Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wykrywanie stabilnych aberracji międzychromosomowych za pomocą wielokrotnej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (mFISH) i kariotypowania spektralnego (SKY) u napromieniowanych myszy

9.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55162

⸱

11 stycznia 2017

 ,  , 
1Division of Radiation Health, Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, University of Arkansas for Medical Sciences, 2Department of Environmental Health, Fay W. Boozman School of Public Health, University of Arkansas for Medical Sciences, 3Surgical Service, Central Arkansas Veterans Healthcare System

W tym artykule

Podsumowanie

Niniejszy protokół opisuje przydatność wielokrotnej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (mFISH) i kariotypowania spektralnego (SKY) w identyfikacji stabilnych międzychromosomowych aberracji w komórkach szpiku kostnego myszy po ekspozycji na promieniowanie całego ciała.

Streszczenie

Promieniowanie jonizujące (IR) wywołuje liczne stabilne i niestabilne aberracje chromosomowe. Niestabilne aberracje, w których morfologia chromosomów jest znacznie upośledzona, można łatwo zidentyfikować za pomocą konwencjonalnych technik barwienia chromosomów. Jednak wykrywanie stabilnych aberracji, które obejmują wymianę lub translokację materiału genetycznego bez znaczącej modyfikacji morfologii chromosomów, wymaga wyrafinowanych technik malowania chromosomów, które opierają się na hybrydyzacji in situ fluorescencyjnie znakowanych sond DNA, technice malowania chromosomów popularnie znanej jako fluorescencja in situ hybrydyzacja (FISH). Sondy FISH mogą być specyficzne dla całego chromosomu/chromosomów lub precyzyjnego podregionu na chromosomie/chromosomach. Metoda ta nie tylko pozwala na wizualizację stabilnych aberracji, ale może również umożliwić wykrycie chromosomu lub określonej sekwencji DNA biorącej udział w tworzeniu się określonej aberracji. W cytogenetyce dostępnych jest wiele technik malowania chromosomów; tutaj omówiono dwie bardzo czułe metody, wielokrotną fluorescencję hybrydyzacji in situ (mFISH) i kariotypowanie spektralne (SKY), w celu identyfikacji stabilnych aberracji międzychromosomowych, które tworzą się w komórkach szpiku kostnego myszy po ekspozycji na promieniowanie całego ciała. Chociaż obie techniki opierają się na znakowanych fluorescencyjnie sondach DNA, metoda wykrywania i proces akwizycji obrazu sygnałów fluorescencyjnych są różne. Te dwie techniki były stosowane w różnych obszarach badawczych, takich jak biologia radiacyjna, cytogenetyka nowotworów, retrospektywna biodozymetria promieniowania, cytogenetyka kliniczna, cytogenetyka ewolucyjna i cytogenetyka porównawcza.

Wprowadzenie

Dwie najbardziej niezawodne metody identyfikacji indukowanych promieniowaniem aberracji międzychromosomowych to wielokrotna fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (mFISH), która pozwala na malowanie dwóch lub więcej chromosomów jednocześnie, oraz kariotypowanie spektralne (SKY), które nadaje odrębny kolor każdej homologicznej parze chromosomów w genomie. W przeciwieństwie do aberracji niestabilnych, aberracje stabilne mają charakter trwały i mogą rozprzestrzeniać się przez kilka pokoleń w napromienianych populacjach1 i są uważane za krytyczne "sygnatury" molekularne zmian cytogenetycznych wywołanych promieniowaniem2. Badania przeprowadzone przez różne grupy wykazały, że stabilne aberracje są związane z patogenezą i rozwojem wielu chorób, w tym raka3. Przed erą malowania chromosomów (określaną również jako cytogenetyka molekularna) konwencjonalna technika pasma G była jedyną metodą wykrywania stabilnych aberracji chromosomowych. Jednak prążkowanie chromosomów jest wyzwaniem dla cytogenetyków, ponieważ rozdzielczość jest ograniczona, odtwarzalność jest niepewna, jest to procedura pracochłonna i wymaga wysoko wykwalifikowanych i doświadczonych cytogenetyków do wiarygodnej interpretacji danych4. Co więcej, klasyczna technika prążkowania nie pozwala na wykrycie złożonych rearanżacji chromosomowych, które obejmują interakcję trzech lub więcej pęknięć rozmieszczonych między dwoma lub więcej chromosomami, co jest częstym skutkiem uszkodzenia popromiennego. Złożone aberracje mogą utrzymywać się u osób wiele lat po ekspozycji na promieniowanie, co czyni je przydatnymi w biodozymetrii retrospektywnej5. W związku z tym konieczne było alternatywne podejście, aby przezwyciężyć ograniczenia konwencjonalnych technik prążkowania w celu wykrycia stabilnych rearanżacji chromosomów.

