wielokrotnej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (mFISH) i kariotypowania spektralnego (SKY) u napromieniowanych myszy

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles