Izolacja komórek nabłonka endometrium i zrębu myszy w celu dencdualizacji in vitro

Podsumowanie

To badanie przedstawia standaryzowaną i zweryfikowaną metodę izolacji i hodowli pierwotnych komórek zrębu i nabłonka endometrium myszy, które mogą być używane w systemie kokultury do badania decydualizacji in vitro.

Streszczenie

Dziesiątkowanie jest zależnym od progesteronu procesem różnicowania komórek zrębu endometrium i jest warunkiem wstępnym udanej implantacji zarodka. Chociaż podjęto wiele wysiłków, aby ujawnić mechanizmy leżące u podstaw decydualizacji, dokładna sygnalizacja między komórkami nabłonka, które mają kontakt z zarodkiem, a leżącymi poniżej komórkami zrębu, pozostaje słabo poznana. Dlatego badanie decydualizacji w sposób, który uwzględnia zarówno komórki nabłonkowe, jak i zrębowe, może poszerzyć naszą wiedzę na temat molekularnych szczegółów decydualizacji. W tym celu najbardziej odpowiednie są fizjologicznie najbardziej odpowiednie modele sztucznego decydualizacji in vivo; Jednak manipulacja komunikacją międzykomórkową jest ograniczona. Obecnie hodowle in vitro komórek zrębu endometrium są wykorzystywane do badania modulacji decydualizacji przez kilka cząsteczek sygnałowych. Konwencjonalnie stosuje się ludzkie lub mysie komórki zrębu endometrium. Jednak dostępność próbek pochodzących od ludzi jest bardzo często ograniczona. Ponadto stosowaniu tkanek mysich towarzyszy różnorodność metod hodowli. W badaniu przedstawiono zwalidowaną i znormalizowaną metodę uzyskiwania czystych kultur komórek nabłonka endometrium (EEC) i komórek zrębu (ESC) przy użyciu dorosłych nienaruszonych myszy leczonych estrogenem przez trzy kolejne dni. Protokół jest zoptymalizowany w celu poprawy wydajności, żywotności i czystości komórek i został dodatkowo rozszerzony w celu zbadania decydualizacji w kokulturze EWG i ESC. Model ten może być odpowiedni do wykorzystania znaczenia obu typów komórek w decydualizacji i oceny udziału istotnych cząsteczek sygnałowych wydzielanych przez EWG lub ESC podczas komunikacji międzykomórkowej.

Wprowadzenie

Ludzka błona śluzowa macicy jest wewnętrzną wyściółką macicy i przechodzi comiesięczne cykle rozpadu i naprawy w ramach przygotowań do ewentualnej ciąży. Składa się z pojedynczej warstwy komórek nabłonkowych wyściełających światło macicy i leżący pod nią zrąb, którego grubość zmienia się w zależności od wahań hormonów jajnikowych, estrogenu i progesteronu. Podczas fazy lutealnej poowulacyjny wzrost progesteronu indukuje różnicowanie komórek zrębu endometrium w większe, okrągłe komórki dziesiętne, proces zwany decydualizacją^1,2. U człowieka zjawisko to występuje spontanicznie w celu wytworzenia predecidua, ale staje się bardziej wyraźne po zagnieżdżeniu się zarodka. Funkcjonalną konsekwencją decydualizacji jest to, że macica przejściowo staje się podatna na zagnieżdżenie się zarodka. Interwał ten jest oznaczony jako "okno implantacji". We wczesnym okresie implantacji zarodka, dziesiętne komórki zrębu endometrium otaczające zagnieżdżający się zarodek będą stanowić barierę zapobiegającą przedostawaniu się szkodliwych substancji do zarodka³. W czasie ciąży decidua ta dostarczy składników odżywczych rozwijającemu się płodowi przed łożyskiem, a później utworzy matczyną część łożyska⁴.

Względy etyczne i praktyczne ograniczają projektowanie badań na ludziach w celu zbadania procesu decydualizacji i skłoniły do użycia modeli zwierzęcych. Będąc członkiem grupy łożyska hemochorialnego, endometrium gryzoni również ulegnie decydualizacji przed łożyskiem⁵. Jednak u gryzoni rozpoczęcie procesu decydualizacji zależy od obecności blastocyst w świetle macicy, co wskazuje, że dodatkowy bodziec jest niezbędny do wywołania reakcji dziesiętnych⁶. Oznacza to skomplikowaną komunikację między komórkami nabłonka endometrium, które mają bezpośredni kontakt z blastocystą, a leżącymi poniżej komórkami zrębu. Niemniej jednak decydualizacja może być sztucznie wywołana za pomocą bodźców, takich jak mechaniczne drapanie lub wkraplanie oleju do hormonalnie zagruntowanej macicy. Chociaż badania in vivo z wykorzystaniem sztucznych modeli decydualizacji pozwoliły nam poprawić nasze spostrzeżenia na temat złożonego procesu sygnalizacji decydualizacji, mechanistyczne badania pogłębione, np. badanie niezbędnej komunikacji między komórkami nabłonkowymi i zrębowymi, są ograniczone. Dlatego badania decydualizacji in vitro mogą być wykorzystywane do manipulowania ważnymi szlakami i badania podstawowych procesów. W tym celu można założyć pierwotne hodowle komórek zrębu endometrium z endometrium ludzkiego lub gryzonia. Zatrudnianie gryzoni wyraża zgodę na wykorzystanie genetycznie zmodyfikowanych zwierząt w celu zbadania roli określonego białka będącego przedmiotem zainteresowania podczas procesu decydualizacji. Jednak niedojrzałe myszy przed okresem dojrzewania są często wykorzystywane w celu uniknięcia powikłań cyklu rujowego, podczas gdy w innych przypadkach macice są pobierane ze wszystkich faz cyklu rujowego, co powoduje niejednorodność kultur. Co więcej, proces decydualizacji był badany w różnych protokołach, np. poprzez (i) suplementację hormonów (estrogenu, progesteronu lub cyklicznego monofosforanu adenozyny (cAMP)) do pożywki hodowlanej lub przez (ii) izolację komórek dziesiętnych od myszy w 4,5 dniu (pseudo)ciąży, co wymaga dodatkowej potrzeby sprawdzenia zatyczki i wazektomii samców. Ograniczenia te wskazują na konieczność stosowania ustandaryzowanej metody badania decydualizacji in vitro. W tym badaniu zostanie przedstawiony model fizjologiczny do badania decydualizacji in vitro, począwszy od dorosłych, nie(pseudo)ciężarnych myszy. W tej metodzie codzienne wstrzykiwanie 17β-estradiolu (E2) indukuje proliferację komórek endometrium, co skutkuje zwiększoną wydajnością jednorodnych i czystych populacji komórek. Ponadto zastosowanie systemu kokulturacji pozwala na badanie przesłuchów nabłonkowo-zrębowych oraz możliwość manipulowania procesem decydualizacji na różnych poziomach.