Pod koniec lat sześćdziesiątych, pionierska praca Galla i Pardue (1969) nad hybrydyzacją molekularną przy użyciu sond kwasów nukleinowych znakowanych materiałem radioaktywnym rozpoczęła nową erę w dziedzinie cytogenetyki, która pozwoliła na wykrycie specyficznej sekwencji DNA na chromosomie6. Jednak zastosowanie sond radioaktywnych do hybrydyzacji molekularnej miało kilka wad: sondy radioaktywne są stosunkowo niestabilne, aktywność sondy zależy od rozpadu promieniotwórczego użytego izotopu, hybrydyzacja trwa dłużej, rozdzielczość jest ograniczona, sondy są stosunkowo drogie, a materiały radioaktywne stanowią zagrożenie dla zdrowia. W związku z tym konieczne stało się opracowanie i zaprojektowanie sond nieradioaktywnych. Wprowadzenie fluorescencyjnych sond z kwasami nukleinowymi w latach 80. i 90. XX wieku przezwyciężyło ograniczenia sond radioaktywnych i znacznie zwiększyło bezpieczeństwo, czułość i swoistość techniki hybrydyzacji7-10. Sondy fluorescencyjne wytwarzają niezwykle jasne sygnały, gdy są obserwowane pod mikroskopami fluorescencyjnymi wyposażonymi w odpowiednie filtry wzbudzenia i emisji. Każda utrata, zysk lub przegrupowanie chromosomu znakowanego fluorescencyjnie lub części chromosomu jest łatwo identyfikowalne za pomocą tej techniki FISH.

Analiza aberracji chromosomowych za pomocą malowania FISH doprowadziła do znacznego postępu w badaniach cytogenetycznych na przestrzeni lat. Projektowanie sond znakowanych fluorescencyjnie do konkretnych zastosowań, od sond specyficznych dla locus po sondy do malowania całych chromosomów, znacznie posunęło naprzód tę dziedzinę; Ułatwiło to również wykrycie submikroskopowej ("tajemniczej") rearanżacji, która nie była możliwa w przypadku konwencjonalnego prążkowania chromosomów. Malowanie chromosomów za pomocą projektów mFISH i SKY okazało się cennymi narzędziami do identyfikacji prostych i złożonych rearanżacji międzychromosomowych. Podstawowe zasady działania obu technik są podobne, ale sposób detekcji i dyskryminacji sygnału fluorescencyjnego po hybrydyzacji in situ oraz proces akwizycji obrazu są różne. W mFISH oddzielne obrazy każdego z czterech fluorochromów są rejestrowane przy użyciu filtrów mikroskopowych o wąskim paśmie przepustowym; Następnie wykorzystywane jest dedykowane oprogramowanie do łączenia obrazów. W przypadku SKY pozyskiwanie obrazów opiera się na połączeniu mikroskopii epifluorescencyjnej, obrazowania urządzeń ze sprzężeniem ładunkowym i spektroskopii Fouriera, która umożliwia pomiar całego widma emisyjnego przy pojedynczej ekspozycji we wszystkich punktach obrazu. Zarówno w mFISH, jak i SKY, obrazy monochromatyczne są rejestrowane niezależnie, a następnie łączone, a na koniec unikalne pseudo-kolory są przypisywane do chromosomów w obrazach monochromowych na podstawie określonego barwnika dołączonego do każdej sondy fluorochromowej.

