Szybka kwantyfikacja blastogenezy indukowanej mitogenem w limfocytach T w celu identyfikacji leków immunomodulujących

Podsumowanie

Mitogeneza limfocytów T towarzyszy transformacji blastogennej, po której objętość komórki zwiększa się przed podziałem komórki. W tym miejscu opisujemy metodę ilościowego określania blastogenezy w limfocytach T przy użyciu automatycznego licznika komórek z możliwością pomiaru średnic komórek.

Streszczenie

Proliferacja limfocytów w odpowiedzi na stymulację antygenową lub mitogenną jest łatwo mierzalnym zjawiskiem, przydatnym do testowania immunomodulujących (tj. immunosupresyjnych lub immunostymulujących) związków chemicznych i leków biologicznych. Jednym z najwcześniejszych etapów mitogenezy jest powiększenie komórki lub transformacja blastogenna, po której objętość komórki wzrasta przed podziałem. Zwykle jest wykrywalny w ciągu pierwszych kilku godzin stymulacji limfocytów T. W tym miejscu opisujemy szybką metodę ilościowego określania blastogenezy w limfocytach T wyizolowanych ze śledziony myszy i ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) przy użyciu automatycznego licznika komórek. Różne powszechnie stosowane testy proliferacji są w większości pracochłonne i odzwierciedlają tylko ogólny efekt populacji, a nie indywidualne efekty komórkowe w populacji. W przeciwieństwie do tego, prezentowany zautomatyzowany test licznika komórek zapewnia szybkie, bezpośrednie i precyzyjne pomiary średnic komórek, które można wykorzystać do oceny skuteczności różnych mitogenów i leków immunomodulujących in vitro.

Wprowadzenie

T limfocyty są głównymi komórkami odpowiedzialnymi za odporność adaptacyjną u ssaków. Wiadomo, że reagują one na specyficzne peptydy antygenowe prezentowane przez cząsteczki MHC na powierzchni komórek prezentujących antygen. Po aktywacji pokrewnego receptora limfocytów T (TCR) komórka powiększa się w procesie zwanym transformacją blastogenną lub blastogenezą. Proces ten jest wykrywalny w ciągu pierwszych ~6 godzin po zastosowaniu bodźca¹. Podczas blastogenezy objętość poszczególnych limfocytów T zwiększa się od 2 do^{4-krotnie 2-6}. Limfocyty zaczynają się namnażać w procesie zwanym ekspansją klonalną, którego celem jest wygenerowanie jak największej liczby klonów komórek zawierających TCR specyficznych dla antygenu. Komórki potomne następnie pełnią swoją funkcję immunologiczną, różnicując się w cytotoksyczne (^CD8+) lub pomocnicze (CD4⁺) efektorowe limfocyty T. Tak więc naiwne limfocyty T we krwi ludzkiej lub mysiej znajdują się w fazie G₀ (spoczynkowej) cyklu komórkowego i wspierają minimalną aktywność metaboliczną. Po ekspozycji na antygeny lub mitogeny limfocyty T ponownie wchodzą w cykl komórkowy, przy jednoczesnej stymulacji transkrypcji i syntezie białek^7-10. Mitogeny, takie jak 12-mirystynian forbolu 13-octan (PMA) i jonomycyna stymulują limfocyty poprzez aktywację szlaków sygnałowych zależnych od kinazy białkowej C (PKC)ⁱ Ca²⁺ 1. Aktywacja limfocytów T za pomocą PMA/jonomycyny omija etapy sygnalizacji TCR.

Testy proliferacji in vitro są szeroko stosowane do oceny funkcji limfocytów i odpowiedzi na bodźce. Odczyty proliferacji są zwykle wykonywane od jednego do trzech dni po rozpoczęciu stymulacji limfocytów T i odzwierciedlają zbiorowy stan setek lub tysięcy komórek. Siłę działania różnych mitogenów i leków immunomodulujących in vitro można ocenić, po prostu mierząc tempo proliferacji w obecności tych związków. Niektóre z tych testów i ich ograniczenia omówiono poniżej.

Dla bezpośredniego zliczania numerów komórek, procedura jest czasochłonna, z dużym prawdopodobieństwem błędów operatora.

Dla syntezy DNA, test inkorporacji 3H-tymidyny mierzy syntezę DNA, ale jego głównym ograniczeniem jest radiotoksyczność. Nieradioaktywną alternatywą jest BrdU, ale zakres liniowej odpowiedzi na wzrost komórek jest ograniczony i wymagane jest leczenie przeciwciałami, co zwiększa liczbę etapów procedury^11,12.

Dla aktywności metabolicznej, sole tetrazolowe (MTT, MTS, XTT i WST-1) oraz testy kolorymetryczne na bazie barwnika rezazuryny informują o ogólnym stanie metabolicznym dzielących się populacji komórek. Jednak MTT nie jest rozpuszczalny w pożywce hodowlanej, co wymaga dodatkowych etapów płukania, co powoduje błędy w pomiarze; XTT potrzebuje dodatkowych komponentów, aby skutecznie redukować; Na pomiary oparte na MTS, WST-1 i resazurynie ma wpływ pH pożywki hodowlanej i jej składników: surowicy, albuminy lub czerwieni fenolowej^13-16. Testy te nie mierzą rzeczywistej liczby żywotnych komórek, ale raczej szacują połączoną aktywność enzymów. W związku z tym szybkość proliferacji może nie być dokładnie określona za pomocą testów metabolicznych ze względu na nieliniową korelację między liczbą komórek a redukcją barwnika^12,17.

