Artykuł metodologiczny

Analiza modulacji synaptycznej fotoreceptorów Drosophila melanogaster po ekspozycji na przedłużone światło

DOI:

10.3791/55176

⸱

10 lutego 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neuroscience of Disease, Center for Transdisciplinary Research, Niigata University, 2Brain Research Institute, Niigata University, 3Image and Data Analysis Facility, German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE), 4Graduate School of Life Science and Technology, Tokyo Institute of Technology (Titech), 5Dendrite Differentiation, German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE)

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj pokazujemy, jak określić ilościowo liczbę i rozkład przestrzenny aktywnych stref synaptycznych w fotoreceptorach Drosophila melanogaster, wyróżnionych genetycznie zakodowanym markerem molekularnym, oraz ich modulację po długotrwałej ekspozycji na światło.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Układ nerwowy ma niezwykłą zdolność do adaptacji i reagowania na różne bodźce. To dostosowanie neuronalne jest w dużej mierze osiągane poprzez plastyczność na poziomie synaptycznym. Strefa aktywna (AZ) to region błony presynaptycznej, który pośredniczy w uwalnianiu neuroprzekaźników i składa się z gęstego zbioru białek rusztowania. AZ Drosophila melanogaster (Drosophila) fotoreceptory ulegają molekularnej przebudowie po długotrwałej ekspozycji na naturalne światło otoczenia. W ten sposób poziom aktywności neuronalnej może zmienić skład molekularny AZ i przyczynić się do regulacji funkcjonalnego wyjścia wyjściowego.

Począwszy od przygotowania do ekspozycji na światło, a skończywszy na immunohistochemii, ten protokół szczegółowo opisuje, jak określić liczbę, rozkład przestrzenny i poziom delokalizacji cząsteczek synaptycznych w AZ w fotoreceptorach Drosophila. Korzystając z oprogramowania do analizy obrazu, zidentyfikowano klastry komponentu AZ z fuzją GFP Bruchpilot dla każdego terminala aksonu fotoreceptora R8 (R8). Wykryte plamki Bruchpilot były automatycznie przypisywane do poszczególnych aksonów R8. Aby obliczyć rozkład częstotliwości plamki wzdłuż aksonu, zaimplementowaliśmy dostosowaną wtyczkę oprogramowania. Punkt początkowy i końcowy każdego aksonu został zdefiniowany ręcznie, a położenie każdego punktu Bruchpilot zostało odwzorowane na linii łączącej punkt początkowy i końcowy. Oprócz liczby klastrów Bruchpilot określiliśmy również ilościowo poziom delokalizacji Bruchpilot-GFP w klastrach. Pomiary te szczegółowo odzwierciedlają przestrzennie rozdzieloną dynamikę synaptyczną w pojedynczym neuronie w różnych warunkach środowiskowych dla bodźców.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Modulacja funkcji synaptycznych przyczynia się do niezwykłej zdolności układu nerwowego do precyzyjnego reagowania lub dostosowywania się do zmieniających się bodźców środowiskowych. Regulacja prawdopodobieństwa uwolnienia pęcherzyków presynaptycznych jest jednym ze sposobów kontrolowania siły synaptycznej1. Uwalnianie pęcherzyków synaptycznych odbywa się w strefie aktywnej (AZ), wyspecjalizowanym regionie błony presynaptycznej 2. AZ charakteryzuje się kasetą określonych białek3,4. Większość białek biorących udział w składaniu AZ jest wysoce konserwatywna u nicieni, owadów i ssaków5. Ostatnie badania sugerują, że poziom aktywności neuronalnej reguluje skład molekularny AZ, co z kolei przyczynia się do regulacji funkcjonalnej wydajności zarówno in vitro, jak i in vivo6,7,8. Wcześniej odkryliśmy, że fotoreceptory AZ ulegają przebudowie molekularnej u Drosophila po długotrwałej ekspozycji na naturalne światło otoczenia9. W tym stanie zaobserwowaliśmy, że liczba AZ Bruchpilot (Brp) dodatnich została zmniejszona w aksonach fotoreceptorów.

