Artykuł metodologiczny

Test limfocytów oparty na fluorescencji, odpowiedni do wysokoprzepustowych badań przesiewowych małych cząsteczek

DOI:

10.3791/55199

⸱

10 marca 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology, Infectiology and Immunology, Université de Montréal, 2Department of Pharmacology and Physiology, Université de Montréal, 3Molecular Biology Program, Université de Montréal

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentujemy w obecnym badaniu nowatorski test oparty na fluorescencji, wykorzystujący limfocyty pochodzące od transgenicznej myszy. Test ten nadaje się do wysokoprzepustowych badań przesiewowych (HTS) małych cząsteczek obdarzonych zdolnością hamowania lub promowania aktywacji limfocytów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe (HTS) są obecnie podstawą identyfikacji jednostek chemicznych zdolnych do modulowania reakcji biochemicznych lub procesów komórkowych. Wraz z postępem biotechnologii i wysokim potencjałem translacyjnym małych cząsteczek rozwinęło się wiele innowacyjnych podejść do odkrywania leków, co tłumaczy odradzające się zainteresowanie wykorzystaniem HTS. Dziedzina onkologii jest obecnie najbardziej aktywnym obszarem badań przesiewowych leków, przy czym nie dokonano żadnego znaczącego przełomu w identyfikacji nowych związków immunomodulujących ukierunkowanych na powikłania związane z przeszczepem lub dolegliwości autoimmunologiczne. W tym miejscu przedstawiamy nowatorski test limfocytów na bazie mysiej fluorescencji in vitro, który można łatwo dostosować do identyfikacji nowych związków immunomodulujących. Ten test wykorzystuje limfocyty T lub B pochodzące od transgenicznej myszy, w której promotor Nur77 napędza ekspresję GFP po stymulacji receptora komórek T lub B. Ponieważ intensywność GFP odzwierciedla aktywację/aktywność transkrypcyjną komórki docelowej, nasz test definiuje nowe narzędzie do badania wpływu danego związku (związków) na odpowiedzi komórkowe/biologiczne. Na przykład, przeprowadzono pierwotne badanie przesiewowe przy użyciu 4 398 związków przy braku "hipotezy docelowej", co doprowadziło do zidentyfikowania 160 potencjalnych trafień wykazujących aktywność immunomodulacyjną. W związku z tym zastosowanie tego testu jest odpowiednie dla programów odkrywania leków, które badają duże biblioteki chemiczne przed dalszymi badaniami walidacyjnymi in vitro/in vivo.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe (HTS) to sprawdzona strategia powszechnie stosowana do identyfikacji nowych cząsteczek terapeutycznych lub do repozycjonowania leków zatwierdzonych przez FDA w nowych wskazaniach medycznych. 1 Jak dotąd, osiągnięty sukces HTS może być mierzony przez mnogość wcześniej odkrytych leków. Na przykład inhibitor kinazy tyrozynowej lapatynib stosowany w leczeniu raka piersi, sitagliptyna; inhibitor dipeptydylopeptydazy-4 (DPP-4) stosowany jako lek przeciwhiperglikemiczny oraz doustny inhibitor kinazy tyrozynowej Bcr-Abl dazatynib stosowany w leczeniu przewlekłej białaczki szpikowej to tylko kilka przykładów z długiej listy zatwierdzonych leków pierwotnie odkrytych przez HTS. 2 Chociaż produktywność przemysłu farmaceutycznego ostatnio ucierpiała z powodu braku odkryć nowych substancji chemicznych, prawdopodobieństwo udanego odkrycia leku można zwiększyć poprzez zwiększenie liczby kandydatów przedklinicznych wykazujących modulacyjne właściwości biologiczne/biochemiczne. W związku z tym opracowanie nowych testów HTS dostosowanych do fenotypowych badań przesiewowych może potencjalnie dostarczyć ważnych narzędzi farmakologicznych do odkrywania nowych leków. 3,4,5,6 Co więcej, HTS może być teraz wykonywany w szybszym tempie ze względu na znaczące przemiany technologiczne w ostatnich latach, w tym specjalnie zaprojektowane elastyczne instalacje robotyczne, nowatorskie technologie odczytu i rozległą miniaturyzację. 2,7 Jednym z czynników przyczyniających się do rosnącego zainteresowania stosowaniem fenotypowych badań przesiewowych (aka farmakologii przyszłościowej) jest przekonanie, że skupienie się na efektach funkcjonalnych, a nie na nadmiernie uproszczonych redukcjonistycznych założeniach dotyczących celów molekularnych (badania przesiewowe oparte na celu/reakcje biochemiczne) ma większe szanse na wykazanie skuteczności klinicznej. W związku z tym fenotypowe badania przesiewowe dają nadzieję na odkrycie nowych potencjalnie terapeutycznych związków i szlaków molekularnych obecnie nieuleczalnych chorób. 2

