Restenoza po zabiegach sercowo-naczyniowych (operacja pomostowania, angioplastyka lub stentowanie) jest poważnym problemem zmniejszającym trwałość tych procedur. Idealna terapia hamowałaby proliferację komórek mięśni gładkich (VSMC), jednocześnie promując regenerację śródbłonka. Opisano model jednoczesnej oceny proliferacji VSMC i funkcji śródbłonka in vivo.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Mysi uraz zmiażdżenia aorty: skuteczny model in vivo proliferacji komórek mięśni gładkich i funkcji śródbłonka
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Rekonstrukcja tętnic, czy to angioplastyka, czy operacja pomostowania, wiąże się z jatrogennym urazem powodującym zakłócenie śródbłonka i proliferację komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych (VSMC). Typowe modele mysie badają małe naczynia, takie jak tętnice szyjne i udowe. W niniejszym artykule opisano system in vivo, w którym zarówno proliferacja VSMC, jak i funkcja bariery śródbłonkowej mogą być jednocześnie oceniane w dużym naczyniu. Badaliśmy odpowiedź podnerkową aorty na uraz u myszy C57BL / 6. Aorta została uszkodzona od lewej żyły nerkowej do rozwidlenia aorty przez 30 przezściennych zgnieceń trwających 5 sekund za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką. Zmiany morfologiczne oceniano za pomocą konwencjonalnej histologii. Grubość ścianki aorty mierzono od powierzchni światła do przydanki. Integracja EdU i przeciwbarwienie za pomocą DAPI i alfa-aktyny zostały wykorzystane do wykazania proliferacji VSMC. Aktywacja ERK1/2, znanego moderatora powstawania przerostu błony wewnętrznej, została określona za pomocą analizy Western Blot. Wpływ stanu zapalnego określono za pomocą immunohistochemii dla limfocytów B, limfocytów T i makrofagów. Przekroje śródbłonka en face uwidoczniono za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM). Funkcję bariery śródbłonka określono za pomocą barwienia Evans Blue. Uraz przezścienny spowodował pogrubienie ściany aorty. Uraz ten indukował proliferację VSMC, najbardziej widoczną po 3 dniach od urazu, oraz wczesną aktywację ERK1 / 2 i zmniejszoną ekspresjęp27 kip1. Uraz nie spowodował zwiększonej infiltracji limfocytów B, T ani makrofagów w ścianie naczynia. Uraz spowodował częściowe obnażenie komórek śródbłonka i utratę kontaktu komórka-komórka. Uraz spowodował znaczną utratę funkcji bariery śródbłonkowej, która powróciła do wartości wyjściowej po siedmiu dniach. Mysi przezścienny model uszkodzenia aorty zapewnia wydajny system do jednoczesnego badania zarówno proliferacji VSMC, jak i funkcji bariery śródbłonkowej w dużym naczyniu.
Wprowadzenie
Restenoza po zabiegach sercowo-naczyniowych (operacja pomostowania, angioplastyka lub stentowanie) jest poważnym problemem zmniejszającym trwałość tych procedur. Wszystkie zabiegi rewaskularyzacji są nękane restenozą. Przedstaw strategie zapobiegania restenozy (stenty uwalniające leki i balony pokryte lekiem) hamują zarówno proliferację komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych (VSMC), jak i komórek śródbłonka (EC). W związku z tym interwencje te zapobiegają restenozie, w której pośredniczy VSMC, ale także zapobiegają regeneracji śródbłonka. Bez nienaruszonego śródbłonka pacjenci muszą przyjmować silne leki przeciwpłytkowe, aby zmniejszyć ryzyko zakrzepicy in situ przy ryzyku powikłań krwotocznych. Idealna terapia hamowałaby proliferację VSMC, jednocześnie promując regenerację śródbłonka. W związku z tym istnieje potrzeba jednoczesnego badania proliferacji VSMC i funkcji bariery śródbłonkowej invivo.