Wkład analizy mFISH i SKY w dziedzinie biologii radiacyjnej jest niezwykły, szczególnie dla retrospektywnego szacowania dawki ekspozycji ludzi na IR (biodozymetria promieniowania)11-14, oceny ryzyka rakotwórczego promieniowania15, jak również wykrywania i szacowania ryzyka wtórnego raka związanego z radioterapią16. Niedawne badania na myszach wykazały, że technika malowania chromosomów oparta na FISH jest również ważnym narzędziem do oceny skuteczności środków przeciwdziałania promieniowaniu17. W niniejszym badaniu wykazano wpływ ekspozycji na promieniowanie całego ciała na indukcję stabilnych aberracji chromosomowych w komórkach szpiku kostnego myszy przy użyciu technik mFISH i SKY.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie badania na zwierzętach zostały przeprowadzone w ścisłej zgodności z zaleceniami zawartymi w Przewodniku dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych National Institutes of Health. Protokół dotyczący zwierząt został zatwierdzony przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu Nauk Medycznych w Arkansas. Wszystkie zwierzęta były trzymane w standardowym, klimatyzowanym pomieszczeniu w temperaturze 20 ± 2 °C z 10-15 godzinnymi cyklami świeżego powietrza i swobodnym dostępem do standardowej karmy i wody dla gryzoni. Po przyjeździe myszy zostały poddane kwarantannie przez 1 tydzień i otrzymały certyfikowaną karmę dla gryzoni.

1.Narażenie na promieniowanie i zatrzymanie in vivo komórek metafazy

  1. Wystaw nieznieczulone myszy na promieniowanie całego ciała 2 Gy w komorze napromieniającej. Podczas napromieniania należy umieścić myszy w dobrze wentylowanej komorze przetrzymywania, aby upewnić się, że nie poruszają się swobodnie i otrzymują jednolitą dawkę.
  2. Wstrzyknąć 100 μl 0,05% roztworu kolchicyny (kolchicyna w proszku rozpuszczona w PBS wolnym od wapnia i magnezu) dootrzewnowo za pomocą igły 25 G dołączonej do jednorazowej strzykawki o pojemności 1 ml. Należy unikać wstrzykiwania bezpośrednio do jakiegokolwiek narządu.
  3. Pozostaw zwierzę w klatce na 2 godziny przed pobraniem komórek szpiku kostnego. Obserwuj zwierzę pod kątem oznak bólu lub niepokoju.

2. Pobieranie komórek szpiku kostnego i izolacja komórek jednojądrzastych szpiku kostnego metodą wirowania w gradiacji gęstości

  1. Poddaj mysz eutanazji przez uduszenie CO2 .
  2. Spryskaj 70% etanolem stronę grzbietową i brzuszną.
  3. Wykonaj 2 cm nacięcie na skórze brzucha ostrymi nożyczkami. Chwyć skórę po obu stronach nacięcia pęsetą i delikatnie rozciągnij mięśnie brzucha.
  4. Odetnij obie tylne nogi nożyczkami i natychmiast umieść je we wstępnie schłodzonym PBS z 4% FBS.
  5. Ostrożnie oczyść wszystkie mięśnie przyczepione do tylnej kończyny za pomocą ostrej żyletki i bandaża z bawełnianej gazy.
  6. Oddziel kość piszczelową od kości udowej. Przytnij oba końce każdej kości żyletką.
  7. Przepłukać zawartość szpiku kostnego 3 ml PBS (z 4% FBS) za pomocą igły 23 G dołączonej do strzykawki o pojemności 3 ml i zebrać zawartość do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Przepuścić zawiesinę komórek co najmniej 10 razy przez igłę, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową.
  8. Ostrożnie nałożyć zawiesinę komórek na równą objętość pożywki do separacji limfocytów (3 ml), nie naruszając interfejsu między zawiesiną komórek a pożywką do separacji limfocytów. Wirować przy 400 x g przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  9. Ostrożnie zebrać kożuchową powłokę, nie naruszając innych warstw i przenieść do nowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.