Aby poprawnie zidentyfikować inhibitory lub aktywatory dla danego celu molekularnego lub funkcji komórkowej, wymagany jest bardzo czuły i wiarygodny test w celu odróżnienia prawdziwych trafień od wyników fałszywie dodatnich. Co więc sprawia, że test jest dobry? Jakość danego testu musi być najpierw oceniona na podstawie stosunku sygnału do szumu (odzwierciedlonego przez współczynnik Z). 8 Po drugie, docelowy efekt lub cel ekranu powinien być jasno określony. Na przykład funkcjonalne podejścia oparte na komórkach mogą przynieść znaczące korzyści w zakresie badań przesiewowych receptorów w przeciwieństwie do testu zaprojektowanego specjalnie do oceny wiązania liganda z receptorem. Powodem tego jest to, że to drugie podejście nie pozwala na rozróżnienie ligandów agonistycznych i antagonistycznych. 9 W przeciwieństwie do tego, podejście oparte na komórkach może być prawdopodobnie bardziej skuteczne, ponieważ funkcja receptora może być bezpośrednio oceniana w fenotypie biologicznym (proliferacja, zatrzymanie cyklu komórkowego, apoptoza i/lub różnicowanie). Należy jednak zauważyć, że testy biochemiczne mogą zapewnić znaczące korzyści w porównaniu z testami fenotypowymi, ponieważ naruszają określony cel wewnątrzkomórkowy. Dobrze zoptymalizowany test biochemiczny będzie na ogół miał mniejsze rozproszenie danych niż fenotypowe badanie przesiewowe, jednocześnie upraszczając późniejsze badania związane z molekularnym mechanizmem działania leku. Jednak główną wadą testów opartych na celach lub biochemicznych jest szansa na zwiększenie liczby wyników fałszywie dodatnich, które mogą wpływać na cele niespecyficzne podczas testowania w systemie biologicznym (utrata swoistości pierwotnie badanej w teście biochemicznym). 10 Chociaż dobrze ustalony punkt odcięcia między negatywnymi i pozytywnymi trafieniami może zminimalizować liczbę wyników fałszywie dodatnich w pierwotnym badaniu przesiewowym, użycie fizjologicznie odpowiedniego systemu naśladującego natywne środowisko komórkowe, takie jak nienaruszone komórki, cała tkanka lub całe zwierzę, pozostaje rdzeniem wahadła projektu testu. W związku z tym fenotypowe badania przesiewowe umożliwiają odkrycie wiodącego o pożądanych skutkach biologicznych/fenotypowych w przypadku chorób bez zidentyfikowanych celów leków, bez wcześniejszej wiedzy na temat aktywności lub sposobu działania związku.11