Obecnie istnieje kilka mysich modeli restenozy 1. Modele te obejmują podwiązanie tętnicy szyjnej i uszkodzenie drutu tętnicy udowej 2. Modele aorty obejmują umieszczanie stentów 3, uszkodzenie balonu 4 oraz alloprzeszczep aorty 5. Wszystkie obecne modele są limitowane. Podwiązanie tętnicy szyjnej generuje zmianę neointyczną opartą na przepływie i nie powoduje uszkodzenia śródbłonka. Ponadto zarówno tętnice szyjne, jak i udowe mają wielokrotnie mniej warstw komórkowych niż naczynia ludzkie, co ogranicza ich wartość translacyjną. Mysia aorta, która ma około 1,3 mm średnicy, jest jedynym naczyniem, które jest zbliżone do klinicznie istotnej (wieńcowej) tętnicy ludzkiej (3).
Pomimo potencjału translacyjnego mysich modeli chorób aortalnych, obecne modele mają ograniczenia. Modele te wymagają zaawansowanych umiejętności mikrochirurgicznych i specjalistycznego sprzętu, takiego jak balony do angioplastyki i stenty. W niniejszym artykule przedstawiamy nowatorską, powtarzalną technikę jednoczesnego indukowania proliferacji VSMC i zakłócania funkcji bariery śródbłonkowej.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Oświadczenie etyczne: Protokoły dotyczące obchodzenia się ze zwierzętami zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Maryland (numer protokołu 0416009) i przeprowadzone zgodnie z międzynarodowymi standardami AAALAC.
1. Zabieg chirurgiczny
- Technika anestezjologiczna
- Sterylizować wszystkie narzędzia używane w chirurgii przetrwania za pomocą sterylizacji parowej w temperaturze 121 °C przez 30 min.
- Indukuj znieczulenie za pomocą zbiornika indukcyjnego ze 100%O2 i 2,5% izofluranem dostarczanym przez precyzyjny waporyzator. Po indukcji odstawić izofluran i przepłukać komoręO2. Utrzymuj znieczulenie za pomocą 1,5-2% izofluranu przez maskę na twarz i 1 l/minO2 przez wdychanie.
- Przymocuj zarówno komorę indukcyjną, jak i maskę na twarz do pochłaniacza węgla drzewnego w celu adsorpcji gazów odlotowych w celu ochrony personelu. Zapewnij odpowiednią płaszczyznę znieczulenia, wykazując, że nie ma reakcji na szkodliwe bodźce (szczypanie palców).
- Stwórz pole operacyjne składające się z tacki chirurgicznej z podkładką izotermiczną, aby zapewnić wsparcie termiczne podczas operacji. Dodatkowa podkładka izotermiczna zapewni wsparcie termiczne zwierzętom w klatce regeneracyjnej.
- Przygotowanie zwierząt
- Przeprowadź następujące badanie na 10-12 tygodniowych samcach myszy C57BL/6.
- Usuń włosy z brzusznej powierzchni brzucha zwierzęcia od mostka do okolicy pachwinowej za pomocą środka do depilacji lub elektrycznej maszynki do strzyżenia z ostrzem numer 40.
- W przypadku środka do depilacji należy nanieść ten związek na obszar operacyjny na 2-3 minuty, a następnie usunąć go bawełną. Używamy dostępnego w handlu związku wodorotlenku wapnia i wodorotlenku sodu.
- Przygotuj obszar nad ramieniem 70% alkoholem i wstrzyknij podskórnie karprofen (5 mg/kg) za pomocą igły o średnicy 25 lub mniejszej. Zabieg ten zapewni zwierzęciu analgezję pooperacyjną.
- Przenieś zwierzę na pole operacyjne i ustaw w pozycji leżącej grzbietowej.
- Przygotuj miejsce operacji, szorując 8-12% jodu prowidonu za pomocą czystego bawełnianego aplikatora lub bawełnianej gazy. Następnie dwukrotnie spłucz skórę 70% alkoholem.
- Umieść lubrykant do oczu w obu oczach, aby zmniejszyć częstość występowania wysuszenia rogówki. Przykryj pole operacyjne sterylnym obłożeniem.
- Technika operacyjna
- Wykonaj środkowe nacięcie laparotomii brzusznej o długości około 2-2,5 cm za pomocą skalpela, zaczynając bezpośrednio doogonowo wyrostek mieczykowaty i rozciągając się w kierunku miednicy.
