Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Metoda pobierania wymazów w celu wykrycia ludzkiego norowirusa na powierzchniach

19.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55205

⸱

6 lutego 2017

 ,  , 
1Division of Viral Diseases, Centers for Disease Control and Prevention

W tym artykule

Podsumowanie

Metodologia pobierania próbek oparta na makropianie została opracowana i oceniona pod kątem wykrywania i kwantyfikacji norowirusa na twardych powierzchniach środowiskowych.

Streszczenie

Ludzkie norowirusy są główną przyczyną epidemicznego i sporadycznego zapalenia żołądka i jelit na całym świecie. Ponieważ większość zakażeń rozprzestrzenia się bezpośrednio z człowieka na człowieka lub pośrednio przez powierzchnie środowiskowe lub żywność, skażone ogniska i powierzchnie nieożywione są ważnymi nośnikami rozprzestrzeniania się wirusa podczas epidemii norowirusa.

Opracowaliśmy i oceniliśmy protokół wykorzystujący wymazy z makropianki do wykrywania i typowania ludzkich norowirusów z twardych powierzchni. W porównaniu z wacikami z końcówką z włókna lub chusteczkami antystatycznymi, waciki makropiankowe umożliwiają usuwanie wirusów (w zakresie 1,2-33,6%) z powierzchni desek sedesowych o wysokości do 700cm2. Protokół obejmuje etapy ekstrakcji wirusa z wymazów i dalszego zagęszczania wirusowego RNA za pomocą kolumn wirowych. W sumie 127 (58,5%) z 217 próbek wymazów, które zostały pobrane z powierzchni na statkach wycieczkowych i placówkach opieki długoterminowej, w których zgłoszono norowirusowe zapalenie żołądka i jelit, uzyskało pozytywny wynik na obecność norowirusa GII metodą RT-qPCR. Spośród nich 29 (22,8%) można było z powodzeniem zgenotypować. Podsumowując, wykrywanie norowirusa na powierzchniach środowiskowych przy użyciu opracowanego przez nas protokołu może pomóc w określeniu poziomu skażenia środowiska podczas epidemii, a także w wykrywaniu wirusa, gdy próbki kliniczne nie są dostępne; Może to również ułatwić monitorowanie skuteczności strategii remediacji.

Wprowadzenie

Ludzkie norowirusy są główną przyczyną epidemicznego i sporadycznego ostrego zapalenia żołądka i jelit na całym świecie 1,2,3. Wirus jest niezwykle zaraźliwy, a jego przenoszenie następuje poprzez bezpośrednią interakcję międzyludzką lub pośrednio poprzez kontakt ze skażoną żywnością, wodą lub powierzchniami środowiskowymi. Norowirusy mogą być wydalane przez dłuższy czas, a przedłużone przetrwanie wirusa na powierzchniach środowiskowych zostało udokumentowane 1,2,3. Podczas szczytowego wydalania na gram kału uwalniane są miliardy cząsteczek wirusa, a wymiociny zawierają również wystarczającą liczbę cząsteczek wirusa, aby spowodować infekcję 4,5,6,7,8,9,10. Ponadto przenoszenie wirusa między powierzchniami nieożywionymi a ludzką skórą może być łatwe 2,11,12. W związku z tym monitorowanie skażenia środowiska może pomóc w dochodzeniu w sprawie wystąpienia epidemii oraz w ocenie skuteczności procedur oczyszczania i dezynfekcji.

Opisano kilka protokołów pobierania próbek środowiskowych do wykrywania rotawirusa, kolifaga MS2, kaliciwirusa kotów (FCV) i bakteriofaga P22 13,14,15,16. Jednak warunki walidacji opisane w tych badaniach, w tym szybkie wysychanie (<1 godz.) i małe powierzchnie (25 x 100 cm2), mogą nie odzwierciedlać odpowiednio ustawień polowych. Ponadto spodziewane niskie poziomy zanieczyszczenia powierzchni środowiskowych wymagają protokołów, które są w stanie wykryć bardzo niewiele cząstek wirusa.

