Tutaj opisane są zoptymalizowane metody generowania in vivo i in vitro modeli stłuszczenia wątroby oraz analizy fenotypów stłuszczeniowych i związanych z nimi parametrów fizjologicznych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Zoptymalizowana analiza stłuszczenia wątroby in vivo i in vitro
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Ustanowienie systemu procedur do jakościowego i ilościowego charakteryzowania stłuszczenia wątroby in vivo i in vitro jest ważne dla badań metabolicznych w wątrobie. W tym miejscu opisano liczne testy w celu kompleksowego pomiaru fenotypu i parametrów stłuszczenia wątroby w modelach mysich i hepatocytów.
Łącząc metody fizjologiczne, histologiczne i biochemiczne, system ten może być używany do oceny postępu stłuszczenia wątroby. In vivo pomiary masy ciała i magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) zapewniają ogólne zrozumienie myszy w sposób nieinwazyjny. Barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E) oraz czerwoną czerwienią olejową określa morfologię histologiczną i odkładanie się lipidów w tkance wątroby w warunkach przeciążenia składnikami odżywczymi, takich jak karmienie dietą wysokotłuszczową. Następnie całkowita zawartość lipidów jest izolowana przez ekstrakcję chloroformem/metanolem, po której następuje analiza biochemiczna pod kątem trójglicerydów i cholesterolu. Co więcej, pierwotne hepatocyty myszy są traktowane wysokim poziomem glukozy i insuliny w celu stymulacji akumulacji lipidów, co jest skutecznym modelem in vitro do naśladowania hiperglikemii i hiperinsulinemii wywołanej dietą in vivo. Następnie osadzanie lipidów mierzy się za pomocą barwienia czerwienią olejową O i ekstrakcji chloroformem/metanolem. Barwienie czerwienią olejową O określa intuicyjne fenotypy stłuszczeniowe wątroby, podczas gdy analiza ekstrakcji lipidów określa parametry, które można analizować statystycznie. Obecne protokoły są interesujące dla naukowców zajmujących się stłuszczeniem wątroby, insulinoopornością i cukrzycą typu 2.
Wprowadzenie
Otyłość jest rosnącym problemem zdrowotnym w krajach rozwiniętych i rozwijających się. Doniesiono, że jest to jeden ze współistniejących stanów często związanych z niealkoholową stłuszczeniową chorobą wątroby (NAFLD), z częstością występowania od 30 do 100 procent u pacjentów z NAFLD1. Ze względu na silną korelację między stłuszczeniem wątroby a otyłością, modele myszy otyłości wywołanej dietą (DIO) są szeroko stosowane do badania złożonych mechanizmów molekularnych związanych z rozwojem NAFLD2,3,4,5,6. Stłuszczenie wątroby jest najwcześniejszym stadium NAFLD i może przekształcić się w niealkoholowe stłuszczeniowe zapalenie wątroby (NASH), marskość wątroby i ostatecznie raka wątroby7. Dlatego ogólnym celem tej metody jest wygenerowanie zwierzęcych i komórkowych modeli stłuszczeniowych wątroby oraz dostarczenie szczegółowych protokołów do wydajnego i dokładnego pomiaru lipidów. Te modele i pomiary są również przydatne do badania innych zaburzeń metabolicznych, takich jak insulinooporność i cukrzyca typu 2.
Ponieważ otyłość jest uznawana za jeden z kluczowych czynników ryzyka NAFLD, do wywoływania otyłości u myszy stosuje się dietę wysokotłuszczową o wysokiej zawartości sacharozy (HFHS), która naśladuje dietę wysokotłuszczową w stylu zachodnim. Następnie stopień stłuszczenia wątroby można ocenić różnymi metodami. Po pierwsze, analiza masy ciała i składu ciała za pomocą magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) pokazuje akumulację lipidów w czasie karmienia. Masę tłuszczową i beztłuszczową masę można określić ilościowo w sposób nieinwazyjny i w czasie rzeczywistym.