- Zmobilizuj jelito cienkie i dwunastnicę i odbij się bocznie w prawo. Zwiń pasek sterylnej bawełny z gazy i nasączony sterylnym solą fizjologiczną do wstrzykiwań, aby umożliwić upakowanie wnętrzności w celu poprawy ekspozycji.
- Gdy jelito cienkie jest zmobilizowane po prawej stronie jamy brzusznej, należy odsłonić otwór zaotrzewnowy i odsłonić aortę brzuszną od lewej żyły nerkowej do rozwidlenia aorty (ryc. 1).
- Za pomocą sterylnego aplikatora z bawełnianą końcówką wykonaj 30 kolejnych zgnieceń, z których każde trwa pięć sekund.
- Usuń opakowanie i pozwól wnętrznościom powrócić do swojej naturalnej pozycji.
- Zamknij powięź za pomocą biegnącego 4-0 wchłanialnego szwu monofilamentowego (polidioksanon). Skóra zamykana jest niewchłanialnym szwem monofilamentowym 6-0 (nylon).
- Rekonwalescencja i opieka pozabiegowa
- Po zabiegu umieść zwierzę w klatce rekonwalescencji z czystą ściółką na podkładce izotermicznej, aby kontynuować wsparcie termiczne do momentu, gdy zwierzę będzie w stanie normalnie się poruszać. Nie pozostawiaj zwierzęcia bez opieki, dopóki nie wykaże zdolności do utrzymania pozycji leżącej mostka.
- Monitoruj zwierzę co godzinę przez pierwsze 4 godziny po zabiegu. Gdy zwierzę zacznie normalnie poruszać się, zwróć je do przydzielonego pomieszczenia hodowlanego. Zwierzę nie będzie trzymane w towarzystwie innego zwierzęcia, dopóki w pełni nie wyzdrowieje.
- Monitorować zwierzę dwa razy dziennie przez pierwsze 72 godziny po zabiegu i co najmniej 3 razy w tygodniu po zabiegu. Monitorowanie obejmuje ważenie zwierzęcia trzy razy w tygodniu.
- Karpofen (5 mg/kg) należy podawać podskórnie dwa razy na dobę przez pierwsze 72 godziny po zabiegu.
2. Pobieranie tkanek
- Metoda eutanazji
- Poddaj zwierzęta eutanazji w określonych punktach czasowych.
- Indukuj znieczulenie za pomocą zbiornika indukcyjnego ze 100%O2 i 2,5% izofluranem dostarczanym przez precyzyjny waporyzator.
- Aby zbadać integralność śródbłonka, podaj zwierzęciu barwnik Evans Blue.
UWAGA: Evans Blue jest ujemnie naładowanym barwnikiem azowym o wysokim powinowactwie do albuminy i może barwić naczynia krwionośne tylko przy braku nienaruszonego śródbłonka6. - W przypadku badań integralności śródbłonka, w czasie eutanazji, należy perfuzjować zwierzęta 5 ml 0,3% barwnika Evans Blue, a następnie 5 ml PBS pod ciśnieniem fizjologicznym przez 5 minut. Zwierzę jest utrzymywane w chirurgicznej płaszczyźnie znieczulenia podczas zabiegu perfuzji.
- Aby zbadać integralność śródbłonka, podaj zwierzęciu barwnik Evans Blue.
- Po osiągnięciu głębokiej płaszczyzny znieczulenia otwórz klatkę piersiową za pomocą sternotomii. Wykonać ranę szarpaną w prawym przedsionku, aby umożliwić odpływ krwi ze zwierzęcia i dostęp do lewej komory za pomocą igły 21 G i wstrzyknąć sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), aż ścieki z prawego przedsionka będą czyste.
- Po perfuzji z PBS należy wejść do jamy brzusznej przez nacięcie w linii środkowej.
- Ponownie zmobilizuj jelito cienkie po prawej stronie brzucha, odsłaniając aortę podnerkową, ostro odetnij aortę od sąsiednich tkanek i wytnij ją od lewej żyły nerkowej do rozwidlenia aorty.
- Przechowuj wyciętą aortę w 4% roztworze paraformaldehydu do czasu przetworzenia tkanki.
- W przypadku badań integralności śródbłonka otwórz aortę wzdłużnie i przypnij ją do arkusza wosku, odsłaniając całą powierzchnię światła6. Przeprowadź jakościową ocenę integralności śródbłonka na podstawie stopnia zabarwienia barwnikiem Evans Blue6.