3. Przygotowanie rozprzestrzeniania się komórek metafazowych

  1. Dodać 10 ml PBS do probówki zawierającej kożuch.
  2. Wirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Ostrożnie usunąć supernatant. Następnie rozdrobnij osad komórkowy delikatnym stukaniem i dodaj 10 ml PBS.
  4. Wirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Usunąć sklarowany osad bez naruszania osadu komórkowego, rozbić osad i dodać 4 ml wstępnie podgrzanego hipotonicznego 0,075 M roztworu chlorku potasu. Dodawaj roztwór hipotoniczny kropla po kropli, delikatnie stale wstrząsając.
  6. Inkubować komórki przez 20 minut w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej.
  7. Po poddaniu działaniu hipotonicznym dodać równą objętość (4 ml) utrwalacza (metanol: lodowaty kwas octowy, 3:1 v/v) do probówki o pojemności 15 ml i delikatnie wymieszać, odwracając probówkę.
  8. Wirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant.
  9. Rozdrobnij osad komórkowy przez stukanie, a następnie delikatnie wiruj przez kilka sekund i dodawaj 3 ml roztworu utrwalającego kropla po kropli, ciągle wstrząsając.
  10. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie wirować przy 400 x g przez 5 minut.
  11. Usunąć supernatant, rozbić osad komórkowy delikatnym stuknięciem i dodać 3 ml świeżego utrwalacza.
  12. Wirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant. Rozdrobnij osad komórkowy delikatnym stuknięciem i dodaj świeży utrwalacz o pojemności 3 ml.
  13. Powtórz krok 3.12 jeszcze dwa razy.
  14. Wirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant bez naruszania osadu komórkowego. Następnie dodać od 400 do 600 μl utrwalacza i dokładnie wymieszać pipetując.
  15. Upuść stałe ogniwa o pojemności 30 μl na wstępnie oczyszczone i mokre szkiełka przechylone pod kątem 45° i pozostaw szkiełka do całkowitego wyschnięcia na powietrzu przez noc.

4. Malowanie chromosomów myszy przez mFISH

  1. Denaturacja chromosomów
    1. Umieść szkiełko zawierające rozprzestrzenianie się komórek metafazowych w 2x SSC na 2 minuty w temperaturze pokojowej.
    2. Odwodnić szkiełko przez seryjne płukanie etanolem przez 2 minuty w 70%, 80% i 100%. Inkubować przez 60 minut w temperaturze 65 °C.
    3. Podgrzej 40 ml roztworu denaturacyjnego (70% formamidu/2x SSC; pH 7,0) do 70 °C (± 2 °C) w szklanym słoiku Coplin przez 30 minut. Denaturacja chromosomów poprzez inkubację szkiełka we wstępnie podgrzanym roztworze denaturacyjnym przez 1 - 1,5 min.
    4. Natychmiast zsunąć w lodowatym 70% etanolu na 2 minuty, aby zatrzymać proces denaturacji, a także zapobiec ponownemu wyżarzaniu zdenaturowanych chromosomów. Następnie odwodnić się, myjąc 80% etanolem przez 2 minuty. Powtórz płukanie etanolem ze 100% etanolem przez 2 minuty. Całkowicie wysuszyć szkiełko w temperaturze pokojowej.
  2. Denaturacja i hybrydyzacja mieszaniny sondy
    1. Krótko odwirować mieszaninę sondy dostarczoną przez producenta, przenieść 10 μl mieszaniny sondy do probówki wirówkowej z zatrzaskiem o pojemności 500 μl i dokonać denaturacji przez inkubację w temperaturze 80 °C (± 2 °C) w łaźni wodnej przez 7 minut.
    2. Umieścić probówkę wirówkową z mieszaniną sondy w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 10 minut.
    3. Nałóż zdenaturowaną mieszaninę sondy na szkiełko ze zdenaturowanymi chromosomami.
    4. Ostrożnie przykryj obszar szklanym szkiełkiem nakrywkowym o wymiarach 18 mm x 18 mm i wyeliminuj wszelkie widoczne pęcherzyki powietrza, bardzo delikatnie dociskając szkiełko nakrywkowe, aby się zsunąć. Uszczelnić wszystkie cztery strony szkiełka nakrywkowego cementem kauczukowym i inkubować przez 12 godzin do 16 godzin w ciemności w temperaturze 37 °C w wilgotnej komorze do hybrydyzacji.
  3. Mycie i detekcja po hybrydyzacji
    1. Ostrożnie usuń cement gumowy i szkiełko nakrywkowe.
    2. Umieścić szkiełko we wstępnie podgrzanym 0,4x SSC w temperaturze 74 °C (± 2 °C) na 5 minut.
    3. Szkiełko myć w roztworze myjącym II (4x SSC/0,1% Tween-20) przez 2 min.
    4. Umieść 20 μl podłoża montażowego zapobiegającego blaknięciu z barwnikiem DAPI (1,5 μg/ml) i przykryj szklanym szkiełkiem nakrywkowym. Delikatnie dociśnij szkiełko nakrywkowe chusteczką laboratoryjną, aby usunąć pęcherzyki powietrza i nadmiar roztworu montażowego. Uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego lakierem do paznokci.
    5. Oglądaj preparaty za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w odpowiednie filtry.

