Oparty na aptamierze czujnik do wykrywania niechelatowanego gadolinu(III)

Podsumowanie

Opisano zastosowanie cząsteczek polideoxynukleotydu (44-merowego aptameru) do wykrywania niechelatowanego jonu gadolinu(III) w roztworze wodnym. Obecność jonu jest wykrywana poprzez wzrost emisji fluorescencji czujnika.

Streszczenie

Pokazano metodę oznaczania obecności niechelatowanego trójwartościowego jonu gadolinu (Gd³⁺) w roztworze wodnym. Gd³⁺ jest często obecny w próbkach środków kontrastowych na bazie gadolinu w wyniku niekompletnych reakcji między ligandem a jonem lub jako produkt dysocjacji. Ponieważ jon jest toksyczny, jego wykrycie ma kluczowe znaczenie. W niniejszym artykule opisano budowę i zastosowanie czujnika opartego na aptamie (Gd-sensor) dla Gd³⁺. Czujnik wytwarza zmianę fluorescencji w odpowiedzi na rosnące stężenie jonu i ma granicę wykrywalności w zakresie nanomolowym (~100 nM przy stosunku sygnału do szumu wynoszącym 3). Test można przeprowadzić w buforze wodnym o pH otoczenia (~7 - 7,4) na mikropłytce 384-dołkowej. Czujnik jest stosunkowo niereaktywny w stosunku do innych fizjologicznie istotnych jonów metali, takich jak jony sodu, potasu i wapnia, chociaż nie jest specyficzny dla Gd³⁺ w porównaniu z innymi trójwartościowymi lantanowcami, takimi jak europ(III) i terb(III). Niemniej jednak lantanowce nie są powszechnie spotykane w środkach kontrastowych ani w układach biologicznych, dlatego czujnik może być używany do selektywnego oznaczania niechelatowanego Gd³⁺ w warunkach wodnych.

Wprowadzenie

Rosnące znaczenie obrazowania rezonansem magnetycznym (MRI) w diagnostyce klinicznej, ograniczone naturalną czułością tej techniki, doprowadziło do gwałtownego wzrostu badań nad opracowaniem nowych środków kontrastowych opartych na gadolinie (GBCAs)¹. GBCAs to cząsteczki podawane w celu poprawy jakości obrazu, które zazwyczaj mają strukturę chemiczną składającą się z trójwartościowej jonu gadolinu (Gd³⁺) skoordynowanego z ligandem polidentatowym. Kompleksowanie to ma krytyczne znaczenie, ponieważ nieschelatowany Gd³⁺ jest toksyczny; powiązano go z rozwojem nefrogiennej włóknicy systemowej u niektórych pacjentów z chorobą lub niewydolnością nerek². W związku z tym wykrywanie wolnych jonów w roztworze wodnym jest kluczowe dla zapewnienia bezpieczeństwa GBCAs. Obecność nieschelatowanego Gd³⁺ w roztworach GBCAs często jest wynikiem niepełnej reakcji między ligandem a jonem, dysocjacji kompleksu lub wyparcia przez inne biologiczne kationy metali³.

Wśród wielu technik stosowanych obecnie do oznaczania obecności Gd³⁺, najwyższy stopień wszechstronności i zastosowalności wykazują metody oparte na chromatografii i/lub spektrometrii⁴. Do ich zalet należą wysoka czułość i dokładność, możliwość analizy różnych matryc próbek (w tym surowicy ludzkiej⁵, moczu i włosów⁶, ścieków⁷ oraz formulacji środków kontrastowych⁸) oraz jednoczesne oznaczanie ilościowe wielu kompleksów Gd³⁺ (wykaz badań przeprowadzonych przed 2013 rokiem opisano w kompleksowym przeglądzie autorstwa Telgmanna et al.)⁴. Jedyną wadą jest fakt, że kilka z tych metod wymaga aparatury (takiej jak spektrometria mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie)⁴, do której niektóre laboratoria mogą nie mieć dostępu. W kontekście odkrywania nowych GBCA na poziomie badań i dowodów koncepcji (proof-of-concept), wartościową alternatywą może być stosunkowo wygodniejsza, szybsza i bardziej kosztowo efektywna metoda spektroskopowa (taka jak absorpcja UV-Vis lub fluorescencja). Mając na uwadze te zastosowania, opracowano fluorescencyjny sensor oparty na aptamerach do oznaczania Gd³⁺ w roztworach wodnych⁹.

Aptamer (Gd-aptamer) jest jednoniciową cząsteczką DNA o długości 44 zasad i specyficznej sekwencji zasad, która została wyizolowana w procesie systematycznej ewolucji ligandów poprzez wykładnicze wzbogacenie (SELEX)⁹. Aby przekształcić aptamer w sensor fluorescencyjny, do końca 5' nici przyłączany jest fluorofor, który następnie ulega hybrydyzacji z nicią wygaszającą (QS) poprzez 13 zasad komplementarnych (Rysunek 1). Nić QS jest znakowana cząsteczką ciemnego wygaszacza na końcu 3'. W obecności Gd³⁺, sensor (Gd-sensor), składający się z Gd-aptameru i QS w stosunku molowym odpowiednio 1:2, będzie wykazywał minimalną emisję fluorescencji ze względu na przekazywanie energii z fluoroforu do wygaszacza. Dodanie wodnego roztworu Gd³⁺ spowoduje wyparcie nici QS z Gd-aptameru, co doprowadzi do wzrostu emisji fluorescencji.