Białka rodziny Brp/CAST/ELKS są podstawowymi elementami budulcowymi AZ w synapsach kręgowców i bezkręgowców10. U mutantów Drosophila brp wywołane uwalnianie pęcherzyków jest stłumione11,12. 17 C-końcowych reszt aminokwasowych Brp jest niezbędnych do grupowania pęcherzyków synaptycznych w połączeniu nerwowo-mięśniowym Drosophila (NMJ)13,14. Badania te wykazały centralną rolę tej cząsteczki w organizacji i funkcji AZ. Dzięki niedawno opracowanemu narzędziu genetycznemu, znakowaniu synaptycznemu z rekombinacją (STaR), Brp można obserwować in vivo w określonych typach komórek, na endogennych poziomach ekspresji i przy rozdzielczości pojedynczej synapsy15. Narzędzie to umożliwia ilościową ocenę endogennej dynamiki synaps w złożonym ośrodkowym układzie nerwowym.

Przeprowadzono kilka badań, w tym kwantyfikację synaps na podstawie danych uzyskanych z mikroskopii konfokalnej. Zmiany synaptyczne zostały ocenione poprzez pomiar długości, powierzchni, objętości, gęstości i zliczanie liczby w oparciu o wyrafinowane aplikacje. Na przykład, darmowe oprogramowanie ImageJ zapewnia metodę kwantyfikacji dla całkowitej powierzchni synaptycznej i pomiarów gęstości synaptycznej w Drosophila NMJ16. Liczba miejsc kolokalizacji markerów pre i postsynaptycznych została określona ilościowo za pomocą wtyczki "Puncta Analyzer" dostępnej na platformie oprogramowania ImageJ17. Alternatywnie, wieloparadygmatowy program oparty na numerycznym środowisku obliczeniowym, Synapse Detector (SynD), może automatycznie śledzić dendryty neuronów znakowanych markerem fluorescencyjnym, a następnie określać ilościowo poziomy białek synaptycznych w funkcji odległości od ciała komórki18. Oprogramowanie Synaptic Puncta Analysis (SynPAnal) zostało zaprojektowane do szybkiej analizy obrazów 2D neuronów uzyskanych z mikroskopii konfokalnej lub fluorescencyjnej. Podstawową funkcją tego oprogramowania jest automatyczna i szybka kwantyfikacja gęstości i intensywności białka puncta19. Ostatnio wygenerowano algorytm automatycznego wykrywania synaps oparty na uczeniu się do kwantyfikacji liczby synaptycznej w 3D20, korzystając z oprogramowania do analizy wspomaganej wizualizacją 3D (Vaa3D)21.

Komercyjne oprogramowanie do analizy obrazów jest również potężnym narzędziem do kwantyfikacji synaptycznej. Na przykład, znakowane fluorescencyjnie receptory neuroprzekaźników lub presynaptyczny komponent AZ zostały określone ilościowo w trzech wymiarach z rozdzielczością pojedynczej synapsy w C. elegans22 lub Drosophila olfactory system23,24, co pozwala na szybkie scharakteryzowanie setek synaps w jednej próbce.

Tutaj prezentujemy metodę za pomocą dostosowanej wtyczki do analizy obrazu, zaimplementowanej w wieloparadygmatowym środowisku obliczeń numerycznych, która pozwala na półautomatyczną analizę wielu aspektów AZ, w tym ich liczby, rozkładu i poziomu wzbogacenia składników molekularnych w AZ. Tak więc ta złożona analiza pozwoliła nam ocenić dynamikę składników synaptycznych w zakończeniach aksonów w różnych warunkach środowiskowych. Zbadaliśmy wpływ ekspozycji na światło na synapsy wyjściowe fotoreceptorów dorosłych much. Zabieg wykonywany jest w trzech etapach: 1) przygotowanie do ekspozycji na światło, 2) preparacja, immunohistochemia i obrazowanie konfokalne oraz 3) analiza obrazu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Procedury eksperymentalne opisane w tym protokole obejmują wyłącznie pracę z Drosophila i nie podlegają przepisom dotyczącym dobrostanu zwierząt w Niemczech i Japonii.