Niniejsze badanie dotyczy rozwoju i testowania zoptymalizowanego i powtarzalnego fenotypowego badania przesiewowego opartego na dwóch ważnych komponentach: komercyjnie dostępnym modelu myszy i zgrupowanej podrodzinie związków chemicznych. W odniesieniu do modelu zwierzęcego test opiera się na wykorzystaniu limfocytów pochodzących ze szczepu myszy (Nur77GFP) zawierającego sztuczny chromosom bakteryjny zawierający kasetę, w której ekspresja białka zielonej fluorescencji (GFP) jest sterowana przez promotor Nur77. 12 Cechą charakterystyczną tej stymulacji jest fakt, że Nur77 jest natychmiastowym wczesnym genem, który uległ regulacji w górę po stymulacji receptora limfocytów T (TCR) lub receptora komórek B (BCR). 12 Jeśli chodzi o samą metodę przesiewową, zastosowano podejście, które pomogło uniknąć przesiewania trywialnych analogów, jednocześnie minimalizując czas potrzebny na ocenę dużej biblioteki chemicznej (>105 związków). W tym celu wykorzystano bazę danych związków chemicznych wybranych przez chemików medycznych za pomocą wirtualnych narzędzi przesiewowych w celu zidentyfikowania topologicznie podobnych związków na podstawie znanych aktywnych struktur nasiennych jako punktów odniesienia. Takie podejście pozwoliło nam na przebadanie przesiewowe 4 398 związków reprezentujących ogólną bibliotekę ponad 136 000 jednostek chemicznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie protokoły dla zwierząt zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Université de Montréal. Myszy były poddawane eutanazji poprzez stopniowe wdychanieCO2, aż do momentu, gdy nie zaobserwowano żadnych parametrów życiowych, po czym nastąpiło zwichnięcie szyjki macicy. Procedura została przeprowadzona przez certyfikowaną osobę, aby zapewnić, że zwierzęta zostały poddane eutanazji w sposób humanitarny i zgodnie z zaleceniami Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami.

1. Przygotowanie pożywki splenocytów i buforu cytometrycznego przepływowego

  1. Wykonaj wszystkie czynności pod okapem biologicznym oczyszczonym w 70% etanolem.
  2. Wyjmij 70 ml wstępnie podgrzanego podłoża Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 1x (dostępnego w handlu i dostarczanego w przefiltrowanych sterylnych butelkach o objętości 500 ml) i umieść w sterylnej probówce. Usunięte medium zostanie użyte w dalszej części protokołu.
  3. Uzupełnij pozostałe 430 ml RPMI 1640 1x 50 ml inaktywowanej płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 5 ml penicyliny/streptomycyny, 5 ml HEPES, 5 ml aminokwasów endogennych, 5 ml pirogronianu sodu i 0,05 ml przefiltrowanego (1M) 2-merkaptoetanolu.
    UWAGA: Wstępnie podgrzej pożywkę splenocytową za pomocą łaźni wodnej ustawionej na 37 ºC, aby uniknąć szoku cieplnego komórek. Jest to ważne, aby uniknąć indukcji apoptozy komórkowej.
  4. Aby przygotować bufor do cytometrii przepływowej, dodać 2 ml FBS do 98 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i przechowywać w lodówce do czasu użycia (najlepiej w ciągu trzech dni).

2. Wytwarzanie zawiesiny komórek splenocytów ze śledziony myszy Nur77GFP

  1. A septycznie odizolować śledzionę od 6-8 tygodniowej samicy myszy Nur77GFP.
    1. Aby to osiągnąć, pracuj pod sterylnym kapturem. Namocz ofiarowane futro myszy, nożyczki i kleszcze w 70% etanolu.
    2. Połóż mysz na prawym boku, przetnij skórę i mięśnie w lewym górnym kwadrancie brzucha. Sprawdź obszar nacięcia, aby widocznie zlokalizować śledzionę, a następnie ją wytnij. Trzymaj śledzionę w podłożu splenocytowym na lodzie, aż będzie gotowa do wykonania następnego kroku.
  2. Umieścić śledzionę (śledziony) na 10-centymetrowej szalce Petriego z2 kulturami komórkowymi zawierającej 5 ml wstępnie podgrzanej pożywki ze splenocytów.
  3. Rozgnieść śledzionę za pomocą sterylnego tłoka strzykawki, aż roztwór stanie się mętny. Macierz kolagenowa śledziony powinna pozostać do końca zabiegu.
  4. Po intensywnym zacieraniu w pożywce splenocytowej zebrać zawiesinę komórek i przepuścić ją przez sitko o wielkości 70 μm umieszczone na probówce o pojemności 50 ml w celu odfiltrowania wszelkich zanieczyszczeń lub skrzepów.
  5. Wirować przy 500 x g przez 5 min. Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić osad komórkowy w 2-3 ml wyprodukowanego we własnym lub komercyjnym buforze do lizy krwinek czerwonych. Po pipetowaniu (2-3 razy) odstawić zawiesinę na 20-30 sekund.
  6. Dodać 5 ml PBS lub odpowiedniego wybranego buforu, a następnie odwirować zawiesinę komórek przez 5 minut przy 500 x g.
  7. Usunąć supernatant (powinien być koloru czerwonego, ponieważ zawiera lizowane krwinki czerwone) i ponownie zawiesić osad komórkowy w 2 ml pożywki splenocytowej.
  8. Za pomocą hemocytometru policz liczbę komórek wybarwionych błękitem trypanowym, aby odróżnić komórki żywe od martwych (martwiczych).