Opracowaliśmy metodę próbkowania powierzchni opartą na makropianie do wykrywania i typowania norowirusa. Metoda ta została zwalidowana podczas kilku epidemii norowirusa. Protokół obejmuje 1) sposób pobierania próbek wymazów z powierzchni środowiskowych, (2) jak najlepiej zachować integralność próbek podczas pobierania i wysyłki do laboratorium oraz 3) badania laboratoryjne i typowanie norowirusa.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Pobieranie wymazów w terenie

  1. Załóż czystą parę rękawiczek.
  2. Zmierz wielkość obszaru pobierania próbek bez dotykania powierzchni za pomocą taśmy mierniczej lub linijki. Postaraj się jak najdokładniej oszacować powierzchnię i wypełnij formularz raportu (Tabela uzupełniająca 1).
  3. Sprawdź zestaw wacików pod kątem ewentualnych wycieków i oznacz torby transportowe na próbki i zestawy wacików.
  4. Przesuń wacik po obszarze pobierania próbek w następujący sposób: jedno pociągnięcie w kierunku poziomym, jedno pociągnięcie w kierunku pionowym i jedno pociągnięcie w kierunku ukośnym. Nie pobieraj wymazów z powierzchni większej niż 700 cm2.
  5. Umieść każdy wacik w tubce i mocno dokręć nakrętkę.

2. Przechowywanie i transport wymazów do laboratorium

  1. Waciki należy przechowywać w temperaturze 4 °C do 48 godzin. Jeśli wymagane jest przechowywanie przez dłuższy czas, należy przechowywać waciki w temperaturze -20 °C (lub -70 °C).
  2. Probówki należy przechowywać w temperaturze 0-4 °C (tj. używać zimnych wkładów) w izolowanym pojemniku podczas transportu do laboratorium i wysłać w ciągu 24-48 godzin od pobrania.

3. Koncentracja wirusa, ekstrakcja i oczyszczanie wirusowego RNA

UWAGA: Wszystkie etapy wirowania używają wirówki stołowej o stężeniu 5 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, chyba że zaznaczono inaczej. Zachowaj szczególną ostrożność podczas pracy z uniwersalnym buforem do ekstrakcji kwasów nukleinowych (UNEX). Nosić okulary lub osłonę twarzy.

  1. Oznaczyć jedną probówkę o pojemności 15 ml i jedną kolumnę Midi RNA dla każdej próbki. W każdym eksperymencie należy uwzględnić negatywną kontrolę ekstrakcji.
  2. Aby przygotować roztwór do lizy na 10 wymazów, wymieszaj 25 ml buforu UNEX z 25 ml PBST (PBS pH 7,2 zawierające 0,02% Tween-80).
  3. Dodać 50 μl zawiesiny colifag MS2 (106 PFU/μl) do 50 ml roztworu do lizy.
  4. Umieść wacik w probówce o pojemności 15 ml i dodaj 5 ml roztworu do lizy. Mieszać i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Dodaj 5 ml 100% etanolu do każdej probówki i wiruj przez 10 sekund.
  6. Ostrożnie wyjmij wacik z probówki o pojemności 15 ml (zawiera bufor UNEX), delikatnie dociskając go do boku probówki, aby usunąć nadmiar płynu, a następnie wyrzuć wacik. Pozostałe objętości powinny wynosić od 9 do 10 ml.

4. Ekstrakcja wirusowych kwasów nukleinowych w kolumnie Midi

  1. Ostrożnie przenieść 4,5 ml mieszaniny UNEX/etanolu z kroku 3.6 na kolumnę midi, odwirować i wyrzucić filtrat.
  2. Załaduj kolejne 4,5 ml z tej samej mieszaniny do tej samej kolumny, odwiruj i wyrzuć filtrat.
  3. Do pierwszego płukania dodać 3,5 ml 70% etanolu do kolumny Midi, odwirować i wyrzucić filtrat.
  4. Do drugiego prania dodaj kolejne 3,5 ml 70% etanolu na kolumnę Midi. Odwirować i wyrzucić filtrat.
  5. W celu wirowania na sucho odwiruj kolumny Midi, aby usunąć wszelkie ślady etanolu (który może negatywnie wpłynąć na odzysk wirusowego RNA).
  6. Umieść kolumnę Midi w nowej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml. Dodać 250 μl buforu elucyjnego do kolumny Midi; Odczekaj 1 minutę przed odwirowaniem, aby uzyskać najwyższy odzysk wirusowego RNA.
  7. Przechowywać wyekstrahowany kwas nukleinowy w temperaturze -70 °C lub natychmiast przejść do kroku 5.