- W przypadku innych testów histologicznych należy przeciąć aortę poprzecznie i osadzić ją w związkach o optymalnej temperaturze skrawania (OCT), zgodnie z metodą histologiczną, która ma być użyta 7.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Przekroje poprzeczne aorty zatopione w OCT zostały wycince i zabarwione hematoksyliną i eozyną, a następnie poddano je barwieniu Verhoeffa-Van Giesona (VVG) w celu identyfikacji wewnętrznej i zewnętrznej błony elastycznej 7. Uraz zmiażdżeniowy wywołał pogrubienie ściany aorty w porównaniu z aortami zwierząt poddanych procedurze pozorowanej (wyłącznie laparotomii i mobilizacji jelita cienkiego). Grubość ściany, oceniana jako odległość od błony zewnętrznej do światła...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Scharakteryzowaliśmy efekty modelu uszkodzenia aorty mysiej powodującego przerost przyśrodkowy i dysfunkcję bariery śródbłonkowej. Częściowe odwarstwienie EC wzdłuż błony wewnętrznej aorty towarzyszyło utracie kontaktu komórka-komórka i wzmocnieniu wypukłości komórek. W związku z tym funkcja bariery śródbłonkowej była znacznie upośledzona, co stymulowało szlaki sygnałowe wrażliwe na mitogeny, prowadząc do proliferacji VSMC i pogrubienia ściany naczynia. Mocną stroną tego modelu jest to, że jest on technicznie łatwiejszy ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Ta praca została sfinansowana przez Departament ds. Weteranów Nagroda Rozwoju Kariery (1IK2BX001553-01) (TSM) oraz stypendium Vascular Cures E. J. Wylie Scholarship (TSM).
Podziękowania
Dziękujemy dr Hsia Ru-ching z Głównego Ośrodka Mikroskopii Elektronowej Szkoły Medycznej Uniwersytetu Maryland za jej wsparcie techniczne w przetwarzaniu próbek skaningowej mikroskopii elektronicznej.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Smar do oczu | Dechra | 17033-211-38 | Środki farmaceutyczne |
| Isoflurane | VetOne | 502017 | Środki farmaceutyczne |
| Carprofen | Zoetis | 26357 | Środki farmaceutyczne |
| Waporyzator precyzyjny | Summit Medical | 10675 | Materiały chirurgiczne |
| Wymiatacz węgla drzewnego | Bickford Inc. | 80120 | Materiały chirurgiczne |
| Podkładka izotermiczna | Aparat Harvard | 50-7053-R | Materiały chirurgiczne |
| Sterylny aplikator z bawełnianą końcówką | Fisher Scientific | 23-400-124 | Materiały chirurgiczne |
| 4-0 wchłanialny szew monofilamentowy | Ethicon, Inc | J310 | Materiały chirurgiczne |
| 5-0 niewchłanialny szew monofilamentowy | Ethicon,Inc | 1666 | Materiały chirurgiczne |
| Igła 21 x 1 cal | BD Biosciences | 305165 | Materiały chirurgiczne |
| Igła o rozmiarze 25 x 1 cal Igła | BD Biosciences | 305125 | Materiały chirurgiczne |
| Suchy sterylizator | Cellpoint | 7770 | Artykuły chirurgiczne |
| Drobne nożyczki | Narzędzia do nauki | 14058-09 | Narzędzia chirurgiczne |
| Kleszcze Adson | Narzędzia do nauki | 11006-12 | Narzędzia chirurgiczne |
| Kleszcze Dumont #5 | Narzędzia do nauki o naprawach | 11254-20 | Narzędzia chirurgiczne |
| Vannas Nożyczki sprężynowe 3 mm | Fine Science Tools | 15000-00 | Narzędzia chirurgiczne |
| Sterownik igieł | Fine Science Tools | 91201-13 | Narzędzia chirurgiczne |
| Rękojeść skalpela #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | Narzędzia chirurgiczne |
| Ostrza skalpela #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | Narzędzia chirurgiczne |
| PBS | Lonza | 17-516F | Odczynniki do przetwarzania tkanek |
| Evans Blue | Sigma-Aldrich | E2129 | Odczynniki do przetwarzania tkanek |