3. Izolacja limfocytów T z zawiesiny komórek splenocytów

  1. Odwirować zawiesinę komórkową przez 5 minut przy 500 x g. Ponownie zawiesić komórki w pożywce RPMI bez surowicy (50 ml od kroku 1.3), aby uzyskać stężenie komórkowe 10 x 106 komórek/ml.
  2. Przenieść komórki do probówki polistyrenowej o pojemności 5 ml i odłożyć na bok 100 μl podwielokrotności splenocytów w celu oceny/porównania czystości na końcu etapu oczyszczania.
  3. Dodać normalną surowicę szczura do zawiesiny komórkowej w stężeniu 50 μl / ml, a następnie koktajl przeciwciał izolujących limfocyty T (50 μl / ml).
  4. Wymieszaj zawiesinę komórkową i odstaw na 10 minut. Ten krok pozwala koktajlowi przeciwciał związać wszystkie niechciane komórki.
  5. Dodaj szybkie kulki streptawidyny (kulki magnetyczne) na 2,5 minuty, a następnie doprowadź objętość do 2,5 ml za pomocą pożywki bez surowicy.
  6. Umieść rurkę w magnesie izolującym komórki na 3 minuty.
  7. Przenieś zawiesinę limfocytów T do nowej rurki polistyrenowej, przytrzymując magnes i wylewając roztwór jednym ruchem.
    UWAGA: Wyizolowana zawiesina zawiera oczyszczone limfocyty T. Wszystkie niechciane komórki są trzymane z boku rurki związane z magnetycznymi kulkami streptawidyny.
  8. Policz wyizolowane limfocyty T za pomocą błękitu trypanowego i hemocytometru.
    UWAGA: Na tym etapie czystość wyizolowanych limfocytów T można zweryfikować (opcjonalnie), analizując procent zdarzeń CD3 + przed i po izolacji limfocytów T za pomocą cytometrii przepływowej. 13
    1. Krótko odwirować 1 ml zawiesiny komórek splenocytu o stężeniu 500 x g. Odrzucić supernatant i zawiesić komórki w buforze cytometrii przepływowej w stężeniu 1 x 106 komórek/ml.
    2. Dodaj znakowane fluorescencyjnie przeciwciało anty-mysie CD3 w stężeniu 1:100. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 30 minut. Przemyć raz, odwirować i ponownie zawiesić w buforze cytometrii przepływowej (400 μl) w celu analizy metodą cytometrii przepływowej.

4. Izolacja komórek B z zawiesiny komórek splenocytów

  1. Postępuj zgodnie z tym samym protokołem, jak opisano dla limfocytów T (kroki 3.1-3.8), ale przy użyciu zestawu do izolacji komórek B. Do oceny czystości należy użyć przeciwciała CD19 zamiast przeciwciała CD3.13
    1. Do oceny czystości (opcjonalnie) należy użyć przeciwciała CD19 zamiast przeciwciała CD3. Odwirować 1 ml zawiesiny komórek splenocytu przy 500 x g. Odrzucić supernatant i zawiesić komórki w buforze cytometrii przepływowej o stężeniu 1 x 106 komórek/ml.
    2. Dodać znakowane fluorescencyjnie przeciwciało anty-mysie CD19 o stężeniu 1:100 i inkubować w temperaturze 4 °C przez 30 minut. Przemyć raz, odwirować i ponownie zawiesić w buforze cytometrii przepływowej (400 μl) w celu analizy za pomocą cytometrii przepływowej.