Ponadto, rezonans magnetyczny (MRI) jest używany do pokazania zarówno rozkładu tłuszczu w całym ciele, jak i w wątrobie. Sygnał skali szarości analizy MRI można przekształcić w czytelny pseudokolorowy obraz, a intensywność skali szarości i koloru jest półkwantyfikowalna. Technologia ta zapewnia wyjątkowe korzyści w zakresie pomiaru akumulacji lipidów u żywych zwierząt. Po drugie, analiza histologiczna wątroby jest najczęściej stosowaną metodą określania stłuszczenia wątroby. Barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E) dostarcza informacji histologicznych, takich jak morfologia hepatocytów i infiltracja makrofagów, podczas gdy barwienie czerwienią olejową O pokazuje wielkość i położenie kropelek lipidów w hepatocytach. Po trzecie, analiza zawartości lipidów za pomocą ekstrakcji chloroformem/metanolem jest dokładnym i ilościowym pomiarem lipidów wątrobowych. Całkowity poziom trójglicerydów i cholesterolu można zmierzyć metodami biochemicznymi. Co ważne, analiza ekstrakcji lipidów i barwienie czerwienią olejową O mogą być również stosowane w hepatocytach modyfikowanych genetycznie lub leczonych farmakologicznie.
Zaletą obecnej metody jest wykorzystanie wielu zoptymalizowanych podejść do generowania modeli stłuszczeniowych wątroby i kompleksowego charakteryzowania fenotypów zarówno in vivo, jak i in vitro. Mysie modele DIO mogą podsumować patologię i fenotypy metaboliczne ludzkiej stłuszczeniowej choroby wątroby. Inne parametry metaboliczne u ludzi również mogą być replikowane w tym modelu8. Generowanie stłuszczeniowego modelu hepatocytów w odpowiedzi na wysoki poziom glukozy i insuliny jest wydajne, użyteczne i przezwycięża ograniczenia związane z kosztowną i czasochłonną pracą myszy. Podsumowując, metody te są wystarczające i niezbędne do badania dysfunkcji lipidów w wątrobie i insulinooporności podczas przeciążenia składnikami odżywczymi.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie protokoły eksperymentalne na zwierzętach zostały zatwierdzone przez instytucjonalny komitet ds. opieki i użytkowania zwierząt w Instytucie Nauk o Żywieniu, Szanghajskim Instytucie Nauk Biologicznych, Chińskiej Akademii Nauk (Szanghaj, Chiny).
1. Model myszy DIO
- Karmienie HFHS
- Nakarm ośmiotygodniowego samca myszy C57BL/6 HFHS, który zawiera 40 kcal% tłuszczu i 40 kcal% sacharozy. Umieść je w 12-godzinnym cyklu ciemnego światła.
- Utrzymuj myszy w stanie odżywiania HFHS przez cztery do szesnastu tygodni. Sprawdzaj masę ciała co tydzień.
- Analiza składu ciała i analiza obrazu pseudo-kolorowego
- Poddaj myszy analizie analizatora składu ciała.
- Zabezpiecz przytomne, nie znieczulone myszy w plastikowej tubie w. Zmierz masę tkanki tłuszczowej, beztłuszczową masę i płyny za pomocą systemu NMR, jak opisano wcześniej2.
- Zeskanuj całe ciało każdej myszy za pomocą systemu MRI.
- Znieczulić myszy 1% awertyną za pomocą wstrzyknięcia dootrzewnowego (25 μL/g) i przeprowadzić analizę obrazową w specjalistycznych szklanych rurkach.
UWAGA: Proces obrazowania trwa blisko 0,5 godziny dla każdej myszy. Po zakończeniu pomiaru włóż myszy z powrotem do klatki.
- Znieczulić myszy 1% awertyną za pomocą wstrzyknięcia dootrzewnowego (25 μL/g) i przeprowadzić analizę obrazową w specjalistycznych szklanych rurkach.
- Skanuj całe ciała myszy w warstwie grzbietowej, środkowej i brzusznej; skanuj wątrobę w kierunku pionowym. Użyj magnesu 0,55 T i następujących parametrów instrumentalnych: przestrzeń K = 192 x 256 μm, grubość przekroju = 3 mm, TE = 14,8 ms, TR = 400 ms, FOVRead = 100 mm, FOVPhase = 100 mm i liczba skanów = 8. Skanuj przy użyciu tych samych warunków magnetycznych dla wszystkich grup myszy.
- Odwzoruj obraz w skali szarości na obraz pseudokolorowy zgodnie z intensywnością sygnału9.
- Poddaj myszy analizie analizatora składu ciała.
- Eutanazja myszy
- Sterylizuj narzędzia preparacyjne, takie jak kleszcze i nożyczki.
- Wlej wystarczającą ilość izofluranu na ręcznik papierowy i pozwól izofluranowi ulatniać się w szklanym słoiku. Upewnij się, że myszy są uśpione za pomocą izofluranu.
