Badanie fenotypów gospodarza w Gambusia affinis po leczeniu antybiotykami

Podsumowanie

To badanie obejmuje metody mające na celu ujawnienie wpływu na modelowego gospodarza ryb po zmianie składu społeczności mikrobiomu skóry i jelit przez antybiotyk.

Streszczenie

Powszechność stosowania antybiotyków w medycynie oznacza, że zrozumienie wynikających z tego konsekwencji dla gospodarza jest niezbędne. Antybiotyki często zmniejszają różnorodność społeczności mikrobiomu gospodarza i zmieniają skład społeczności drobnoustrojów. Wiele chorób, takich jak zapalenie jelit związane z antybiotykami, nieswoiste zapalenie jelit i zaburzenia metaboliczne, powiązano z zaburzoną mikrobiotą. Złożona interakcja między gospodarzem, mikrobiomem i antybiotykami wymaga elastycznego modelu do badania interakcji gospodarz-mikrobiom. Nasze słodkowodne ryby kręgowe służą jako użyteczny model do badania uniwersalnych aspektów struktury i funkcji mikrobiomu błony śluzowej, a także do analizowania wynikających z wpływu gospodarza na społeczność drobnoustrojów. Metody obejmują wyzwania związane z gospodarzem, takie jak zakażenie znanym patogenem ryb, narażenie na drobnoustroje kałowe lub glebowe, stres osmotyczny, toksyczność azotanów, analiza wzrostu i pomiar ruchliwości jelit. Techniki te demonstrują elastyczny i użyteczny system modelowy do szybkiego określania fenotypów gospodarza.

Wprowadzenie

Ustalono, że antybiotyki mogą zaburzać ludzki mikrobiom, prowadząc do dysbiozy, co oznacza brak równowagi w społeczności mikrobiologicznej. Wykazano, że zmiana składu mikrobioty po leczeniu antybiotykami zmniejsza różnorodność społeczności, zmniejsza liczbę kluczowych członków i zmienia metabolizm społeczności, zwłaszcza w klasie gut1^,2. Zaburzenia mikrobiomu jelitowego spowodowane antybiotykami mogą zmniejszyć odporność na kolonizację Clostridium difficile^3,4 i Salmonella⁵.

Dodatkowo, zakłócenie mikrobioty zostało powiązane z rozwojem wielu syndromów i chorób u ludzi (np. zapalenie jelit związane z antybiotykami, nieswoiste zapalenie jelit, zaburzenia metaboliczne, itp.). Antybiotyki są również szeroko stosowane w rolnictwie jako stymulatory wzrostu w produkcji zwierzęcej i drobiarskiej⁶. Stosowanie tych potężnych narzędzi nie jest pozbawione skutków ubocznych, co jest widoczne w szybkim wzroście oporności na antybiotyki, a także w skutkach zaburzonego mikrobiomu u zamieszkałego gospodarza. Wiele badań wykazało, że stosowanie antybiotyków o szerokim spektrum działania ma długotrwałe konsekwencje dla struktury i funkcji mikrobioty, jednak skutki uboczne mikrobiomu zaburzonego przez antybiotyki, wpływającego na fizjologię gospodarza, to tylko spekulacje, które nie zostały jeszcze potwierdzone.

Wzajemne oddziaływanie między gospodarzem, mikrobiotą i antybiotykami jest dalekie od zwięzłego zrozumienia. Dlatego prosty i łatwiejszy w obsłudze model jest korzystny dla rzucenia światła na bardzo złożony system ssaków. Powierzchnie błon śluzowych u ludzi, w tym jelita, są siedliskiem największej gęstości i różnorodności drobnoustrojów, a także najbardziej intymnych interakcji między drobnoustrojami a gospodarzem. Mikrobiom błony śluzowej skóry ryb ma kilka zalet jako system modelowy. Teleostei (ryba kostna) jest jedną z najwcześniejszych linii, które rozdzieliły się w kręgowcach, co oznacza, że teleosty mają zarówno wrodzone, jak i nabyte układy odpornościowe, które współewoluowały w związku ze społecznościami bakterii komensalnych⁷. Skóra ryb ma wiele cech wspólnych z powierzchniami błony śluzowej typu 1 ssaków, takich jak funkcje fizjologiczne, składniki odporności i rozmieszczenie komórek wytwarzających śluz⁸. Zewnętrzne położenie powierzchni błony śluzowej skóry ryb zapewnia mikrobiom, który można łatwo eksperymentalnie manipulować i pobierać próbki.