5. Aktywacja limfocytów T i indukcja ekspresji GFP

  1. Zasiać limfocyty T w zawiesinie na okrągłodennej 96-dołkowej płytce o stężeniu 2,5 x 105 komórek/dołek.
  2. Dodaj rekombinowaną interleukinę (IL)-7 w stężeniu 2 ng/ml i kulki magnetyczne CD3/CD28 (25 μl/106 komórek). Utrzymuj część limfocytów T niepotraktowaną kulkami, aby służyła jako kontrola negatywna dla późniejszych pomiarów, które reprezentują nieaktywowane limfocyty T.
  3. Dwanaście godzin później zbierz limfocyty T z 96-dołkowej płytki, delikatnie pipetując zawiesinę komórek w każdym dołku w górę iw dół, aby rozbić wszelkie kompleksy/agregaty komórek koralikowych. Zebrać zawiesinę ze wszystkich studzienek do probówki polistyrenowej o pojemności 5 ml.
  4. Umieść probówkę zawierającą zawiesinę w tym samym magnesie izolacyjnym komórek, który był wcześniej używany do oczyszczania komórek T lub B i pozwól jej odpocząć przez 5 minut.
  5. Przenieś zawiesinę limfocytów T do nowej rurki polistyrenowej, przytrzymując magnes i wylewając roztwór jednym ruchem.
  6. Odwirować komórki w temperaturze 500 x g przez 5 minut. Ponownie zawiesić komórki w świeżym pożywce splenocytowej, aby uzyskać stężenie 2 x 106 komórek/ml.
  7. Oceń intensywność ekspresji GFP za pomocą cytometrii przepływowej (opcjonalnie do kontroli jakości) po 12 do 24 godzinach od stymulacji w porównaniu z nieaktywowanymi limfocytami T. 12
    UWAGA: Fluorescencja GFP jest nieodłączna od limfocytów TNur77 GFP i objawia się po pomyślnej aktywacji TCR. 12
  8. W celu oceny żywotności i aktywacji (opcjonalnie) za pomocą mikroskopii, wybarwić aktywowane komórki preparatem Hoechst 30 minut przed analizą w stężeniu 0,2 μg/ml. Dodać odpowiednią objętość zawiesiny komórek do szkiełka nakrywkowego lub do studzienki płaskodennej, czarnościennej płytki 384-dołkowej i zbadać pod mikroskopem fluorescencyjnym w celu oceny żywych komórek. Martwe komórki nie zachowają barwienia jądrowego. 14

6. Aktywacja komórek B i indukcja ekspresji GFP

  1. Używając kolby hodowlanej T-25, ponownie zawiesić wyizolowane limfocyty B w ilości 1 x 106 komórek/ml.
  2. Dodać anty-mysie IgG/IgM (H+L) w stężeniu 10 μL/ml i rekombinowany CD40L w stężeniu 200 ng/ml. Utrzymuj część limfocytów B niepoddanych działaniu substancji, aby służyła jako kontrola ujemna do późniejszych pomiarów (reprezentujących nieaktywowane limfocyty B).
  3. Oceń intensywność ekspresji GFP za pomocą cytometrii przepływowej po 12 lub 24 godzinach od stymulacji w porównaniu z nieaktywowanymi limfocytami B.
    UWAGA: Fluorescencja GFP jest nieodłączna od limfocytów BNur77 GFP i objawia się po pomyślnej aktywacji BCR. 12
  4. W celu oceny żywotności i aktywacji (opcjonalnie) za pomocą mikroskopii, aktywowane komórki należy wybarwić Hoechst 30 minut przed analizą w stężeniu 0,2 μg/ml. Dodać odpowiednią objętość zawiesiny komórek do szkiełka nakrywkowego lub do studzienki płaskodennej, czarnościennej płytki 384-dołkowej i zbadać pod mikroskopem fluorescencyjnym w celu oceny żywych komórek. Martwe komórki nie zachowają barwienia jądrowego. 14

