Oparty na aptamierze czujnik do wykrywania niechelatowanego gadolinu(III)

Podsumowanie

Opisano zastosowanie cząsteczek polideoxynukleotydu (44-merowego aptameru) do wykrywania niechelatowanego jonu gadolinu(III) w roztworze wodnym. Obecność jonu jest wykrywana poprzez wzrost emisji fluorescencji czujnika.

Streszczenie

Pokazano metodę oznaczania obecności niechelatowanego trójwartościowego jonu gadolinu (Gd³⁺) w roztworze wodnym. Gd³⁺ jest często obecny w próbkach środków kontrastowych na bazie gadolinu w wyniku niekompletnych reakcji między ligandem a jonem lub jako produkt dysocjacji. Ponieważ jon jest toksyczny, jego wykrycie ma kluczowe znaczenie. W niniejszym artykule opisano budowę i zastosowanie czujnika opartego na aptamie (Gd-sensor) dla Gd³⁺. Czujnik wytwarza zmianę fluorescencji w odpowiedzi na rosnące stężenie jonu i ma granicę wykrywalności w zakresie nanomolowym (~100 nM przy stosunku sygnału do szumu wynoszącym 3). Test można przeprowadzić w buforze wodnym o pH otoczenia (~7 - 7,4) na mikropłytce 384-dołkowej. Czujnik jest stosunkowo niereaktywny w stosunku do innych fizjologicznie istotnych jonów metali, takich jak jony sodu, potasu i wapnia, chociaż nie jest specyficzny dla Gd³⁺ w porównaniu z innymi trójwartościowymi lantanowcami, takimi jak europ(III) i terb(III). Niemniej jednak lantanowce nie są powszechnie spotykane w środkach kontrastowych ani w układach biologicznych, dlatego czujnik może być używany do selektywnego oznaczania niechelatowanego Gd³⁺ w warunkach wodnych.

Wprowadzenie

Rosnące znaczenie obrazowania metodą rezonansu magnetycznego (MRI) w diagnostyce klinicznej, które jest ograniczone przez wrodzoną czułość techniki, spowodowało szybki wzrost badań nad rozwojem nowych środków kontrastowych na bazie gadolinu (GBCA)¹. GBCA to cząsteczki, które są podawane w celu poprawy jakości obrazu i zazwyczaj mają strukturę chemiczną trójwartościowego jonu gadolinu (Gd³⁺) skoordynowaną z ligandem polizębatym. Ta kompleksacja ma kluczowe znaczenie, ponieważ niechelatowany Gd³⁺ jest toksyczny; Ma on związek z rozwojem nerkopochodnego zwłóknienia układowego u niektórych pacjentów z niewydolnością nerek lub niewydolnością nerek². W związku z tym wykrywanie wolnego jonu wodnego ma zasadnicze znaczenie dla zapewnienia bezpieczeństwa GBCA. Obecność niechelatowanego Gd³⁺ w roztworach GBCA często jest wynikiem niepełnej reakcji między ligandem a jonem, dysocjacji kompleksu lub wyparcia przez inne kationy metali biologicznych³.

Wśród kilku obecnie używanych technik do określania obecności Gd³⁺, te opierające się na chromatografii i/lub spektrometrii plasują się najwyżej pod względem wszechstronności i możliwości zastosowania⁴. Do ich mocnych stron należą wysoka czułość i dokładność, zdolność do analizy różnych matryc próbek (w tym ludzkiej surowicy⁵, moczu i włosów⁶, ścieków⁷ i preparatów środków kontrastowych⁸) oraz jednoczesna kwantyfikacja wielu kompleksów Gd³⁺ (lista badań sprzed 2013 r. została opisana w obszernym przeglądzie Telgmann i wsp.).⁴. Jedyną wadą jest to, że kilka z tych metod wymaga oprzyrządowania (takiego jak spektrometria mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie)⁴, do których niektóre laboratoria mogą nie mieć dostępu. W kontekście nowatorskiego odkrycia GBCA na poziomie badawczym i dowodu słuszności koncepcji, stosunkowo wygodniejsza, szybsza i bardziej opłacalna metoda oparta na spektroskopii (taka jak absorpcja UV-Vis lub fluorescencja) może służyć jako cenna alternatywa. Mając na uwadze te zastosowania, opracowano fluorescencyjny czujnik aptamerowy do wodnego roztworu^{Gd 3+ 9}.