Do pomiaru stężenia ATP, wzrost ATP wywołany aktywacją limfocytów T koreluje z proliferacją. Jednak zwiększenie wewnątrzkomórkowego ATP jest jednym z początkowych etapów aktywacji limfocytów T; Wiele kroków w tyle jest faktyczna proliferacja^17,18.

Do testu rozcieńczania barwnika, barwnik fluorescencyjny CFSE barwi komórki poprzez kowalencyjne wiązanie z białkami wewnątrzkomórkowymi. Barwnik wykazuje zależny od proliferacji spadek intensywności fluorescencji, który może śledzić liczbę podziałów komórkowych. Jednak ze względu na znakowanie białek kowalencyjnych funkcje tych białek mogą być zagrożone. Barwnik jest toksyczny dla komórek w wyższych stężeniach. Jednak przy niższych stężeniach barwnika początkowa intensywność fluorescencji jest zmniejszona, co zmniejsza liczbę podziałów komórkowych, które można śledzić. Dodatkowo, po znakowaniu za pomocą CFSE, następuje niezależna od proliferacji ~50% utrata początkowej fluorescencji w ciągu pierwszych 24 do 48 godzin, co ogranicza zakres dynamiczny tego testu^19,20.

Większość tych testów odzwierciedla zbiorczy stan dużej liczby komórek i wymaga traktowania komórek barwnikami fluorescencyjnymi. Komórki martwicze i apoptotyczne mogą również przyczyniać się do tych pomiarów, chyba że zostaną usunięte z analizy przez barwienie chemikaliami lub przeciwciałami.

Blastogeneza limfocytów może być oceniana za pomocą różnych metod, takich jak mikroskopia optyczna czy cytometria przepływowa^4,21,22. W tym miejscu opisujemy szybką metodę pomiaru rozmiarów komórek T za pomocą automatycznego licznika komórek, który zbiera obrazy komórek w czasie rzeczywistym, które są przechowywane i mogą być ponownie analizowane w późniejszym czasie. Oprócz pomiarów wielkości, urządzenie to zapewnia dokładną liczbę komórek i procent żywotnych komórek, zgodnie z wykluczeniem trypanowego niebieskiego barwnika. Urządzenie użyte w tym protokole jest dostępne na rynku, a producent przetestował precyzję przyrządu przy użyciu trzech różnych przyrządów i kilku kontroli koncentracji i żywotności. Wyniki tych badań wykazały współczynnik wariancji, który wynosił na ogół poniżej 6%. Jak zaznaczono w protokole, urządzenie jest regularnie kalibrowane za pomocą kulek polistyrenowych o średnicy 6 μm i 8 μm. Zaletą stosowania licznika komórek do różnicowania spoczynkowych limfocytów T i limfoblastów T na podstawie średnicy komórki jest łatwość użycia i zautomatyzowany charakter analizy. Oprogramowanie jest w stanie narysować okrąg wokół każdej komórki i obliczyć średnicę komórki. Dodatkowo obrazy są widoczne dla operatora, który może zweryfikować dokładność instrumentu w identyfikacji komórek i prawidłowym narysowaniu okręgu wokół nich. Jeśli chodzi o ograniczenia, instrument sam w sobie nie jest w stanie odróżnić szczątków od komórek; Dlatego ważne jest, aby operator oglądał każdy obraz w trakcie jego przetwarzania. Istnieje możliwość włączenia pęcherzyków powietrza, co zmniejszy liczbę użytecznych pól do analizy; Zdarza się to jednak rzadko, jeśli wykonywana jest regularna konserwacja spłukiwania.

W tym badaniu, grupy limfocytów T śledziony były stymulowane jonomycyną i zwiększały stężenie PMA przez 12-48 godzin. Stężenia PMA tak niskie jak 2 ng/ml indukowały zarówno silną odpowiedź blastogeniczną, jak i znaczną proliferację. Pomiary wpływu kilku leków, takich jak leki immunosupresyjne cyklosporyna A (CsA), FK506 (takrolimus) i rapamycyna (syrolimus), a także blokery kanałów jonowych TRAM-34 i FTY720 (fingolimod), na blastogenezę wykazały dobrą zgodność z raportowanym wpływem na proliferację. Mierzono również odpowiedź blastogenną ludzkich PBMC na PMA/jonomycynę i stymulację mysich komórek T kulkami magnetycznymi pokrytymi przeciwciałami anty-CD3 i anty-CD28.

Test licznika komórkowego określa ilościowo zarówno blastogenezę, jak i szybkość proliferacji (gęstość komórki) jednocześnie, ale oddzielnie, w przeciwieństwie do wyżej wymienionych metod, które analizują kombinację tych efektów. Przedstawiony protokół zapewnia szybką i solidną technikę oceny siły działania środków mitogennych i immunomodulujących.

Protokół

Wszystkie eksperymenty są przeprowadzane zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Laboratorium Stanowym Wright oraz Instytucjonalną Komisję Rewizyjną.

UWAGA: Ludzkie PBMC są izolowane metodą wirowania w gradiacji gęstości Ficoll^{metodą 5}.