1. Warunki ekspozycji na światło

  1. Przygotuj muchy przenoszące bezsensowną flippazę (sens-flp) i bruchpilot-frt-stop-frt-gfp (brp-FSF-gfp)15 do wizualizacji Brp-GFP w neuronach fotoreceptora R8 (R8s). Locus genomowy kodujący brp w sztucznym chromosomie bakteryjnym (BAC) został zmodyfikowany w celu wygenerowania tego konstruktu brp-FSF-gfp. U muszek przenoszących ten zmodyfikowany BAC ekspresja Brp-GFP jest pod kontrolą endogennych sekwencji regulatorowych, ale ograniczona do fotoreceptorów R8 po bezsensownym usunięciu kasety FRT-STOP-FRT za pośrednictwem bezsensownej flippazy15. Zauważ, że sens-flp rzadko wyraża flippazę w R7.
  2. Utrzymuj muchy w cyklu 12 godzin światła/12 godzin ciemności (LD) w temperaturze 25 °C od stadium larwy do eklozji (ryc. 1A).
  3. Zbierz muchy 0 - 6 godzin po eklozji i umieść je w nowej fiolce zawierającej pokarm dla much.
  4. Umieścić fiolki w przezroczystym stojaku wykonanym z żywicy akrylowej w trzech stopniach (wysokość 41 cm, podstawa 21 cm, grubość 4 cm i wysokość 13 cm dla każdego stopnia) (Rysunek 1B).
  5. Dostosuj odległość między szafą rack a panelem LED, aby zapewnić oświetlenie o średnim natężeniu 1,000 luksów za pomocą cyfrowego światłomierza (Rysunek 1C).
  6. Muchy należy trzymać przez 1–3 dni w jednym z następujących warunków: stała ciemność (DD), 12 godzin światła/12 godzin cyklu ciemności (LD) lub stałe światło (LL) w temperaturze 25 °C w małym inkubatorze (rysunki 1A i 1C).

2. Preparacja, immunohistochemia i obrazowanie

  1. Wypreparuj mózgi much za pomocą kleszczy, utrwal je 4% formaldehydem i barwnikiem immunologicznym za pomocą pierwotnego przeciwciała przeciwko Chaoptin (1:50) i drugiego przeciwciała do wizualizacji fotoreceptorów na podstawie poprzednich procedur eksperymentalnych25. Krótko:
    1. Przygotuj 0,1% Triton X-100 w PBS (0,1% PBT). Roztwór ten stosuje się w celu poprawy penetracji tkanek przeciwciał.
    2. Znieczulij muchy na elektrodce CO2 , posortuj prawidłowy genotyp i przenieś je na szalkę Petriego wypełnioną 0,1% PBT.
    3. Wbij kleszcze pod trąbkę i ściągnij odpowiednio prawe i lewe oko za pomocą innych kleszczy.
    4. Usuń trąbkę i tchawicę przyczepioną do mózgu.
    5. Przenieś mózg za pomocą kleszczy do probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 150 μl 0,1% PBT w temperaturze pokojowej.
    6. W ciągu 10 minut powtórz od 2.1.3 - 2.1.5, aby uzyskać jak najwięcej mózgów.
    7. Dodać 50 μl 16% formaldehydu do probówki i wymieszać pipetując.
    8. Inkubować mózgi w utrwalaczu w temperaturze pokojowej przez 50 minut.
    9. Przemyć trzykrotnie 200 μl 0,1% PBT za pomocą mikropipety, zwracając uwagę, aby pozostawić mózgi w probówce.
    10. Po ostatnim przemyciu usunąć 0,1% PBT i dodać pierwszorzędowy roztwór przeciwciała, przygotowany w następujący sposób: dodać do 196 μl 0,3% PBT (0,3% Triton X-100 w PBS) 4 μl przeciwciała anty-Chaoptin (końcowe rozcieńczenie 1:50) w celu wizualizacji fotoreceptorów.
    11. Inkubować mózgi w pierwszorzędowym roztworze przeciwciała w temperaturze 4 °C O/N.
    12. Przemyć 3x 200 μL 0,1% PBT za pomocą mikropipety.
    13. Po ostatnim przemyciu należy usunąć 0,1% PBT i dodać 200 μl 0,3% PBT zawierającego przeciwciało drugorzędowe.
    14. Inkubować w ciemności w temperaturze 4 °C O/N.
    15. Przemyć trzykrotnie 200 μl 0,1% PBT za pomocą mikropipety.
  2. Do montażu umieść dwie małe krople (po 2 μl każda) podłoża mocującego za pomocą mikropipety na środku szkiełka mikroskopowego w odległości około 2 cm od siebie.
  3. Umieść dwa szkiełka nakrywkowe, po jednym na każdej kropli i pozostaw wąską przerwę między szkiełkami nakrywkowymi wynoszącą około 0,2 mm.
  4. Umieścić 15 μl podłoża mocującego na wierzchu szkiełka nakrywkowego i dodać mózgi za pomocą mikropipety do podłoża mocującego.
  5. Pod mikroskopem preparacyjnym umieść mózgi brzuszną stroną do góry w wąskiej szczelinie między dwoma szkiełkami nakrywkowymi (ryc. 2).
  6. Umieść szkiełko nakrywkowe na wierzchu i uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego za pomocą przezroczystego lakieru do paznokci, aby utrwalić próbkę (Rysunek 2).
  7. Uzyskaj obrazy mózgów za pomocą mikroskopu konfokalnego. Użyj 63-krotnego obiektywu olejowego (1,4 N. A.) i 2,6-krotnego zoomu cyfrowego. Wygeneruj ponad 20 odcinków optycznych rdzenia drugiego zwoju wzrokowego z krokiem o wielkości 0,5 μm.