7. Wysokoprzepustowe badania przesiewowe małych cząsteczek

  1. Przygotować zawiesinę komórek o stężeniu 2 x 106 komórek/ml aktywowanych limfocytów T lub B (kulki magnetyczne lub przeciwciała/CD40L) lub grup nieaktywowanych.
  2. Umieść 75 000 komórek/basenik na płytce 384-dołkowej (objętość 40 μl). Użyj płaskodennej, czarnej płytki 384-dołkowej lub szkiełka mikroskopowego do oceny żywotności i aktywacji za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (opcjonalny etap kontroli jakości przed HTS) przy użyciu barwienia Hoechst (szczegółowe informacje znajdują się w krokach 5.8 i 6.4). 14
  3. Ręcznie lub za pomocą automatycznego systemu dodaj wybrane leki (rozpuszczone w 0,5% DMSO) do każdej studzienki.
  4. Dodać nośnik (DMSO) do dodatnich (aktywowanych) i ujemnych (nieaktywowanych) studzienek kontrolnych. Dostosuj stężenie DMSO do maksimum 0,5%.
  5. Inkubować płytki przez 24 godziny (lub wybrany czas inkubacji) w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  6. W dniu badania przesiewowego rozcieńczyć roztwór barwienia Hoechst 33342 (1:3,333; np. dodać 10 μl do komórek w płytkach 384-dołkowych, aby uzyskać całkowitą objętość do 50 μl). Barwienie 30 minut przed analizą GFP poprzez dodanie roztworu Hoechsta do uzyskania stężenia 0,2 μg/ml.
  7. Delikatnie pipetować komórki w górę i w dół, aby uzyskać jednorodny rozkład w każdym dołku.
    UWAGA: Ten krok jest ważny w przypadku dozowania leków (krok 7.3) przy użyciu systemu automatycznego, ponieważ komórki mają tendencję do gromadzenia się po jednej stronie studzienki, przeciwnej do kierunku przepływu.
  8. Wirować płytki w temperaturze 45 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
  9. Pozostaw talerze na 15 minut w temperaturze pokojowej.
  10. Wykonaj odczyt płytki (płytek) za pomocą automatycznego systemu konfokalnego badania przesiewowego o wysokiej zawartości (HCS). 15 Załaduj płytę do maszyny. Ustaw obiektyw na powiększenie 40x lub większe. Użyj kamery #4 dla Hoechst (lampa UV) i kamery #1 dla GFP (laser 488). Ustaw maszynę tak, aby odczytywała 6-10 pól na dołek. Wyreguluj maszynę tak, aby wykonywała dwa sekwencyjne odczyty na pole przy 488 nm (do odczytu GFP) i świetle UV (do odczytu Hoechst). Ustaw obiektyw na powiększenie 40x lub większe.
    UWAGA: System jest mikroskopem komputerowym, który nie wymaga żadnych regulacji. Odległość ogniskowa, intensywność padającego światła i czas ekspozycji są ustawiane automatycznie przez maszynę.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Projekt testu HTS