1. Żniwa śledziony

1. Trzymaj dorosłe samice myszy ICR w standardowych warunkach laboratoryjnych z wymaganiami dotyczącymi pożywienia, wody i ściółki specyficznymi dla gatunku.
   UWAGA: Średni wiek zwierząt wynosił 2,9 miesiąca, a średnia waga wynosiła 30,4 g w momencie eutanazji.
2. W dniu izolacji (DOI) poddać zwierzęta eutanazji pojedynczo bez obecności innych zwierząt tego samego gatunku. Dołoż wszelkich starań, aby zapewnić minimalny stres myszy. Eutanazja za pomocą CO₂ z wtórnym zwichnięciem szyjki macicy, aby zapewnić śmierć.
   1. Umieścić zwierzę, nadal w klatce transferowej, w komorze CO₂ i rozpocząć przepływ gazu z prędkością 5 l/min. Takie natężenie przepływu wypiera tlen w zalecanym tempie 10-30% na minutę.
   2. Po utracie przytomności należy zwiększyć natężenie przepływu CO₂ do 15 l/min. Sprawdzić, czy zwierzę przestało oddychać i pozostawić w komorze na dodatkowe 2 minuty.
   3. Zastosuj zwichnięcie szyjki macicy z siłą odwracającą uwagę, aby zapewnić śmierć.
3. Śledzionę należy pobrać ze zwierzęcia przy użyciu techniki aseptycznej w ciągu 10 minut od śmierci.
   1. Przed użyciem wysterylizuj dwa zestawy nożyczek i kleszczyków do usuwania śledziony w piecu autoklawowym. Wysterylizuj powierzchnię preparacyjną, stosując 70% etanolu.
   2. Nałóż 70% etanolu na brzuch myszy. Za pomocą jednego zestawu nożyczek i kleszczy wykonaj nacięcie w sierści i skórze po lewej stronie brzucha, a następnie rozsuń i oderwij skórę, aby odsłonić otrzewną. Po wystawieniu na działanie promieni słonecznych nanieść 4% roztwór chlorheksydyny przed otwarciem otrzewnej.
   3. Za pomocą drugiego zestawu nożyczek i kleszczy wykonaj 2-3-centymetrowe cięcie wzdłuż środkowej części brzucha. Otwórz otrzewną i usuń śledzionę, odcinając przyczepy trzewne i nadmiar tłuszczu. Umieść śledzionę w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco.

2. Przygotowanie surowych splenocytów

UWAGA: Wykonuj wszystkie kroki pod kabiną bezpieczeństwa biologicznego z przepływem laminarnym, stosując technikę aseptyczną.

1. Pobrane śledziony namoczyć w 10 ml zdejonizowanego sterylnego_H2Oprzez 5 minut w naczyniu hodowlanym o średnicy 10 cm w celu lizy erytrocytów powierzchniowych.
   UWAGA: Ten krok można pominąć, jeśli śledziona została uszkodzona podczas izolacji.
2. Aby uwolnić splenocyty, zmiażdż śledziony między dwoma wysterylizowanymi szkiełkami (matowa strona skierowana w stronę śledziony) na świeżym naczyniu hodowlanym o średnicy 10 cm. Wymieszać z 10 ml RPMI-1640 uzupełnionym 10% płodową surowicą bydlęcą, 2 mM L-glutaminy, 50 j.m./ml penicyliny i 50 μg/ml streptomycyny (zwanej poniżej pełnym RPMI).
3. Przefiltruj komórki przez sterylne nylonowe sitko o średnicy 40 μm do nowego naczynia hodowlanego o średnicy 10 cm, aby usunąć tkankę łączną i zanieczyszczenia.
4. Lizować pozostałe erytrocyty, dodając 20 ml buforu do lizy RBC składającego się ze 155 mM NH₄Cl, 10 mM NaHCO₃ i 0,1 mM EDTA przy pH 7,4 i ~ 300 mOsm / L.
   UWAGA: Osmolalność mierzy się za pomocą osmometru do pomiaru temperatury zamarzania lub ciśnienia pary.
   1. Przenieść komórki z 10-centymetrowej płytki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i odwirować przy 250 x g przez 10 minut (4 °C).
   2. Usunąć supernatant, dodać 20 ml buforu do lizy RBC i ponownie zawiesić granulowane komórki przez pipetowanie.
   3. Inkubować w temperaturze pokojowej w buforze do lizy przez 10 minut, delikatnie kołysząc.
   4. Wirować przez 10 minut w temperaturze 250 x g (4 °C) w celu osadzenia komórek. Odlej bufor do lizy.
   5. Ponownie zawiesić komórki w 10 ml pełnego RPMI i ponownie odwirować (250 x g, 10 min, 4 °C). Odrzucić supernatant.
5. Ponownie zawiesić splenocyty w 2 ml pełnego RPMI ogrzanego do 37 °C w celu przeniesienia do kolumny z włókna nylonowego.

