Artykuł metodologiczny

Ukierunkowane różnicowanie pierwotnych i ostatecznych progenitorów hematopoetycznych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

DOI:

10.3791/55196

⸱

1 listopada 2017

 , 
1Department of Internal Medicine, Hematology Division, Washington University in St. Louis

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokoły hodowli ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC), używane do różnicowania hPSC na hematopoetyczne komórki progenitorowe CD34+. Metoda ta wykorzystuje specyficzną dla etapu manipulację kanoniczną sygnalizacją WNT w celu określenia komórek wyłącznie do ostatecznego lub pierwotnego programu krwiotwórczego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jednym z głównych celów medycyny regeneracyjnej jest wytwarzanie i utrzymywanie hematopoetycznych komórek macierzystych (HSC) pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC). Do niedawna wysiłki zmierzające do różnicowania hPSC w HSC generowały głównie hematopoetyczne komórki progenitorowe, które nie mają potencjału HSC, a zamiast tego przypominają hematopoezę woreczka żółtkowego. Te powstałe hematopoetyczne czynniki progenitorowe mogą mieć ograniczoną użyteczność w modelowaniu in vitro różnych zaburzeń układu krwiotwórczego u dorosłych, szczególnie tych z linii limfoidalnych. Jednak niedawno opisaliśmy metody generowania erytro-mielo-limfoidalnych wieloliniowych ostatecznych hematopoetycznych komórek progenitorowych z hPSC przy użyciu specyficznego dla etapu protokołu ukierunkowanego różnicowania, który opisujemy tutaj. Poprzez enzymatyczną dysocjację hPSC na tworzywach z tworzywa sztucznego pokrytych matrycą błony podstawnej, powstają ciała zarodkowe (EB). EB są różnicowane do mezodermy przez rekombinowany BMP4, który jest następnie określany do ostatecznego programu krwiotwórczego przez inhibitor GSK3β, CHIR99021. Alternatywnie, pierwotna hematopoeza jest określana przez inhibitor PORCN, IWP2. Hematopoeza jest dodatkowo napędzana przez dodanie rekombinowanego VEGF i wspierających cytokin krwiotwórczych. Uzyskane hematopoetyczne komórki progenitorowe wygenerowane tą metodą mają potencjał do wykorzystania w modelowaniu chorób i rozwoju in vitro.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste (hPSC) są zdefiniowane jako obejmujące zarówno ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESC), jak i ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC) i mają unikalną zdolność nie tylko do samoodnawiania się w odpowiednich warunkach wzrostu, ale także zdolność do różnicowania się na wszystkie typy komórek pochodzących z trzech listków zarodkowych: endodermy, mezodermy i ektodermy1. Ze względu na te unikalne zdolności, hPSC są bardzo obiecujące dla medycyny regeneracyjnej, modelowania chorób i terapii komórkowych2. Chociaż udało się odróżnić wiele typów komórek od hPSC, jednym z istotnych wyzwań jest specyfikacja in vitro wyłącznie dorosłych hematopoetycznych komórek macierzystych (HSC) pochodzących z hPSC i ostatecznych hematopoetycznych komórek progenitorowych.

Jedną z prawdopodobnych przeszkód dla rozwoju ludzkich HSC z hPSC jest obecność wielu programów krwiotwórczych w ludzkim embrionie3. Pierwszy program, który się pojawia, określany jako "prymitywna hematopoeza", pochodzi z pozaembrionalnej tkanki woreczka żółtkowego i najlepiej charakteryzuje się przejściową produkcją progenitorów erytroblastów (EryP-CFC), makrofagów i megakariocytów. Warto zauważyć, że program ten nie powoduje powstawania HSC, ani nie powoduje powstawania komórek progenitorowych limfoidalnych T i B. Jednak woreczek żółtkowy przejściowo powoduje powstawanie ograniczonych ostatecznych komórek progenitorowych układu krwiotwórczego, takich jak erytro-szpikowy prekursor (EMP4,5,6,7,8) oraz wielosilny progenitor z niedoborem erytroidów (LMPP9). Jednak ani EMP, ani LMPP nie są w pełni multipotencjalne ani zdolne do wszczepienia podobnego do HSC u dorosłych biorców. W przeciwieństwie do tego, w późniejszym okresie rozwoju, klasycznie zdefiniowany "ostateczny" program hematopoetyczny jest określony w regionie aorta-gonad-mesonephros właściwego zarodka, dając początek wszystkim dorosłym liniom krwiotwórczym, w tym HSC. Specyfikacja tych wewnątrzembrionalnych ostatecznych komórek krwiotwórczych zachodzi w sposób zależny od Notch, poprzez przejście śródbłonka do hematopoetycznego ze śródbłonka hemopochodnego (HE)3,10,11,12,13,14. Oprócz zdolności do rekonstytucji, potencjał wieloliniowy i zależność tych komórek od Notch można wykorzystać do odróżnienia tych ostatecznych hematopoetycznych komórek progenitorowych od EMP i LMPP (przegląd w references3,13).

Zrozumienie mechanizmu(ów) rządzącego pierwotną i ostateczną specyfikacją hematopoetyczną z hPSC jest prawdopodobnie kluczowe dla powtarzalnej produkcji ostatecznych komórek progenitorowych hematopoetycznych na różnych liniach hPSC. Do niedawna nie istniały protokoły różnicowania hPSC, które mogłyby oddzielić mnożących pierwotnych i ostatecznych przodków hematopoetycznych15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25. Wiele podejść wykorzystujących płodową surowicę bydlęcą (FBS) i/lub kokulturę zrębu najpierw nakreśliło potencjał hematopoetyczny różnicowania hPSC, z mieszaninami pierwotnego i ostatecznego potencjału hematopoetycznego15,16,17,19,22,23,25. Co więcej, wiele protokołów hematopoetycznych bez surowicy opisało wymagania dotyczące sygnału dla specyfikacji mezodermy z hPSC, która zawiera potencjał hematopoetyczny18,20,21,24. Ponieważ jednak metody te nadal prowadziły do powstania heterogenicznych mieszanin obu programów, ich zastosowanie w zastosowaniach klinicznych i zrozumieniu mechanizmów rozwojowych może być ograniczone.