5. Koncentracja wirusowego kwasu nukleinowego za pomocą zestawów do czyszczenia i koncentratora RNA

  1. Dodaj 500 μl buforu wiążącego RNA do 250 μl RNA eluowanego w kroku 4.7 powyżej i wiruj przez 10 s.
  2. Dodaj 750 μl 100% etanolu i wiruj przez 10 sekund.
  3. Oznacz kolumnę wirowania dla każdej próbki. Załadować próbkę o objętości 750 μl na kolumnę wirową.
  4. Odwirować kolumny wirowe przy 12 000 x g przez 1 minutę. Wyrzucić przepływ.
  5. Załaduj pozostałe 750 μl na kolumnę wirową i odwiruj przy 12 000 x g przez 1 minutę.
  6. Do mycia wstępnego dodać 400 μl buforu przygotowawczego RNA do każdej kolumny wirowej i odwirować przy 12 000 x g przez 1 minutę. Wyrzuć przepływ.
  7. Do pierwszego płukania dodać 800 μl buforu płuczącego RNA do każdej kolumny wirowej i odwirować przy 12 000 x g przez 1 minutę. Wyrzucić przepływ.
  8. Do drugiego płukania dodać 400 μl buforu do płukania RNA do kolumny wirowej i odwirować przy 12 000 x g przez 1 minutę. Wyrzucić przepływ.
  9. W przypadku wirowania na sucho odwirować kolumnę wirową, aby usunąć wszelkie ślady buforu płuczącego o stężeniu 12 000 x g przez 2 minuty.
  10. Ostrożnie przenieś kolumnę wirową do czystej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
  11. Dodać 25 μl buforu elucyjnego do kolumny wirowej i inkubować przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. Zwiększy to odzyskiwanie wirusowego RNA z kolumny.
  12. Zebrać RNA, odwirowując kolumnę wirową przy 10 000 x g przez 1 minutę.
  13. Przejdź bezpośrednio do RT-qPCR (krok 6) lub przechowuj RNA w temperaturze -70 °C.

6. Mutiplex RT-qPCR Wykrywanie norowirusów Genogrupy I i II oraz Coliphage MS 2 (Tabela uzupełniająca 2)

  1. Oczyść powierzchnie robocze, pipety i wirówki roztworem do odkażania RNazy, aby zmniejszyć możliwe zanieczyszczenie.
  2. Rozmrozić odczynniki RT-qPCR na lodzie. Rozmrozić RNA na lodzie (w oddzielnym obszarze/pomieszczeniu).
  3. Określ liczbę reakcji i dodaj ich o co najmniej 10% więcej (np. jeśli potrzebnych jest 10 reakcji, przygotuj mieszankę wzorcową dla 11).
  4. Wiruj poszczególne składniki mieszanki wzorcowej, z wyjątkiem 25x enzymu RT-qPCR, przez 5 sekund. Ostrożnie wymieszaj enzym, przesuwając probówkę palcem.
  5. Krótko odwirować składniki mieszanki głównej przez 5 sekund.
  6. Przygotować mieszankę wzorcową do wykrywania NOROVIRUS GI i GII za pomocą testu RT-PCR w czasie rzeczywistym zgodnie z instrukcjami dołączonymi do zestawu, a następnie dodać specyficzne dla norowirusa startery i sondy oligonukleotydowe do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml (tabela uzupełniająca 3).
  7. Wymieszaj mieszankę główną, pipetując 5-10 razy w górę i w dół (nie zaleca się wirowania). Podwielokrotność 22 μl mieszanki wzorcowej w każdym dołku 96-dołkowej płytki do PCR w czasie rzeczywistym.
  8. Wirować próbkę RNA przez 5 sekund i zbierać przez krótkie (5 s) wirowanie.
  9. Dodać 3 μl próbki RNA oraz kontroli dodatniej GI i GII do płytki RT-qPCR (postępuj zgodnie z szablonem z tabeli 2). Dodaj 3 μl wody wolnej od nukleaz do studzienek bez kontroli matrycy (NTC).
  10. Uszczelnij płytkę w czasie rzeczywistym za pomocą optycznej folii samoprzylepnej.
  11. Ostrożnie odwirować płytkę w czasie rzeczywistym o sile 1 300 x g przez 1 minutę, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza lub krople cieczy, które mogą być obecne w studzienkach.
  12. Skonfiguruj przyrząd do PCR w czasie rzeczywistym i ustaw następujące warunki termocyklingu: 1) krok RT przez 10 minut w temperaturze 45 °C, (2) aktywacja polimerazy Taq, 10 minut w temperaturze 95 °C i (3) 45 cykli po 15 s w temperaturze 95 °C i 60 s w temperaturze 60 °C.