Protokół

AlexaFluor (Świetl

)

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach w tym badaniu zostały zatwierdzone przez komisję ds. oceny etycznej KU Leuven (Belgia) (Projekt P174/2013). Myszy trzymano w standardowych warunkach, z dostępem ad libitum do granulek pokarmowych i wody z kranu, a następnie trzymano w kontrolowanych warunkach (23 ±1,5 °C, wilgotność względna 40 - 60%, cykl 12/12 jasny/ciemny).

1. Myszy

1. Użyj dostępnego na rynku szczepu myszy (np. C57Bl/6, samica w wieku 8 - 12 tygodni). Zazwyczaj 4-5 myszy daje odpowiednią ilość komórek do dalszych eksperymentów.
2. Nienaruszonym myszom wstrzyknąć podskórnie 100 μl roztworu 17β-estradiolu (E2) (100 ng/100 μl) przez 3 kolejne dni przed izolacją w celu standaryzacji fazy cyklu rujowego zwierząt i wywołania proliferacji komórek endometrium. Konieczność sprawdzenia fazy cyklu myszy przed rozpoczęciem protokołu jest możliwa do uniknięcia dzięki leczeniu 3 d'estradiolem.

2. Przygotowania

1. Przygotować roztwór 100 ng/100 μl E2 w oleju arachis. Do wstrzyknięć pięciu myszy (zgodnie z opisem w ppkt 1.2) potrzebna jest ilość 1,5 ml.
   1. Rozpuścić 1 mg E2 w 1 ml etanolu do uzyskania roztworu podstawowego o stężeniu 1 mg/ml.
   2. Rozcieńczyć ten roztwór podstawowy w stosunku 1:1000 w oleju z arachidy.
2. Przygotuj 500 ml zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBBS) 1x uzupełnionego 100 μg/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny (zwanej dalej HBSS+).
3. Przygotować 500 ml przefiltrowanej pożywki z komórek zrębu endometrium myszy (MESC) do hodowli MESC: Zmodyfikowana mieszanka pożywki Eagle / składników odżywczych F12 firmy Dulbecco (DMEM/F12) z czerwienią fenolową, L-glutaminą i kwasem 4-(2-hydroksyetylo)piperazyno-1-etanosulfonowym, N-(2-hydroksyetylo)piperazyno-N′-(kwasem 2-etanosulfonowym) (HEPES) zawierającym 10% FBS, 0,5 μg/ml amfoterycyny B i 100 μg/ml gentamycyny (zwanej dalej pożywką MESC).
4. Przygotować 500 ml przefiltrowanej pożywki 2% MESC do hodowli MESC podczas decydualizacji: DMEM/F12 z czerwienią fenolową, L-glutaminą i HEPES zawierającymi 2% FBS, 0,5 μg/ml amfoterycyny B i 100 μg/ml gentamycyny.
5. Przygotuj 500 ml przefiltrowanej pożywki z komórek nabłonka endometrium myszy (MEEC): DMEM zawierającej 10% FBS, 0,5 μg/ml amfoterycyny B, 100 μg/ml gentamycyny, 25% pożywki MCDB-105 i 5 μg/ml insuliny (zwanej dalej pożywką MEEC).
6. Przygotuj szkiełka nakrywkowe pokryte poli-L-lizyną (PLL) do hodowli MESC.
   1. Rozpuścić 25 mg PLL w 250 ml wody destylowanej. Przefiltrować roztwór za pomocą filtra 0,22 μm.
   2. Dodać sterylne szkiełka nakrywkowe do płytki 12-dołkowej. Dodać 300 μl rozpuszczonej PLL na szkiełka nakrywkowe.
   3. Usunąć roztwór po 30 minutach inkubacji. Płytki można przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu dalszego użycia (do 1 - 2 miesięcy).
7. Przygotować roztwór podstawowy kolagenazy typu IA o stężeniu 10 mg/ml i przechowywać porcje 300 μl w temperaturze -20 °C. Przefiltrować przed użyciem.

3. Wymagane przygotowania 24 godziny przed izolacją

1. Przygotuj szkiełka nakrywkowe pokryte kolagenem do hodowli MEEC.
   1. Przygotować 0,02 M roztwór kwasu octowego w wodzie destylowanej (1 ml na szkiełko nakrywkowe).
   2. Dodaj 150 μl kolagenu w 12 ml 0,02 M kwasu octowego, aby uzyskać końcowe stężenie 50 μg/ml.
   3. Dodać sterylne szkiełka nakrywkowe do płytki 12-dołkowej.
   4. Dodać 1 ml roztworu kolagenu (patrz 3.1.2).
   5. Inkubować O/N (minimum 12 godzin) w temperaturze 37 °C.
      Podczas izolacji:
   6. Usuń roztwór kolagenu z szkiełek nakrywkowych przez odsysanie i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu w sterylnym środowisku (w komorze laminarnej).
   7. Szkiełka nakrywkowe należy dwukrotnie przepłukać solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).
2. Przygotuj 2,5% roztwór pankreatyny, dodając 0,25 g pankreatyny do 15 ml probówki kanonicznej zawierającej 10 ml HBSS+. Wytrząsać (200 obr./min) roztwór w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę w celu zwiększenia rozpuszczalności. Przechowywać w temperaturze 4 °C.