- Zamocuj myszy na stole operacyjnym. Spryskaj każdy brzuch 75% etanolem, wykonaj nacięcie w skórze właściwej wyrostka mieczykowatego za pomocą nożyczek i rozerwij skórę właściwą wzdłuż linii środkowej rękami, aby odsłonić otrzewną.
- Zacisnąć wyrostek mieczykowaty za pomocą kleszczy i przeciąć otrzewną wzdłuż dna żeber, aby odsłonić wnętrzności.
- Zebrać krew w probówkach pokrytych EDTA przez nakłucie serca.
- Przetnij przeponę wzdłuż wątroby i ostrożnie usuń wątrobę z enterocelii za pomocą cienkich nożyczek. Wytnij trzy kawałki tkanki wątroby do następujących pomiarów lipidów: a) 6 x 3 x 3 mm do barwienia H&E, b) 6 x 3 x 3 mm do barwienia czerwienią olejową O i c) 20-40 mg wątroby do ekstrakcji chloroformem/metanolem.
- Barwienie H&E
- Utrwalić wątrobę w 4% buforowanym fosforanem octanie formaliny w temperaturze 4 °C przez noc, a następnie zanurzyć ją w wosku parafinowym.
- Wytnij skrawki parafiny (5 μm) i zamontuj je na szkiełkach do barwienia H&E, jak opisano wcześniej3,10.
- Barwienie czerwienią olejową O
- Przygotowanie Regenta
- Przygotuj roztwór roboczy Oil Red O z 10% formaliną, 60% izopropanolem, hematoksyliną i galaretką glicerolową. Rozpuścić 0,5 g proszku Oil Red O w 100 ml izopropanolu i podgrzać w łaźni o temperaturze 60 °C, aby uzyskać 0,5% roztwór podstawowy.
- Rozcieńczyć wodą podwójnie destylowaną (ddH2O) w stosunku 3:2 (3 ml roztworu podstawowego i 2 ml ddH2O). Przefiltrować roztwór roboczy i odstawić na co najmniej 10 minut w temperaturze pokojowej.
- Osadź wątrobę w związku o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) w plastikowym pudełku do zatapiania. Zamrażać w temperaturze -20 °C przez 30 min. Pokrój ją na odcinki o grubości 8 μm w zamrażającym mikrotomie, zamontuj chusteczkę na szkiełku podstawowym i umieść w temperaturze pokojowej na 30 minut.
- Umieść ręcznik papierowy na dnie wanny do barwienia i wlej niewielką ilość 10% formaliny, aby zwilżyć ręcznik papierowy. Umieścić szkiełko w pojemniku do barwienia i utrwalić zamrożone fragmenty w oparach formaldehydu na 5 minut w temperaturze 4 °C.
- Zanurz szkiełko w 60% izopropanolu w wannie barwiącej na 3 sekundy; powtórz raz.
- Dodać kilka kropli roztworu roboczego Oil Red O do szkiełka, aby pokryć całą tkankę i inkubować przez 15 minut. Chronić tkankę przed światłem w temperaturze pokojowej.
- Płucz szkiełko w nowym 60% izopropanolu w wannie barwiącej przez 3 sekundy; powtórz dwukrotnie.
- Delikatnie przepłucz szkiełko dwukrotnie w wodzie destylowanej i usuń wodę z tkanki. Pamiętaj, aby nie wysuszyć chusteczki.
- Umieść szkiełko w Hematoxylin na 1 minutę i delikatnie spłukuj wodą z kranu przez 5-10 minut. Delikatnie opłucz szkiełko dwukrotnie w wodzie destylowanej i trzymaj je w wodzie destylowanej, aż będzie gotowe do nałożenia na szkiełko nakrywkowe.
- Podgrzej galaretkę glicerolową w kuchence mikrofalowej i umieść kilka kropli na chusteczce. Delikatnie połóż szkiełko nakrywkowe na wierzchu i uważaj, aby nie tworzyły się bąbelki.
- Obserwuj plamę pod mikroskopem i uchwyć charakterystyczne obrazy za pomocą obiektywów 20X i 40X.
- Przygotowanie Regenta
- Pomiar lipidów w wątrobie
- Umieść wypreparowaną tkankę wątroby w nowej plastikowej probówce wirówkowej o pojemności 2 ml. Homogenizować w 1 ml PBS za pomocą homogenizatora i przenieść lizat do nowej szklanej probówki o pojemności 15 ml.
- Dodać 5 ml roztworu chloroformu/metanolu (2:1, v/v), energicznie mieszać mieszaninę przez 1 minutę i odstawić na 2 godziny na lód.
