Dostarczanie wewnątrzprzewodowe do gruczołu sutkowego królika

Podsumowanie

Tutaj opisujemy technikę miejscowego dostarczania odczynników do gruczołu sutkowego królika poprzez wstrzyknięcie doprzewodowe. Dodatkowo opisujemy protokół wizualizacji i potwierdzenia porodu za pomocą wysokorozdzielczego obrazowania ultrasonograficznego środków kontrastowych.

Streszczenie

Miejscowe wewnątrzprzewodowe leczenie raka piersi oferuje potencjalne korzyści, w tym skuteczne dostarczanie do guza oraz zmniejszenie toksyczności ogólnoustrojowej i działań niepożądanych^{1,2,3,4,5,6,7}. Pozostaje jednak kilka wyzwań, zanim zabiegi te będą mogły być stosowane na szerszą skalę. Opracowanie i walidacja wewnątrzprzewodowych środków terapeutycznych w odpowiednim modelu zwierzęcym ułatwia opracowanie wewnątrzprzewodowych strategii terapeutycznych dla pacjentów. Podczas gdy gruczoł sutkowy myszy jest szeroko stosowany jako modelowy system rozwoju sutka i nowotworzenia, anatomia różni się od gruczołu ludzkiego. Większy model zwierzęcy, taki jak królik, może służyć jako lepszy model dla struktury gruczołu mlekowego i wewnątrzprzewodowego rozwoju terapeutycznego. W przeciwieństwie do myszy, u których dziesięć drzew przewodowych jest rozmieszczonych przestrzennie wzdłuż osi ciała, a każde z nich kończy się osobnym smoczkiem, gruczoł sutkowy królika bardziej przypomina gruczoł ludzki, z wieloma nakładającymi się na siebie systemami przewodowymi, które wychodzą przez oddzielne otwory w jednym smoczku. W tym miejscu przedstawiamy małoinwazyjne metody dostarczania odczynników bezpośrednio do przewodu mlecznego królika oraz wizualizacji samego porodu za pomocą obrazowania ultrasonograficznego o wysokiej rozdzielczości.

Wprowadzenie

Wewnątrzprzewodowe dostarczanie środków terapeutycznych zostało zbadane na modelach gryzoni i we wczesnych fazach badań na ludziach3^,4,5,6,11,12. Niedawne badanie fazy I wykazało bezpieczeństwo i wykonalność wewnątrzprzewodowej karboplatyny lub wewnątrzprzewodowej pegylowanej liposomalnej doksorubicyny u kobiet oczekujących na mastektomię w leczeniu raka inwazyjnego².

Poprzednie protokoły dostarczania wewnątrzprzewodowego zostały opracowane dla gruczołów sutkowych myszy i szczurów^6,7,8,9. Do celów badawczych przeprowadzono również wewnątrzprzewodowe iniekcje komórek nowotworowych i dostarczanie onkogenów do wektorów lentiwirusowych w modelach gryzoni^13,14,15,16. Jednak idealny model in vivo procesu dostarczania wewnątrzprzewodowego powinien pozwolić na opracowanie nowych klas związków terapeutycznych i ułatwić ocenę przedkliniczną. Różnice anatomiczne między gryzoniami a ludźmi skomplikowały tłumaczenie tych badań.

W przeciwieństwie do myszy, u których każdy przewód kończy się osobnym smoczkiem, ludzka pierś składa się z 5 do 9 niezależnych systemów kanałowych, z których każdy ma osobny otwór kończący się na smoczku. Gruczoły sutkowe królika posiadają cztery niezależne systemy przewodów, z których każdy jest oddzielnie dostępny przez jeden z czterech otworów w jednym smoczku. Model królika bardziej odpowiada anatomii człowieka i pozwala na badanie wewnątrzprzewodowego dostarczania leków w bardziej odpowiednim kontekście.