Ostatnio rozbudowaliśmy te badania, przedstawiając wymagania dotyczące sygnału specyficznego dla etapu sygnalizacji ACTIVIN/NODAL i WNT w prymitywnej i ostatecznej specyfikacji hematopoetycznej z mezodermy pochodzącej z hPSC18,26. Ten ostatni był szczególnie wyjątkowy, ponieważ jego zastosowanie specyficznej dla etapu manipulacji sygnałem WNT pozwala na określenie wyłącznie prymitywnych lub wyłącznie ostatecznych komórek progenitorowych układu krwiotwórczego26. Podczas specyfikacji mezodermy hamowanie kanonicznej sygnalizacji WNT za pomocą inhibitora PORCN IWP2 skutkuje specyfikacją CD43 + EryP-CFC i komórek progenitorowych szpiku, bez wykrywalnego potencjału limfatycznego. W przeciwieństwie do tego, stymulacja kanonicznej sygnalizacji WNT za pomocą inhibitora GSK3β, CHIR99021, na tym samym etapie różnicowania spowodowała całkowity brak wykrywalnego CD43 + EryP-CFC, jednocześnie prowadząc do specyfikacji CD34 + CD43-HE. Populacja ta posiadała potencjał mieloidalny, erytroidalny eksprymujący HBG i limfoidalny T. Późniejsze analizy wykazały, że ten HE nie ma wyrażenia CD7327,28 i CD18428, a jego potencjał krwiotwórczy był zależny od NOTCH28. Co więcej, analizy klonalne pojedynczych komórek wykazały, że te ostateczne linie hematopoetyczne mogą pochodzić z multipotencjalnych pojedynczych komórek28. Podsumowując, badania te wskazują, że specyficzna dla etapu manipulacja sygnalizacją WNT może określać albo czysto prymitywnych hematopoetycznych progenitorów, albo multipotencjalnych ostatecznych hematopoetycznych progenitorów zależnych od NOTCH.

Tutaj przedstawiamy naszą strategię różnicowania, która daje wyłącznie prymitywne lub ostateczne hematopoetyczne prekursory, poprzez manipulację kanoniczną sygnalizacją WNT podczas mezodermalnego wzorca i ich dalsze testy linii hematopoetycznej. Protokół ten ma ogromną wartość dla badaczy, którzy są zainteresowani produkcją pierwotnych lub ostatecznych hematopoetycznych komórek progenitorowych z hPSC do zastosowań w medycynie regeneracyjnej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Odczynniki

  1. Uzyskaj linie komórkowe; hESC lub hiPSCs1, mysie fibroblasty embrionalne (MEFs)29, OP9-DL4 stroma30,31.
  2. Przygotowanie odczynnika
    1. Przygotować 0,1% m/v roztwór żelatyny w PBS. Sterylizować w autoklawie i przechowywać w temperaturze 4 °C po porcjowaniu.
      1. Przygotuj naczynia z tworzywa sztucznego pokryte żelatyną. Posmaruj naczynia 6-dołkowe 1,5 ml 0,1% roztworu żelatyny. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Bezpośrednio przed użyciem odessać pozostały roztwór żelatyny.
    2. Przygotuj pożywkę MEF, robiąc IMDM z 15% v/v FBS i 1x antybiotykami. Uzupełnij 2 mM L-glutaminy i 400 μM monotioglicerolu (MTG) przed użyciem i przechowuj w temperaturze 4 °C.
    3. Przygotuj pożywkę hodowlaną hPSC jako roztwór DMEM/F12 z 20% zamiennikiem surowicy nokautującej v/v (KOSR), 1x aminokwasami endogennymi (NEAA), 1x antybiotykami, 55 μM β-merkaptoetanolem, 2 mM L-glutaminą i 10 ng/ml bFGF. Przefiltrować do sterylizacji za pomocą filtra 2 μm i przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C.
    4. Przygotować bezsurowicowe medium do płukania jako roztwór DMEM/F12 z 5% v/v KOSR i 4 mM HCl. Przefiltrować do sterylizacji za pomocą filtra 2 μm, podwielokrotności i przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C.
    5. Przygotować roztwór 1 mg/ml DNazy I, rozpuszczając DNazę I przez 3 - 4 godziny w lodowatej, sterylnej wodzie dejonizowanej na lodzie. Przefiltrować do sterylizacji za pomocą filtra 2 μm i przechowywać podwielokrotności w temperaturze -20 °C.
    6. Przygotować roztwór STOP z pożywką WASH: dodać 10% FBS i 10 μg/ml DNazy I. Roztwór STOP należy przygotować bezpośrednio przed użyciem.
    7. Przygotować roztwór mieszaniny matrycy błony podstawnej (np. matrigel, określany tutaj jako MAT).
      UWAGA: Wszystkie etapy przygotowania i stosowania mieszaniny MAT należy wykonywać na lodzie lub w temperaturze 4 °C. Zamrożone MAT rozmrażać w lodzie w temperaturze 4 °C przez noc. Rozcieńczyć MAT w stosunku 1:1, dodając 10 ml lodowatego IMDM i schłodzić w lodzie w temperaturze 4 °C przez noc. Rozcieńczyć mieszaninę MAT dodatkowymi 20 ml lodowatego IMDM i schłodzić w lodzie w temperaturze 4 °C przez noc. Przelać do wstępnie schłodzonych probówek i przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia. Mieszaninę MAT gotową do użycia rozmrażać przez noc w temperaturze 4 °C.
      1. Pokryj płytki do hodowli komórkowych MAT.
        UWAGA: Wszystkie etapy powlekania płyt MAT powinny być wykonywane na lodzie. Płytki 6- i 24-dołkowe schładzać wstępnie w temperaturze -20 °C przez co najmniej 1 godzinę. Gdy będziesz gotowy do pokrycia talerzy, połóż je na lodzie. Pokryj każdą studzienkę 4x rozcieńczoną matą, usuwając i ponownie używając nadmiaru roztworu. Pozostawić na lodzie na 30 - 60 minut i odessać nadmiar MAT. Suszyć płytki pokryte MAT w inkubatorze o temperaturze 37 °C 5% CO2 przez co najmniej 3 godziny. Zużyć w ciągu 72 godzin od nałożenia powłoki.
    8. Przygotować roztwór 10% albuminy surowicy bydlęcej (BSA), rozpuszczając 10% w/v BSA w lodowatej, destylowanej, dejonizowanej wodzie o temperaturze 4 °C przez 3 - 4 godziny. Przefiltrować do sterylizacji z filtrem 2 μm do butelki blokującej światło i przechowywać w temperaturze 4 °C.
    9. Przygotuj roztwór kwasu askorbinowego. Powoli rozpuść 5 mg/ml roztworu kwasu L-askorbinowego w lodowatej, destylowanej, dejonizowanej wodzie na lodzie przez 3 - 4 godziny. Mieszaj od czasu do czasu, aż się rozpuści. Przefiltrować do sterylizacji za pomocą filtra 2 μm i przechowywać podwielokrotności w temperaturze -20 °C.
    10. Przygotuj pożywkę do różnicowania bez surowicy (SFD), sporządzając roztwór 75:25 F-12 IMDM:Ham, a następnie dodaj 0,5% BSA, 1x B27 i 0,5x suplementy N2. Przechowywać w temperaturze 4 °C. Bezpośrednio przed użyciem dodać 1x L-glutaminę, 50 μg/ml kwasu askorbinowego, 400 μM MTG i 150 μg/ml holotransferyny.
    11. Przygotuj pożywkę do hodowli komórek macierzystych bez surowicy (np. StemPro, określaną dalej jako SP34) zgodnie z instrukcjami producenta. Przechowywać w temperaturze 4 °C. Bezpośrednio przed użyciem dodać 1x L-glutaminę, 50 μg/ml kwasu askorbinowego, 400 μM MTG i 150 μg/ml holotransferyny.
    12. Przygotować 0,2% roztwór kolagenazy II, rozpuszczając kolagenazę II do końcowego stężenia 0,2% w/v w roztworze 1:4 FBS:PBS. Rozpuścić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez co najmniej 15 minut. Przefiltrować roztwór do sterylizacji za pomocą filtra 2 μm i przechowywać podwielokrotności w temperaturze -20 °C.
    13. Bezpośrednio przed użyciem należy przygotować bufor do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) w postaci roztworu 5% FBS w IMDM.
    14. Przygotuj pożywkę OP9 jako roztwór α-MEM, 20% FBS, 2 mM L-glutaminy i 1x antybiotyków. Przefiltrować do sterylizacji za pomocą filtra 2 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C.
    15. Otrzymać pożywki na bazie metylocelulozy (np. MethoCult, zwane dalej MeC) w postaci wstępnie podanych ilości 3 ml lub w postaci butelki o pojemności 100 ml. W przypadku stosowania 100 ml MeC, po przybyciu podzielić na 2,5 ml porcji w stożkowych probówkach o pojemności 14 ml.
      UWAGA: Wszystkie porcje należy przechowywać w temperaturze -20 °C. Podwielokrotności pożywki MeC należy rozmrozić bezpośrednio przed użyciem.