- Wirować przy 1,650 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C; mieszanina powinna zostać podzielona na 3 warstwy: górną warstwę metanolu, środkową warstwę białka i dolną warstwę chloroformu i lipidów.
- Przenieść dolną fazę do nowej szklanej rurki za pomocą szklanej pipety Pasteura; nie ma potrzeby pobierania każdej kropli dolnej frakcji. Odłóż rurkę na bok na lodzie.
- Dodać 600 μl 4 mM MgCl2 i 1,5 ml chloroformu do frakcji sklarowanej nad osadem pozostawionej w poprzedniej probówce i energicznie wirować. Inkubować na lodzie przez 30 minut i odwirowywać przy 1,650 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
- Połączyć dolną fazę z pierwszą rurką dolnej fazy za pomocą pipety Pasteura. Odrzuć górną i środkową warstwę.
- Odparować chloroform w gazowym azocie w łaźni o temperaturze 37 °C. Dokładnie umyć boki szklanych probówek 200 μl 1% Triton X-100/chloroform (v/v). Odparować w gazowym azocie. Rozpuść lipid w 200 μl ddH2O i dobrze odwiruj, aby uzyskać ostateczną emulsję.
- Zmierz całkowity poziom trójglicerydów (TG) i cholesterolu (TC) za pomocą zestawu do pomiaru trójglicerydów lub cholesterolu zgodnie z protokołem producenta3.
UWAGA: Wartości lipidów są znormalizowane do stężeń białka w początkowym homogenacie, zgodnie z określeniem ilościowym białka3.
2. Pierwotny model hepatocytów myszy
- Izolacja pierwotnych hepatocytów myszy
- Znieczulij każdą mysz 6% hydratem chloralu (10 μl/g dootrzewnowo).
- Wyizoluj pierwotne hepatocyty, jak opisano wcześniej10. Hoduj komórki na szkiełkach nakrywkowych pokrytych kolagenem w 6-dołkowej płytce do barwienia czerwienią olejową O. W celu ekstrakcji lipidów umieść komórki na 10-centymetrowym naczyniu do hodowli komórkowych10.
- Leczenie komórkowe i barwienie czerwienią olejową O
- Zastąp pożywkę 2 ml pożywki głodowej i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 24 godziny. Potraktuj ją 30 mM glukozy i 100 nM insuliny. Inkubować w inkubatorze hodowli w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.
- Zassać pożywkę. Dodaj 2 ml PBS i delikatnie zamieszaj, aby spłukać pożywkę; Powtórz raz.
- Przymocuj szkiełko nakrywkowe do szkiełka za pomocą gumki. Odsłoń komórki przylegające do powierzchni zewnętrznej. Wykonaj barwienie czerwienią olejową O, jak opisano powyżej (krok 1.5).
UWAGA: Podstawowe poziomy akumulacji lipidów są stymulowane przez leczenie wysokim poziomem glukozy i insuliną po głodzeniu surowicy. Krople lipidów są wizualizowane przez barwienie czerwienią olejową O.
- Pomiar lipidów
- Leczyć hepatocyty wysokim poziomem glukozy i insuliną w tym samym stanie (krok 2.2.1). Dodaj 1 ml PBS do każdego 10-centymetrowego naczynia do hodowli komórkowych. Zeskrobać komórki i zebrać je do nowych szklanych probówek o pojemności 15 ml, z których porcje 100 μl przenosi się do świeżych probówek o pojemności 1,5 ml w celu ilościowego określenia białka.
- Dodać 4 ml chloroformu/metanolu (2:1, v/v) do pozostałych 900 μl komórek. Sonikuj przez około 20 sygnałów dźwiękowych, a następnie energicznie wiruj, aby uwolnić lipid w komórkach. Inkubować mieszaninę na lodzie przez 2 godziny. Wykonaj ekstrakcję lipidów (krok 1.6).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Jak pokazano na Rysunku 1A, masa ciała myszy wzrosła do 45±1.2 g po 16 tygodniach żywienia dietą HFHS, co stanowi wartość około 1,5-krotnie wyższą niż w grupie karmionej standardową karmą. Analizy składu ciała metodą NMR, obrazujące masę tłuszczową i beztłuszczową myszy, przedstawiono na Rysunku 1B. Rozkład tkanki tłuszczowej w całym organizmie oraz w wątrobie określono za pomocą MRI; reprezentatywne obrazy w pseudokolorach uzyskane u żywych, świadomych m...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
NAFLD to szereg postępujących chorób wątroby, które są związane z zespołem metabolicznym, otyłością, insulinoopornością lub cukrzycą typu 2 (T2DM)11. Cechą charakterystyczną NAFLD jest stłuszczenie, czyli nagromadzenie lipidów w hepatocytach. W tym miejscu przedstawiono spektrum metod charakteryzujących fenotypy i parametry stłuszczenia wątroby przy użyciu myszy DIO i pierwotnych hepatocytów myszy. Procedura ta może być pomocna w wyjaśnieniu mechanizmów molekularnych NAFLD i innych powiązanych cho...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Finansowanie: Praca ta była wspierana przez granty z Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (nr 81270930, 31471129 i 31671224) oraz Programu Stu Talentów Chińskiej Akademii Nauk (2013OHTP04) dla Y.L.