Zachodni komar, Gambusia affinis (G. affinis), to modelowa ryba, która była używana w przeszłości do badania krycia i toksykologii^9,10,11. Biorąc pod uwagę niewielkie rozmiary, liczebność populacji w środowisku naturalnym jako gatunek inwazyjny, minimalne koszty opieki i odporną naturę, opracowaliśmy G. affinis jako model mikrobiomu błony śluzowej. Co więcej, Gambusia dzielą fizjologię rodzenia młodych z żyworodnymi ssakami, co jest rzadkie u gatunków ryb. Przeprowadziliśmy najobszerniejsze badanie dotyczące prawidłowej mikrobioty skóry ryb przy użyciu profilowania 16S z Gambusia¹². Dalsze prace wykazały trzy negatywne skutki dla gospodarza wynikające z zakłócenia mikrobioty skóry i jelit przy użyciu antybiotyku o szerokim spektrum działania¹³.

Pięć różnych efektów zostało zbadanych u ryb po ekspozycji na antybiotyki. Najbardziej ugruntowaną korzyścią dla gospodarza dla mikrobiomu jest konkurencyjne wykluczenie patogenów. Wiadomo, że patogen ryb Edwardsiella ictaluri powoduje ogniska posocznicy jelitowej w komercyjnych hodowlach sumów¹⁴. Wykazano również, że E. ictaluri śmiertelnie infekuje danio pręgowanego^15,16 i Gambusia¹⁷. Wyzwanie tym patogenem ze słupa wody może służyć jako miara wykluczenia. Dla porównania z podatnością na pojedynczy patogen przeprowadzono również przeżycie podczas ekspozycji na duże zagęszczenie organizmów mieszanych. Kał i gleba bogata w substancje organiczne były wykorzystywane jako powszechnie spotykane źródła zbiorowisk mikroorganizmów.

Inną ustaloną rolą, jaką pełni społeczność bakteryjna jelitowa, jest przetwarzanie składników odżywczych i zbieranie energii, wpływając w ten sposób na ogólne pobieranie składników odżywczych przez gospodarza. Jako ogólny pomiar wartości odżywczych, masa ciała ryb została porównana przed i po miesiącu karmienia standardową dietą. Ryby traktowane antybiotykiem jako średnia straciły na wadze, podczas gdy ryby kontrolne średnio przybrały na wadze w ciągu miesiąca. Mechanizm tego braku przyrostu masy ciała jest niejasny. Jednym z możliwych czynników przyczyniających się do tego jest czas pasażu pokarmu w jelitach. Metoda ruchliwości przewodu pokarmowego została zaadaptowana na podstawie danych z ryb zebry (Adam Rich, SUNY Brockport, komunikacja osobista) w celu określenia czasu tranzytu. Nie ustalono jeszcze, czy ryby poddane działaniu antybiotyków mają zmieniony czas pasażu.

Częstym wyzwaniem, którego doświadczają w naturalnym środowisku wszystkie organizmy, zwłaszcza ryby, jest stres osmotyczny. Wykazano, że Gambusia szybko przystosowuje się do ostrego stresu w wysokich stężeniach zasolenia¹⁸. Co zaskakujące, ryby z mikrobiomem zmienionym przez antybiotyk wykazywały obniżoną przeżywalność z powodu wysokiego stresu solnego. Mechanizm tego nowego fenotypu jest obecnie badany. Innym częstym stresem u zwierząt wodnych, zwłaszcza w akwariach, są toksyczne formy azotu (amoniak, azotany i azotyny). Przeżywalność przeciwko azotanom nie różniła się istotnie między rybami leczonymi antybiotykami i kontrolnymi. Metody przedstawione w tym manuskrypcie mogą być stosowane w przypadku Gambusia lub podobnych organizmów modelowych ryb, takich jak danio pręgowany i medaka, do pomiaru fenotypów ryb po manipulacji eksperymentalnej.