Tutaj używamy dwóch technik do oceny dostarczania wewnątrzprzewodowego. Jednoczesne podanie barwnika witalnego pozwala na wizualizację przez skórę i zapewnia proste i szybkie potwierdzenie metody. W przypadku niektórych zastosowań preferowane może być mapowanie kanałów w wyższej rozdzielczości. Przedstawiamy tutaj protokół obrazowania ultrasonograficznego przewodów poprzez doprzewodowe podanie niecelowanego odczynnika kontrastowego.

Protokół

Procedury z wykorzystaniem zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Teksańskiego w Austin.

1. Przygotowanie przedoperacyjne

1. Zapisz masę ciała każdego królika. Podobnie jak w przypadku wszystkich badań przedklinicznych, należy regularnie monitorować masę ciała zwierząt w celu oceny potencjalnej toksyczności.
2. Przed znieczuleniem królika należy napełnić stożkową probówkę o pojemności 50 ml dostępnym w handlu żelem ultradźwiękowym i wirować z prędkością 500 x g przez 30 s; po zakończeniu wirowania w żelu nie powinno być widocznych pęcherzyków.
3. Glikopironian podawać podskórnie w dawce 0,1 mg/kg mc., a acepromazynę domięśniowo w dawce 0,75 mg/kg. Odczekaj 15-20 minut, aż środek uspokajający zacznie działać, jednocześnie monitorując parametry życiowe i zachowanie.
   UWAGA: Glikopirolan jest środkiem antycholinergicznym, który zapobiega bradykardii i zmniejsza wydzielanie z dróg oddechowych i przewodu pokarmowego. Acepromazyna jest środkiem uspokajającym, który służy jako premedykacja do znieczulenia.
4. Podawać podskórnie 35 mg/kg ketaminy i 5 mg/kg ksylazyny jako środek znieczulający. Jednakże, gdy operator staje się bardziej doświadczony i może szybciej wykonać podawanie wewnątrzprzewodowe, należy zmniejszyć dawki leku do 15 mg/kg ketaminy i 3 mg/kg ksylazyny podskórnie; Skróci to czas znieczulenia i czas potrzebny zwierzęciu do powrotu do zdrowia po znieczuleniu.
5. Sprawdzaj i dokumentuj tętno, SPO_2, temperaturę, częstość oddechów i kolor błony śluzowej co 15 minut. Nałóż smar do oczu na obie oczy.
   UWAGA: Tylko personel, który przeszedł odpowiednie szkolenie i został zatwierdzony przez IACUC swojej instytucji, powinien podawać lub monitorować znieczulenie. Stosowanie monitora znieczulenia weterynaryjnego może pomóc w uzyskaniu parametrów życiowych i jest zalecane. Monitor anestezjologii weterynaryjnej nie zastępuje jednak konieczności ręcznego sprawdzania zwierzęcia co 15 minut. Zapoznaj się z instrukcjami producenta, aby uzyskać informacje na temat prawidłowego użytkowania monitora weterynaryjnego.
6. Sprawdź początek znieczulenia poprzez delikatne uszczypnięcie palca u nogi; królik powinien nie reagować przed kontynuacją.
7. Ostrożnie ogolić ogonowy brzuch królika w okolicy trzeciej i czwartej pary strzyków pachwinowych.
8. Po usunięciu większości włosów nałóż dostępny bez recepty krem do depilacji na ogolony obszar. Usuń krem po 10 minutach od aplikacji za pomocą wilgotnych ręczników papierowych zwilżonych ciepłą wodą.
   UWAGA: Skóra królika jest bardzo delikatna/wrażliwa. Krem do depilacji należy stosować nie dłużej niż 10 minut. W rzeczywistości bezpieczniej jest wypróbować "miejsce testowe" po 5 minutach i pozostawić je na dłużej tylko wtedy, gdy miejsce testowe wskazuje, że potrzebny jest dłuższy okres czasu.
9. Przetrzeć miejsce gazikiem nasączonym alkoholem, aby oczyścić miejsce wstrzyknięcia.
10. Umieść królika na grzbiecie w korycie w kształcie litery V wyłożonym kocem z recyrkulacją ciepłej wody i wkładką chłonną.