Dwa ważne czynniki zostały wzięte pod uwagę przy projektowaniu testu fluorescencyjnego. Po pierwsze, musieliśmy odtworzyć stan fizjologiczny, w którym aktywacja komórek T lub B oznaczałaby dolegliwość (np. chorobę przeszczep przeciwko gospodarzowi). Po drugie, ocena aktywacji komórkowej powinna być przeprowadzana przy użyciu czułej i ilościowej metody. Fluorescencja jest obecnie jednym z podstawowych wybo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykorzystano kilka metod odczytu w celu opracowania czułych i wiarygodnych testów HTS. Należą do nich metody kolorymetryczne, luminescencyjne czy fluorescencyjne. Chociaż metody kolorymetryczne są proste do skonfigurowania, wymagają wielokrotnego dodawania substancji chemicznych, które mogą zakłócać lub zakłócać działanie badanych komórek. 23 Ponadto nie pozwalają one na dynamiczną ocenę odpowiedzi biologicznej, ponieważ skutek farmakologiczny jest oceniany na podstawie określonego punktu końcoweg...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez fundusze Merck Frosst Start-up dostarczone przez Université de Montréal. Chcielibyśmy podziękować doktorom Jean Duchaine i Dominicowi Salois z platformy wysokoprzepustowej w Instytucie Badań nad Immunologią i Rakiem za dyskusję, komentarze i informacje zwrotne. Moutih Rafei posiada nagrodę Fonds de la Recherche en Santé du Québec Junior 1 Award.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Myszy Nur77GFPSzczep myszy Jackson Laboratorynr 016617W naszym zakładzie dla zwierząt założono kolonię domową 
96 płytek hodowlanych basen-U, sterylnaaktywacja limfocytów TVWR International10062-902
70 µ m sitko komórkowe, sterylneCorning Inc.352350Generacja zawiesiny komórek splenocytów
5 ml polistyrenowe probówki z okrągłym dnem, sterylneCorning Inc.352058Generacja zawiesiny komórek splenocytów
50 ml polipropylenowe stożkowe probówki, sterylneVWR International89039-656 Wytwarzanie zawiesiny komórkowej splenocytów
Strzykawka 10 ml bez igły, sterylnaBecton, Dickinson and Company305482Do zacierania kolby hodowlanej śledziony
T-25Greiner Bio-One690 175Do inkubacji limfocytów B podczas aktywacji
5 ml naczynie do hodowli komórkowych, sterylneGreiner Bio-One627 160Do zacierania śledziony
Penicylina- Streptomycyna (10 000 U/mL)WISENT Inc.450-200-EL   Składnik pożywki splenocytów
RPMI 1600 z wodorowęglanem sodu i L-glutaminąWISENT Inc.350-002-CL Składnik pożywki splenocytów
MEM aminokwasy endogenneWISENT Inc.321-010-EL Składnik pożywki splenocytów
Kwas wolny od HEPES 1 MWISENT Inc.330-050-EL Składnik pożywki splenocytów
Roztwór pirogronianu sodu (100mM)WISENT Inc.600-110-EL Składnik pożywki splenocytów
Płodowa surowica bydlęca (FBS) WISENT Inc.080-910 Składnik pożywki splenocytowej i buforu cytometrii przepływowej
Solanka fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)WISENT Inc.311-010-CLSkładnik buforu
2-merkaptoetanolu (55 mM)przepływowejThermo Fisher Scientific21985-023splenocytów
Stemcell Technologies19851Do izolacji limfocytów T
Zestaw do izolacji komórek BStemcell Technologies19854Do izolacji limfocytów B
Mysi aktywator T CD3/CD28 superparamagnetyczny koralikiThermo Fisher Scientific11452DDo aktywacji limfocytów T 
Magnes do izolacji komórekStemcell Technologies18000Do izolowania limfocytów T i usuwania kulek magnetycznych 
AffiniPure F(ab')2 Fragment kozła anty-mysia IgG + IgM (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.115-006-068Do stymulacji limfocytów B
Rekombinowana mysia IL-7Peprotech217-17 Aby wspomóc przeżycie limfocytów T podczas aktywacji
Rekombinowany CD40LR& D Systems8230-CL/CFDo stymulacji limfocytów B
Przeciwciało anty-mysie CD3BD Pharmingen561799Do barwienia limfocytów T do cytometrii przepływowej
Przeciwciało anty-mysie CD19BD Pharmingen553786Do barwienia limfocytów B do cytometrii przepływowej
Biomek FXpPerkinElmer Inc.A31842Aby ponownie zawiesić komórki po 24-godzinnej inkubacji
System badań przesiewowych o wysokiej zawartości Opera PhenixPerkinElmer Inc.HH14000000Do analizy sygnału GFP/Hoechst
za pomocą kulek magnetycznych do cytometrii Składnik zestawu do izolacji komórek T