| Paraformaldehyd | Sigma-Aldrich | P6148 | Odczynniki do przetwarzania tkanek |
| Wosk modelarski | Bego | 40001 | Odczynniki do przetwarzania tkanek |
| Związek OCT | Tissue-Tek | Sakura 4583 | Odczynniki do Przetwarzanie tkanek |
| Roztwór hematoksyliny Mayera | Sigma-Aldrich | MHS16 | Odczynniki do analizy immunohistologicznej |
| Eozyna Y roztwór alkoholowy | Sigma-Aldrich | HT110316 | Odczynniki do analizy immunohistologicznej |
| Zestaw barwników elastynowych | Sigma-Aldrich | HT25A | Odczynniki do analizy immunohistologicznej |
| Zestaw do obrazowania Click-it Edu Alexa-488 | Invitrogen | C10337 | Odczynniki do analizy immunohistologicznej |
| Przeciwciało anty-Erk1/2 | Technologia sygnalizacji komórkowej | 4695 | Odczynniki do immunohistologii analiza |
| przeciwciała anty-fosfo-Erk1/2 | Technologia sygnalizacji komórkowej | 4370 | Odczynniki do analizy immunohistologicznej |
| Przeciwciało anty-p27kip1 | Technologia sygnalizacji komórkowej | 3698 | Odczynniki do analizy immunohistologicznej |
| Kwas trichlorooctowy | Sigma-Aldrich | T9159 | Odczynniki do analizy immunohistologicznej |
Bibliografia
- Carmeliet, P. Mechanisms of angiogenesis and arteriogenesis. Nat Med. 6 (4), 389-395 (2000).
- Carmeliet, P., Moons, L., Collen, D. Mouse models of angiogenesis, arterial stenosis, atherosclerosis and hemostasis. Cardiovasc Res. 39 (1), 8-33 (1998).
- Baker, A. B., et al. Heparanase Alters Arterial Structure, Mechanics, and Repair Following Endovascular Stenting in Mice. Circ Res. 104 (3), 380-387 (2009).
- Petrov, L., Laurila, H., Hayry, P., Vamvakopoulos, J. E. A mouse model of aortic angioplasty for genomic studies of neointimal hyperplasia. J Vasc Res. 42 (4), 292-300 (2005).
- Li, J., et al. Vascular smooth muscle cells of recipient origin mediate intimal expansion after aortic allotransplantation in mice. Am J Path. 158 (6), 1943-1947 (2001).
- Radu, M., Chernoff, J. An in vivo assay to test blood vessel permeability. J Vis Exp. (73), e50062(2013).
- Turbett, G. R., Sellner, L. N. The use of optimal cutting temperature compound can inhibit amplification by polymerase chain reaction. Diagn Mol Pathol. 6 (5), 298-303 (1997).
- Puchtler, H., Waldrop, F. S. On the mechanism of Verhoeff's elastica stain: a convenient stain for myelin sheaths. Histochem. 62 (3), 233-247 (1979).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Nelson, P. R., Yamamura, S., Mureebe, L., Itoh, H., Kent, K. C. Smooth muscle cell migration and proliferation are mediated by distinct phases of activation of the intracellular messenger mitogen-activated protein kinase. J Vasc Surg. 27 (1), 117-125 (1998).
- Rzucidlo, E. M. Signaling pathways regulating vascular smooth muscle cell differentiation. Vascular. 17, Suppl 1. S15-S20 (2009).
- Aoki, T., Sumii, T., Mori, T., Wang, X., Lo, E. H. Blood-brain barrier disruption and matrix metalloproteinase-9 expression during reperfusion injury: mechanical versus embolic focal ischemia in spontaneously hypertensive rats. Stroke. 33 (11), 2711-2717 (2002).
- Yu, D., et al. MARCKS Signaling Differentially Regulates Vascular Smooth Muscle and Endothelial Cell Proliferation through a KIS-, p27kip1- Dependent Mechanism. PLoS One. 10 (11), e0141397(2015).
- Banai, S., et al. Rabbit ear model of injury-induced arterial smooth-muscle cell-proliferation - kinetics, reproducibility, and implications. Circ Res. 69 (3), 748-756 (1991).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