5. Kariotypowanie spektralne (SKY) chromosomów myszy

  1. Denaturacja chromosomów i sondy
    1. Zrównoważyć szkiełko w 2x SSC w temperaturze pokojowej przez 2 minuty, bez wstrząsania.
    2. Szkiełko odwadniające w serii etanolu (70%, 80% i 100% etanolu) przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. Wysuszyć szkiełko na powietrzu, aby całkowicie usunąć etanol.
    3. Ciepły 40 ml roztworu denaturacyjnego (70% formamidu/2x SSC; pH 7,0) w szklanym słoiku Coplin przez 30 min.
    4. Inkubować szkiełko w podgrzanym roztworze denaturacyjnym przez 1 do 1,5 minuty.
    5. Natychmiast zanurz szkiełko w lodowatym 70% etanolu na 2 minuty, aby zatrzymać proces denaturacji, a także zapobiec ponownemu wyżarzaniu zdenaturowanych chromosomów.
    6. Odwodnić szkiełko, umieszczając je w 80% etanolu na 2 minuty, a następnie w 100% etanolu na 2 minuty w temperaturze pokojowej.
    7. Denaturować sondę SKY (fiolka #1 dostarczona przez producenta) w łaźni wodnej ustawionej na 80 °C (± 2 °C) przez 7 minut, a następnie natychmiast umieścić w innej łaźni wodnej ustawionej na 37 °C na 10 minut.
  2. Hybrydyzacja sondy
    1. Dodać 10 μl zdenaturowanej sondy SKY na zdenaturowane chromosomy.
    2. Ostrożnie umieść szklane szkiełko nakrywkowe o wymiarach 18 mm x 18 mm na sondzie SKY, tak aby pod szkiełkiem nakrywkowym nie zostały uwięzione pęcherzyki powietrza.
    3. Uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego cementem gumowym.
    4. Umieścić szkiełko w wilgotnej, światłoszczelnej komorze i inkubować w ciemności w temperaturze 37 °C przez 24 godziny do 36 godzin.
  3. Mycie po hybrydyzacji i detekcja fluorescencji
    1. Usuń cement gumowy bardzo ostrożnie, nie naruszając szkiełka nakrywkowego.
    2. Umieścić szkiełko w podgrzanym roztworze do szybkiego mycia (0,4 x SSC) w temperaturze 72 °C (± 2 °C) na 5 minut, ciągle wstrząsając. Zanurzyć szkiełko w roztworze myjącym III (4x SSC/0,1% Tween 20) i inkubować przez 1 minutę, wstrząsając.
    3. Opcjonalnie: Dodać 80 μl odczynnika blokującego (fiolka #2 dostarczona przez producenta) na obszar hybrydyzacji, umieścić plastikowe szkiełko nakrywkowe o wymiarach 24 mm x 60 mm i inkubować w ciemności w temperaturze 37 °C przez 30 minut w wilgotnej komorze.
    4. Delikatnie zdjąć plastikowe szkiełko nakrywkowe i umyć szkiełko wstępnie podgrzanym (45 ºC) roztworem myjącym III przez 5 minut.
    5. Nałożyć 80 μl odczynnika barwiącego Cy5 (fiolka #3 dostarczona przez producenta), umieścić plastikowe szkiełko nakrywkowe o wymiarach 24 mm x 60 mm i inkubować w temperaturze 37 °C w ciemności przez 40 minut w wilgotnej komorze.
    6. Zanurzyć szkiełko w szklanym słoiku Coplin zawierającym wstępnie podgrzany (45 °C) roztwór myjący III (4x SSC/0,1% Tween 20) i inkubować w temperaturze 45 °C w łaźni wodnej przez 2 minuty wstrząsając. Powtórz ten krok prania 3 razy.
    7. Nałożyć 80 μl odczynnika barwiącego Cy5.5 (fiolka #4 dostarczona przez producenta), umieścić plastikowe szkiełko nakrywkowe o wymiarach 24 mm x 60 mm i inkubować w temperaturze 37 °C w ciemności przez 40 minut w wilgotnej komorze.
    8. Umyć szkiełko 3 razy podgrzanym (45 ºC) roztworem myjącym III.
    9. Przytrzymaj suwak w pozycji pochylonej przy ręczniku papierowym, aby spuścić nadmiar płynu. Dodać 20 μl odczynnika DAPI zapobiegającego blaknięciu (fiolka #5 dostarczona przez producenta) i ostrożnie umieścić szklane szkiełko nakrywkowe o wymiarach 24 mm x 60 mm, nie wprowadzając żadnych pęcherzyków powietrza. Uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego lakierem do paznokci i obserwuj za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego wyposażonego w przechwytywanie obrazów SKY.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Całociało irradiation indukuje liczne aberracje chromosomowe w komórkach szpiku kostnego napromieniowanych myszy. Niniejszy protokół został zoptymalizowany pod kątem in vivo zatrzymania mitozy komórek szpiku kostnego po ekspozycji na promieniowanie, pobrania komórek szpiku kostnego z tylnych kończyn napromieniowanych myszy, izolacji mononuklearnych komórek szpiku kostnego za pomocą wirowania w gradiencie gęstości, przygotowania preparatów rozpływowych komórek w metafazie oraz póź...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