4. Izolacja i hodowla komórek nabłonka endometrium myszy (MEEC) i komórek zrębu endometrium myszy (MESC)

1. Dodać 25 mg trypsyny do 15 ml probówki zawierającej 2,5% roztwór pankreatyny (patrz 3.2), aby otrzymać końcowy roztwór zawierający 0,25% trypsyny (dalej określany jako mieszanka wytrawiająca MESC).
2. Izolacja macicy
   1. Sprawdź fazę cyklu zwierząt za pomocą badania wymazu z pochwy.
      1. Skrępuj zwierzę i delikatnie przepłucz pochwę 50 μl PBS 3 - 5 razy.
      2. Zbierz ostatnie spłukiwanie na szkiełku szkiełkowym.
      3. Zbadaj materiał pod mikroskopem jasnego pola za pomocą obiektywu 10X lub 20X.
      4. Używaj tylko myszy, które są w fazie rui. Ten etap charakteryzuje się obecnością zrogowaciałych komórek nabłonka w płukaniu pochwy (ryc. 1).
   2. Poddać zwierzęta eutanazji przy użyciu odpowiedniej metody, takiej jak zwichnięcie szyjki macicy lub narkoza wywołana przez CO₂ .
   3. Spryskaj tusze 70% etanolem, aby wytworzyć sterylne środowisko.
   4. Za pomocą sterylnych narzędzi chirurgicznych otwórz brzuch i odepchnij jelita na bok, aby uwidocznić oba rogi macicy.
   5. Chwyć róg macicy na najbardziej dystalnym końcu pod jajowodem. Wypreparuj rogi macicy z jajowodu i usuń tkankę tłuszczową i łączną. Wytnij róg na dystalnym końcu nad trzonem macicy i umieść go na szalce Petriego o średnicy 35 mm z 3 ml HBSS+.
      1. Powtarzaj ten krok dla drugiego rogu i dla innych zwierząt, aż wszystkie rogi macicy zostaną zebrane.
   6. Oczyść róg macicy (w HBSS+) dalej pod stereoskopem i usuń całą resztki tkanki tłuszczowej lub łącznej.
   7. Rozetnij rogi macicy wzdłużnie, aby odsłonić światło macicy i zastąp róg na nowej szalce Petriego świeżym HBSS+.
   8. Przenieś wszystkie rogi macicy do probówki o pojemności 15 ml zawierającej pankreatynę i trypsynę.
   9. Inkubować poziomo przez 60 minut w temperaturze 4 °C na wytrząsarce orbitalnej (50 obr./min).
   10. Inkubować poziomo przez 45 minut w temperaturze 23 °C (RT), bez wstrząsania.
   11. Inkubować poziomo przez 15 minut w temperaturze 37 °C (łaźnia wodna), bez wstrząsania.
   12. W międzyczasie przygotuj mieszankę wytrawiającą MESC, rozpuszczając 300 μl 1 mg/ml kolagenazy w 2,7 ml 0,05% roztworu kwasu trypsyno-etylenodiaminotetraoctowego (EDTA).
       UWAGA: Od teraz kolejne etapy izolacji wykonywane są w sterylnym środowisku pod komorą z przepływem laminarnym.
3. Hodowla komórek nabłonka endometrium myszy (MEEC)
   1. Po 2 godzinach inkubacji ostrożnie wylać roztwór sklarowanego osadu.
   2. Przenieść macicę na szalkę Petriego zawierającą zimną pożywkę MEEC i inkubować przez 5 minut w celu dezaktywacji aktywności trypsyny.
   3. Przenieś macicę do probówki o pojemności 15 ml zawierającej 3 ml zimnego HBSS+.
   4. Wiruj przez 10 sekund, aby uwolnić arkusze nabłonka.
   5. Opłucz macicę na czystej szalce Petriego za pomocą 3 ml HBSS+.
   6. Powtórzyć czynności 4.3.2-4.3.4, aby uzyskać w sumie trzy zawiesiny zawierające arkusze nabłonka.
   7. Przenieść macicę do mieszanki wytrawiającej MESC i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C, wstrząsając (200 obr./min) (przejść do kroku 4.4 w celu dalszej izolacji MESC).
   8. Odzyskaj arkusze nabłonka, delikatnie pipetując zawiesiny trzech komórek na siatkę nylonową o grubości 100 μm w celu usunięcia resztek tkanki.
   9. Odwirować zebraną zawiesinę komórkową o stężeniu 500 x g przez 5 minut.
   10. Zawiesić osad w 12 ml pożywki MEEC i dobrze wymieszać.
   11. Osadzać roztwór na 5 minut w celu oddzielenia pozostałego MESC za pomocą sedymentacji grawitacyjnej.
   12. Ostrożnie wyjmij górne 2 ml za pomocą pipety 5 ml.
   13. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 500 x g przez 5 min.
   14. Zawiesić w podłożu MEEC, delikatnie pipetując w górę i w dół.
   15. Umieść komórki na szkiełkach nakrywkowych pokrytych kolagenem w pożądanej gęstości do dalszych eksperymentów (ryc. 2a).
   16. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO₂ przez minimum 12 h.
       UWAGA: W przypadku barwienia immunologicznego lub eksperymentów funkcjonalnych, takich jak fluorescencyjne obrazowanie wapnia, zaleca się płytkie komórki bezpośrednio na szkiełkach nakrywkowych, podczas gdy wysiewanie na płytce 6-dołkowej jest zalecane, gdy pożądana jest izolacja RNA lub białka. Izolacja komórek zrębu endometrium myszy dzieli się na dwie rundy, ponieważ czystość komórek po zaledwie jednym trawieniu może być niewystarczająca. Macica jest trawiona dwukrotnie w celu optymalnej regeneracji i czystości komórek. W obu rundach interwencje techniczne są identyczne. Komórki pobrane z obu rund mogą być zachowane do dalszych eksperymentów, zgodnie z życzeniem badacza.
4. Hodowla komórek zrębu endometrium myszy (MESC): 1. runda
   1. Przed rozpoczęciem pierwszej rundy wytrawiania przygotuj drugą mieszankę wytrawiającą, rozpuszczając 300 μl 1 mg/ml kolagenazy w 2,7 ml 0,05% roztworu trypsyny-EDTA. Ta mieszanka jest potrzebna w kroku 4.4.8.
   2. Przygotować trzy małe szalki Petriego z zimnym (4 °C) HBSS+ i 3 probówkami po 15 ml z 3 ml pożywki MESC (probówka X1, X2 i X3).
   3. Po 30 minutach inkubacji delikatnie potrząsaj roztworem trypsyny zawierającym macicę przez 10 sekund. Komórki MESC oderwą się od tkanki macicy i pozostaną w roztworze trypsyny.
   4. Przenieść macicę na pierwszą szalkę Petriego zawierającą 3 ml zimnego (4°C) HBSS+ i dobrze spłukać.
   5. Dodać 3 ml pożywki MESC do probówki pierwotnie zawierającej rogi macicy (probówka w kroku 4.4.3) w celu zahamowania aktywności trypsyny.
   6. Przenieść macicę z szalki Petriego z zimnym (4 °C) HBSS+ do probówki X1 zawierającej 3 ml pożywki MESC i delikatnie wstrząsać przez 10 s.
   7. Powtórzyć kroki 4.4.4 (przenieść na płytkę Petriego z zimnym (4 °C) HBSS+) i 4.4.6 (przenieść do probówki X2 i X3) dwa razy.
      UWAGA: Ostatecznie w wyniku tego protokołu zostaną otrzymane 4 zawiesiny komórek: jedna probówka zawierająca roztwór trypsyny i 3 probówki z podłożem MESC zawierającym MESC (probówki X1, X2 i X3).
   8. Przenieść macicę do nowego MESC wytrawiania, jak opisano w kroku 4.4.1 i inkubować pionowo przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
   9. Zebrać komórki zrębu, przepuszczając zawiesiny czterech komórek przez siatkę nylonową o grubości 40 μm. Opłucz siatkę dodatkowymi 5 ml MESC.
   10. Odwirować zawiesinę komórek przy 500 x g przez 7 minut.
   11. Ponownie zawiesić osad w MESC i płytkę na szkiełkach nakrywkowych pokrytych PLL w celu przeprowadzenia dalszych eksperymentów z pożądaną gęstością.
   12. Inkubować przez co najmniej 4–6 godzin lub O/N w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO_{2 .}
5. Hodowla komórek zrębu endometrium myszy (MESC): 2. runda
   1. Przygotować trzy małe szalki Petriego z zimnym (4 °C) HBSS+ i 3 probówkami po 15 ml z 3 ml pożywki MESC (probówki Y1, Y2 i Y3).
   2. Powtórz kroki 4.4.3 - 4.4.7.
   3. Przenieś ostatnią zawiesinę komórek wraz z macicą do siatki nylonowej o grubości 40 μm.
   4. Zebrać komórki zrębu, przepuszczając zawartość rurki Y1, Y2 i Y3 przez nylonową siatkę. Opłucz siatkę dodatkowymi 5 ml MESC.
   5. Odwirować zawiesinę komórek przy 500 x g przez 7 minut.
   6. Ponownie zawiesić osad w podłożu MESC i płytkę na szkiełkach nakrywkowych pokrytych PLL w celu przeprowadzenia dalszych eksperymentów (rysunek 2b).
   7. Inkubować przez co najmniej 4 - 6 godzin w temperaturze 37 °C z 5% CO₂,
      UWAGA: W przypadku barwienia immunologicznego lub eksperymentów funkcjonalnych, takich jak fluorescencyjne obrazowanie wapnia, zaleca się umieszczanie komórek na szkiełkach nakrywkowych, podczas gdy wysiewanie na płytce 6-dołkowej jest zalecane, gdy pożądana jest izolacja RNA lub białka.