3. Oczyszczanie limfocytów T

1. Umyj kolumny z wełny nylonowej dwukrotnie 5 ml pełnego RPMI. Inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO₂ kultur komórkowych przez 1 godzinę.
   UWAGA: Konieczne jest, aby wełna nylonowa była mokra przez cały czas trwania eksperymentu i używała pełnej prędkości obrotowej ogrzanej do 37 °C na wszystkich etapach izolacji wełny nylonowej.
2. Dodaj izolowane splenocyty do kolumny i inkubuj przez 1 godzinę, aby umożliwić limfocytom B, fibroblastom i komórkom pomocniczym przyleganie do wełny nylonowej.
   1. Dodać 2 ml RPMI zawierającego splenocyty do kolumny i przepuszczać, aż dojdzie do górnej warstwy wełny nylonowej.
   2. Dodać 2 ml pełnego RPMI ogrzanego do temperatury 37 °C na wierzch wełny nylonowej i przepuścić podłoże przez wełnę, aż poziom cieczy dotrze do górnej powierzchni.
   3. Dodaj 3 ml ciepłego kompletnego RPMI do kolumny, aby całkowicie pokryć wełnę nylonową.
   4. Inkubować załadowaną kolumnę w stanie niezakłóconym w inkubatorze do hodowli komórkowych o temperaturze 37 °C i stężeniu 5%_{CO2 przez} 1 godzinę.
3. Eluować komórki, przemłukując kolumnę dwukrotnie 5 ml pełnego RPMI. Wykonać dodatkowe płukanie eluowanych komórek przez odwirowanie.
   1. Napełnij kolumnę do góry 2 razy pełnym RPMI i pozwól, aby roztwór z kolumny przepłynął do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
      UWAGA: Unikaj stukania lub uderzania w kolumnę, co może spowodować przemieszczenie komórek B, komórek dodatkowych i fibroblastów przylegających do wełny nylonowej.
   2. Zebrać frakcję przepływową i wirować w masie 250 x g przez 10 minut (4 °C) w celu osadzenia komórek. Umyć raz 10 ml pełnego RPMI. Ponownie zagnieździć ogniwa (250 x g, 10 min, 4 °C) i ponownie zawiesić w 2 ml pełnej masy RPMI.
   3. Zmierz gęstość komórek za pomocą hemocytometru i rozcieńcz w pełnym RPMI do 0,5 x 10⁶ komórek/ml.
   4. Zasiać 1 lub 2 ml podwielokrotności komórek do każdej studzienki odpowiednio 24- lub 6-dołkowej płytki do hodowli komórkowej i wyhodować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO₂,
      UWAGA: Na tym etapie do każdej studzienki można dodać 1 mM 1,4-ditiotreitol (DTT), aby poprawić przeżywalność limfocytów T.
   5. Opcjonalnie: Potwierdzić skuteczność protokołu izolacji za pomocą cytometrii przepływowej. Ten protokół zwykle daje ~ 80% limfocytów T²³,
      UWAGA: Ogniwa oczyszczone z wełny nylonowej zawierają około 50% komórek CD4⁺ i 23% komórek CD8⁺. Aby dalej oczyszczać subpopulacje CD4+ i CD8+, można przeprowadzić pojedynczy etap zubożenia immunomagnetycznego przy użyciu ośmiu przeciwciał i kulek magnetycznych²⁴. Alternatywnie, czystsze populacje limfocytów T CD4 ⁺ i CD8 ⁺ można wyizolować przez selekcję pozytywną lub ujemną ze specyficznymi przeciwciałami.

4. Aktywacja limfocytów T i eksperymentalna ekspozycja na lek

1. Aktywuj limfocyty T w ciągu 24 godzin od izolacji poprzez dodanie PMA i soli wapniowej jonomycyny lub kulek magnetycznych pokrytych przeciwciałami anty-CD3 i anty-CD28^23,25,26. Dodaj eksperymentalne leki (np. CsA, FK506, rapamycynę, TRAM-34 i FTY720) w momencie aktywacji.
   UWAGA: W tym przypadku stężenia PMA wahały się od 2 do 250 ng/ml, a stężenie jonomycyny utrzymywano na poziomie 250 nM. Jeśli to możliwe, rozcieńczenia powinny być przygotowywane z podstawowych porcji każdego leku, tak aby objętość dodawana do każdej studzienki komórek wynosiła ≥1 μl w celu zapewnienia odtwarzalności. Koraliki magnetyczne z powłoką anty-CD3/anty-CD28 są dodawane w stosunku 1:1 kulki do komórki. Zwiększenie liczby koralików na komórkę (tj. stosunku koralików do komórki) zwiększy intensywność stymulacji^25,26. Koraliki są myte i ponownie zawieszane w pełnym RPMI przed ich dodaniem do komórek. Zwróć uwagę, że niebieski trypan plami koraliki.
2. Hodować komórki przez 12-72 godzin w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ przed analizą za pomocą automatycznego licznika komórek.

5. Automatyczne gromadzenie danych z licznika komórek

1. Przed badaniem próbki należy upewnić się, że komórki są delikatnie wymieszane pipetą serologiczną, aby uniknąć zbrylania. Jest to szczególnie ważne w przypadku aktywowanych limfocytów ze względu na ich zwiększoną adhezję.
   1. W przypadku kultur, które są aktywowane kulkami anty-CD3/CD28, po pipetowaniu należy przenieść próbkę do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml lub 2 ml. Oddziel koraliki, trzymając rurkę na magnesie przez 1-2 minuty. Do analizy należy użyć supernatantu zawierającego komórki.
      UWAGA: Przeanalizuj zarówno komórki spoczynkowe, jak i aktywowane w ciągu 1 godziny, aby uwzględnić wstępną aktywację komórek spoczynkowych przez surowicę obecną w pożywce hodowlanej. Po 12 godzinach stymulacji PMA/jonomycyną wykryto niewielki wzrost wielkości komórek (ryc. 2). Po 72 godzinach nie zaobserwowano znaczącego wzrostu wielkości komórek w porównaniu z 48 godzinami (dane nie pokazane).
2. Przenieść 1 ml zawiesiny komórek do kubka na próbkę i przepuścić ją przez automatyczny licznik komórek zgodnie z instrukcjami zawartymi w instrukcji.
   UWAGA: W każdym z badań należy użyć co najmniej 1 ml (maksymalnie 2 ml) hodowli komórkowej. Automatyczny licznik komórek wykorzystuje strzykawkę do mieszania błękitu trypanowego z zawiesiną komórek i przepuszcza mieszaninę błękitu trypanowego przez pole, które jest obrazowane i analizowane przez oprogramowanie. Oprogramowanie wykrywa komórki zabarwione na niebiesko trypanem, rysuje okrąg wokół każdej komórki i określa średnicę. Z każdej próbki pobieranych jest 100 obrazów, a następnie określana jest żywotność i rozmiary komórek. Zastosowany tutaj próg detekcji licznika komórek ma dolną granicę 5 μm.
3. Przenieś dane z każdego przebiegu do arkusza kalkulacyjnego w celu dalszej analizy.
4. Regularnie kalibruj urządzenie, używając 1 ml próbki kulek polistyrenowych o średnicy 6 μm i 8 μm.
   UWAGA: Należy używać rzeczywistych rozmiarów ściegów zmierzonych przez producenta dla każdej partii, a nie rozmiaru nominalnego. Kulki 6 i 8 μm są wygodne, ponieważ średnice te są bliskie oczekiwanym średnicom spoczynkowych i aktywowanych limfocytów T (patrz rysunek 1).