Aptamer (Gd-aptamer) to jednoniciowa cząsteczka DNA o długości 44 zasad o specyficznej sekwencji zasad, która została wyizolowana w procesie systematycznej ewolucji ligandów przez wykładnicze wzbogacanie (SELEX)⁹. Aby zaadaptować aptamer do czujnika fluorescencyjnego, fluorofor jest przyłączany do końca 5' nici, który jest następnie hybrydyzowany z nicią hartowniczą (QS) za pośrednictwem 13 uzupełniających zasad (ryc. 1). QS jest oznaczony ciemną cząsteczką wygaszającą na końcu 3'. W przypadku braku Gd³⁺, czujnik (czujnik Gd), składający się ze stosunku molowego odpowiednio 1:2 aptamera Gd i QS, będzie miał minimalną emisję fluorescencji dzięki transferowi energii z fluoroforu do wygaszacza. Dodanie wodnego roztworu Gd³⁺ spowoduje wyparcie QS z Gd-aptameru, powodując wzrost emisji fluorescencji.

Rysunek 1. Czujnik (czujnik Gd), który składa się z 44-zasadowego długiego aptameru (Gd-aptamer) oznaczonego fluoresceiną (fluoroforem) i 13-zasadowej długiej nici hartowniczej (QS) oznaczonej dabcylem (ciemnym wygaszaczem). W przypadku braku niechelatowanego Gd³⁺ fluorescencja czujnika jest minimalna. Po dodaniu Gd³⁺ następuje przemieszczenie QS i obserwuje się wzrost emisji fluorescencji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Obecnie istnieje jedna powszechnie stosowana metoda wykrywania wodnego stężenia Gd³⁺ oparta na spektroskopii. W teście tym wykorzystuje się cząsteczkę oranżu ksylenolowego, która ulega przesunięciu maksymalnej długości fali absorpcji z 433 do 573 nm po chelatacji do jonu¹⁰. Stosunek tych dwóch maksimów absorbancji można wykorzystać do ilościowego określenia ilości niechelatowanego Gd³⁺. Czujnik aptamerowy jest alternatywą (może być również komplementarny) dla testu z oznaczeniem oranżowania ksylenolowego, ponieważ obie metody mają różne warunki reakcji (takie jak pH i skład zastosowanych roztworów buforowych), selektywność docelowa, liniowe zakresy kwantyfikacji i metody wykrywania⁹.

Protokół

UWAGA: Woda klasy biologii molekularnej jest używana we wszystkich preparatach buforowych i roztworowych. Wszystkie jednorazowe probówki (do mikrowirówek i PCR) oraz końcówki do pipet są wolne od DNaz i RNaz. Przed użyciem należy zapoznać się z kartą charakterystyki substancji niebezpiecznej (MSDS) dla wszystkich chemikaliów. Zdecydowanie zaleca się stosowanie odpowiednich środków ochrony osobistej (PPE).

1. Przygotowanie roztworów podstawowych aptameru

1. Kup komercyjnie 2 nici polideoksynukleotydu. Zamów oba pasma z oczyszczaniem za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC).
   Pasmo 1 (Gd-aptamer):
   5'-/56-FAM/AGGCTCTCGGGACGACCAGAGTTGGTCCCGCTTTATGTGTCCCGAG-3'
   Pasmo 2 (QS):
   5'-GTCCCGAGAGCCT/3Dab/-3'
2. Rozpuścić każdą nić w wodzie, aby uzyskać 100 μM indywidualnych roztworów podstawowych aptamera Gd i QS.
3. Roztwory te należy przechowywać w temperaturze -20 °C. Rozwiązania są stabilne do tej pory, przez 3 lata.
4. Aby zminimalizować cykle zamrażania i rozmrażania, roztwory podstawowe należy przechowywać w podwielokrotnościach o pojemności 10 μl.