5. Podwójne barwienie wimentyny/cytokeratyny do walidacji czystych kultur MEEC i MESC

1. Wysiewaj komórki na szkiełkach nakrywkowych.
2. Myć 3 x 5 min PBS zawierającym wapń i magnez na wytrząsarce orbitalnej (50 obr./min).
3. Utrwal komórki 4% paraformaldehydem (PFA) (UWAGA!) przez 10 minut, nie na shakerze.
4. Umyć 3x PBS bez wapnia i magnezu na shakerze (50 obr./min).
5. Przepuszczaj ogniwa 0,2% Triton X-100 przez 10 minut na wytrząsarce (50 obr./min).
6. Umyć 3x PBS na shakerze.
7. Blok z 5% kozim surowicą (GS) w PBS przez 2 godziny na wytrząsarce (50 obr./min)
8. Inkubować komórki monoklonalną króliczą anty-ludzką wimentyną (1:500) i monoklonalną mysią anty-ludzką pancytokeratyną (1:1,000) w temperaturze 4 °C na wytrząsarce (50 obr./min). Przeciwciała rozcieńcza się w PBS z 0,5% GS.
9. Umyć 3x PBS na wytrząsarce (50 obr./min).
10. Inkubuj komórki z przeciwciałami drugorzędowymi (1:1,000 w 0,5% GS), anty-króliczymi IgG sprzężonymi z Alexa Fluor 488 i anty-mysimi IgG skoniugowanymi z Alexa Fluor 488 na shakerze.
11. Umyć 3x PBS na shakerze.
12. Zamontuj szkiełka z wodnym medium montażowym zawierającym DAPI i suche O/N.
13. Uszczelnij szkiełka lakierem do paznokci i trzymaj w temperaturze 4 °C do dalszego użycia (Rysunek 2a, b).

6. Dziesiątkowanie in vitro w systemie kokultury

UWAGA: Do stworzenia systemu kokultury na 24-dołkowej płytce potrzeba czterech do pięciu zwierząt. Kontynuuj zgodnie z poniższym protokołem w sterylnym środowisku, najlepiej w komorze z przepływem laminarnym.

1. Przygotować wkładki do hodowli komórkowych podczas etapów wirowania i/lub inkubacji izolacji komórek nabłonka (jak opisano w ppkt 4.3) na dodatkowej płytce 24-dołkowej.
   1. Dodaj 200 - 400 μl pożywki MESC do żądanej ilości dołków w płytce 24-dołkowej.
   2. Umieść wkładki w wstępnie napełnionych 24 dołkach za pomocą sterylnych kleszczy.
2. Zawiesić granulat MEEC (krok 4.3.14) w podłożu MEEC i podzielić na wkładki (objętość robocza: 150 - 300 μl na wkładkę). Hodować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO_{2 .}
3. Wysiewaj komórki zrębu na innej 24-dołkowej płytce (kompatybilnej z wkładkami do hodowli komórkowych) po drugiej rundzie izolacji komórek zrębu (krok 4.5.6). Użyć objętości roboczej 400 μl zawiesiny komórek na studzienkę.
4. Pozostawić komórki zrębu na przyczepienie się przez co najmniej 4–6 godzin w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5%_CO2.
5. Przenieś wkładki do hodowli komórkowych pokryte komórkami nabłonkowymi z pierwszej 24-dołkowej płytki na drugą 24-dołkową płytkę pokrytą komórkami zrębu. Używaj wysterylizowanych kleszczy lub dotykaj wkładek tylko przy ich zwisającej stopie.
6. Hodować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO₂ przez okres 3–5 dni, aż komórki nabłonka utworzą monowarstwę, a komórki zrębu osiągną zbieżność 80–90%. Dodatkowo użyj transepitelialnego oporu elektrycznego (TEER) do monitorowania monowarstwy nabłonka za pomocą miernika nabłonka Volt/Ohm, jak opisano przez Granta i wsp.⁷. Wartości 800-1,000/studnię były wystarczające, aby uznać zlewanie się monowarstwy nabłonka.
7. W razie potrzeby należy wymieniać pożywkę co 2 - 3 dni za pomocą szklanych pipet lub cienkich końcówek do pipet. Zacznij od wymiany pożywki komórek zrębu (wysianych na dole), zanim wymienisz pożywkę we wkładkach. Zaleca się stosowanie podgrzanej pożywki do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C.
8. Przed rozpoczęciem eksperymentu należy przygotować pożywkę do dziesiątkowania w celu wywołania dziesiątkowania in vitro. Użyj objętości roboczej 400 μl na studzienkę komórek zrębu.
   1. Przygotować następujące roztwory podstawowe i przechowywać podwielokrotności w temperaturze -20 °C.
      1. Przygotować 250 μM 17-octanu medroksyprogesteronu (MPA) w etanolu.
      2. Przygotować 100 mM roztwór podstawowy 8′,5′′-cAMP 8-bromoadenozyny w ultraczystej wodzie.
   2. Sporządzić pożywkę dziesiętną zawierającą 1 μM MPA i 0,5 mM cAMP w pożywce MESC zawierającej 2% FBS.
9. Delikatnie usuń pożywkę z dołków i dodaj pożywkę dziesiętną na komórki zrębu. Jeśli wymagany jest warunek kontrolny, należy użyć pożywki MESC zawierającej 2% FBS.
10. Usunąć pożywkę z wkładek do hodowli komórkowych i dodać 300 μl pożywki MEEC na komórki.
11. Inkubować komórki przez 5 dni w inkubatorze w temperaturze 37 °C w 5% CO₂ .
12. Po piątym dniu oceń stopień decydualizacji w komórkach zrębu za pomocą RT-qPCR (patrz poniżej).
13. Zweryfikuj żywotność komórek nabłonka za pomocą odczynnika żywotności na bazie resazuryny.
    1. Przygotować roztwór odczynnika żywotności w stosunku 1:10 w pożywce MEEC.
    2. Przenieś wkładki z kultur komórkowych do nowej 24-dołkowej płytki.
    3. Dodać 150 - 300 μl odczynnika żywotności - roztworu MEEC na komórki.
    4. Inkubować w temperaturze 37 °C w 5% CO₂ przez co najmniej 4 - 5 godzin lub przez noc i ocenić żywotność komórek, obserwując zmianę koloru (od niebieskiego do fioletowego/różowego).
       UWAGA: Dziesiętność można również ocenić za pomocą testu ELISA specyficznego dla prolaktyny u myszy, zgodnie z preferencjami badacza.