6. Dane i analiza statystyczna

1. Analizuj dane za pomocą odpowiedniego oprogramowania statystycznego i graficznego.
   UWAGA: Arkusz kalkulacyjny dla każdego przebiegu zawiera liczbę komórek o każdej średnicy (zakres: od 5 μm do 70 μm). Komórki o średnicy powyżej 17 μm są usuwane z analizy, aby wykluczyć cząstki kurzu i małe pęcherzyki, które mogą być odczytane przez urządzenie jako żywe komórki.
2. Wykonaj testowanie hipotez przy użyciu testu t Welcha dla zbiorów danych o nierównej wariancji; wyniki są uważane za statystycznie istotne, jeśli p < 0,001. Zastosowany wzór to
   
   
   gdzie i są przykładowymi średnimi, i <8img alt="Równanie 5" src="/files/ftp_upload/55212/55212eq5.jpg" /> to wariancje próbki, a / i to rozmiary prób dla każdego zestawu danych. Liczba stopni swobody jest szacowana konserwatywnie przy użyciu mniejszej z dwóch wielkości próby dla każdego porównania. Wykresy słupkowe są przedstawiane jako średnia ± SEM.

7. Test proliferacji limfocytów T śledziony

1. Zmierz proliferację limfocytów T za pomocą testu proliferacji czytnika płytek kolorymetrycznych opartego na MTS lub MTT.
   UWAGA: Test opiera się na redukcji związku tetrazolium MTS (odczynnik Owena) do rozpuszczalnego produktu formazanu, prawdopodobnie przez NADPH lub NADH wytwarzane w metabolicznie aktywnych komórkach przez enzymy dehydrogenazy.
2. Policz oczyszczone limfocyty T za pomocą hemocytometru i ponownie zawiesij je w pełnym RPMI-1640 o końcowej gęstości 1 x 10⁶ komórek/ml.
   UWAGA: Na tym etapie do komórek można dodać 1 mM DTT.
3. W razie potrzeby aktywuj komórki za pomocą PMA i jonomycyny wraz z testowanymi lekami i delikatnie wymieszaj (podobnie jak w kroku 4).
4. Umieścić na płytce 100 μl komórek w każdym dołku na 96-dołkowej płytce poddanej działaniu hodowli komórkowej i inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ przez 48 godzin. Dodać 100 μl pożywki RPMI-1640 bez komórek do jednego dołka, aby uzyskać odczyt absorbancji tła.
5. Dodać 20 μl odczynnika na bazie MTS do każdego dołka i inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ przez 4 godziny.
6. Pomiary absorbancji należy wykonać przy długości fali 490 nm za pomocą czytnika płytek. Pomiary absorbancji odpowiadają liczbie metabolicznie aktywnych komórek w każdym dołku.
   UWAGA: W razie potrzeby odejmij poziomy tła. Wartości absorbancji tła zależą od rodzaju pożywki hodowlanej, surowicy, zewnętrznego pH i czasu ekspozycji odczynnika MTS na światło. Odczynniki na bazie MTS są wrażliwe na światło, a ekspozycja na światło przez kilka godzin może skutkować wyższymi wartościami absorbancji tła.

Wyniki

Użyliśmy tego testu, aby porównać tworzenie się blastów limfocytów podczas stymulacji PMA, estrem forbolu i jonomycyną, jonoforem wapnia. Rysunek 1A przedstawia rozkład częstości średnic spoczynkowych i farmakologicznie aktywowanych limfocytów T śledziony. Leczenie komórek PMA/jonomycyną przez ~2 dni spowodowało znaczące przesunięcie mediany rozkładu w kierunku większych średnic (patrz np. odnośnik⁴). W związku z tym zmniejszono liczbę ogniw o mniejszych średnicach. Aby upewnić się, że nasze urządzenie zgłasza prawidłowe średnice, przeprowadziliśmy dwie kalibracje kulkami polistyrenowymi o średnicach 6 μm i 8 μm (patrz Tabela Materiałów). Rysunki 1B i 1C pokazują odczyty z aktywowanych limfocytów T nałożonych wzorcem 8 μm i spoczynkowych limfocytów T nałożonych wzorcem 6 μm. Rysunek 1D przedstawia rozmiary ściegów kontrolnych podane przez producenta w stosunku do średnich średnic mierzonych za pomocą naszego automatycznego licznika komórek. Okazało się, że rozmiar 6 μm był nieco przeszacowany w naszych pomiarach, prawdopodobnie ze względu na próg pomiarowy instrumentu mający dolną granicę 5 μm. Jednak odchylenie standardowe średnic ściegu obliczone na podstawie pomiarów licznika ogniw było zgodne z odchyleniem standardowym zgłoszonym przez producenta. Z tych eksperymentów wnioskujemy, że to urządzenie może być niezawodnie używane do porównywania rozmiarów mysich limfocytów T w stanie spoczynku i stymulowanych mitogenem oraz że urządzenie może dokładnie mierzyć rzeczywiste średnice komórek.