7. Kwantyfikacja norowirusa w próbkach wymazów

  1. Należy sprawdzić wyniki kontroli dodatnich i ujemnych w celu walidacji wyników RT-qPCR (tabela uzupełniająca 3).
  2. Określić, czy każda krzywa standardowa spełnia dopuszczalne wartości podane w tabeli uzupełniającej 2 i obliczyć całkowite odchylenie standardowe dla krzywej standardowej, stosując równanie 1.
    (Równanie 1) % wydajności = 100 x 10 (średnie wartości Ct-punkt przecięcia)/Nachylenie.
  3. Jeśli oprogramowanie termocyklera PCR nie oblicza nachylenia dla każdej krzywej standardowej, należy określić wartości nachylenia i R2przez regresję za pomocą oprogramowania statystycznego (np. Excel, SPSS lub SAS). Ponadto należy obliczyć sprawność procentową dla krzywych standardowych zgodnie z równaniem I
  4. Zapisać liczbę kopii RNA obliczoną przez oprogramowanie termocyklera dla wszystkich badanych próbek w oparciu o krzywe wzorcowe, które spełniają kryteria określone w tabeli uzupełniającej 4. Ponownie uruchom wszystkie próbki o krzywych standardowych, którenie spełniają kryteriów lub mają fałszywie dodatnie wyniki kontroli. Sprawdź wartości Ct colifaga MS2, który został dodany jako kontrola wewnętrzna w celu monitorowania hamowania PCR.
  5. Oznaczyć całkowitą liczbę kopii RNA w próbce, mnożąc liczbę kopii RNA obliczoną w kroku 7.2 przez stosunek objętości (25 do 50 μl) całkowitego eluentu RNA do objętości RNA (3 do 5 μl) użytego w reakcji RT-qPCR. Alternatywnie oblicz gęstość RNA, dzieląc całkowitą liczbę kopii RNA przez analizowaną powierzchnię obiektu (cm 2).

8. Genotypowanie próbek dodatnich RT-PCR w czasie rzeczywistym za pomocą zagnieżdżonej konwencjonalnej amplifikacji PCR Hemi

  1. Przygotować pierwszą rundę mieszanki wzorcowej dla każdego zestawu starterów testu RT-PCR (tabele uzupełniające 2 i 5).
  2. Dodać 5 μl norowirusowego dodatniego RNA do 20 μl mieszanki wzorcowej.
  3. Uruchom RT-PCR w następujących warunkach: (1) krok RT przez 30 minut w 42 °C, (2) aktywacja polimerazy Taq, 15 minut w 95 °C i (3) 40 cykli po 30 s w 95 °C, 30 s w 50 °C i 60 s w 72 °C. Po 40 cyklach inkubować przez dodatkowe 10 minut w temperaturze 72 °C.
  4. Przygotować drugą rundę mieszanki mater dla każdego zestawu starterów testu RT-PCR (tabele uzupełniające 2 i 5).
  5. Dodać 23 μl mieszanki wzorcowej i dodać 2 μl produktów RT-PCR pierwszej rundy (z pierwszej rundy) do każdej probówki (najlepiej produkt pierwszej rundy należy rozcieńczyć w stosunku 1:10 w wodzie wolnej od RNaz).
  6. Powtórz krok 8.3.
  7. Przygotuj 2% żel agarozowy w 100 ml 1x Tris-acetate EDTA (40 mM Tris, 20 mM kwas octowy i 1 mM EDTA, przy pH 8,3). Po rozpuszczeniu agarozy przez podgrzanie mieszaniny w kuchence mikrofalowej dodać 10 μl barwnika kwasu nukleinowego na 100 ml przygotowanego żelu po schłodzeniu mieszaniny do 60-70 °C, wlać żel i włożyć grzebienie. Pozostaw żel na co najmniej 30 minut.
  8. Wymieszaj 15 μl każdego produktu RT-PCR z 3 μl 6-krotnego barwnika ładującego. Załadować 15 μl każdej próbki i poddać żelowi agarozowemu elektroforezę pod napięciem 100 V przez 1 godzinę.
  9. Wyciąć docelowe fragmenty RT-PCR o odpowiedniej wielkości (330 pz dla GI i 341 pz dla GII) z żelu i oczyścić RNA za pomocą dostępnego w handlu zestawu do ekstrakcji żelu. Oczyszczony produkt PCR może być teraz używany do sekwencjonowania Sangera.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rycina 1 przedstawia schemat blokowy protokołu pobierania wymazów. Protokół ten składa się z czterech głównych etapów: 1) pobranie próbki, 2) przechowywanie i transport próbek, 3) oczyszczanie i stężenie wirusowego RNA oraz 4) test RT-qPCR i genotypowanie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Norowirusy mają 50% dawkę zakaźną dla ludzi między 18 a 103 cząsteczkami wirusa20. Dlatego nawet niewielkie zanieczyszczenie powierzchni może stanowić zagrożenie dla zdrowia publicznego. Oceniono kilka aspektów protokołu pobierania próbek wymazów, w tym: 1) różne materiały wymazowe, 2) wymazy w warunkach przechowywania podczas transportu, 3) stężenie wirusowego RNA oraz 4) colifag MS2 jako wewnętrzna kontrola ekstrakcji.