7.Walidacja decydualizacji za pomocą qRT-PCR

UWAGA: Dla walidacji decydualizacji za pomocą qRT-PCR, zaleca się wykonanie wszystkich warunków testowych w dwóch egzemplarzach, aby otrzymać wystarczającą ilość komórek do analizy RNA.
Ilościowy RT-PCR przeprowadza się zgodnie z wcześniejszym opisem w De Clercq i wsp.⁸.
W skrócie:

1. Wyizoluj całkowite RNA za pomocą komercyjnego zestawu do izolacji RNA.
   1. Oceń ilość i jakość RNA przy użyciu metod komercyjnych zgodnie z protokołem producenta.
2. Syntetyzuj cDNA, zgodnie z protokołem producenta, zaczynając od 1 μg całkowitego RNA.
3. Do przeprowadzenia reakcji qRT-PCR należy użyć zestawu komercyjnego zgodnego z protokołem producenta.
   1. Uruchom wszystkie próbki w trzech egzemplarzach.
   2. Do przeprowadzenia reakcji należy użyć komercyjnego TaqMan Master Mix i specyficznych sond TaqMan dla pożądanych genów porządkowych i prolaktyny (prl8a2).

Wyniki

Ogólny przegląd protokołu

Rycina 1A przedstawia ogólny schemat protokołu. W celu synchronizacji zwierząt i standaryzacji fazy cyklu rujowego zastosowano codzienne iniekcje E2 (100 ng) przez trzy kolejne dni. Faza cyklu rujowego może być oceniana na podstawie płukania pochwy i jest podzielona na fazy: proestrus, estrus, diestrus oraz metestrus. Fazę cyklu można określić na podstawie stosunku złuszczonych komórek w płuczydle, które ulegają zmianom hormonalnym. Wzrost poziomu estrogenów prowadzi do przejścia zwierząt w fazę estrusu. Fazę tę można łatwo zidentyfikować po obecności wyłącznie zrogowaciałych komórek nabłonkowych i braku leukocytów (Rycina 1B). W dniu 4. pobierane są macice zwierząt znajdujących się w fazie estrusu, a następnie izolowane są MEEC i MESC (Rycina 1C). Decidualizację można indukować poprzez dodanie 0,5 mM cAMP oraz 1 µM MPA do pożywki z 2% FBS podczas 5-dniowego okresu inkubacji.

Kontrola jakości hodowli MEEC i MESC

Czystość pierwotnych kultur komórkowych można ocenić na podstawie różnic w ekspresji wimentyny i cytokeratyny. Wimentyna jest filamentem pośrednim eksprymowanym w komórkach mezenchymalnych, a tym samym w komórkach podścieliska endometrium. Cytokeratyna to filament pośredni występujący w cytoreszkielecie tkanki nabłonkowej. Rycina 2A przedstawia poziom ekspresji mRNA wimentyny i cytokeratyny w MEEC i MESC oceniony za pomocą qRT-PCR. Poziomy wimentyny są wysokie w MESC i niskie w MEEC (2,2x wyższe, p < 0,001), natomiast poziomy cytokeratyny są wysokie w MEEC i niskie w MESC (36x wyższe, p < 0,001). Wykonano podwójne barwienie na wimentynę i cytokeratynę, które wykazało, że komórki podścieliska wykazują ekspresję wimentyny, podczas gdy komórki nabłonkowe wykazują ekspresję cytokeratyny (Rycina 2B, C). Jako kontrolę negatywną dla immunobarwienia zastosowano brak przeciwciała pierwszorzędowego (Rycina 2D, E). Te barwienia immunohistochemiczne wykazują, że obie kultury komórek endometrium (MEEC i MESC) charakteryzują się czystością do 90%.

Decidualizacja w kokulturach MEEC/MESC

Po izolacji komórki nabłonka i podścieliska endometrium myszy wysiano w systemie kokultury, aby odtworzyć środowisko błony śluzowej macicy. Komórki hodowano do momentu, aż komórki nabłonka utworzyły monowarstwę w insertach do hodowli komórkowych (wartości TEER wynoszące 800 - 1,000/studnię), a komórki podścieliska osiągnęły stan subkonfluencji. Decidualizację komórek podścieliska indukowano poprzez zastosowanie 0,5 mM cAMP oraz 1 µM MPA. Po pięciu dniach inkubacji poziom mRNA prolaktyny w komórkach podścieliska oceniono za pomocą qRT-PCR jako wskaźnik decidualizacji (Rycina 3A). Poziomy prolaktyny były wysoce wyrażone w komórkach poddanych działaniu hormonów i niewykrywalne w komórkach inkubowanych w medium kontrolnym (p < 0,01).

Ponieważ komórki nabłonkowe są trudne do wizualizacji wewnątrz insertów do hodowli komórkowych, bezpośrednio po pięciodniowym okresie inkubacji przeprowadzono test żywotności (Rysunek 3B). Do dołków dodano mieszaninę standardowej pożywki wzrostowej oraz odczynnika do oceny żywotności i inkubowano przez co najmniej 8 – 12 h. Zmiana koloru z niebieskiego na jasnoróżowy wskazywała na obecność żywych komórek nabłonkowych. Należy pamiętać, że zmiana koloru nastąpi tylko w przypadku obecności żywych komórek.