2. Przygotowanie środka kontrastowego

1. Rozpuścić niecelowany odczynnik kontrastowy zgodnie z instrukcjami producenta. Delikatnie pipetować w górę i w dół, aby wymieszać.
   UWAGA: Środek kontrastowy stosowany w tym protokole jest stabilny w temperaturze pokojowej przez 4 - 6 godzin po rozpuszczeniu. Delikatnie kołysać fiolką między każdym pobraniem.
   UWAGA: Wymagana objętość roztworu będzie zależeć od liczby kanałów, które mają zostać wstrzyknięte. Królik ma 4 otwory przewodowe na strzyk, a 0,2 ml roztworu wystarcza do wypełnienia jednego drzewa przewodowego dorosłego białego królika nowozelandzkiego (Oryctolaguscuniculus). W ten sposób do jednego gruczołu sutkowego można dostarczyć całkowitą objętość 0,8 ml.

3. Dostawa wewnątrzprzewodowa

1. Zlokalizuj odpowiednie strzyki do wstrzyknięcia; zalecane są 3. i 4. para strzyków pachwinowych, ponieważ można je łatwo uwidocznić, gdy zwierzę znajduje się na grzbiecie.
2. Załadować 0,2 ml sterylnego 0,9% soli fizjologicznej do 1 ml strzykawki tuberkulinowej Luer-lock za pomocą igły 22 G. Po umieszczeniu soli fizjologicznej w strzykawce należy prawidłowo zutylizować igłę 22 G i zastąpić ją sterylną igłą o rozmiarze 25G. Delikatnie przetrzyj obszar 85% alkoholem izopropylowym na gaziku.
3. Trzymając skos igły do góry i strzykawkę równolegle do ciała zwierzęcia, włóż skos igły z boku smoczka i powoli wstrzyknij 0,1-0,2 ml soli fizjologicznej; pozwoli to na lepszą wizualizację otworów kanałowych.
4. Umieścić 0,2 ml roztworu do wstrzykiwań w strzykawce tuberkulinowej Luer-lock o pojemności 1 ml.
5. Delikatnie chwyć smoczek kciukiem i palcem wskazującym, a następnie lekko go unieś, aby ustawić go do wstrzyknięcia doprzewodowego; lupa oczna do noszenia na ciele może pomóc w wizualizacji otworów przewodowych.
6. Utrzymując uniesioną pozycję smoczka, ostrożnie kanulować interesujący nas przewód za pomocą igły o końcówce 25 G.
7. Po kannekulacji delikatnie przekręcić strzykawkę Luer-lock na piaście igły infuzyjnej z końcówką, aż do jej zablokowania.
8. Podnieść smoczek i powoli wstrzykiwać roztwór, aby zminimalizować potencjalne uszkodzenia spowodowane przez szybko poruszający się płyn w przewodzie; w żadnym momencie nie powinno być oporu podczas wstrzykiwania roztworu.

4. Obrazowanie ultrasonograficzne

1. Nałóż dużą ilość odwirowanego żelu ultradźwiękowego na skórę obszaru zainteresowania. Upewnij się, że w żelu nie ma pęcherzyków powietrza, ponieważ pogorszą one jakość obrazu.
2. Ustaw głębokość obrazowania na 6 mm. Umieść przetwornik 21 MHz w kontakcie z żelem i zeskanuj obszar zainteresowania w trybie B. Obserwuj środek kontrastowy w skanowanym obszarze, w tym w otworze kanałowym i w całym kanale.
   UWAGA: Te ustawienia zostały opracowane do użytku z określonym ultrasonografem fotoakustycznym. Więcej informacji można znaleźć w Tabeli materiałów. Może być konieczne dostosowanie mocy nadawania i głębokości obrazowania innych systemów obrazowania w celu optymalizacji wizualizacji gruczołu piersiowego.
3. Usuń żel ultradźwiękowy ze skóry zwierzęcia za pomocą gaziku.