2. Różnicowanie mezodermy hPSC

  1. Wyhodowanie linii komórkowych hPSC na MEF do 70 - 80% konfluencji, w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2,
    UWAGA: hPSC powinny mieć ostre, niezróżnicowane granice.
  2. Przygotować naczynia z tworzywa sztucznego pokryte MAT na 24 godziny przed pasażowaniem hPSC.
    UWAGA: Całkowita liczba 6-dołkowych szalek pokrytych MAT różni się w zależności od linii hPSC. Zwykle trzy 6-dołkowe szalki są wystarczające na 6-dołkowe naczynie z konfluentnymi hPSC na MEF.
    1. Przed pierwszym różnicowaniem należy przeprowadzić próbne zubożenie dopływu z różnymi stosunkami konfluentnych studzienek hPSC:MAT (1:4, 1:3, 1:2 itd.) przed pierwszym różnicowaniem, aby określić, ile 6-dołkowych szalek pokrytych MAT należy użyć do kolejnych różnic.
      UWAGA: 24 godziny po posianiu na MAT hPSC powinny zlewać się w 80 - 90%, z grudkami komórek o wielkości około 10 - 20 komórek.
  3. Zassać pożywkę hPSC i dodać 1 ml 37 °C 0,25% trypsyny-EDTA do każdego dołka na 1 minutę. Odessać i dodać 1 ml pożywki STOP do każdej studzienki. Za pomocą skrobaka do komórek zeskrob komórki z płytki. Dodaj 1 ml buforu WASH do każdej studzienki.
    1. Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 2 ml rozcierać 3-5 razy, aby rozbić duże skupiska komórek i przenieść komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Odwirować hPSC przy stężeniu 330 x g przez 5 minut.
  4. Ponownie zawiesić komórki w całkowitej objętości pożywki hPSC odpowiadającej 2 ml na studzienkę wyrobów z tworzywa sztucznego pokrytych MAT, które mają być użyte. Dodać 2 ml/studzienkę hPSC do plastikowych naczyń i inkubować przez noc w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
  5. 24 godziny później odessać pożywkę i zastąpić ją 37 °C 0,05% Trypsin-EDTA na 1 minutę. Odessać Trypsynę-EDTA i dodać 1 ml pożywki STOP. Energicznie zeskrob komórki za pomocą skrobaka do komórek. Dodaj 1 ml pożywki WASH do każdej studzienki. Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 2 ml rozcierać komórki 1-2 razy i przenieść do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Odwirować komórki przy 220 x g przez 5 min.
    UWAGA: Czas leczenia trypsyną-EDTA powinien być określony przez badacza dla każdej linii hPSC. Leczenie trypsyną powinno być stosowane tak długo, jak to możliwe, bez powodowania dysocjacji pojedynczych komórek. Ten krok powinien odłączyć wszystkie hPSC od płytek pokrytych MAT, ale nie spowodować dysocjacji pojedynczej komórki. Wynikowe EB powinny wynosić średnio 6 - 10 komórek.
  6. Zassać media. Używając pipety serologicznej o pojemności 5 ml, delikatnie zawiesić komórki w 20 ml pożywki WASH. Wirować przy 220 x g przez 5 min.
  7. Delikatnie zawiesić EB w pożywce dnia 0 (Tabela 1). Dozować 2 ml pożywki różnicującej zawierającej EB do każdego dołka 6-dołkowej płytki do hodowli komórkowych o niskiej przyczepności za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml. Umieścić w inkubatorze wielogazowym o temperaturze 37 °C 5% CO2 5%O2.
    UWAGA: Pożywka dnia 0: pożywka SFD uzupełniona 10 ng / ml BMP4 (Tabela 1). Na każde dwie płytki hPSC należy użyć jednego 6-dołkowego naczynia do hodowli komórkowej o niskiej przyczepności.
  8. 24 godziny później dodać 2 ml pożywki dnia 1 (tabela 1). Inkubować komórki przez noc w inkubatorze wielogazowym.
    UWAGA: Pożywka dnia 1: pożywka SFD uzupełniona 10 ng / ml BMP4 i 10 ng / ml bFGF do każdej studzienki (Tabela 1).
  9. 18 godzin później delikatnie zbierz EB za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml i wiruj w 100 x g przez 5 minut. Umyj i połącz całą kulturę z 10 ml IMDM. Wirować z prędkością 100 x g przez 5 min. Zassać pożywkę.
    UWAGA: W kulturach będą istniały szczątki. Ten etap wirowania przy niskiej prędkości (100 x g) usunie zanieczyszczenia.
  10. Delikatnie zawiesić EB w pożywce SFD uzupełnionej pożywką dnia 2 (Tabela 1), a następnie dozować 2 ml na studzienkę do 6-dołkowych płytek do hodowli komórkowych o niskiej przyczepności. Inkubować w inkubatorze wielogazowym o temperaturze 37 °C przez 30 godzin.
    UWAGA: Pożywka dnia 2: 10 ng/ml BMP4 i 5 ng/ml bFGF oraz odpowiedni agonista lub antagonista WNT (Tabela 1).
    1. Dodać 3 μM CHIR99021, aby określić ostatecznych hematopoetycznych przodków. Alternatywnie dodaj 3 μM IWP2 i 1 ng/ml aktywiny A, aby określić prymitywne komórki progenitorowe układu krwiotwórczego.
  11. Przejdź do sekcji 3, aby zapoznać się ze specyfikacją układu gnotwórczego układu krwiotwórczego.