Rycina 1: Ogólny przegląd protokołu. (A) Schemat protokołu izolacji rozpoczynającego się od trzech kolejnych dni iniekcji estrogenu. W dniu 3. należy przygotować niezbędne odczynniki. W dniu 4. ocenia się fazę rui (oznaczoną gwiazdką) poprzez wykonanie płukania pochwy. MEEC i MESC są izolowane przy użyciu różnych etapów trawienia. W dniu 6. lub po osiągnięciu konfluencji komórek, w systemie kokultury można indukować decydualizację poprzez dodanie cAMP i MPA do medium oraz inkubację przez pięć dni (dni 6–11). (B) Reprezentatywne zdjęcie fazy rui charakteryzującej się obecnością zrogowaciałych komórek nabłonka w płukaniu pochwy (powiększenie 10X). (C) Reprezentatywne zdjęcie MESC i MEEC (powiększenie 20X, pasek skali: 100 µm). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Rycina 2: Immunobarwienie oraz ilościowy RT-PCR dla vimentyny i cytokeratyny w komórkach MEEC i MESC. (A) Poziomy mRNA ekspresji vimentyny i cytokeratyny wskazujące na czystość kultur. Poziomy RNA określono ilościowo w stosunku do średniej geometrycznej genów pomocniczych ACTB i TBP. Dane przedstawiono jako średnia ± SEM. Podwójne barwienie na vimentynę/cytokeratynę w kulturach MESC (B) oraz kulturach MEEC (C). Wstawka po lewej stronie przedstawia widok przy powiększeniu 63X. Kontrola negatywna z pominięciem przeciwciała pierwszorzędowego dla MESC (D) i MEEC (E) (Pasek skali: 50 µm). ***: p <0.001 przy zastosowaniu dwukierunkowej analizy wariancji (Two-way ANOVA) z korekcją Bonferroniego dla wielokrotnych porównań. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 3: Walidacja decidualizacji za pomocą RT-PCR. (Apoziomy mRNA ekspresji prolaktyny w komórkach zrębu w celu oceny decidualizacji. Poziomy RNA poddano relatywnej kwantyfikacji względem średniej geometrycznej genów gospodarskich PGK1 i TBP. zmiana krotności w komórkach hodowlanych w podłożu kontrolnym lub decidualnym przedstawiono jako średnią ±SEM (skaningowa mikroskopia elektronowa).BZdjęcia ilustracyjne komórek zrębu przed (góra) i po (dół) stymulacji do decydualizacji. Wstawka po prawej przedstawia powiększenie zdecydualizowanej komórki zrębu. Decydualizacja charakteryzuje się obecnością komórek wielojądrowych, wskazanych czarnymi strzałkami.C) Reprezentatywne obrazy oceny żywotności komórek nabłonkowych w insercie po zakończeniu testu. Zdjęcia wykonano bezpośrednio po podaniu odczynnika do oceny żywotności (Prestoblue) (0 h) oraz następnego dnia rano (ON). **: p <0,01 przy użyciu testu U Manna-Whitneya. ON: przez noc. Pasek skali: 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Dyskusja

Decydualizacja to zależne od progesteronu różnicowanie komórek zrębu endometrium w okrągłe wydzielające komórki dziesiętne. U człowieka proces ten zachodzi spontanicznie podczas fazy lutealnej cyklu miesiączkowego i jest inicjowany w komórkach zrębu otaczających komórki naczyniowe, tworząc predecidua. Jednak u gryzoni obecność blastocysty jest niezbędna do wywołania decydualizacji. Fakt, że decydualizacja następuje dopiero po kontakcie z komórkami nabłonka endometrium, oznacza, że ważne czynniki są wydzielane przez komórki nabłonkowe w celu wywołania decydualizacji w leżącym poniżej zrębie. Chociaż należy uznać tę różnicę w inicjacji procesu decydualizacji, fakt, że decydualizacja człowieka staje się bardziej silna po zagnieżdżeniu się zarodka, sugeruje, że w grę mogą wchodzić podobne mechanizmy. Hodowle komórkowe in vitro są często wykorzystywane do badania wpływu określonych cząsteczek podczas procesu decydualizacji. Niemniej jednak dostępność i ilość tkanek ludzkich, które można pobrać, jest często ograniczona i towarzyszą jej różnice, np. faza cyklu, liczba ciąż i obecność chorób ginekologicznych, takich jak endometrioza lub adenomioza. Wielu z tych problemów można zapobiec, stosując mysią tkankę, która jest łatwo dostępna i niezależna od fazy cyklu. Kolejną mocną zaletą wykorzystania tkanki mysiej jest możliwość wykorzystania genetycznie modyfikowanych gryzoni oraz możliwość przeprowadzenia dużej liczby eksperymentów. Obecnie w literaturze opisano wiele różnych protokołów izolacji, które charakteryzują się dużą zmiennością w wieku zwierząt i okresie w fazie rui w momencie użytkowania.

Badanie to przedstawia nową metodę pierwotnych kohodowli komórek zrębu i nabłonka endometrium, w której wykorzystano standaryzowany cykl rujowy poprzez codzienne wstrzykiwanie estrogenu przed izolacją. Ponadto wiadomo, że estrogen indukuje proliferację w komórkach nabłonka i zrębu, co dodatkowo zwiększa wydajność izolacji. Protokół izolacji opisany w tym artykule został oparty na Grant i wsp.⁷ Uwzględniono jednak dalsze kroki optymalizacyjne w celu zwiększenia wydajności, czystości i żywotności różnych kultur komórkowych. Po pierwsze, HBSS był zawsze uzupełniany antybiotykami, aby uniknąć zanieczyszczenia pierwotnej hodowli. Podczas izolacji MEEC dokonano adaptacji temperatury (15 minut w temperaturze 37 °C) w celu zwiększenia poboru komórek nabłonka podczas pierwszego trawienia. Następnie uwzględniono dodatkowy etap w celu ograniczenia aktywności enzymatycznej po trawieniu trypsyną poprzez dodanie pożywki zawierającej FBS w celu zahamowania jego aktywności. Ponadto MEEC przepuszczono przez filtr, którego oczka była większa niż powszechnie określa się (100 μm), ponieważ często występują one w skupiskach i arkuszach komórek. Co więcej, zanieczyszczenie komórkami zrębu zostało zmniejszone poprzez wykonanie dodatkowego etapu, w którym MEEC i MESC zostały rozdzielone na podstawie sedymentacji grawitacyjnej. Wreszcie, MEEC wysiewano na szkiełkach nakrywkowych pokrytych kolagenem, aby zwiększyć przyczepność komórek do szklanych szkiełek nakrywkowych, ponieważ stało się jasne, że mocowanie do szkiełek nakrywkowych bez powłoki lub powlekanych PLL było niewystarczające. Podczas izolacji MESC kolagenaza (1 mg/ml) była suplementowana w celu poprawy trawienia. Co więcej, ten etap mineralizacji został przeprowadzony w dwóch powtórzeniach, aby uniknąć zanieczyszczenia pozostałych MEEC. Wszystkie te dodatkowe etapy zaowocowały czystymi i żywotnymi hodowlami jednorodnych populacji komórek.