Protokół

Wszystkie doświadczenia na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z protokołami IACUC o numerach 14-05-05-1018-3-01, 13-04-29-1018-3-01 i 14-04-17-1018-3-01.

1. Zbieranie, obchodzenie się ze zwierzętami i etyczna opieka

1. Zebrać Gambusia affinis z pola (przewodnik identyfikacyjny na http://www.sms.si.edu/irlspec/Gambusia_affinis.htm) za pomocą małej siatki zanurzeniowej i umieścić w wiadrach o pojemności 19 litrów. Użyj oględzin, aby zidentyfikować gatunki.
2. Odpoczywaj ryby przez 1 - 2 dni w wiadrze z wodą ze stawu. Następnie przenieś ryby do zbiorników akwariowych o pojemności 76 lub 189 litrów, wypełnionych w połowie wodą ze stawu, a w połowie wodą z kranu o temperaturze 25 °C, napowietrzonych bulgoczącym kamieniem napowietrzającym. Podczas pracy z rybami należy używać małej siatki do zanurzania, aby w minimalnym stopniu zakłócić ich mikrobiom skóry.
   UWAGA: Gęstość ryb nie powinna być wyższa niż 20 ryb/38 l wody w akwarium. Ryby aklimatyzują się w akwarium przez co najmniej 5 dni przed eksperymentami.
3. Karm ryby w codziennym schemacie z 5 mg pokarmu w płatkach na rybę. Trzymaj ryby w cyklu 12 godzin światła / 12 godzin ciemności.

2. Wstępna ekspozycja na antybiotyki we wszystkich eksperymentach

1. Pobierając wszystkie ryby z każdego eksperymentu z tego samego akwarium, umieść je w dwóch oddzielnych grupach (leczone: wystawione na antybiotyk i kontrolowane: nienarażone) w 19-litrowych wiadrach. Poprzednie zebrane dane pokazują, że ryby w tym samym akwarium mają zhomogenizowane mikrobiomy skóry, które mają niewielkie różnice w składzie społeczności. ¹²
2. Podczas eksperymentów trzymaj ryby w 2 l sztucznej wody w stawie (APW; 0,33 g/L CaCl₂, 0,33 g/L MgSO₄, 0,19 g/L NaHCO₃), która jest sterylizowana w autoklawie przed użyciem.
3. Przygotować roztwór podstawowy antybiotyku ryfampicyny, dodając 50 mg/ml do dimetylosulfotlenku (DMSO). Ryfampicyna jest reprezentatywnym antybiotykiem o szerokim spektrum działania, który jest nietoksyczny dla ryb. U ludzi i myszy dobrze rozprowadza się w tkankach.
4. Z zapasu ryfampicyny podawać końcowe stężenie 25 μg/ml w 2 litrach APW w celu ekspozycji na antybiotyki leczonej grupy ryb przez 3 dni. Należy pamiętać, że po 3 dniach liczba bakterii skórnych nadających się do hodowli powraca podobnie jak w przypadku wstępnie poddanej obróbce skóry ryb.
5. Równolegle należy trzymać grupę ryb niepoddanych działaniu substancji w APW i podać równoważną ilość DMSO (0,5 ml na l APW) do słupa wody, aby działała jako grupa kontrolna.
6. Ponieważ eksperymenty mają na celu zmierzenie wpływu mikrobiomu zmienionego antybiotykiem na fenotypy ryb, w celu uniknięcia skutków bezpośrednio z samego antybiotyku, po trzydniowym okresie ekspozycji na antybiotyk (lub kontroli) należy przenieść ryby do wiadra z 2 litrami świeżego APW.
   1. Stosuj 10-godzinny okres odpoczynku, aby antybiotyk został usunięty przez ciała ryb. Oprzyj ten czas eliminacji na eksperymentach, w których ryby były wystawione na działanie 25 μg/ml antybiotyku przez trzy dni. Poddaj rybę eutanazji poprzez przecięcie rdzenia kręgowego, a następnie zmiażdżenie całego ciała za pomocą młynka do tkanek.
   2. Określić obecność antybiotyku, umieszczając 50 μl tej zawiesiny po przefiltrowaniu 0,2 μm w środku agarowej szalki Petriego. Zrób otwór na tę zawiesinę, wciskając do góry nogami sterylną końcówkę pipety o pojemności 200 μl do agaru, która usuwa małą zatyczkę.
   3. Użyj płytek agarowych z odmierzoną objętością 20 ml agaru odżywczego i równomiernie rozprowadź za pomocą bawełnianego wacika z organizmem wskaźnikowym, Bacillus subtilis, który jest wrażliwy na ryfampicynę. Otrzymać B. subtilis z agatora odżywczego inkubowanego w temperaturze 25 °C O/N i za pomocą bawełnianego wacika w celu uzyskania kolonii. Obserwowanie strefy inhibicji po całonocnej inkubacji w temperaturze 25 °C wskazuje na obecność antybiotyku w tkankach ryb.