Następnie przystąpiliśmy do testowania zależności wzrostu średniej średnicy od stężenia PMA i stwierdziliśmy, że przy stałym stężeniu jonomycyny wynoszącym 250 nM, efekt PMA nie uległ znaczącej zmianie poprzez podniesienie jej stężenia z 2 do 250 ng/ml (Rysunek 2A). Korzystając z testu opartego na MTS, zmierzyliśmy proliferację limfocytów T przy 50 i 250 ng / ml PMA i nie znaleźliśmy znaczącej różnicy (Figura 2C), zgodnie z naszymi danymi dotyczącymi średnicy komórek. Inhibitory kalcyneuryny cyklosporyna A (300 nM) i FK506 (1 nM) hamowały zarówno blastogenezę (Figura 2B), jak i proliferację (Figura 2C). W obu przypadkach hamowanie nie było jednak całkowite. Pomiary wykonane 12 godzin po dodaniu PMA/jonomycyny wykazały wzrost średnicy o 7,2% i 6,8% odpowiednio dla 50 ng/ml i 250 ng/ml PMA (ryc. 2D). Wzrost wielkości przy tych dwóch stężeniach nie różnił się istotnie, jak miało to miejsce w przypadku stymulacji trwającej 48 godzin (porównaj z ryciną 2A).

Dane dotyczące średnicy komórek zebrane z limfocytów T w stanie spoczynku i aktywowanych po 48 godzinach stymulacji PMA/jonomycyną są podsumowane w Tabeli 1. Średnia powierzchnia i objętość spoczynkowych mysich limfocytów T śledziony ICR wynosiły odpowiednio 151,4 μm² i 1,9 x ^10-4 nl. Średnia powierzchnia i objętość aktywowanych limfocytów T wynosiły odpowiednio 300,6 μm² i 5,9 x ^10-4 nl. Ogólny średni wzrost średnicy dla wszystkich aktywowanych komórek wyniósł 40,92% (Tabela 1).

Przetestowaliśmy również inne związki chemiczne, które stwierdzono jako immunosupresyjne: CsA, FK506, rapamycyna, FTY720 i TRAM-34. Na rycinie 3 przedstawiono pomiary wielkości komórek uzyskane w spoczynkowych i aktywowanych limfocytach T pod nieobecność i obecność tych leków. CsA i FK506, które celują w zależny od kalcyneuryny czynnik jądrowy aktywowanych limfocytów T (NFAT)^27,28, były najsilniejsze, hamując odpowiedź blastogenną o prawie 72% (Figura 3A i 3B). Co ciekawe, wraz ze wzrostem stężeń PMA, siła działania CsA i FK506 nieznacznie spadła, mimo że nie było dodatkowego wzrostu średnicy komórek przy braku tych leków (Figura 2A i 2B). Rapamycyna, lek immunosupresyjny, który hamuje ssaczy cel rapamycyny (mTOR)^29,30, miał umiarkowany, ale statystycznie istotny efekt (Figura 3A, 3B i 3C). FTY720 jest agonistą receptora sfingozyno-1-fosforanu, który hamuje wydostawanie się limfocytów do krążenia³¹, a ostatnio odkryto, że hamuje TRPM7, kanał kationowy o wysokiej ekspresji w limfocytach T³². Zarówno FTY720, jak i rapamycyna miały porównywalny wpływ na blastogenezę, zmniejszając ją ze średniego wzrostu średnicy o 52% do około 34% (ryc. 3A i 3B). TRAM-34 jest blokerem aktywowanego wapniem kanału potasowego KCa3.1³³. Testowany przy 700 nM, TRAM-34 był nieskuteczny w mysich limfocytach T, zgodnie z niedawnym badaniem proliferacji ludzkich komórek T; jego siła działania może zależeć od charakteru i siły stymulacji mitogennej³⁴ (ryc. 3A i 3B). 700 nM TRAM-34 był skuteczny w blokowaniu kanałów KCa3.1 w naszych eksperymentach elektrofizjologii patch clamp (dane nie pokazane). Porównano to między komórkami w stanie spoczynku a komórkami wystawionymi na działanie leku w wielu badaniach w ramach tego samego eksperymentu po 48 godzinach. Gdy rapamycyna i CsA były stosowane razem, blastogeneza została całkowicie zahamowana (Figura 3C).

Aktywacja mysich limfocytów T za pomocą kulek magnetycznych pokrytych anty-CD3/anty-CD28 przez 72 godziny spowodowała 27% wzrost średniej średnicy, która została zmniejszona do 5% w obecności CsA (Rysunek 3D). Ludzkie komórki jednojądrzaste po aktywacji PMA / jonomycyny przez 48 godzin zwiększyły średnicę o 33%, a aktywacja w obecności CsA zmniejszyła odpowiedź do 23% (ryc. 4).