3. Specyfikacja prekursorów hematopoetycznych CD34+

  1. Po 30 godzinach wyizolować EB za pomocą pipety serologicznej o objętości 2 ml w 3. dniu różnicowania. Przenieść do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i odwirować przy 330 x g przez 5 minut. Delikatnie zawiesić i przemyć 10 ml IMDM. Ponownie odwirować komórki przy 330 x g przez 5 minut.
  2. Ponownie zawiesić EB w pożywce dnia 3 (Tabela 2) i dozować 2 ml do każdej studzienki 6-dołkowych płytek o niskiej przyczepności. Inkubować komórki w inkubatorze wielogazowym o temperaturze 37 °C przez 72 h.
    UWAGA: Pożywka dnia 3: SP34, uzupełniona 15 ng/ml VEGF i 5 ng/ml bFGF (Tabela 2). Dodaj więcej pożywki do dołka, jeśli pH pożywki zebranej w 3. dniu różnicowania znacznie się zmieniło (tj. pożywka żółto-pomarańczowa). Alternatywnie, użyj mniejszej liczby EB na studzienkę w dniu 0.
  3. Po 72 godzinach inkubacji dodać 2 ml pożywki dnia 6 (tabela 2) do każdego dołka. Inkubować w inkubatorze wielogazowym o temperaturze 37 °C przez dodatkowe 48 h.
    UWAGA: Pożywka dnia 6: pożywka SP34 uzupełniona 15 ng / ml VEGF, 5 ng / ml bFGF, 200 ng / ml SCF, 4 j.m. EPO, 20 ng / ml IL-6, 10 ng / ml IL-11 i 50 ng / ml IGF-1 (Tabela 2). Jeśli w kroku 3.1 dodano więcej pożywki, dodaj równoważną ilość pożywki w kroku 3.2, tak aby końcowe stężenia cytokin pozostały takie same.
  4. Wyizolować EB potraktowane CHIR99021 w 8. dniu różnicowania. Przejdź do sekcji 4.
  5. EB poddane działaniu IWP2 zbiera się w 8 dniu różnicowania do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Wirować przy 330 x g przez 5 min. Delikatnie zawiesić w podłożu w dniu 8 (Tabela 2). Inkubować przez 24 godziny w inkubatorze o temperaturze 37 °C i stężeniu 5% CO2 w naczyniach o niskiej przywieralności. Przejdź do sekcji 4.
    UWAGA: Pożywka dnia 8: pożywka SP34 uzupełniona 100 ng / ml SCF, 2 IU EPO, 10 ng / ml IL-6, 5 ng / ml IL-11, 25 ng / ml IGF-1, 30 ng / ml TPO, 10 ng / ml Flt3-L i 30 ng / ml IL-3 (Tabela 2).

4. Enzymatyczna dysocjacja EB i izolacja hematopoetycznych progenitorów

  1. Wyizolować EB za pomocą pipety serologicznej do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Wirować przy 330 x g przez 5 min. Odessać supernatant.
  2. Dodaj 2 ml 0,25% trypsyny-EDTA do EB. Wir przez 5 s. Inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 8 minut. Dodać 5 ml roztworu STOP. Wirować przy 330 x g przez 5 min. Odessać supernatant.
  3. Ponownie zawiesić EB w 5 ml kolagenazy II. Wirować przez 5 s i inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Po 60 minutach wirować przez 5 s i dodać 5 ml roztworu STOP. Wirować z prędkością 330 x g przez 5 min. Odessać supernatant.
  4. W 1 ml buforu FACS ponownie zawiesić komórki. Przepuść komórki przez sitko o średnicy 40 μm. Usuwa to wszelkie niezdysocjowane grudki komórek.
  5. Policz komórki. Podwielokrotność 1 x 106 komórek do stożkowej probówki o pojemności 14 ml. Wiruj komórki w temperaturze 330 x g przez 5 minut. Zawiesić komórki w stężeniu 5 x 106 komórek/ml w buforze FACS. Podwielokrotność i pulę 10% komórek w każdym warunku do kontroli koloru metodą cytometrii przepływowej. Inkubować komórki w przeciwciałach przez 30 minut na lodzie, w ciemności.
    UWAGA: Zobacz sugerowane kombinacje fluoroforów w Tabeli materiałów.
    1. W przypadku komórek leczonych IWP2 należy użyć przeciwciał anty-CD34 i anty-CD43.
    2. W przypadku komórek traktowanych CHIR99021 należy użyć przeciwciał anty-CD34, anty-CD43, anty-CD73 i anty-CD184.
  6. Przepłucz komórki dwukrotnie za pomocą buforu FACS. Wirować z prędkością 330 x g przez 5 min. Zawiesić komórki w końcowym stężeniu 5 x 106 komórek/ml.
  7. Analizuj lub izoluj komórki za pomocą cytometrii przepływowej. W przypadku prymitywnych komórek progenitorowych układu krwiotwórczego przeanalizuj ekspresję CD34 i CD43 (Figura 2A). Aby uzyskać ostateczne komórki progenitorowe układu krwiotwórczego, wyizoluj HE (CD34 + CD43−CD73−CD184−) za pomocą FACS (Figura 2B). Zebrać komórki w probówkach zawierających schłodzony bufor FACS.
  8. Aby ocenić ostateczny potencjał krwiotwórczy z izolowanego HE, przejdź do sekcji 5 dla przejścia śródbłonka do układu krwiotwórczego lub sekcji 7 dla testu limfoidalnego T. W przypadku prymitywnych hematopoetycznych testów CFC, przejdź do sekcji 6.