3. Generowanie punktów, obiektów powierzchniowych, punktów początkowych i końcowych

  1. Aby określić ilościowo liczbę, rozkład i poziom delokalizacji punkcji Brp-GFP, otwórz stos uzyskany za pomocą mikroskopii konfokalnej w oprogramowaniu do analizy obrazu i odtwórz obrazy 3D (ryc. 3A). Należy zauważyć, że krok w tym badaniu został wykonany z użyciem leku Imaris.
  2. Zidentyfikuj punkt Brp-GFP za pomocą modułu wykrywania punktowego dla każdego terminala aksonu R8.
    1. Wybierz opcję "Dodaj nowe miejsca".
    2. Wybierz opcję "Segmentuj tylko obszar zainteresowania" w ustawieniach algorytmu. Ręcznie wybierz zakończenie aksonu R8 w rdzeniu.
    3. Wybierz kanał źródłowy sygnału Brp-GFP.
      UWAGA: Aksony fotoreceptorów R7 i R8 były znakowane immunologicznie anty-Chaoptin (Figura 3A). Jednak tylko R8 zawiera Brp-GFP puncta i dlatego można go łatwo odróżnić (ryc. 3A). Co więcej, punkt końcowy R8 można zidentyfikować przez rozrzedzenie aksonów anty-chaoptin-dodatnich w punkcie wejścia do warstwy rdzenia M3.
    4. Ustaw szacowaną średnicę XY na 0,35 μm i zaznacz "Odejmowanie tła" w wykrywaniu punktowym.
    5. Wybierz "Jakość" w typie filtra i filtruj automatycznie. Następnie kliknij przycisk Zakończ.
    6. Powtórzyć od 3.2.1 t- 3.2.5 dla innych aksonów R (Rysunek 3B).
  3. Aby zmierzyć poziom delokalizacji Brp-GFP w aksonach R8, wygeneruj obiekty powierzchniowe z funkcją "Powierzchnia" dla każdego aksonu (rysunek 3C).
    1. Wybierz opcję "Dodaj nowe powierzchnie".
    2. Wybierz opcję "Segmentuj tylko obszar zainteresowania" w ustawieniach algorytmu. Następnie ręcznie wybierz zakończenie aksonu R8 w rdzeniu.
    3. Wybierz kanał źródłowy fotoreceptorów.
    4. Zaznacz "Gładkie".
    5. Wybierz "Intensywność bezwzględna" w progu.
    6. Zaznacz "Włącz". "Średnica punktów wysiewu" wynosi 0,5 μm.
    7. Wybierz typ filtru "Jakość" i "Liczba wokseli", a następnie filtruj automatycznie.
    8. Przejdź do "Edytuj" i usuń fragmenty powierzchni wygenerowane na innych nieinteresujących aksonach.
    9. Powtórz od 3.3.1 - 3.3.8 dla innych aksonów R (Rysunek 3C). Zauważ, że niektóre obiekty na powierzchni zostały przerwane z powodu cienkiego i słabego sygnału w fotoreceptorach w warstwie M2, ale nadal były one uważane za pojedynczy obiekt od punktu początkowego do końcowego.