Czystość populacji komórek oceniano za pomocą barwienia immunologicznego i qRT-PCR przy użyciu wimentyny jako markera zrębu i cytokeratyny jako markera nabłonkowego. Wyraźnie zaobserwowano przeciwny wzorzec ekspresji wimentyny i cytokeratyny w MEEC i MESC. Można jednak zauważyć, że względna ekspresja mRNA wimentyny i cytokeratyny jest podobna w kulturach MEEC. Podobne wyniki publikują inne grupy badawcze, w których komórki nabłonkowe w hodowli nabywają ekspresję wimentyny⁹. Ważniejsza jest różnica w ekspresji białek między wimentyną a cytokeratyną, którą zaobserwowano w barwieniach immunohistologicznych różnych populacji komórek. Podwójne barwienie immunologiczne wykazało, że EEC były dodatnie dla cytokeratyny, a ESC były dodatnie dla wimentyny. Zastosowanie tych markerów w barwieniu immunologicznym jest uznaną metodą i standardowo stosowaną do oznaczania typów komórek¹⁰.

Chociaż przeprowadzono wiele badań nad decydualizacją MESC, możliwe jest, że obecność komórek nabłonkowych w tym modelu może zmienić wyniki decydualizacji. Po pierwsze, wykazano, że jeśli MEEC wyrośnie do monowarstwy w obecności pożywki kondycjonowanej przez MESC lub w warunkach jednoczesnej hodowli, monowarstwa ma zwiększoną oporność elektryczną przeznabłonkową komórek nabłonka (TEER), wynikającą z czynników wydzielanych przez MESC⁷. Co więcej, Pierro i wsp.¹¹ dostarczyło dowodów na to, że proliferacja nabłonka, na którą wpływa 17β-estradiol, może być pośredniczona przez czynniki wydzielane z komórek zrębu, a alternatywnie, komórki nabłonkowe mogą uwalniać czynniki modulujące decydualizację zrębu^12,13. Ogólnie rzecz biorąc, oczywiste jest, że środowisko kokultury nabłonkowo-zrębowej zapewnia bardziej fizjologiczną sytuację, która pozwala na interakcję i komunikację parakrynną. Metoda hodowli dwóch różnych typów komórek przy użyciu systemu kohodowli inkubacyjnej została opisana wcześniej^14,15 i została dostosowana do stosowania mysich komórek pierwotnych. Dzięki wykrywaniu poziomów mRNA prolaktyny jako odczytu dla decydualizacji, opisana technika ma bardzo powtarzalny odczyt dla decydualizacji i pozwala tym samym na badanie relacji nabłonkowo-zrębowej podczas decydualizacji. Sygnały parakrynne, w których pośredniczy MEEC, mogą zmieniać zakres decydualizacji w komórkach zrębu. Co więcej, model pozwala na specyficzną modulację strony nabłonkowej bez bezpośredniego wpływu na komórki zrębu. Dlatego ta kokultura MEEC i MESC oferuje doskonałe narzędzie do oceny wpływu hormonów, cytokin itp. na komórki nabłonkowe z odczytem decydualizacji zrębu. Kolejną zaletą tego systemu kohodowli jest to, że pozwala on naukowcom badać udział określonego białka w procesie decydualizacji w przedziale nabłonkowym lub zrębowym przy użyciu komórek wyizolowanych od zwierząt transgenicznych. Ponadto technika ta będzie bardzo pomocna w badaniu adhezji blastocyst w celu oceny, czy czynniki parakrynne wydzielane przez komórki nabłonkowe w obecności blastocysty są wystarczające do wywołania decydualizacji leżących poniżej komórek zrębu. Ważny etap inwazji trofoblastów korelował z degradacją macierzy zewnątrzkomórkowej, w której pośredniczy działanie enzymów proteolitycznych. Zaproponowana technika może być zastosowana jako model in vitro do badania wzajemnych oddziaływań między blastocystą, komórkami nabłonkowymi i podścieliskiem.

Jednak w tej chwili niewiele wiadomo o pochodzeniu komórek nabłonkowych, które mogą być zarówno luminalne, jak i gruczołowe. Dlatego konieczna jest dalsza charakterystyka profilu genetycznego i molekularnego komórek nabłonkowych. Ponadto opisana metoda jest ograniczona dostępną wiedzą na temat polaryzacji komórek nabłonka. W tej chwili nie brano pod uwagę polaryzacji komórek nabłonkowych. Jednak różnice w ekspresji białek błonowych są opisane w błonach wierzchołkowych i podstawnych. Niewłaściwa polaryzacja warstwy nabłonkowej może mieć wpływ na oddziaływanie parakrynne między komórkami nabłonkowymi i zrębowymi. Opisano jednak metody otrzymywania spolaryzowanych komórek nabłonkowych i można je włączyć do opisanej techniki^15,16.