O sukcesie mFISH i SKY decyduje kilka kluczowych etapów. Pierwszym i najważniejszym krokiem jest optymalizacja leczenia kolchicyną w celu mitotycznego zatrzymania in vivo komórek jednojądrzastych szpiku kostnego. Stężenie kolchicyny i czas leczenia indywidualnie lub wspólnie określają indeks mitotyczny, a także kondensację chromosomów - dwa ważne warunki skutecznego malowania chromosomów. Wysokie stężenie kolchicyny lub dłuższy czas leczenia prowadzi do wysoce zagęszczonych chromosomów, niekompatybilnych dla pra...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez Arkansas Space Grant Consortium i National Space Biomedical Research Institute przez National Aeronautics and Space Administration, granty NNX15AK32A (RP) i RE03701 (MH-J) oraz P20 GM109005 (MH-J) oraz US Veterans Administration (MH-J). Dziękujemy Christopherowi Fettesowi, koordynatorowi programu na Wydziale Zdrowia Środowiskowego i Zawodowego na Uniwersytecie Nauk Medycznych w Arkansas, za pomoc redakcyjną w przygotowaniu manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
FormamidSigma-Aldrich221198-100ML
Bufor SSC 20 razy; KoncentratSigma-AldrichS6639-1L
SKY Odczynnik laboratoryjny doobrazowania spektralnego stosowanegoFPRPR0030/M40
CAD - Zestaw do wykrywania skoncentrowanych przeciwciałStosowane obrazowanie spektralneFPRPR0033
pojedynczych farb Dostosowane - 3 kolory; Chromosom 1 myszy: czerwony, chromosom 2 myszy: zielony, chromosom 3 myszy: AquaApplied Spectral ImagingFPRPR0182/10
Szkiełka nakrywkoweFisher Scientific12-545B
Tween 20Fisher ScientificBP337-100
Kwas solny, 37%, Acros OrganicsFisher ScientificAC45055-0025 
Witraże szklane Fisherbrand  z zakrętkąFisher Scientific08-816
KaryoMAX roztwór chlorku potasu Life Technologies10575-090
Szkiełka mikroskopowe Fisherbrand Superfrost PlusFisher Scientific12-550-15
Colcemid w proszkuFisher Scientific50-464-757 
Histopaque-1083 Sigma-Aldrich10831
Shepherd Mark I, model 25 137Cs grzejnikJ. L. Shepherd & AssociatesModel 484B
Strzykawka 1 mlBD Biosciences647911
Alkohol etylowy, 200 ProofFisher ScientificMEX02761
PBS, (1x PBS Liq.), bez wapnia i magnezuFisher ScientificICN1860454
Surowica bydlęcaFisher Scientific10-437-010
MetanolFisher ScientificA454SK-4
Lodowaty kwas octowyFisher ScientificAC295320010
Mikroskop Zeiss ZeissAXIO Imager.Z2
na myszy płodu