  4. Aby zidentyfikować rozkład punktów Brp-GFP wzdłuż każdego neuronu w rdzeniu neuropil, zdefiniuj punkt początkowy i końcowy za pomocą funkcji punktu pomiaru (ryc. 3D).
    1. Wybierz opcję "Dodaj nowe punkty pomiaru". Następnie wybierz "Edytuj" i wybierz "Powierzchnia obiektu", aby przeciąć się z górną częścią obiektów powierzchni.
    2. Umieść punkty pomiarowe na powierzchni obiektów aksonów R w warstwie M1 w kolejności. Są one teraz zdefiniowane jako punkty początkowe (rysunek 3D).
    3. Wybierz opcję "Dodaj nowe punkty pomiaru". Następnie wybierz "Edytuj" i wybierz "Powierzchnia obiektu", aby przeciąć się z dolną częścią obiektów powierzchni.
    4. Umieść punkty pomiarowe na spodzie obiektów powierzchniowych aksonów R w warstwie M3 w kolejności. Są one teraz zdefiniowane jako punkty końcowe (rysunek 3D).
  5. Aby odjąć sygnał tła od kanału GFP, wygeneruj obiekty powierzchniowe, punkty, punkty początkowe i końcowe dla dwóch aksonów R w warstwie M6 (rysunek 3E).
    1. Wybierz opcję "Dodaj nowe powierzchnie".
    2. Wybierz opcję "Segmentuj tylko obszar zainteresowania" w ustawieniach algorytmu. Następnie ręcznie wybierz terminal aksonowy R7 między warstwą M5 i M6.
    3. Wybierz kanał źródłowy fotoreceptora.
    4. Zaznacz "Gładkie".
    5. Wybierz "Intensywność bezwzględna" w progu.
    6. Wybierz typ filtra "Jakość" i "Liczba wokseli", a następnie filtruj automatycznie.
    7. Wybierz opcję "Dodaj nowe miejsca".
    8. Zaznacz opcję "Pomiń automatyczne tworzenie, edytuj ręcznie".
    9. Wybierz "Środek obiektu" i dodaj punkt w wewnętrznym obszarze obiektu powierzchni wygenerowanego z 3.5.1 - 3.5.6.
    10. Powtórz od 3.5.1 do 3.5.9 dla innego terminala aksonu R7.
    11. Wybierz opcję "Dodaj nowe punkty pomiaru". Następnie wybierz "Edytuj" i umieść punkty pomiarowe na dwóch obiektach powierzchniowych końcówki terminala aksonu R7 w warstwie M6. Są one teraz definiowane jako punkty początkowe.
    12. Wybierz opcję "Dodaj nowe punkty pomiaru". Następnie wybierz "Edytuj" i umieść punkty pomiarowe na spodzie dwóch obiektów powierzchniowych końcówki terminala aksonowego R7 w warstwie M6. Są one teraz zdefiniowane jako punkty końcowe (rysunek 3E).

4. Obliczanie liczby plamek, rozkładu częstotliwości plamek i poziomu wzbogacenia Brp-GFP za pomocą dostosowanego oprogramowania do analizy danych obrazu