5. Przejście od śródbłonka do układu krwiotwórczego

  1. Wirować wyizolowane komórki CD34 + CD43−CD73−CD184 − przy 330 x g przez 5 minut. Ponownie zawiesić komórki w pożywce HE przy 200 000 komórek / ml (Tabela 2). Rozmieść komórki w podwielokrotnościach o objętości 50 μl na 96-dołkowej płytce do hodowli komórkowej o niskiej przyczepności. Inkubować komórki przez noc w inkubatorze wielogazowym o temperaturze 37 °C 5% CO2 5%O2.
    UWAGA: Pożywka HE: pożywka SP34 uzupełniona o 5 ng/ml VEGF, 5 ng/ml bFGF, 100 ng/mL SCF, 2 IU EPO, 10 ng/mL IL-6, 5 ng/ml IL-11, 25 ng/mL IGF-1, 30 ng/mL TPO, 10 ng/ml FLT3-L, 30 ng/mL IL-3, 10 ng/mL BMP4, 20 ng/mL SHH, 10 μg/ml Angiotensyna II, i 100 μM losartanu potasu w dawce 2 x 105 komórek/ml (Tabela 2).
  2. W razie potrzeby przygotować 24-dołkowe płytki pokryte powłoką MAT (patrz krok 1.2.7.1).
  3. Komórki agregują się w grudki po 6-10 komórek w ciągu nocy. Na każde 50 μl objętości ponownie zagregowanych komórek, delikatnie przenieś komórki do środka 24-dołkowej płytki pokrytej MAT następnego ranka. Delikatnie umieścić płytkę w inkubatorze wielogazowym o temperaturze 37 °C na 4 - 6 godzin, aż komórki zostaną połączone.
  4. Dodaj 1 ml świeżej pożywki HE do każdej studzienki, po połączeniu komórek. Inkubować komórki w inkubatorze wielogazowym o temperaturze 37 °C 5% CO2 5%O2 do momentu, gdy komórki krwiotwórcze będą widoczne (zwykle 5-7 dni; Rysunek 2D). Wizualizuj pod 100-krotnym powiększeniem za pomocą mikroskopu świetlnego.
  5. Zbierz ostateczne hematopoetyczne czynniki progenitorowe, delikatnie usuwając pożywki HE z komórek. Przepuść tę pożywkę przez sitko komórkowe o wielkości 40 μm i zbierz. Do przylegających komórek w studzience dodać 0,5 ml 0,25% trypsyny-EDTA do komórek i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Dodać 0,5 ml roztworu STOP do każdej studzienki. Przepuść komórki przez ten sam sitko o wielkości 40 μm, aby zebrać wszystkie przylegające i nieprzylegające komórki. Wirować z prędkością 330 x g przez 5 min.
    1. Aby ocenić potencjał CFC tej masowej hodowli, przejdź do sekcji 6.
  6. Umyj komórki dwukrotnie w buforze FACS. Wirować z prędkością 330 x g przez 5 min.
  7. Ponownie zawieś komórki w buforze FACS przy 5 x 106 komórek/ml. Wybarwić komórki przeciwciałami anty-CD45 i anty-CD34 przez 30 minut na lodzie w ciemności (sugerowane fluorofory znajdują się w Tabeli Materiałów).
  8. Umyj komórki dwukrotnie w buforze FACS. Wirować z prędkością 330 x g przez 5 min.
  9. Wyizoluj komórki CD34 + CD45 + za pomocą FACS ( Rysunek 2E). Posortuj komórki do schłodzonego bufora FACS.
  10. W razie potrzeby ocenić ostateczne komórki progenitorowe układu krwiotwórczego CD34 + CD45 + (test CFC w sekcji 6, potencjał limfoidalny w sekcji 7 lub inny test zainicjowany przez badacza).

6. Test CFC

  1. Rozmrozić podwielokrotności MeC dla każdej próbki używanej do oznaczania CFC.
  2. Dodaj komórki do oznaczenia (kroki 4.5, 4.7, 5.5 lub 5.9) w MeC. Dokładnie odwirować i odstawić kultury MeC na 5 - 10 minut, aż pęcherzyki powietrza rozproszą się, zgodnie z instrukcjami producenta. Używając igły o rozmiarze 16 1/2 na strzykawce o pojemności 3 ml, ostrożnie wyjmij 2 ml MeC.
    UWAGA: Typowe gęstości posiewu wahają się od 1 000 do 20 000 komórek/ml, w zależności od przewidywanej częstości występowania progenitora.
  3. Ostrożnie dozuj 1 ml mieszaniny komórek MeC do każdej z dwóch 35-milimetrowych naczyń do hodowli tkankowych. Równomiernie rozprowadź MeC w naczyniach o średnicy 35 mm, delikatnie stukając i obracając naczynie. Umieść każdą z powyższych szalek w 15 cm naczyniu do hodowli tkankowych wypełnionym wodą. Inkubować w inkubatorze o temperaturze 37 °C i stężeniu 5% CO2 .
  4. Wizualizuj kultury MeC za pomocą mikroskopu świetlnego przy 40-krotnym powiększeniu. Proszę określić ilościowo różne otrzymane CFC. Przeanalizuj prymitywne testy CFC 8 - 10 dni po posiewie (Rysunek 2C). Przeanalizuj ostateczne testy CFC 14 dni po posiewie. Reprezentatywne morfologie kolonii testów CFC można zobaczyć w Rysunek 2F.