3. Ekstrakcja mikrobiomu

1. Ekstrahuj próbkę mikrobiomu skóry z zewnętrznego naskórka błony śluzowej, umieszczając ryby w sterylnej stożkowej probówce o pojemności 15 ml wypełnionej 2 ml sterylnego roztworu PBST (137 mM NaCl, 10 mM fosforanu, 0,1% Tween-20, pH 7,4) i wirując w ustawieniu 10 przez 1 minutę z 10-sekundowymi przerwami. Detergent i sól w buforze sprzyjają równomiernemu rozpraszaniu się bakterii w roztworze. Porównywalne wyniki uzyskano przy 0,85% soli fizjologicznej, ale obniżonej liczbie bakterii przy użyciu czystej wody.
2. Przenieś rybę z rurki stożkowej do wiadra do odzyskiwania. Śmiertelność ekstrakcji skóry jest zwykle niższa niż 10%. Albo przeanalizować zawiesinę bakteryjną w probówce natychmiast po ekstrakcji, albo zagnieździć bakterie przez 2-minutowe wirowanie w wirówce w temperaturze pokojowej przy 15 000 x g i przechowywać w temperaturze -80 °C do przyszłej analizy.
   UWAGA: Wszystkie analizy hodowli i biochemiczne są natychmiastowe; Ekstrakcja DNA lub białka może odbywać się z zamrożonych próbek.
3. Aby uzyskać próbkę mikrobiomu jelitowego, najpierw umieść rybę na sterylnej szalce Petriego. Poddaj rybę eutanazji, przecinając rdzeń kręgowy szyjny bezpośrednio za głową nożyczkami chirurgicznymi, a następnie wkłuw, a następnie zewnętrznie zdezynfekuj ciało chusteczkami z 70% etanolu.
4. Po rozbiorzeniu usuń całe jelito, przecinając za przełykiem i przed odbytem.
5. Pokrój jelito na małe kawałki o długości 1-2 mm i umieść wszystkie sekcje w dwóch ml roztworu PBST w stożkowej probówce. Po wirowaniu przez 1 minutę usunąć supernatant do innej czystej probówki (należy uważać, aby nie wyciągnąć skrawków jelit).
   UWAGA: Supernatant zawiera wyekstrahowane bakterie jelitowe, które mogą być wykorzystane do bezpośrednich analiz lub granulowane poprzednią metodą opisaną dla próbek skóry.