5. Opieka pooperacyjna

1. Obserwuj miejsce wstrzyknięcia: nie powinno być żadnych śladów urazu okolicy strzyka lub otaczającej tkanki, a obrzęk w okolicy strzyka prawdopodobnie wskazuje na wstrzyknięcie poduszeczki tłuszczowej do sutka, a nie na udane wstrzyknięcie doprzewodowe.
2. Umieść królika w pozycji mostkowej. W razie potrzeby podać dożylnie 0,2 mg / kg johimbiny do żyły ucha brzeżnego; Odwróci to działanie ksylazyny i pozwoli zwierzęciu szybciej dojść do siebie po znieczuleniu.
3. Monitoruj królika co 15 minut przez cały okres rekonwalescencji, aż zwierzę stanie się czujne, zareaguje i utrzyma pozycję mostkową.
   UWAGA: Ta procedura nie powinna powodować uszkodzenia tkanek ani obrzęku. W przypadku zaobserwowania zaczerwienienia lub obrzęku, należy podać dawkę meloksykamu 0,1-0,2 mg/kg PO, gdy zwierzę jest przytomne i może przyjmować leki doustnie. Skontaktuj się z personelem weterynaryjnym instytucji w celu uzyskania dalszych wskazówek.

Wyniki

W niniejszej pracy wykazujemy, że wewnątrzprzewodowe podawanie środków kontrastowych do przewodów mlecznych królika może zostać przeprowadzone bez uszkodzenia tkanek (Rysunek 2). U królików cztery oddzielne systemy przewodowe zbiegają się w jednym sutku, dzięki czemu można uzyskać do nich dostęp i obrazować je indywidualnie za pomocą tej metody. Poszczególne ujścia przewodów są łatwo widoczne; zwróć uwagę na grot strzałki wskazujący drugie ujście przewodu sąsiadujące z ka...

Dyskusja

Ta metoda dostarczania wewnątrzprzewodowego do gruczołu mlekowego królika może być stosowana do ultradźwięków, odczynników kontrastowych i wielu innych roztworów wodnych, w tym niezbędnych barwników i środków terapeutycznych. Wcześniejsze badania wykazały wewnątrzprzewodowe dostarczanie hormonów 17,18,19. W modelach gryzoni przeprowadzono wewnątrzprzewodowe dostarczanie kwasów nukleinowych⁸, chemioterapeu...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
MicroMarker niecelowany odczynnik kontrastowy	VisualSonics	VS-11694
Luer Lock 1 mL Strzykawki	BD	309628
Glikopirolan 0,2 mg / ml	Wedgewood Compounding Pharmacy	GLYCOP-INJ013VC	6-miesięczny okres przydatności do spożycia, zapasy mogą być ograniczone.
Siarczan atropiny 0,5 mg/ml	Animal Health International	15320764	Jeśli glikopirolan jest niedostępny. Nie stosować w skojarzeniu z glikopironianem.
Ketamina HCL 100 mg/ml	Animal Health International	21250699	http://www.animalhealthinternational.com/
Acepromazyna 10 mg/ml	Animal Health International	17640541
Ksylazyna 20 mg/ml	Animal Health International	20101547
Johimbina 0,2 mg/ml	Zwierzę Health International	14588965
Krem do depilacji Veet			Sensitive skin solution. Dostępne u lokalnych sprzedawców.
Igły infuzyjne z końcówką	Sai Infusion Technology	B14-50	http://www.sai-infusion.com/collections/blunt-needles
Pulsoksymetr weterynaryjny	EdanUSA	VE-H100B	http://www.edanusa.com/Product/ VE-H100B-Veterinary-Pulse-Oximeter.html
Pompa ciepłej wody	Gaymar	TP700
Koc z ciepłą wodą	Animal Health International	21232696	Maxi-Therm Lite Podkładki ocieplające
System ultradźwiękowy	VisualSonics	Vevo 2100