7. Test limfocytów T w celu ustalenia ostatecznego potencjału hematopoetycznego

  1. Hoduj komórki OP9-DL4 aż do zlewania się w naczyniu do hodowli tkankowej o średnicy 100 mm30,31,32.
    1. Rozmrozić komórki OP9-DL4 72 - 96 godzin przed posiewem testów limfocytów T. Ponownie zawiesić ogniwa OP9-DL4 w 10 ml pożywki OP9 i rozlać na płytkę o średnicy 10 cm. Uprawiać w inkubatorze o temperaturze 37 °C 5% CO2 aż do 70 - 90% konfluencji.
    2. Aby zebrać komórki OP9-DL4 z naczynia o średnicy 100 mm, usuń pożywkę i dodaj 5 ml 0,25% trypsyny-EDTA na 5 minut. Zatrzymaj aktywność trypsyny za pomocą 5 ml pożywki OP9. Wiruj komórki w temperaturze 330 x g przez 5 minut. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml pożywki OP9 i policzyć komórki.
      UWAGA: Jedna 10-centymetrowa płytka zlewających się komórek OP9-DL4 da około 10 x 106 komórek OP9-DL4.
    3. 48 godzin przed testem limfocytów T umieść 2 x 106 komórek w 12 ml pożywki OP9 w 24-dołkowym naczyniu (0,5 ml / dołek). Rosnąć w inkubatorze o temperaturze 37 °C 5% CO2 .
  2. Dodaj 2 000 - 10 000 komórek do oznaczenia (jak uzyskano w krokach 4.5, 4.7, 5.5 lub 5.9) do 1 dołka komórek OP9-DL4 w pożywce OP9 uzupełnionej przez: 30 ng / ml SCF (tylko pierwsze 6 dni), 5 ng / ml IL-7 i 5 ng / ml FLT3-L. Inkubować w inkubatorze o temperaturze 37 °C i stężeniu 5% CO2 . Na tym etapie nie zachodzą żadne zmiany nośników.
  3. Co 4 - 5 dni pasuj komórki progenitorowe limfocytów T na świeże komórki zrębu OP9-DL4 w 6-dołkowym naczyniu. Rozetrzeć komórki za pomocą pipety o pojemności 1 ml i przepuścić przez filtr 40 μm w celu usunięcia grudek. Wirować z prędkością 330 x g przez 5 min. Odessać od mediów. Ponownie zawiesić komórki w 2 ml świeżej pożywki OP9 uzupełnionej 5 ng/ml IL-7 i 5 ng/ml Flt3-L i umieścić na świeżych komórkach OP9-DL4.
    UWAGA: 48 godzin przed pasażowaniem umieść 2 x 106 świeżych komórek OP9-DL4 w 12 ml pożywki OP9 i rozprowadź 2 ml / studzienkę do naczyń 6-dołkowych.
  4. Po co najmniej 21 dniach kohodowli energicznie rozcierać komórki i przepuszczać przez filtr 40 μm w celu usunięcia resztek komórek. Wirować przy ciśnieniu 330 x g przez 5 minut i odessać supernatant.
  5. Umyj komórki dwukrotnie w zimnym buforze FACS. Wirować z prędkością 330 x g przez 5 min.
  6. Ponownie zawieś komórki w buforze FACS przy 5 x 106 komórek/ml. Wybarwiaj komórki przeciwciałami anty-CD45, anty-CD56, anty-CD4 i anty-CD8 przez 30 minut na lodzie w ciemności (sugerowane kombinacje fluoroforów znajdują się w Tabeli Materiałów). Zastosuj barwienie żywych/martwych komórek (DAPI itp.), aby usunąć zanieczyszczenia z analizy.
  7. Umyj komórki dwukrotnie w buforze FACS. Wirować z prędkością 330 x g przez 5 min.
  8. Przeanalizuj komórki za pomocą cytometru przepływowego, aby ocenić obecność progenitorów limfocytów T (Rysunek 3).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Schemat przedstawiający indukcję pierwotnych i ostatecznych komórek krwiotwórczych z hPSC jest zilustrowany w Rysunek 1. Wzorzec mezodermy przez kanoniczną sygnalizację WNT występuje w dniach 2-3 różnicowania, po którym następuje specyfikacja hematopoetycznego progenitora.