4. Przygotowanie modelu infekcji i kąpiel określonego patogenu

1. Uzyskać zakaźny szczep Edwardsiella ictaluri (E. ictaluri) i przechowywać kulturę w temperaturze -80 °C. Szczep 93 - 146 użyty w tym badaniu, wyizolowany z zakażonego suma, uzyskano od Marka Lawrence'a, College of Veterinary Medicine, Mississippi State University.
2. Umieść E. ictaluri na selektywnym i różnicowym podłożu zwanym E. ictaluri (EIM) agar¹⁹ w celu hodowli bakterii i inkubacji przez 2 dni w temperaturze 27 °C.
3. Przenieść czystą izolowaną kolonię z kultury i zaszczepić 150 ml kolby zawierającej 40 ml bulionu odżywczego (NB; 5 g/l peptonu, 4 g/l ekstraktu wołowego). Umieścić kolbę w wytrząsarce ustawionej na 150 obr./min na 2 dni w temperaturze 27 °C.
4. Po inkubacji rozcieńczyć próbkę kultury w PBST do odczytu spektrometru 0,2 OD przy 650 nm, aby skalibrować kulturę E. ictaluri dla pożądanych objętości dawki zakaźnej.
5. Następnie przenieś zarówno leczone (po 3 dniach ekspozycji na antybiotyki), jak i nieleczone grupy ryb do indywidualnych plastikowych kubków zawierających 130 ml świeżej sztucznej wody ze stawu lub APW przez około 10 godzin w celu usunięcia leku z tkanek ryb.
6. Następnie z obu grup przenieś ponownie każdą rybę do 8-uncjowych plastikowych kubków zawierających 130 ml czystego APW.
7. Każdej rybie należy podać śmiertelną dawkę zawierającą 2,8 x 10 ⁶ jtk/ml kultury E. ictaluri do APW (model infekcji kąpielowej) i przechowywać w inkubatorze o temperaturze 27 °C przez 24 godziny.
8. Po kąpieli z E. ictaluri przenieść ryby pojedynczo do nowych kubków ze 130 ml APW.
9. Po wymianie wody rekordowa śmiertelność ryb w ciągu tygodnia. W tym okresie ryby nie są karmione. W przeciwieństwie do sumów, Gambusia nie wykazuje zewnętrznych oznak infekcji, dlatego konieczne jest zastosowanie śmiertelności jako eksperymentalnego punktu końcowego.

5. Wyzwanie wielomikrobiologiczne z kałem i glebą

1. Leczenie kału
   1. Uzyskaj świeży kał ludzki od zdrowego ochotnika, który nie otrzymał antybiotyków w ciągu ostatnich dwóch tygodni, używając sterylnych rękawiczek i sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
   2. Po pobraniu zbierz kał do sterylnej plastikowej torby, a następnie przenieś do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Utworzyć stężenie zapasowe, zawieszając kał w PBST, aby uzyskać roztwór podstawowy 500 - 800 mg/ml. Tę gęstą mieszaninę najlepiej przenosić za pomocą plastikowej końcówki do pipety o pojemności 1 ml lub większej, która została przecięta na dole sterylnymi nożyczkami, tak aby otwór był większy.
   3. Po wstępnej ekspozycji na antybiotyk grupy ryb poddanych działaniu substancji i kontrolnych nieleczonych, rozdzielić do oddzielnych plastikowych kubków zawierających zawiesinę kału w końcowych stężeniach 15 mg/ml lub 10 mg/ml do APW o całkowitej objętości 130 ml. Przechowywać kubki w inkubatorze w temperaturze 25 °C.
   4. Rejestruj śmiertelność ryb podczas ekspozycji na kał poprzez ścisłą obserwację przez 2 dni.
2. Uzdatnianie gleby
   1. Zbierz 1 - 2 kg bogatej organicznej wierzchniej warstwy gleby (powinna zawierać największą gęstość i różnorodność drobnoustrojów) na głębokość około 7 - 15 cm i umieść w czystym plastikowym pojemniku. Należy pamiętać, że glebę należy zużyć w ciągu dwóch dni po pobraniu.
   2. Bezpośrednio po początkowym okresie ekspozycji oddziel obie grupy ryb leczonych i nietraktowanych antybiotykami do indywidualnych plastikowych kubków zawierających 18,2 g gleby w 130 ml APW. Dobrze wymieszaj glebę w wodzie ręcznie przed dodaniem ryby. Większość cząstek stałych nie zawiesza się i pozostaje na dnie kubka.
   3. Wystawić ryby na działanie promieni słonecznych przez 3 dni w temperaturze 25 °C i odnotować ewentualną śmiertelność.