2. Przygotowanie 2x Gd-sensor Solution

1. Przygotować bufor do oznaczania (20 mM HEPES, 2 mM MgCl₂, 150 mM NaCl, 5 mM KCl). Dostosuj pH do ~7,4 za pomocą NaOH i HCl i przefiltruj przez sterylne jednorazowe filtry butelkowe z membraną PES 0,2 μm. Przechowywać w sterylnych butelkach. Przy odpowiednim filtrowaniu i przechowywaniu (w temperaturze pokojowej) bufor jest stabilny do tej pory, przez 2 lata.
2. Rozcieńczyć 1 μl roztworu podstawowego aptamera Gd (od etapu 1.2) i 2 μl roztworu podstawowego QS (od etapu 1.2) w 497 μl buforu do oznaczania. Dobrze wymieszaj za pomocą wiru. Ich stężenia w roztworze 2x Gd-sensor wynoszą odpowiednio 200 nM i 400 nM.
   UWAGA: Objętość roztworu 2x Gd-sensor przygotowanego na tym etapie wynosi 500 μL, co wystarcza do przetestowania 6 - 7 różnych stężeń Gd³⁺ dla krzywej kalibracyjnej i roztworów środków kontrastowych (krok 3). Każda próbka da zduplikowane dołki w 384-dołkowej płytce.
   1. Dostosuj objętość roztworu 2x Gd-sensor zgodnie z liczbą roztworów Gd³⁺, które należy przetestować.
3. Przenieś roztwór 2x Gd-sensor do 9 probówek PCR, po 50 μl do każdej probówki. Umieść probówki w termocyklerze.
4. Ustaw program w termocyklerze na podgrzanie roztworu w probówkach do 95 °C, przytrzymaj przez 5 minut, a następnie powoli schładzaj roztwory do 25 °C przez ~15 min (z szybkością ~0,05 - 0,1 °C/s). Cykl ogrzewania i chłodzenia ma zapewnić optymalną hybrydyzację między aptamerem Gd a QS. Częściowa hybrydyzacja powoduje niepełne wygaszenie i wyższą fluorescencję tła czujnika. Jeśli termocykler nie jest dostępny, przeprowadź ten proces za pomocą gorącej kąpieli wodnej.
5. Po schłodzeniu do temperatury 25 °C należy natychmiast użyć roztworu lub przechowywać w termocyklerze (do około 2 godzin) do momentu, gdy będzie gotowy do użycia. Gdy do ogrzewania używana jest łaźnia wodna, pozostaw rurki w wannie, ponieważ woda powoli schładza się do temperatury pokojowej.

3. Konstruowanie krzywej kalibracji fluorescencji i wykrywanie obecności niechelatowanego Gd³⁺ w roztworze środka kontrastowego Gd

1. Rozpuścić GdCl₃ w postaci stałej w buforze do oznaczania (tym samym buforze, co w kroku 2.1).
2. Poprzez seryjne rozcieńczanie przygotować po 100 μl każdego z 6 różnych roztworów Gd³⁺ w probówkach do mikrowirówek o podwójnym stężeniu końcowym pożądanym dla krzywej kalibracyjnej (2x roztwory).
   1. Na przykład, aby skonstruować kalibrację dla 0 (tylko bufor bez GdCl₃), 50, 100, 200, 400 i 800 nM Gd³⁺, przygotuj roztwory zawierające 0, 100, 200, 400, 800 i 1,600 nM jonu. Należy upewnić się, że jako kontrolę ujemną należy zawsze uwzględnić "ślepą próbę" z 0 nM Gd³⁺
   .
3. Rozpuścić badany środek kontrastowy w buforze do oznaczania. Przygotować 2 lub 3 różne stężenia roztworów środka kontrastowego za pomocą seryjnego rozcieńczania.
   UWAGA: Zaleca się przetestowanie 3 różnych stężeń roztworu środka kontrastowego. Ma to na celu zapewnienie, że stężenia te mieszczą się w zakresie liniowym. Jeżeli badane próbki nie wykazują zależności liniowej, należy zmniejszyć stężenia zastosowanego środka kontrastowego.
4. Wyjmij z termocyklera probówki PCR zawierające roztwór 2x czujnika Gd z kroku 2.5.
5. Dodaj 50 μl każdego roztworu Gd³⁺ z kroku 3.2 do 6 z 9 probówek PCR zawierających 2x roztwór czujnika Gd. Mieszać, pipetując w górę i w dół. Każda probówka PCR zawiera teraz pożądane stężenie Gd³⁺ do testowania, 100 nM Gd-aptameru i 200 nM QS.
6. Do pozostałych probówek PCR zawierających 2x roztwór czujnika Gd, dodaj 50 μl roztworów środka kontrastowego z kroku 3.3. Dobrze wymieszaj, pipetując kilka razy w górę i w dół.
7. Roztwory należy inkubować w probówkach do PCR przez około 5 minut w temperaturze pokojowej. Można je odstawić na maksymalnie 30 minut.
8. Przenieść 45 μl każdej probówki do płytki 384-dołkowej. Każda probówka PCR da zduplikowane dołki.
9. Zapisać fluorescencję każdej studzienki na czytniku płytek. Fluorofor (FAM) zastosowany w konstrukcji czujnika Gd ma maksima wzbudzenia i emisji odpowiednio 495 i 520 nm, zgodnie z podaniem na stronie internetowej dostawcy. Wybierz odpowiednie długości fal wzbudzenia i emisji lub filtry w zależności od tego, czy czytnik płytek jest oparty na monochromatorze czy filtrze.
10. Wykreśl wykres fluorescencji w dowolnych jednostkach fluorescencji (AFU) w stosunku do stężenia Gd³⁺.
11. Wykreśl wykres jako zmianę fałdowania fluorescencji w stosunku do stężenia Gd³⁺. Obliczyć zmianę krotności fluorescencji, dzieląc jednostkę AFU każdego stężenia przez jednostkę AFU roztworu "ślepej" próby ślepej (przy 0 nM Gd³⁺). Zmiana fałdu fluorescencji pozwoli na normalizację wyników, jeśli AFU wykazuje pewne okresowe (różne dni itp.) zmiany.
12. Porównać emisję fluorescencji roztworu zawierającego środek kontrastowy i "ślepej próby", która jest roztworem zawierającym 0 nM GdCl₃ (tylko bufor).
    UWAGA: Wyższa fluorescencja roztworu GBCA implikuje obecność niechelatowanego Gd³⁺, co może wymagać dalszego oczyszczania środka kontrastowego. Ilość obecnego niechelatowanego Gd³⁺ można oszacować za pomocą krzywej kalibracyjnej skonstruowanej w kroku 3.10 lub 3.11.