Reprezentatywna analiza cytometryczna przepływu i testy tworzenia kolonii kultur różnicowania hematopoetycznego pochodzących z h...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten opisuje szybką, wolną od surowicy i zrębu metodę różnicowania pierwotnych lub ostatecznych komórek progenitorowych układu krwiotwórczego. Mezodermalna specyfikacja pierwotnych lub ostatecznych hematopoetycznych komórek progenitorowych może być niezawodnie osiągnięta przy użyciu naszego protokołu, który w unikalny sposób wykorzystuje małocząsteczkowe inhibitory kanonicznej sygnalizacji WNT. Specyficzna dla etapu aktywacja WNT przez inhibitor GSK3β CHIR9902133 powoduje powstanie ostatec...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Wydział Medycyny Wewnętrznej, Oddział Hematologii, Washington University School of Medicine. CD był wspierany przez T32HL007088 z National Heart, Lung, and Blood Institute. CMS został wsparty nagrodą American Society of Hematology Scholar Award.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zmodyfikowana pożywka Dulbecco firmy Iscove (IMD)Corning10-016
Płodowa surowica bydlęca (FBS), ocena komórek ESGemini Bioproducts100-500
Płodowa surowica bydlęca (FBS)HyklonSH30396.03
L-glutamina, roztwór 200 mMLife Technologies25030-081
Penicylina-streptomycynaŻycie Technologie15070-063
0,25% Trypsyna-EDTATechnologie życia25200056
0,05% Trypsyna-EDTATechnologie życia25300054
Żelatyna, skóra świńska, typ ASigma-AldrichG1890
Alpha-MEMLife Technologies12000-022
DMEM-F12Corning10-092-CV
Zamiennik surowicy nokautującejLife Technologies10828028"KOSR"
Aminokwasy endogenne (NEAA)Life Technologies11140050
b-merkaptoetanol, roztwór 55 mMLife Technologies21985023
Kwas solnySigma-AldrichH1758
Frakcja V, Albumina surowicy bydlęcejFisher Naukowysuplement BP1605
Ham's F12Corning10-080
N2Life Technologies17502048
Suplement B27, bez witaminy ALife Technologies12587010
Stempro-34 (SP34)Life Technologies10639011"SP34"
Obniżony współczynnik wzrostu MatrigelCorning354230"MAT"
L-kwas absorpcyjnySigma-AldrichA4403
Transferyna w surowicy ludzkiejSigma-Aldrich10652202001
Monotioglicerol (MTG)Sigma-AldrichM6145
Kolagenaza BRoche11088831001
Kolagenaza IILife Technologies17101015
DNaseICalbiochem260913
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Technologie życia14190144
bFGFR& D Systems233-FB
BMP4R& D Systems314-BP
Activin A R& D Systems338-AC
VEGFR& D Systems293-VE
SCFR& D Systems255-SC
IGF-1R& D Systems291-G1
IL-3R& D Systems203-IL
IL-6 R& D Systems206-IL
IL-7 R& D Systems207-IL
IL-11R& D Systems218-1L
TPOR& D Systems288-TP
EPOPeprotech100-64
Ligand Flt-3 (FLT3-L)R& D Systems308-FK
CHIR99021Tocris4423
IWP2Tocris3533
Angiotensyna IISigma-AldrichA9525
Losartan PotassiumTocris3798
CD4 PerCP Cy5.5 Clone RPA-T4BD Biosciences560650Rozcieńczenie 1:100; Test limfocytów T
CD8 PE Klon RPA-T8BD Biosciences561950Rozcieńczenie 1:10; Test limfocytów T
CD34 APC Klon 8G12BD Biosciences340441Rozcieńczenie 1:100; Test EHT
CD34 PE-Cy7 Klon 8G12BD Biosciences348801Rozcieńczenie 1:100; Śródbłonek hemogenny
CD43 FITC Klon 1G10BD Biosciences555475Rozcieńczenie 1:10; Śródbłonek hemogenny
CD45 APC-Cy7 Klon 2D1BD Biosciences557833Rozcieńczenie 1:50; Test limfocytów T
CD45 eFluor450 Klon 2D1BD Biosciences642284Rozcieńczenie 1:50; Test EHT
CD56 APC Klon B159BD Biosciences555518Rozcieńczenie 1:20; Test limfocytów T
CD73 PE Klon AD2BD Biosciences550257Rozcieńczenie 1:50; Śródbłonek hemopochodny
CD184 APC Klon 12G5BD Biosciences555976Rozcieńczenie 1:50; Śródbłonek hemogenny
4',6-diamidino-2-fenyloindolowy (DAPI)BD Biosciences564907Rozcieńczenie 1:10,000; Test limfocytów T
OP9 DL4Holmes, R. i J.C. Zuniga-Pflucker. Cold Spring Harb Protoc, 2009. 2009(2): p. pdb prot5156
MethoCult H4034 StemcellTechnologies4034"MeC"
Milli-Q system oczyszczania wodyEMD Millipore
5% CO2 inkubatorZestaw na 37 C
InkubatorZestaw na 37 C, 5% CO2, 5% O2
6-dołkowa płytka do hodowli tkankowejCorning353046
24-dołkowa płytka do hodowli tkankowejCorning353226
6-dołkowa płytka do hodowli tkankowej o niskiej przyczepnościCorning3471
24-dołkowa płytka do hodowli tkankowej o niskiej przyczepnościCorning3473
35 mm szalki do hodowli tkankowychCorning353001
Igła z końcem,
Corning309657
ml probówka polipropylenowaCorning352063
5 ml probówka z polistyrenuCorning352058
50 ml polipropylenowa stożkowaCorning430921
ml pipeta serologicznaCorning357507
Pipeta serologiczna 5 mlCorning4487
Pipeta serologiczna 10 mlCorning4488
Pipeta serologiczna 25 mlCorning4489
SkrobakiCorning353085
2,0 ml KriowialeCorning430488
5 ml probówka z 40 &mikro; Filtr siatkowy MCorning352235
40 & mikro; Filtr siatkowy do komórekM Corning352340
Wirówka do hodowli komórkowych Kaptur
bezpieczeństwa biologicznego
FACS AriaII lub równoważny
LSRii lub równoważny
Oprogramowanie FlowJoTreeStar
KąpielZestaw w temperaturze 37 C
0,22 &mikro; System filtracji MAutoklaw
Lodówka 4 C-Zamrażarka
20
C-Zamrażarka
Komórki wielogazowy strzykawki Corning 305198 3 cm3 o średnicy 16 mm 5 15 ml polipropylenu stożkowa Corning 430791 2 komórkowe wodna Corning 80 C