6. Wyzwanie stresu osmotycznego

1. Po poddaniu działaniu substancji, po którym następuje 10-godzinny okres odpoczynku, jak opisano powyżej, należy zindywidualizować ryby w oddzielnych kubkach zawierających NaCl w stężeniu 17,5 mg/ml (300 mM) w 150 ml APW. Jest to połowa typowego zasolenia wody morskiej, która nie jest w pełni śmiertelna (<50%) do zwalczania ryb, ale jest silnie stresująca, wymagająca skutecznej osmoregulacji.
2. Obserwuj śmiertelność ryb w czasie 36 godzin.

7. Wyzwanie dotyczące toksyczności azotanów

1. Odpoczywaj ryby przez okres 10 godzin po ekspozycji na antybiotyk, a następnie oddziel ryby do indywidualnych kubków zawierających stężenie azotanu sodu 10 mg/ml (118 mM) lub 17,5 mg/ml (206 mM) w 130 ml APW.
2. Rekord śmiertelności powyżej 4 dni dla małej dawki i 1 d dla wysokiej dawki.

8. Analiza wzrostu ryb zindywidualizowanych lub zgrupowanych

1. Ukończ 3-dniowy okres ekspozycji na antybiotyk lub okres kontrolny jako grupy w wiadrach.
2. W przypadku Individual napełnij kubki styropianowe o pojemności 8 uncji po 150 ml APW każdy, przenieś pojedynczą rybę do kubka i zapisz całkowitą masę ciała w celu wstępnej oceny.
   1. Powtórzyć tę czynność dla wszystkich ryb zarówno w grupie poddanej działaniu substancji, jak i niepoddanej zabiegowi. Używaj białych kubków styropianowych zamiast przezroczystych plastikowych kubków, ponieważ ryby nie będą jeść, gdy są w przezroczystych kubkach.
3. Karm ryby codziennie standardową dietą składającą się z dwóch granulek na rybę. Użyto granulek zamiast płatków, ponieważ granulki mają niską zmienność indywidualnej masy (3,53 ±0,42 mg każdy, czyli 8% różnicy), co powoduje, że ryby otrzymują podobne ilości pokarmu. Monitoruj zużycie, wizualnie rejestrując niezjedzone granulki. Wskaźniki konsumpcji zazwyczaj przekraczały 80%.
4. Pod koniec każdego tygodnia przez 4 tygodnie określ wagę ryby. Przygotuj nową filiżankę ze świeżym APW, umieść na wadze, a następnie zapisz wagę. Następnie wlej rybę do siatki zanurzeniowej z oryginalnego kubka i przenieś do nowego kubka, który następnie jest ponownie ważony. Nie obchodzi się z rybami, aby uniknąć stresu.
5. W przypadku grup umieść 2 litry APW w wiadrze o pojemności 19 litrów i wytaruj wagę. Trzymaj ryby razem w obu grupach podczas przenoszenia do nowych wiader APW, a następnie zapisuj całkowitą wagę grupy. Rejestruj masę grupy ryb co tydzień przez miesiąc, przenosząc ją do nowego koszyka.