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered. Nat Rev Drug Discov. 10 (7), 507-519 (2011).
  2. Macarron, R., et al. Impact of high-throughput screening in biomedical research. Nat Rev Drug Discov. 10 (3), 188-195 (2011).
  3. Lokey, R. S. Forward chemical genetics: progress and obstacles on the path to a new pharmacopoeia. Curr Opin Chem Biol. 7 (1), 91-96 (2003).
  4. Hall, S. E. Chemoproteomics-driven drug discovery: addressing high attrition rates. Drug Discov Today. 11 (11-12), 495-502 (2006).
  5. Pruss, R. M. Phenotypic screening strategies for neurodegenerative diseases: a pathway to discover novel drug candidates and potential disease targets or mechanisms. CNS Neurol Disord Drug Targets. 9 (6), 693-700 (2010).
  6. St Onge, R., Schlecht, U., Scharfe, C., Evangelista, M. Forward chemical genetics in yeast for discovery of chemical probes targeting metabolism. Molecules. 17 (11), 13098-13115 (2012).
  7. Houston, J. G., Banks, M. N., Binnie, A., Brenner, S., O'Connell, J., Petrillo, E. W. Case study: impact of technology investment on lead discovery at Bristol-Myers Squibb. Drug Discov Today. 13 (1-2), 44-51 (2008).
  8. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
  9. Walters, W. P., Namchuk, M. Designing screens: how to make your hits a hit. Nat Rev Drug Discov. 2 (4), 259-266 (2003).
  10. Zheng, W., Thorne, N., McKew, J. C. Phenotypic screens as a renewed approach for drug discovery. Drug Discov Today. 18 (21-22), 1067-1073 (2013).
  11. Malo, N., Hanley, J. A., Cerquozzi, S., Pelletier, J., Nadon, R. Statistical practice in high-throughput screening data analysis. Nat Biotechnol. 24 (2), 167-175 (2006).
  12. Moran, A. E., et al. T cell receptor signal strength in Treg and iNKT cell development demonstrated by a novel fluorescent reporter mouse. J Exp Med. 208 (6), 1279-1289 (2011).
  13. Kovacic, N., Müthing, J., Marusic, A. Immunohistological and Flow Cytometric Analysis of Glycosphingolipid Expression in Mouse Lymphoid Tissues. J Histochem Cytochem. 48, 1677-1689 (2000).
  14. Shapiro, H. M. Flow cytometric estimation of DNA and RNA content in intact cells stained with hoechst 33342 and pyronin Y. Cytometry. 2, 143-150 (1981).
  15. Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. High content screening: seeing is believing. Trends Biotechnol. 28 (5), 237-245 (2010).
  16. An, W. F. Fluorescence-based assays. Methods Mol Biol. 486, 97-107 (2009).
  17. Kishimoto, H., Sprent, J. Strong TCR ligation without costimulation causes rapid onset of Fas-dependent apoptosis of naive murine CD4+ T cells. J Immunol. 163 (4), 1817-1826 (1999).
  18. Schluns, K. S., Kieper, W. C., Jameson, S. C., Lefrancois, L. Interleukin-7 mediates the homeostasis of naive and memory CD8 T cells in vivo. Nat Immunol. 1 (5), 426-432 (2000).
  19. Jiang, Q., et al. Cell biology of IL-7, a key lymphotrophin. Cytokine Growth Factor Rev. 16 (4-5), 513-533 (2005).
  20. Koenen, P., et al. Mutually exclusive regulation of T cell survival by IL-7R and antigen receptor-induced signals. Nat Commun. 4, 1735(2013).
  21. Vella, A., Teague, T. K., Ihle, J., Kappler, J., Marrack, P. Interleukin 4 (IL-4) or IL-7 prevents the death of resting T cells: stat6 is probably not required for the effect of IL-4. J Exp Med. 186 (2), 325-330 (1997).
  22. Hawkins, C. J., Vaux, D. L. The role of the Bcl-2 family of apoptosis regulatory proteins in the immune system. Semin Immunol. 9 (1), 25-33 (1997).
  23. Sumantran, V. N. Cellular chemosensitivity assays: an overview. Methods Mol Biol. 731, 219-236 (2011).
  24. Huh, S., et al. A cell-based system for screening hair growth-promoting agents. Arch Dermatol Res. 301 (5), 381-385 (2009).
  25. Weiss, A. TCR signal transduction: opening the black box. J Immunol. 183 (8), 4821-4827 (2009).
  26. Noel, P. J., Boise, L. H., Green, J. M., Thompson, C. B. CD28 costimulation prevents cell death during primary T cell activation. J Immunol. 157 (2), 636-642 (1996).
  27. Michels, A. W., et al. Structure-based selection of small molecules to alter allele-specific MHC class II antigen presentation. J Immunol. 187 (11), 5921-5930 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Fluorescence based Lymphocyte AssayHigh throughput ScreeningT Cell IsolationB Cell IsolationNur77 GFP MouseMagnetic Bead SeparationGFP Expression AnalysisSmall Molecule ScreeningImmunomodulatory Compound IdentificationCell Culture Incubation

Powiązane artykuły