Rysunek 1: Rozkłady częstości średnic mysich śledzionowych limfocytów T. (A) Czarne kolumny wskazują komórki spoczynkowe, a czerwone kolumny wskazują komórki aktywowane PMA/jonomycyną (48 godzin). (B) Rozkłady aktywowanych limfocytów T śledziony nałożonych na wzorzec kalibracji wielkości cząstek 8 μm. (C) Rozkłady spoczynkowych limfocytów T nałożonych na wzorzec kalibracyjny 6 μm. Numery użytych komórek i koralików są podane w ramkach. (D) Mediana średnicy mierzona za pomocą licznika ogniw wykreślonego w stosunku do średnicy ściegu podanej przez producenta. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Zależność aktywacji mysich limfocytów T od stężenia PMA. (A) Średnie średnice limfocytów T niepoddanych działaniu lub poddanych działaniu 2, 50 i 250 ng/ml PMA przy ustalonym stężeniu jonomycyny (250 nM). (B) Pomiary licznika komórkowego spoczynkowych i aktywowanych (2, 50, 250 ng/ml PMA) limfocytów T przy braku i obecności 300 nM CsA lub 1 nM FK506. (C) Test proliferacji MTS przy 50 i 250 ng/ml PMA z jonomycyną 250 nM przy braku i obecności 300 nM CsA. Istotne różnice (p < 0,001) są oznaczone gwiazdkami. n oznacza łączną liczbę prób. Dane pochodzą z komórek wyizolowanych od 3 myszy. (D) Średnice komórek spoczynkowych i aktywowanych limfocytów T (250 ng/ml PMA i 250 nM jonomycyny) 12 godzin po aktywacji przy braku i obecności 300 nM CsA. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 3: Wpływ CsA, FK506, FTY720, rapamycyny i TRAM-34 na wielkość komórki. (A i C) Średnie średnice spoczynkowych i aktywowanych PMA/jonomycyną mysich limfocytów T przy braku i obecności leków. Stężenia są podane w ramce. (B) Dane z A wyrażone jako procentowy wzrost w stosunku do spoczynkowej średnicy limfocytów T. Aktywację limfocytów przeprowadzono za pomocą 250 ng/ml PMA i 250 nM jonomycyny, a pomiary wykonano po 48 godzinach. (D) Pomiary licznika komórek komórek spoczynkowych i aktywowanych anty-CD3/CD28, 72 godziny po aktywacji przy braku i obecności 300 nM CsA. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 4: Blastogeneza w ludzkich PBMC po stymulacji mitogenem. (A) Czarne kolumny wskazują spoczynkowe, a czerwone kolumny wskazują aktywowane PBMC. (B) Średnie średnice spoczynkowych i aktywowanych PBMC przy braku i obecności 300 nM CsA. Komórki aktywowano 250 ng/ml PMA i 250 nM jonomycyną, a pomiary wykonano po 48 godzinach od aktywacji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Kolumna 1	Odpoczynku	Aktywowany	CsA 100 nM	CsA 200 nM
Średnia średnica	6,94 μm	9,78 μm	8,19 μm	7,92 μm
Średni wzrost średnicy		40,92%	17,88%	14,09%
Średnia powierzchnia	151,37 μm²	300,61 μm²	210,56 μm²	197,22 μm²
Średni wzrost powierzchni		98,59%	39,00%	30,16%

Tabela 1: Podsumowanie średniej średnicy komórki i względnego wzrostu powierzchni. Pomiary wykonano 48 godzin po aktywacji 250 ng/ml PMA i 250 nM jonomycyny.

Dyskusja

W tym miejscu opisujemy technikę szybkiego wykrywania i kwantyfikacji transformacji blastogennej komórek T przy użyciu automatycznego licznika komórek. W naszych warunkach (stymulacja jonomycyną 250 ng/ml PMA i 250 nM) powierzchnia komórki zwiększyła się dwukrotnie, a objętość trzykrotnie po 48 godzinach od aktywacji. Test jest wystarczająco czuły, aby wykryć wybuch w ciągu pierwszych 12 godzin aktywacji, gdzie objętość komórki wzrosła tylko 1,25-krotnie w porównaniu ze spoczynkiem (ryc. 2D). Bardziej fizjologicznie istotny mechanizm aktywacji limfocytów T przy użyciu kulek magnetycznych pokrytych przeciwciałem anty-CD3 i anty-CD28 wywołał znaczącą odpowiedź blastogeniczną, ze średnim 2,3-krotnym wzrostem objętości (72 godziny po aktywacji, ryc. 3D). Ludzkie komórki jednojądrzaste wykazały 2,6-krotną zmianę objętości po stymulacji PMA / jonomycyny przez 48 godzin (ryc. 4). Średnią średnicę i objętość mysich limfocytów T śledziony ICR określono odpowiednio na 6,9 μm i 1,9 x ^10-4 nl. Ludzkie PBMC (od jednego zdrowego dawcy) miały średnią średnicę 7,7 μm i średnią objętość 2,7 x ^10-4 nl. Korzystając z tego protokołu, przetestowaliśmy również rosnące stężenia PMA pod kątem ich zdolności do aktywacji limfocytów T. Te wyniki na pojedynczych komórkach były zgodne z testami proliferacji wykonanymi przy podobnych stężeniach PMA.

Przetestowano kilka związków, które według doniesień wpływają na proliferację komórek: FTY720^31,32; leki immunosupresyjne cyklosporyna A, FK506 i rapamycyna^27,28; i TRAM-34, bloker aktywowanych wapniem kanałów KCa3.1^33,35. Stwierdziliśmy, że w badanych stężeniach najsilniejszymi inhibitorami blastogenezy były CsA i FK506. Rapamycyna miała mniejszy, ale statystycznie istotny wpływ hamujący blastogenezę. Z drugiej strony TRAM-34 nie wpływał na blastogenezę.

CsA hamowało zarówno blastogenezę, jak i proliferację, ale nie całkowicie (Figura 2B i 2C), co pokazuje, że automatyczny pomiar licznika komórek jest dobrym korelatem skuteczności leku w proliferacji komórek T. W obecności rapamycyny wraz z CsA blastogeneza została całkowicie zahamowana, co sugeruje, że szlaki pośredniczone przez NFAT i mTOR w połączeniu mogą w pełni odpowiadać za powiększenie komórek T po mitogennej stymulacji PMA / jonomycyną (Figura 3C).