Do niedawna oceniano i proponowano do ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają sprzecznych interesów. Ustalenia i wnioski zawarte w tym raporcie są ustaleniami i wnioskami autorów i niekoniecznie reprezentują oficjalne stanowisko Centrów Kontroli i Prewencji Chorób.

Podziękowania

Autorzy nie mają żadnych podziękowań.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Nazwa ogólna zestawów
wacik makropiankowyZestaw do nawilżonego wacika EnviroMax Puritan2588060PFUW
strong>RNA bufor do lizy  CDC UNEX bufferMicrobiologicsNr kat. MR0501
RNA ekstrakcja wirowa kolumnaMidiOmega BiotekNr kat. R6664-02
RNA oczyszczanie RNAZymol RNA Zestaw do czyszczenia i koncentratora Zymo ResearchCat No R1016
Zestaw do Real time RT-PCRAgPath Jednoetapowy zestaw RT-PCR LifeTechnologies Nr kat. 4387391
Konwencjonalny zestaw RT-PCRQiagen jednoetapowy zestaw RT-PCRZestaw Qiagennr kat. 210212
Zestaw do ekstrakcji żeluQiagen QIAquick zestaw do ekstrakcji żeluZestaw Qiagen Kot Nr 28704 lub 28706
Coliphage MS2ATCCNr kat. 15597-B1
Transkrypty
Platforma PCR w czasie rzeczywistymBiosystemsModel ABI 7500
Optyka 96-dołkowa płytka reakcyjnaThermo ScientificNr kat. 4316813
MicroAmp Przezroczysta folia samoprzylepna  Thermo Scientific Nrkat. 4306311
< spływu RNA