  1. Skopiuj plik "XtquantifySynapseSNR.m" i folder "functions" do folderu Imaris XT matlab. Należy pamiętać, że obliczenia w tym badaniu zostały wykonane za pomocą dostosowanej wtyczki zaimplementowanej w Matlabie. Pobierz wtyczkę ze strony internetowej (https://github.com/cmohl2013/synapse_trafo).
  2. Otwórz zestaw danych z n punktami, n powierzchniami i 2 obiektami punktów pomiarowych, z których każdy zawiera n punktów pomiarowych (przygotowanych na podstawie 3.1 - 3.4). Pierwszy obiekt punktu pomiarowego definiuje pozycje początkowe dla wszystkich aksonów. Drugi obiekt punktu pomiarowego określa położenie końcowe wszystkich aksonów. Oba obiekty punktów pomiarowych muszą mieć taką samą liczbę punktów pomiarowych (czyli liczbę aksonów).
  3. Wykonywanie przetwarzania obrazu>>CUSTOM>atsushis wykrywania synaps Vs 6.
  4. Sprawdź metadane i zmień rozmiary pikseli w oprogramowaniu do analizy obrazu, jeśli nie jest poprawne.
  5. Wybierz kanał do przeprowadzenia analizy intensywności regionów plamek i regionów cytoplazmatycznych (kanał z Brp-GFP).
  6. Zdefiniuj nazwę pliku do eksportowania wyników.
  7. Określ liczbę pojemników i długość aksonów w procentach. Wprowadź liczbę pojemników jako "10" i zakres pojemników jako "100%" (rysunki 4A i 4B).
  8. Zdefiniuj regiony plam i inne regiony cytoplazmatyczne do analizy delokalizacji Brp-GFP. Wprowadź promień plamki jako "0,35 μm" i szerokość otaczającego obszaru jako "50 μm". Promień plamki określa obszar dla sygnału puncta GFP (średnica 0,35 μm, wyśrodkowany na jednym punkcie). Szerokość otaczającego obszaru określa obszar dla sygnału GFP w obszarze cytoplazmatycznym (średnica 50 μm, wyśrodkowany na punkcie, ale obejmujący tylko R8 i wykluczający wszystkie obszary plamki w cytoplazmie) (ryc. 4A i 4C).
  9. Poczekaj, aż wszystkie maski neuronów zostaną przetworzone i wyeksportowane jako pliki PDF (rysunki 4B i 4C) oraz tabelę csv do dalszej analizy w arkuszu kalkulacyjnym. Tabela csv zawiera liczbę plamek, średnią intensywność sygnału w "obszarze cytoplazmatycznym" oraz maksymalną intensywność sygnału w "plamce" w każdym pojemniku dla wszystkich aksonów R8.
  10. Otwórz zestaw danych przygotowany w wersji 3.5 w celu odjęcia sygnału tła.
  11. Wykonaj przetwarzanie obrazu zgodnie z opisem w 4.3 - 4.9.
  12. Oblicz średnią całkowitej liczby i rozkładu punktów Brp-GFP w arkuszu kalkulacyjnym (rysunki 4D i 4E).
  13. Oblicz średnią delokalizacji sygnału Brp-GFP w arkuszu kalkulacyjnym przez stosunek średniej intensywności w "obszarze cytoplazmatycznym" do maksymalnej intensywności w "plamce" odjętej przez średnią intensywność sygnału tła (rysunek 4F).