Podsumowując, w opisanym protokole zaproponowano technikę skutecznego ustanowienia pierwotnych kultur komórkowych komórek nabłonka endometrium i zrębu myszy. W wyniku tej techniki uzyskuje się czyste hodowle komórkowe, co potwierdza qRT-PCR oraz barwienie immunologiczne wimentyny i cytokeratyny. Ostatecznie wprowadzono kokulturę nabłonkową i zrębową, która pozwala na badanie sygnałów parakrynnych, w których pośredniczy MEEC i/lub MESC w procesie decydualizacji.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
ThinCert Wkładka do hodowli tkankowych na płytki 24-dołkowe; 1 &mikro; m wielkość porów; przezroczyste	wkładki Greiner Bio-one	662610	są również dostępne dla innych płytek wielodołkowych i/lub innych rozmiarów porów. Inni dostawcy: Merck Millipore. https://shop.gbo.com/en/row/articles/catalogue/article/ 0110_0110_0090_0030/13408/
Hodowla Nunc Cell traktowana 24-dołkowe płytki	Thermo Scientific	142475	http://www.thermofisher.com/order/catalog/product/142475
8-bromoadenozyna 3&,,5′-cykliczna sól sodowa monofosforanu	Sigma	Aldrich B7880	Przygotować roztwór podstawowy 100 mM w wodzie Milli Q. Przechowywać porcje w temperaturze -20 °C. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/b7880?lang=en®ion=BE
17-octan medroksyprogesteronu	Sigma Aldrich	M1629	Przygotować roztwór podstawowy 250 &mikro; M w etanolu. Przechowywać porcje w temperaturze -20 °C. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m1629?lang=en®ion=BE
Olej arachis	Supermarket		Standardowy olej arachis do gotowania, który można znaleźć w każdym supermarkecie, jest używany
Odczynnik żywotności komórek PrestoBlue	Thermo Scientific	A13261	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A13261?ICID=cvc-prestoblue-c1t1
HBSS 1x, bez wapnia, bez magnezu, bez czerwieni fenolowej	Gibco	14175-046	Przechowywać w lodówce tak długo, jak to możliwe. Używaj zimnego HBSS+ podczas protokołu. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14175046
17-β Estradiol	Sigma Aldrich	E8875	Przygotować roztwór podstawowy 1 mg/ml w EtOH przed rozcieńczeniem w oleju arachis (1:1,000). http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/e8875?lang=en& region=BE
Filtr pożywki komórkowej Stericup, 0.22 µ m, polieterosulfon, 500 mL, sterylizowany radioaktywnie	Merck Millipore	SCGPU05RE	http://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Stericup-GP%2C-0.22%C2%A0%C2%B5m%2C-polyethersulfone%2C-500%C2%A0mL%2C-radio-sterilized,MM_NF-SCGPU05RE
Penicylina-Streptomycyna (5,000 U/mL)	Gibco	15070-063	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15070063?ICID=search-15070-063
DMEM/F12, czerwień fenolowa, L-glutamina, HEPES	Gibco	11330-032	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11330057?ICID=search-11330-057
Płodowa surowica bydlęca, kwalifikowana, inaktywowana termicznie, zatwierdzona przez UE, pochodzenie z Ameryki Południowej	Gibco	10500-056	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10500064?ICID=search-10500-064
Amfoterycyna B	Gibco	15290-018	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15290018?ICID=search-15290-018
Gentamycyna (50 mg/ml)	Gibco	15750-037	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15750037?ICID=search-15750-037
DMEM, niska glukoza, pirogronian, bez glutaminy, bez czerwieni fenolowej	Sigma Aldrich	D5921	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d5921?lang=en®ion=BE
MCDB-105	Sigma Aldrich	M6395	Rozcieńczyć w wodzie Milli Q, dostosować pH do 7 za pomocą NaOH i przefiltrować przed użyciem. Przechowywać w ciemności. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m6395?lang=en®ion=BE
Insulina z trzustki bydlęcej	Sigma Aldrich	I1882	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/i1882?lang=en®ion=BE
Szkiełka nakrywkowe, szkło, 18 mm i Oslash;	Glaswarenfabrik Karl Hecht	1001/18	http://www.hecht-assistant.de/187/?L=1&tx_rmproducts_pi1[g]=937 & tx_rmproducts_pi1[p]=3504 & tx_rmproducts_pi1[v]=20088 & cHash=abd12065683fe74b00eaa 5e562824d06
Poli-L-lizyna	Sigma Aldrich	P2636	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p2636?lang=en®ion=BE
Kolagenaza typu IA z Clostridium histolyticum	Sigma Aldrich	C2674	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c2674?lang=en®ion=BE
DPBS, bez wapnia, bez magnezu	Gibco	14190-094	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14190094?ICID=search-14190-094
Trypsyna z trzustki bydlęcej	Sigma Aldrich	T7409	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t7409?lang=en®ion=BE
Trypsyna-EDTA (0,05%), czerwień fenolowa	Gibco	25300-054	Przed użyciem ogrzać do temperatury pokojowej. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/25300054?ICID=search-25300-054
Sitko do komórek, 40 i mikro; m siatka, jednorazowy	BD Falcon	352340	https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/p-48680
Sitko do komórek, 100 &mikro; m siatkowy, jednorazowy	BD Falcon	352360	https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/p-48680
Filtr strzykawkowy Millex-GP, 0,22  &mikro; M, polieterosulfon, 33  mm, sterylizowany promieniami gamma	Merck Millipore	SLGP033RS	https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Millex-GP-Syringe-Filter-Unit%2C-0.22%C2%A0%C2%B5m%2C-polyethersulfone%2C-33%C2%A0mm%2C-gamma-sterilized,MM_NF-SLGP033RS?bd=1
Kwas octowy (lodowaty) 100%	Merck Millipore	1.00063	https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Acetic-acid-%28glacial%29-100%25,MDA_CHEM-100063
Kolagen I	Corning	354236	Z ogona szczura. https://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-BR/Shopping/ProductDetails.aspx?categoryname=& productid=354236%28 Lifesciences%29#
Pankreatyna z trzustki świni	Sigma Aldrich	P3292	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p3292?lang=en®ion=BE
35 mm Naczynia do hodowli tkankowych, polistyren, sterylne	BD Falcon	353001	https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?product_id=4675630
Etanol absolutny AnalaR NORMAPUR ACS, Reag. Ph. Eur. odczynnik analityczny	VWR Chemicals	20821296	https://uk.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=20821.310DP
monoklonalna królicza anty-ludzka wimentyna (D21H3)	Technika sygnalizacji komórkowej	#5741	Użyj 1/500. http://www.cellsignal.com/products/primary-antibodies/vimentin-d21h3-xp-rabbit-mab/5741
Monoklonalna mysia anty-ludzka cytokeratyna pan	Sigma Aldrich	C2562	Użyj 1/1 000. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c2562?lang=en& region=BE
Roztwór paraformaldehydu, 4% w PBS	Affymetrix	19943	http://www.affymetrix.com/catalog/130621/USB/Paraformaldehyde+Solution+4+percent+in+PBS#1_1
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/SIAL/X100?lang=en®ion=BE&gclid= Cj0KEQjwhN-6BRCJsePgxru9iIw BEiQAI8rq 879lESeuIU4N4AEQRLNEXj4f 8z65KkD-q8Xr35sQDRgaAp-k 8P8HAQ
Kozia surowica	Sigma Aldrich	G9023
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g9023?lang=en®ion=BE Kozia anty-królik Alexa Fluor 488	Thermo Scientific	A-11034	http://www.thermofisher.com/order/genome-database/searchResults?query=488& resultPage=1& resultsPerPage=15& autocomplete=& searchMode=słowo kluczowe& productTypeSelect=przeciwciało& targetTypeSelect =antibody_secondary& species=ltechall&keyword= 488#filters=sorticsort2:\%22Capra%20hircus\%22;; generic6:^\%22Oryctolagus%20cuniculus\%22$;; sprzężone:^\%22Alexa%20Fluor& reg;%20488\%22$;;
Kozia anty-mysz Alexa Fluor 594	Thermo Scientific	A-11032	http://www.thermofisher.com/order/genome-database/searchResults?query=594& resultPage=1& resultsPerPage=15& autocomplete=& priorSearchTerms=& searchMode=keyword& productTypeSelect=przeciwciało& targetTypeSelect= antibody_secondary& species=ltechall& keyword=594#filters=genericsort2: \%22Capra%20hircus\%22;; generic6:^\%22Mus%20musculus\%22$;;
Podłoże montażowe VECTASHIELD z DAPI	Vector Laboratories	H-1200	http://vectorlabs.com/vectashield-mounting-medium-with-dapi.html
DPBS, z https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040133 14040174 wapniowo-magnezowym	Gibco