Bibliografia

  1. Isakbaeva, E. T., et al. Norovirus transmission on cruise ship. Emerg. Infect. Dis. 11, 154-158 (2005).
  2. Lopman, B. A., Gastañaduy, P., Park, G. W., Hall, A. J., Parashar, U. D., Vinjé, P. Environmental transmission of norovirus gastroenteritis. Curr. Opin. Virol. 2 (1), 1-7 (2011).
  3. Malek, M., et al. Outbreak of norovirus infection among river rafters associated with packaged delicatessen meat, Grand Canyon, 2005. Clin Infect Dis. 48 (1), 31-37 (2009).
  4. Atmar, R. L., et al. Norwalk virus shedding after experimental human infection. Emerg. Infect. Dis. 14 (10), 1553-1557 (2008).
  5. Norovirus gastroenteritis. N. Engl. J. Med. Glass, R. I., Parashar, U. D., Estes, M. K. 361 (18), 1776-1785 (2009).
  6. Park, G. W., et al. Evaluation of a New Environmental Sampling Protocol for Detection of Human Norovirus on Inanimate Surfaces. Appl. Environ. Microbiol. 81 (17), 5987-5992 (2015).
  7. Barker, J., Jones, M. V. The potential spread of infection caused by aerosol contamination of surfaces after flushing a domestic toilet. J. Appl. Microbiol. 99, 339-347 (2005).
  8. Tung-Thompson, G., Libera, D. A., Koch, K. L., de Los Reyes, F. L., Jaykus, L. A. Aerosolization of a Human Norovirus Surrogate, Bacteriophage MS2, during Simulated Vomiting. PloS one. 10, 0134277(2015).
  9. Atmar, R. L., et al. Determination of the 50% human infectious dose for Norwalk virus. J. Infect. Dis. 209 (7), 1016-1022 (2014).
  10. Petrignani, M., van Beek, J., Borsboom, G., Richardus, J. H., Koopmans, M. Norovirus introduction routes into nursing homes and risk factors for spread: a systematic review and meta-analysis of observational studies. J. Hosp. Infect. 89 (3), 163-178 (2015).
  11. Centers for Disease Control Prevention. Norovirus outbreak in an elementary school--District of Columbia, February 2007. MMWR. Morb. Mortal. Wkly. Rep. 56 (51-52), 1340-1343 (2008).
  12. Cheesbrough, J. S., Barkess-Jones, L., Brown, D. W. Possible prolonged environmental survival of small round structured viruses. J. Hosp. Infect. 35, 325-326 (1997).
  13. Julian, T. R., Tamayo, F. J., Leckie, J. O., Boehm, A. B. Comparison of surface sampling methods for virus recovery from fomites. Appl. Environ. Microbiol. 77, 6918-6925 (2011).
  14. Taku, A., et al. Concentration and detection of caliciviruses from food contact surfaces. J. Food. Prot. 65, 999-1004 (2002).
  15. Scherer, K., Ellerbroek, L., Schulenburg, J., Johne, R., Klein, G. Application of a swab sampling method for the detection of norovirus and rotavirus on artifically contaminated food and environmental surfaces. Food. Environ. Virol. 1 (42), 42-49 (2009).
  16. Herzog, A. B., et al. Evaluation of sample recovery efficiency for bacteriophage P22 on fomites. Appl. Environ. Microbiol. 78, 7915-7922 (2012).
  17. Vega, E., et al. CaliciNet: A Novel Surveillance Network for Norovirus Gastroenteritis Outbreaks in the United States. Emerging Infectious Diseases. 17 (8), 1389-1395 (2011).
  18. Rolfe, K. J., et al. An internally controlled, one-step, real-time RT-PCR assay for norovirus detection and genogrouping. J Clin Virol. 39 (4), 318-321 (2007).
  19. Kittigul, L., et al. Norovirus GII-4 2006b variant circulating in patients with acute Thailand during a 2006-2007 study. J. Med. Virol. 82 (5), 854-860 (2010).
  20. Teunis, P. F., et al. Norwalk virus: how infectious is it. J. Med. Virol. 80 (8), 1468-1476 (2008).
  21. Wollants, E., et al. Evaluation of a norovirus sampling method using sodium dodecyl sulfate/EDTA-pretreated chromatography paper strips. J. Virol. Methods. 122, 45-48 (2004).
  22. Weir, M. H., Shibata, T., Masago, Y., Cologgi, D., Rose, J. B. The Effect of Surface Sampling and Recovery of Viruses and Non-Spore Forming Bacteria on a QMRA Model for Fomites. Environ. Sci. Technol. 50 (11), 5945-5952 (2016).
  23. Microbiology of food and animal feed-Horizontal method for determination of hepatitis A virus and norovirus in food using real-time RT-PCR. International Organization for Standardization (ISO). , Report No. ISO/TS 15216-1:2013(E) (2013).
  24. Huslage, K., Rutala, W. A., Sickbert-Bennett, E., Weber, D. J. A quantitative approach to defining "high-touch" surfaces in hospitals. Infect. Control. Hosp. Epidemiol. 31 (8), 850-853 (2010).
  25. Wu, H. M., et al. A norovirus outbreak at a long-term-care facility: the role of environmental surface contamination. Infect. Control. Hosp. Epidemiol. 26 (10), 802-810 (2005).
  26. Ikner, L. A., Gerba, C. P., Bright, K. R. Concentration and recovery of viruses from water: a comprehensive review. Food Environ. Virol. 4 (2), 41-67 (2012).
  27. Gallimore, C. I., et al. Environmental monitoring for gastroenteric viruses in a pediatric primary immunodeficiency unit. J. Clin. Microbiol. 44 (2), 395-399 (2006).
  28. Ganime, A. C., et al. Dissemination of human adenoviruses and rotavirus species A on fomites of hospital pediatric units. Am J Infect Control. , (2016).
  29. Verani, M., Bigazzi, R., Carducci, A. Viral contamination of aerosol and surfaces through toilet use in health care and other settings. Am J Infect Control. 42 (7), 758-762 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wykrywanie norowirus wwymazy z makropiankipowierzchnie rodowiskoweodzyskiwanie wirus wekstrakcja RNART qPCRgenotypowanie norowirus wkontaminacja powierzchnistrategie remediacji
Metoda pobierania wymazów w celu wykrycia ludzkiego norowirusa na powierzchniach
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.