9. Czas tranzytu jelit

1. Użyć anionowego dekstranu 70 kDa znakowanego fluoresceiną. Dekstran nie jest znacząco trawiony i jest zbyt duży, aby mógł zostać wchłonięty przez warstwę jelitową, dlatego pasaż będzie mierzył czas przejścia przez jelita. Oznakowany dekstran został dodany do pokarmu dla ryb.
2. Do sterylnej probówki o pojemności 1,7 ml dodać 360 μl sterylnej wody dejonizowanej i 52 mg żelatyny (13% roztwór) i umieścić probówkę na bloku grzewczym o temperaturze 60 °C, aż żelatyna się rozpuści i całkowicie się rozpuści.
   1. Zmiel płatki pokarmu dla złotych rybek na drobny proszek za pomocą moździerza i tłuczka, a następnie dodaj 40 mg tego proszku do probówki wraz z 20 μl oleju rybnego. Po wymieszaniu dodać 1,6 mg dekstranu FITC.
3. Dozuj gorącą mieszaninę płynów do kropli o pojemności 20 μl na Parafilm na stole laboratoryjnym i pozwól im szybko ostygnąć i zestalić się. Krople można przechowywać do 4 dni, zanim staną się zbyt twarde do zjedzenia przez ryby. Przechowuj krople w lodówce, umieszczając Parafilm na połowie szalki Petriego, która jest następnie unoszona na sterylnej wodzie w szczelnie zamkniętym plastikowym pojemniku, który utrzymuje krople w stanie nawilżenia.
4. Tuż przed karmieniem ćwiartka rozpada się na sekcje za pomocą żyletki. Przyzwyczajaj ryby do kubków styropianowych indywidualnie przez 2 dni bez karmienia (Uwaga: Użyto tylko nienarażonych ryb kontrolnych). Umieść cztery ćwiartki jedzenia w kubku z rybą i obserwuj rybę przez 30 minut, ile kawałków jedzenia każda z nich zjada.
5. Aby rozpocząć okres monitorowania, należy przenieść ryby pojedynczo do kubków z 80 ml APW za pomocą sieci zanurzeniowej. Co 2 godziny delikatnie obracać ręcznie APW, a następnie pobrać próbkę o objętości 1 ml i przechowywać w oznakowanej probówce o pojemności 1,7 ml w temperaturze 4 °C. Próbki pobiera się przez 36 godzin.
6. Zarejestrować fluorescencję wszystkich próbek za pomocą spektrofotometru fluorescencyjnego w tym samym czasie po zakończeniu testu. Umieścić całą 1 ml próbkę w kuwecie i zarejestrować fluorescencję zmierzoną za pomocą wzbudzenia przy długości fali 495 nm i emisji przy długości fali 520 nm.

Wyniki

Ogólny schemat systemu eksperymentalnego wykorzystanego do badania wpływu ekspozycji na antybiotyki na organizm ryb gospodarzy¹³ przedstawiono na Rysunku 1A; obejmuje on technikę ekstrakcji mikrobiomu skóry (Rysunek 1B) oraz jelit (Rysunek 1C) z ryb. Jako okres ekspozycji na antybiotyk wybrano trzy dni, ponieważ wcześniejsze dane wykazują, że choć całkowita liczba bakterii skóry zdolnych do hodowli spada na początk...

Dyskusja

Niektóre wyzwania wymagają okresu odpoczynku w czystym APW po leczeniu antybiotykami, aby lek został wyczerpany w tkankach ryb. Jeśli okres odpoczynku zostanie pominięty, obecność antybiotyku może zakłócić wyniki, zwłaszcza gdy test wiąże się z narażeniem na bakterie. W celu zbadania skutków zmienionego składu mikrobiomu bez dużych zmian w całkowitej liczbie drobnoustrojów na gospodarzu, wymagane byłyby wstępne eksperymenty monitorujące skład mikrobiomu (profilowanie 16S lub sekwencjonowanie całego genomu) i gęstość popu...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Ryfampicyna	Calbiochem	557303-1GM
Azotan sodu	Sigma Aldrich	S5506
znakowany fluoresceiną 70 kDa anionowy dekstran	ThermoFisher Scientific	D1823
Tabletki soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) Tabletki	Calbiochem	6500-OP	rozpuszczają się w wodzie, aby wytworzyć PBS