Zakres dynamiczny niektórych testów proliferacji jest ograniczony (zob. ryc. 2). Testy proliferacji, takie jak te, których użyliśmy (Figura 2C), zgłaszają sygnał, który obejmuje wkład komórek apoptotycznych i martwiczych. Zautomatyzowane pomiary zmiany średnicy nie mają tego ograniczenia, ponieważ pomiary dotyczą tylko żywotnych komórek. Żywotność komórek ocenia się poprzez wykluczenie barwienia błękitem trypanowym ze zdrowych, żywotnych komórek. W pomiarach wielkości użycie rozproszenia światła do przodu w cytometrii przepływowej może być problematyczne²². W pomiarach automatycznego licznika komórek nie stwierdzono populacji dubletowej (ryc. 1). Ponadto pomiar był wystarczająco dokładny, aby rozróżnić efekty cyklosporyny 100 i 200 nM (Tabela 1) i wykryć blastogenezę w ciągu 12 godzin od stymulacji mitogennej (Figura 2D).

Ten nowy test jest szczególnie przydatny w przypadku niewielkiej liczby próbek. W ciągu 1 godziny można zmierzyć do 15 próbek. Test ma jednak swoje ograniczenia, z których większość można złagodzić. Mimo że może skutecznie rozwiązać problem niewielkiej (<1 μm) różnicy w średnicy komórki, zastosowany przez nas model maszyny ma niższy próg wykrywania wynoszący 5 μm. Limit ten może powodować przeszacowanie bardzo małych rozmiarów komórek, ponieważ skutecznie wyklucza wszystkie komórki o mniejszych średnicach. Jednak nowsze modele licznika komórek mają progi detekcji na poziomie ~2 μm, co powinno złagodzić ten problem. Jeśli w próbce znajduje się zbyt dużo zanieczyszczeń, urządzenie traktuje je jako żywe komórki. Ponadto pęcherzyki powietrza mogą czasami dostać się do komory przepływowej i spowodować zniekształcenie obrazów komórek przechwyconych przez maszynę. Wydaje się, że zniekształcenie nie ma wpływu na określenie żywotności, ale może mieć wpływ na mierzone średnice. Dlatego zaleca się, aby wszystkie obrazy zostały sprawdzone przez eksperymentatora pod kątem pęcherzyków powietrza przed przyjęciem danych z każdej próby do analizy. Ponieważ oprogramowanie rysuje tylko okręgi wokół komórek, średnice komórek niesferycznych mogą być przekrzywione w kierunku długiej osi, co sprawia, że test jest mniej odpowiedni dla komórek niesferycznych.

Ten test jest szybki, trwa około 4 minut na próbkę, w porównaniu z testami proliferacji, które wymagają kilku godzin. Zbieranie danych jest również dość proste za pomocą oprogramowania dołączonego do urządzenia. Oprogramowanie może eksportować dane pomiarowe do arkusza kalkulacyjnego w celu analizy. Wreszcie, jest to pomiar jednokomórkowy, w przeciwieństwie do populacji; mierzona jest zarówno blastogeneza, jak i proliferacja; i jednocześnie rozróżnia komórki żywe i martwe. Może być stosowany do oceny różnych szczepów myszy pod kątem ich zdolności do wywoływania odpowiedzi immunologicznej. Test może być również z powodzeniem stosowany do pomiaru blastogenezy w limfocytach T od ludzkich dawców (ryc. 4), a także może być stosowany w innych typach komórek.

Wiadomo, że wzrost objętości komórek przyczynia się do regulacji metabolizmu: pęcznienie komórek stymuluje indukowaną glutaminą syntezę glikogenu i lipogenezę w hepatocytach^36,37. Neutrofile wykazują wzrost objętości związany z migracją o 35-60%, podczas gdy czynniki chemotaktyczne wywołują 10-15% obrzęk^38-40. Obecny test może być potencjalnie wykorzystany do badania tych procesów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
RPMI-1640	Lonza	BW12-702F
40 μ M Nylonowe sitka komórkowe	Kolumny z
	Polysciences, Inc.	21759-1
Probówki stożkowe 50 ml	The Lab Depot	TLD431697
6-dołkowe płytki poddane działaniu kultur komórkowych	USA Scientific	CC7682-7506
96-dołkowe płytki poddane hodowli komórkowych	Thermo Fisher Scientific	130188
Dimetylosulfotlenek (DMSO)	Fisher BioReagents	BP231-100
CellTiter 96 AQueous One Solution Test proliferacji komórek	Test na bazie Promega	G3582	MTS
Cyklosporyna A	Sigma-Aldrich	30024
FK506	Cayman Chemical Company	104987-11-3
Rapamycin	Santa Cruz Biotechnology	sc-3504
TRAM-34	Sigma-Aldrich	T6700
FTY720	Sigma-Aldrich	SML0700
Dynabeads Mysz T-Aktywator CD3/CD28	Gibco	11456D
Phorbol 12-mirystynian 13-octan (PMA)	Acros Organics
Sól wapniowa jonomycyny	Sigma-Aldrich	I0634
Penicylina-Streptomycyna	MP Biomedicals	ICN1670049	100x w magazynie
Dulbecco' s sól fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS)	HyClone	SH30378.02	10x kolba
1,4-ditiotreitol (DTT)	Research Products International	12/3/3483	środek redukujący
8 i mikro; M Wielkość mikrocząstek Standard	Sigma-Aldrich	84192-5ML-F	Rzeczywisty  8.02 &mikro; m
6 i mikro; M Wielkość mikrocząstek Standard	Sigma-Aldrich	89756-5ML-F	Rzeczywisty 6.084 &mikro;
m Pojedynczy magnetyczny stojak separacyjny do probówki 1,5 - 2 ml	V& P Naukowy, Inc.
Inkubator do hodowli komórkowych	Forma Scientific	3110
Synergy H1	Analizator żywotności komórek Vi-CELL Bio Tek	BTH1M
	Redlica Beckman	731050