Bibliografia

  1. Kodama, Y., et al. Stable chromosome aberrations in atomic bomb survivors: results from 25 years of investigation. Radiat Res. 156, 337-346 (2001).
  2. Lucas, J. N. Cytogenetic signature for ionizing radiation. Int J Radiat Biol. 73, 15-20 (1998).
  3. Zaccaria, A., Barbieri, E., Mantovani, W., Tura, S. Chromosome radiation-induced aberrations in patients with Hodgkin's disease. Possible correlation with second malignancy? Boll. Ist. Sieroter. Milan. 57, 76-83 (1978).
  4. Fisher, N. L., Starr, E. D., Greene, T., Hoehn, H. Utility and limitations of chromosome banding in pre- and postnatal service cytogenetics. Am J Med Genet. 5, 285-294 (1980).
  5. Hande, M. P., et al. Complex chromosome aberrations persist in individuals many years after occupational exposure to densely ionizing radiation: an mFISH study. Genes Chromosomes. Cancer. 44, 1-9 (2005).
  6. Gall, J. G., Pardue, M. L. Formation and detection of RNA-DNA hybrid molecules in cytological preparations. Proc Natl Acad Sci U S A. 63, 378-383 (1969).
  7. Bauman, J. G., Wiegant, J., Borst, P., van, D. P. A new method for fluorescence microscopical localization of specific DNA sequences by in situ hybridization of fluorochromelabelled RNA. Exp Cell Res. 128, 485-490 (1980).
  8. Hopman, A. H., et al. Bi-color detection of two target DNAs by non-radioactive in situ hybridization. Histochemistry. 85, 1-4 (1986).
  9. Nederlof, P. M., et al. Three-color fluorescence in situ hybridization for the simultaneous detection of multiple nucleic acid sequences. Cytometry. 10, 20-27 (1989).
  10. Nederlof, P. M., et al. Multiple fluorescence in situ hybridization. Cytometry. 11, 126-131 (1990).
  11. Szeles, A., Joussineau, S., Lewensohn, R., Lagercrantz, S., Larsson, C. Evaluation of spectral karyotyping (SKY) in biodosimetry for the triage situation following gamma irradiation. Int J Radiat Biol. 82, 87-96 (2006).
  12. Camparoto, M. L., Ramalho, A. T., Natarajan, A. T., Curado, M. P., Sakamoto-Hojo, E. T. Translocation analysis by the FISH-painting method for retrospective dose reconstruction in individuals exposed to ionizing radiation 10 years after exposure. Mutat. Res. 530, 1-7 (2003).
  13. Edwards, A. A critique of 'Collaborative exercise on the use of FISH chromosome painting for retrospective biodosimetry of Mayak nuclear-industrial personnel. Int J Radiat Biol. 78, 867-871 (2002).
  14. Bauchinger, M., et al. Collaborative exercise on the use of FISH chromosome painting for retrospective biodosimetry of Mayak nuclear-industrial personnel. Int J Radiat Biol. 77, 259-267 (2001).
  15. Hieber, L., et al. Chromosomal rearrangements in post-Chernobyl papillary thyroid carcinomas: evaluation by spectral karyotyping and automated interphase FISH. J Biomed. Biotechnol. 2011, 693691(2011).
  16. Cohen, N., et al. detection of chromosome rearrangements in two cases of tMDS with a complex karyotype. Cancer Genet Cytogenet. 138, 128-132 (2002).
  17. Pathak, R., et al. The Vitamin E Analog Gamma-Tocotrienol (GT3) Suppresses Radiation-Induced Cytogenetic Damage. Pharm Res. , (2016).