Podziękowania
Dziękujemy Feifei Zhang za pomocne dyskusje. Jesteśmy wdzięczni Jing Gao i Yixuan Sun za pomoc techniczną oraz Zhengshuai Liu i Fengguang Ma za badania na zwierzętach.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Związek O.C.T | SAKURA | 4583 | |
| Olej czerwony O | Sigma | O0625-25G | |
| Zestaw trójglicerydów nieskończoności | Fisher Zestaw | do pomiaru cholesterolu Infinity TR22421 | |
| Fisher Scientific | TR13421 | ||
| Kolagen typu I, ogon szczura | Milipor | 08-115 | |
| DMEM (niski poziom glukozy) | Invitrogen | 11885-092 | |
| Penicylina / Streptomycyna | Invitrogen | 15140-122 | |
| FBS | Invitrogen | 10099141 | |
| PBS | cellgro | R21-040-CVR | |
| HBSS | cellgro | 20-021-CV | |
| Insulina | TOCRIS Bioscience | 3435 | rozpuszcza się w PBS, 1 mM dla zapasu |
| Glukoza | Sigma | G8270-100G | |
| Mikroskop Olympus | BX53 | ||
| Pompa perystaltyczna | Longerpump | BT100-2J | |
| 10 cm naczynie do hodowli komórkowych | Corning | 420167 | |
| płytka 6-dołkowa | Test BCA Corning | 3516 | |
| Beyotime | P0010 | ||
| Magnetyczny rezonans jądrowy | Technologia Niumag | MiniQMR23-060H-I | |
| Dieta wysokotłuszczowa i surcosowa (HFHS) | Diety badawcze | D12327 |
Bibliografia
- Angulo, P. Medical progress - Nonalcoholic fatty liver disease. New England Journal of Medicine. 346 (16), 1221-1231 (2002).
- Chen, X., et al. Hepatic ATF6 Increases Fatty Acid Oxidation to Attenuate Hepatic Steatosis in Mice through Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Alpha. Diabetes. 65 (7), 1904-1915 (2016).
- Li, Y., et al. AMPK phosphorylates and inhibits SREBP activity to attenuate hepatic steatosis and atherosclerosis in diet-induced insulin-resistant mice. Cell Metab. 13 (4), 376-388 (2011).
- Li, Y., et al. Hepatic SIRT1 attenuates hepatic steatosis and controls energy balance in mice by inducing fibroblast growth factor 21. Gastroenterology. 146 (2), 539-549 (2014).
- Esau, C., et al. miR-122 regulation of lipid metabolism revealed by in vivo antisense targeting. Cell Metabolism. 3 (2), 87-98 (2006).
- Kanda, H., et al. MCP-1 contributes to macrophage infiltration into adipose tissue, insulin resistance, and hepatic steatosis in obesity. Journal of Clinical Investigation. 116 (6), 1494-1505 (2006).
- Cohen, J. C., Horton, J. D., Hobbs, H. H. Human fatty liver disease: old questions and new insights. Science. 332 (6037), 1519-1523 (2011).
- Hebbard, L., George, J. Animal models of nonalcoholic fatty liver disease. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 8 (1), 35-44 (2011).
- Chen, Y., et al. Highly effective inhibition of lung cancer growth and metastasis by systemic delivery of siRNA via multimodal mesoporous silica-based nanocarrier. Biomaterials. 35 (38), 10058-10069 (2014).
- Gong, Q., et al. Fibroblast growth factor 21 improves hepatic insulin sensitivity by inhibiting mammalian target of rapamycin complex 1 in mice. Hepatology. 64 (2), 425-438 (2016).
- Anstee, Q. M., Targher, G., Day, C. P. Progression of NAFLD to diabetes mellitus, cardiovascular disease or cirrhosis. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (6), 330-344 (2013).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