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oko złożone Drosophila składa się z ~780 ommatidiów, z których każdy zawiera osiem typów fotoreceptorów (R1-8). R7 i R8 rzutują swoje aksony na drugi zwój wzrokowy, rdzeń, gdzie tworzą synapsy w warstwach M6 i M3, odpowiednio26. Do zbadania wpływu długotrwałej ekspozycji na światło na skład molekularny stref aktywnych fotoreceptora R8 wykorzystaliśmy metodę STaR15. Endogenne poziomy ekspresji Brp znakowano fluorescencyjnie poprzez o...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym badaniu pokazaliśmy, jak przygotować warunki świetlne, aby wystawić muchy na działanie jednakowego natężenia światła. Określiliśmy ilościowo nie tylko liczbę markerów synaptycznych puncta, ale mogliśmy również przestrzennie określić gęstość synaps wzdłuż aksonów i zmierzyć poziom delokalizacji białka markerowego w obszarach cytoplazmatycznych. Te trzy oceny pozwalają nam ocenić szczegóły dynamiki synaptycznej na poziomie pojedynczego neuronu w różnych warunkach środowiskowych. Nasz protokół można dostosować do różn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jesteśmy wdzięczni T. Stürnerowi za pomocne poprawki, dyskusje i komentarze do manuskryptu; S.L. Zipursky za dostarczenie zapasów much; M Schölling do obróbki obrazu. Część analizy obrazu została wykonana w laboratorium A. Kakita. Prace te były wspierane przez Fundację Alexandra von Humboldta oraz JSPS Fellowships for Research Abroad (A.S.), JSPS Fellows (S.H.-S.), Grant-In-Aid for Start-up (24800024), On Innovative Areas (25110713), Mochida, Takeda, Inamori, Daiichi-Sankyo, Toray Foundations (T.S.), DZNE core funding (G.T.) oraz DZNE Light Microscopy Facility (CM).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
FiolkaHightech, JaponiaMKC-20
PlugThermo Fisher Sciehtific, USAAS-275
Dostosowany przezroczysty stojak wykonany z żywicy akrylowej Shin-Shin Corporation, Japoniawysokość 41 cm, podstawa 21 cm, grubość 4 cm i wysokość 13 cm dla każdego stopnia
Chłodny inkubatorMITSUBISHI ELECTRIC, JaponiaCN-40A
Panel LEDMISUMI, JaponiaLEDXC170-W
Cyfrowy światłomierzCEMDT-1301
Podkładka pod muchyTokken, JaponiaTK-HA03-S
szalka Petriego (35 x 10 mm)Greiner Bio-One International, Niemcy627102
tabletka PBSTakara, JaponiaT900
Triton X-100Wako, Japonia160-24751
Dumont #5 KleszczeNarzędzia do nauki o naprawie11251-20
1,5 ml probówkaSarstedt, NiemcyA. 152X
Formaldehyd 16%NEM, Japonia3152
Pipetman P-200GilsonF123601 
Pipetman P-20GilsonF123600
Pipetman P-2GilsonF144801
przeciwciało anty-chaoptynoweDSHB24B10
Alexa568-sprzężone przeciwciało anty-mysieLife TechnologiesA-11031
VECTASHIELD Podłoże montażoweVector Laboratories, Inc.H-1000
(76 x 26 mm)Thermo Fisher Scientific Gerhard Menzel B.V. & Co. KG, Niemcy
Szkiełko nakrywkowe (18 x 18 mm, 0,17 mm)Zeiss, Niemcy474030-9000-000
Mikroskopy przemysłoweOlympus, JaponiaSZ61-C-SET
Stereoskop OświetlenieOlympus, JaponiaKL 1600 LED
mikroskopia konfokalnaZeiss, NiemcyLSM780
ImarisBitplane, SzwajcariaWersja 7.6.4 lub nowsza
MatlabThe MathWorks, Inc., USA
Excel dla komputerów Mac Firmy Microsoft
Szkiełko mikroskopowe