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  2. Murry, C. E., Keller, G. Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development. Cell. 132 (4), 661-680 (2008).
  3. Ditadi, A., Sturgeon, C. M., Keller, G. A view of human haematopoietic development from the Petri dish. Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (1), 56-67 (2017).
  4. Chen, M. J., et al. Erythroid/myeloid progenitors and hematopoietic stem cells originate from distinct populations of endothelial cells. Cell Stem Cell. 9 (6), 541-552 (2011).
  5. McGrath, K. E., et al. Distinct Sources of Hematopoietic Progenitors Emerge before HSCs and Provide Functional Blood Cells in the Mammalian Embryo. Cell Rep. 11 (12), 1892-1904 (2015).
  6. McGrath, K. E., et al. A transient definitive erythroid lineage with unique regulation of the beta-globin locus in the mammalian embryo. Blood. 117 (17), 4600-4608 (2011).
  7. Palis, J., et al. Spatial and temporal emergence of high proliferative potential hematopoietic precursors during murine embryogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (8), 4528-4533 (2001).
  8. Palis, J., Robertson, S., Kennedy, M., Wall, C., Keller, G. Development of erythroid and myeloid progenitors in the yolk sac and embryo proper of the mouse. Development. 126 (22), 5073-5084 (1999).
  9. Boiers, C., et al. Lymphomyeloid contribution of an immune-restricted progenitor emerging prior to definitive hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 13 (5), 535-548 (2013).
  10. Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464 (7285), 108-111 (2010).
  11. Hadland, B. K., et al. A requirement for Notch1 distinguishes 2 phases of definitive hematopoiesis during development. Blood. 104 (10), 3097-3105 (2004).
  12. Kumano, K., et al. Notch1 but not Notch2 is essential for generating hematopoietic stem cells from endothelial cells. Immunity. 18 (5), 699-711 (2003).
  13. Medvinsky, A., Rybtsov, S., Taoudi, S. Embryonic origin of the adult hematopoietic system: advances and questions. Development. 138 (6), 1017-1031 (2011).
  14. Robert-Moreno, A., Espinosa, L., de la Pompa, J. L., Bigas, A. RBPjkappa-dependent Notch function regulates Gata2 and is essential for the formation of intra-embryonic hematopoietic cells. Development. 132 (5), 1117-1126 (2005).
  15. Chadwick, K., et al. Cytokines and BMP-4 promote hematopoietic differentiation of human embryonic stem cells. Blood. 102 (3), 906-915 (2003).
  16. Davis, R. P., et al. Targeting a GFP reporter gene to the MIXL1 locus of human embryonic stem cells identifies human primitive streak-like cells and enables isolation of primitive hematopoietic precursors. Blood. 111 (4), 1876-1884 (2008).
  17. Kaufman, D. S., Hanson, E. T., Lewis, R. L., Auerbach, R., Thomson, J. A. Hematopoietic colony-forming cells derived from human embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (19), 10716-10721 (2001).
  18. Kennedy, M., et al. T lymphocyte potential marks the emergence of definitive hematopoietic progenitors in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Rep. 2 (6), 1722-1735 (2012).
  19. Ledran, M. H., et al. Efficient hematopoietic differentiation of human embryonic stem cells on stromal cells derived from hematopoietic niches. Cell Stem Cell. 3 (1), 85-98 (2008).
  20. Ng, E. S., et al. The primitive streak gene Mixl1 is required for efficient haematopoiesis and BMP4-induced ventral mesoderm patterning in differentiating ES cells. Development. 132 (5), 873-884 (2005).
  21. Pick, M., Azzola, L., Mossman, A., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. Differentiation of human embryonic stem cells in serum-free medium reveals distinct roles for bone morphogenetic protein 4, vascular endothelial growth factor, stem cell factor, and fibroblast growth factor 2 in hematopoiesis. Stem Cells. 25 (9), 2206-2214 (2007).
  22. Vodyanik, M. A., Bork, J. A., Thomson, J. A., Slukvin, I. I. Human embryonic stem cell-derived CD34+ cells: efficient production in the coculture with OP9 stromal cells and analysis of lymphohematopoietic potential. Blood. 105 (2), 617-626 (2005).
  23. Vodyanik, M. A., Thomson, J. A., Slukvin, I. I. Leukosialin (CD43) defines hematopoietic progenitors in human embryonic stem cell differentiation cultures. Blood. 108 (6), 2095-2105 (2006).
  24. Yu, C., et al. Retinoic acid enhances the generation of hematopoietic progenitors from human embryonic stem cell-derived hemato-vascular precursors. Blood. 116 (23), 4786-4794 (2010).
  25. Zambidis, E. T., Peault, B., Park, T. S., Bunz, F., Civin, C. I. Hematopoietic differentiation of human embryonic stem cells progresses through sequential hematoendothelial, primitive, and definitive stages resembling human yolk sac development. Blood. 106 (3), 860-870 (2005).
  26. Sturgeon, C. M., Ditadi, A., Awong, G., Kennedy, M., Keller, G. Wnt Signaling Controls the Specification of Definitive and Primitive Hematopoiesis From Human Pluripotent Stem Cells. Nat Biotechnol. 32 (6), 554-561 (2014).
  27. Choi, K. D., et al. Identification of the hemogenic endothelial progenitor and its direct precursor in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Rep. 2 (3), 553-567 (2012).
  28. Ditadi, A., et al. Human Definitive Haemogenic Endothelium and Arterial Vascular Endothelium Represent Distinct Lineages. Nat Cell Biol. 17 (5), 580-591 (2015).
  29. Conner, D. A. Mouse embryo fibroblast (MEF) feeder cell preparation. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 23, Unit 23.2 (2001).
  30. La Motte-Mohs, R. N., Herer, E., Zuniga-Pflucker, J. C. Induction of T-cell development from human cord blood hematopoietic stem cells by Delta-like 1 in vitro. Blood. 105 (4), 1431-1439 (2005).
  31. Schmitt, T. M., et al. Induction of T cell development and establishment of T cell competence from embryonic stem cells differentiated in vitro. Nat Immunol. 5 (4), 410-417 (2004).
  32. Holmes, R., Zuniga-Pflucker, J. C. The OP9-DL1 system: generation of T-lymphocytes from embryonic or hematopoietic stem cells in vitro. Cold Spring Harb Protoc. 2009 (2), (2009).
  33. Polychronopoulos, P., et al. Structural basis for the synthesis of indirubins as potent and selective inhibitors of glycogen synthase kinase-3 and cyclin-dependent kinases. J Med Chem. 47 (4), 935-946 (2004).
  34. Chen, B., et al. Small molecule-mediated disruption of Wnt-dependent signaling in tissue regeneration and cancer. Nat Chem Biol. 5 (2), 100-107 (2009).
  35. Sugimura, R., et al. Haematopoietic stem and progenitor cells from human pluripotent stem cells. Nature. , (2017).
  36. Ohgushi, M., et al. Molecular pathway and cell state responsible for dissociation-induced apoptosis in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7 (2), 225-239 (2010).
  37. Peschle, C., et al. Embryonic----Fetal Hb switch in humans: studies on erythroid bursts generated by embryonic progenitors from yolk sac and liver. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (8), 2416-2420 (1984).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Embryoid Body FormationMesoderm SpecificationGSK3 InhibitorPORCN InhibitorVEGF TreatmentFACS IsolationFlow Cytometry

Powiązane artykuły