Wyniki

Typowa zmiana fluorescencji roztworu czujnika Gd w obecności nieschelatowanego Gd³⁺ jest pokazana na rysunku 2. Emisję można wykreślić jako zmianę fałdowania fluorescencji (rysunek 2A) lub odczyt surowej fluorescencji (rysunek 2B) w dowolnych jednostkach (AFU). Oba wykresy dają bardzo podobne krzywe kalibracyjne z zakresem liniowym dla stężeń Gd³⁺ poniżej 1 μM i nasyceniem sygnału na poziomie > 3 μM. Granica wykry...

Dyskusja

Za pomocą czujnika Gd opartego na aptamierze obserwuje się wzrost emisji fluorescencji, który jest proporcjonalny do stężenia niechelatowanego Gd³⁺ . Aby zminimalizować ilość użytej próbki, test można przeprowadzić na 384-dołkowej mikropłytce o całkowitej objętości próbki 45 μl na studzienkę. W tym projekcie wybór fluoresceiny (FAM) i dabcylu (Dab) opierał się przede wszystkim na koszcie odczynników; Aby zmodyfikować długość fali emisji, można zastosować inną parę fluoroforu i wygaszacza¹¹.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Gd-aptamer	IDTDNA	Sekwencja wejściowa i modyfikacja fluoroforu w postaci zamówienia	Można zastosować fluorofor o innej długości fali emisji. Aptamer można również zamówić w innej firmie.
Nić hartownicza	IDTDNA	Sekwencja wejściowa i modyfikacja wygaszacza w formularzu zamówienia	Można zastosować inny moduł wygaszający w celu optymalnego transferu energii z fluoroforu. Aptamer można również zamówić w innej firmie.
		klasy biologii molekularnej	Brak konkretnego producenta, zarówno DEPC, jak i bez DEPC działają równie dobrze
Chlorek gadolinu(III) bezwodny	Strem	936416	Toksyczny
HEPES	Fisher Scientific	BP310-500
Chlorek magnezu bezwodny	MP Biomedicals	0520984480 - 100 g
Chlorek sodu	Acros Organics
Chlorek potasu	Fisher Scientific	P333-500
Wodorotlenek sodu, granulki	Fisher Scientific	BP359
kwas solny	Fisher Scientific	SA49	Toksyczne i
384-dołkowe czarne płaskie płyty polistyrenowe NBS z niskim kołnierzem	Corning	3575	Płytki odpowiednie do fluorescencji czytanie jest wymagane.
Sterylny jednorazowy filtr do butelki Nalgene Rapid-Flow	Thermo Scientific	5680020	Nakrętka butelki jest wyposażona w membranę PES 0,2 mikrona
Jednorazowe sterylne butelki 250 ml	Corning	430281	Można użyć większej lub mniejszej butelki
1,5 ml probówek			Brak konkretnego producenta, o ile są to
probówki			0,2 ml PCR wolne od DNAzy i RNAzyBrak konkretnego producenta, o ile są to
			Brak konkretnego producenta
Końcówki do pipet (bez filtra) o odpowiednich rozmiarach			Brak konkretnego producenta, o ile są wolne od DNAzy i RNAzy
Equipment
Czytnik płytek	Biotek Synergy H1		Równie dobrze sprawdzą się czytniki płytek innych producentów