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alabi, A. A., Tsien, R. W. Synaptic Vesicle Pools and Dynamics. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (8), (2012).
  2. Couteaux, R., Pecot-Dechavassine, M. [Synaptic vesicles and pouches at the level of "active zones" of the neuromuscular junction]. C R Acad Sci Hebd Seances Acad Sci D. 271 (25), 2346-2349 (1970).
  3. Schoch, S., Gundelfinger, E. D. Molecular organization of the presynaptic active zone. Cell and Tissue Research. 326 (2), 379-391 (2006).
  4. Sudhof, T. C. The Presynaptic Active Zone. Neuron. 75 (1), 11-25 (2012).
  5. Owald, D., Sigrist, S. J. Assembling the presynaptic active zone. Curr Opin Neurobiol. 19 (3), 311-318 (2009).
  6. Lazarevic, V., Schone, C., Heine, M., Gundelfinger, E. D., Fejtova, A. Extensive remodeling of the presynaptic cytomatrix upon homeostatic adaptation to network activity silencing. J Neurosci. 31 (28), 10189-10200 (2011).
  7. Matz, J., Gilyan, A., Kolar, A., McCarvill, T., Krueger, S. R. Rapid structural alterations of the active zone lead to sustained changes in neurotransmitter release. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (19), 8836-8841 (2010).
  8. Spangler, S. A., et al. Liprin-alpha2 promotes the presynaptic recruitment and turnover of RIM1/CASK to facilitate synaptic transmission. J Cell Biol. 201 (6), 915-928 (2013).
  9. Sugie, A., et al. Molecular Remodeling of the Presynaptic Active Zone of Drosophila Photoreceptors via Activity-Dependent Feedback. Neuron. 86 (3), 711-725 (2015).
  10. Sigrist, S. J., Schmitz, D. Structural and functional plasticity of the cytoplasmic active zone. Curr Opin Neurobiol. 21 (1), 144-150 (2011).
  11. Kittel, R. J., et al. Active zone assembly and synaptic release. Biochem Soc Trans. 34 (Pt 5), 939-941 (2006).
  12. Kittel, R. J., et al. Bruchpilot promotes active zone assembly, Ca2+ channel clustering, and vesicle release. Science. 312 (5776), 1051-1054 (2006).
  13. Hallermann, S., et al. Naked dense bodies provoke depression. J Neurosci. 30 (43), 14340-14345 (2010).
  14. Wagh, D. A., et al. Bruchpilot, a protein with homology to ELKS/CAST, is required for structural integrity and function of synaptic active zones in Drosophila. Neuron. 49 (6), 833-844 (2006).
  15. Chen, Y., et al. Cell-type-specific labeling of synapses in vivo through synaptic tagging with recombination. Neuron. 81 (2), 280-293 (2014).
  16. Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. Quantitative analysis of Drosophila larval neuromuscular junction morphology. Cold Spring Harb Protoc. 2012 (4), 490-493 (2012).
  17. Ippolito, D. M., Eroglu, C. Quantifying synapses: an immunocytochemistry-based assay to quantify synapse number. J Vis Exp. (45), (2010).
  18. Schmitz, S. K., et al. Automated analysis of neuronal morphology, synapse number and synaptic recruitment. J Neurosci Methods. 195 (2), 185-193 (2011).
  19. Danielson, E., Lee, S. H. SynPAnal: software for rapid quantification of the density and intensity of protein puncta from fluorescence microscopy images of neurons. PLoS One. 9 (12), e115298(2014).
  20. Sanders, J., Singh, A., Sterne, G., Ye, B., Zhou, J. Learning-guided automatic three dimensional synapse quantification for drosophila neurons. BMC Bioinformatics. 16, 177(2015).
  21. Peng, H., Ruan, Z., Atasoy, D., Sternson, S. Automatic reconstruction of 3D neuron structures using a graph-augmented deformable model. Bioinformatics. 26 (12), i38-i46 (2010).
  22. Sturt, B. L., Bamber, B. A. Automated quantification of synaptic fluorescence in C. elegans. J Vis Exp. (66), (2012).
  23. Kremer, M. C., et al. Structural long-term changes at mushroom body input synapses. Curr Biol. 20 (21), 1938-1944 (2010).
  24. Mosca, T. J., Luo, L. Synaptic organization of the Drosophila antennal lobe and its regulation by the Teneurins. Elife. 3, e03726(2014).
  25. Wu, J. S., Luo, L. A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining. Nat Protoc. 1 (4), 2110-2115 (2006).
  26. Fischbach, K. F., Dittrich, A. P. M. The Optic Lobe of Drosophila-Melanogaster .1 A Golgi Analysis of Wild-Type Structure. Cell and Tissue Research. 258 (3), 441-475 (1989).
  27. Berger-Muller, S., et al. Assessing the role of cell-surface molecules in central synaptogenesis in the Drosophila visual system. PLoS One. 8 (12), e83732(2013).
  28. Fouquet, W., et al. Maturation of active zone assembly by Drosophila Bruchpilot. J Cell Biol. 186 (1), 129-145 (2009).
  29. Ke, M. T., et al. Super-Resolution Mapping of Neuronal Circuitry With an Index-Optimized Clearing Agent. Cell Rep. 14 (11), 2718-2732 (2016).
  30. Ehmann, N., et al. Quantitative super-resolution imaging of Bruchpilot distinguishes active zone states. Nat Commun. 5, 4650(2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Fotoreceptory Drosophilaanaliza strefy aktywnejkwantyfikacja Bruchpilotaprotok immunohistochemicznyoprogramowanie do analizy obrazumetoda detekcji punkt wpomiar orientacji akson wocena plastyczno ci synaptycznejefekty ekspozycji na wiat o

Powiązane artykuły