  18. Spurbeck, J. L., Zinsmeister, A. R., Meyer, K. J., Jalal, S. M. Dynamics of chromosome spreading. Am J Med Genet. 61, 387-393 (1996).
  19. Deng, W., Tsao, S. W., Lucas, J. N., Leung, C. S., Cheung, A. L. A new method for improving metaphase chromosome spreading. Cytometry A. 51, 46-51 (2003).
  20. Hande, M. P., et al. Past exposure to densely ionizing radiation leaves a unique permanent signature in the genome. Am J Hum Genet. 72, 1162-1170 (2003).
  21. Tug, E., Kayhan, G., Kan, D., Guntekin, S., Ergun, M. A. The evaluation of long-term effects of ionizing radiation through measurement of current sister chromatid exchange (SCE) rates in radiology technologists, compared with previous SCE values. Mutat. Res. 757, 28-30 (2013).
  22. Kanda, R., et al. Non-fluorescent chromosome painting using the peroxidase/diaminobenzidine (DAB) reaction. Int J Radiat Biol. 73, 529-533 (1998).
  23. Kakazu, N., et al. Development of spectral colour banding in cytogenetic analysis. Lancet. 357, 529-530 (2001).
  24. Rithidech, K. N., Honikel, L., Whorton, E. B. mFISH analysis of chromosomal damage in bone marrow cells collected from CBA/CaJ mice following whole body exposure to heavy ions (56Fe ions). Radiat Environ Biophys. 46, 137-145 (2007).
  25. Abrahams, B. S., et al. Metaphase FISHing of transgenic mice recommended: FISH and SKY define BAC-mediated balanced translocation. Genesis. 36, 134-141 (2003).
  26. Savage, J. R., Simpson, P. On the scoring of FISH-"painted" chromosome-type exchange aberrations. Mutat. Res. 307, 345-353 (1994).
  27. Savage, J. R., Simpson, P. FISH "painting" patterns resulting from complex exchanges. Mutat. Res. 312, 51-60 (1994).
  28. Tucker, J. D., et al. PAINT: a proposed nomenclature for structural aberrations detected by whole chromosome painting. Mutat. Res. 347, 21-24 (1995).
  29. Knehr, S., Zitzelsberger, H., Bauchinger, M. FISH-based analysis of radiation-induced chromosomal aberrations using different nomenclature systems. Int J Radiat Biol. 73, 135-141 (1998).
  30. Lucas, J. N., et al. Rapid translocation frequency analysis in humans decades after exposure to ionizing radiation. Int J Radiat Biol. 62, 53-63 (1992).
  31. Braselmann, H., et al. SKY and FISH analysis of radiation-induced chromosome aberrations: a comparison of whole and partial genome analysis. Mutat. Res. 578, 124-133 (2005).
  32. Sokolova, I. A., et al. The development of a multitarget, multicolor fluorescence in situ hybridization assay for the detection of urothelial carcinoma in urine. J Mol Diagn. 2, 116-123 (2000).
  33. Lindholm, C., et al. Biodosimetry after accidental radiation exposure by conventional chromosome analysis and FISH. Int J Radiat Biol. 70, 647-656 (1996).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

kom rki szpiku kostnegoca kowite napromieniowanie cia apreparaty metafazowemikroskopia fluorescencyjnamalowanie chromosom wanaliza cytogenetycznaradiobiologia
Wykrywanie stabilnych aberracji międzychromosomowych za pomocą wielokrotnej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (mFISH) i kariotypowania spektralnego (SKY) u napromieniowanych myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.