Rycina 1. Sensor (Gd-sensor), który składa się z 44-nukleotydowego aptameru (Gd-aptamer) znakowanego fluoresceiną (fluoroforem) oraz 13-nukleotydowej nici gaszącej (QS) znakowanej dabcylem (ciemnym gaszaczem). W przypadku braku niechelatowanego Gd³⁺ fluorescencja sensora jest minimalna. Po dodaniu Gd³⁺ dochodzi do wyparcia nici QS, co skutkuje wzrostem emisji fluorescencji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Obecnie istnieje jedna powszechnie stosowana metoda spektroskopowa służąca do wykrywania wodnych roztworów Gd³⁺. Analiza ta wykorzystuje cząsteczkę pomarańczowego ksylenolu, która po chelatacji z jonem ulega przesunięciu maksymalnej długości fali absorpcji z 433 do 573 nm¹⁰. Stosunek tych dwóch maksimów absorbancji może być wykorzystany do ilościowego oznaczenia niechelatowanego Gd³⁺. Sensor aptamerowy stanowi alternatywę (może być również uzupełnieniem) dla analizy z użyciem pomarańczowego ksylenolu, ponieważ obie metody charakteryzują się różnymi warunkami reakcji (takimi jak pH i skład stosowanych roztworów buforowych), różną selektywnością wobec celu, różnymi zakresami liniowości oznaczania oraz różnymi sposobami detekcji⁹.

Protokół

UWAGA: Woda klasy biologii molekularnej jest używana we wszystkich preparatach buforowych i roztworowych. Wszystkie jednorazowe probówki (do mikrowirówek i PCR) oraz końcówki do pipet są wolne od DNaz i RNaz. Przed użyciem należy zapoznać się z kartą charakterystyki substancji niebezpiecznej (MSDS) dla wszystkich chemikaliów. Zdecydowanie zaleca się stosowanie odpowiednich środków ochrony osobistej (PPE).

1. Przygotowanie roztworów podstawowych aptameru

1. Kup komercyjnie 2 nici polideoksynukleotydu. Zamów oba pasma z oczyszczaniem za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC).
   Pasmo 1 (Gd-aptamer):
   5'-/56-FAM/AGGCTCTCGGGACGACCAGAGTTGGTCCCGCTTTATGTGTCCCGAG-3'
   Pasmo 2 (QS):
   5'-GTCCCGAGAGCCT/3Dab/-3'
2. Rozpuścić każdą nić w wodzie, aby uzyskać 100 μM indywidualnych roztworów podstawowych aptamera Gd i QS.
3. Roztwory te należy przechowywać w temperaturze -20 °C. Rozwiązania są stabilne do tej pory, przez 3 lata.
4. Aby zminimalizować cykle zamrażania i rozmrażania, roztwory podstawowe należy przechowywać w podwielokrotnościach o pojemności 10 μl.

2. Przygotowanie 2x Gd-sensor Solution

1. Przygotować bufor do oznaczania (20 mM HEPES, 2 mM MgCl₂, 150 mM NaCl, 5 mM KCl). Dostosuj pH do ~7,4 za pomocą NaOH i HCl i przefiltruj przez sterylne jednorazowe filtry butelkowe z membraną PES 0,2 μm. Przechowywać w sterylnych butelkach. Przy odpowiednim filtrowaniu i przechowywaniu (w temperaturze pokojowej) bufor jest stabilny do tej pory, przez 2 lata.
2. Rozcieńczyć 1 μl roztworu podstawowego aptamera Gd (od etapu 1.2) i 2 μl roztworu podstawowego QS (od etapu 1.2) w 497 μl buforu do oznaczania. Dobrze wymieszaj za pomocą wiru. Ich stężenia w roztworze 2x Gd-sensor wynoszą odpowiednio 200 nM i 400 nM.
   UWAGA: Objętość roztworu 2x Gd-sensor przygotowanego na tym etapie wynosi 500 μL, co wystarcza do przetestowania 6 - 7 różnych stężeń Gd³⁺ dla krzywej kalibracyjnej i roztworów środków kontrastowych (krok 3). Każda próbka da zduplikowane dołki w 384-dołkowej płytce.
   1. Dostosuj objętość roztworu 2x Gd-sensor zgodnie z liczbą roztworów Gd³⁺, które należy przetestować.
3. Przenieś roztwór 2x Gd-sensor do 9 probówek PCR, po 50 μl do każdej probówki. Umieść probówki w termocyklerze.
4. Ustaw program w termocyklerze na podgrzanie roztworu w probówkach do 95 °C, przytrzymaj przez 5 minut, a następnie powoli schładzaj roztwory do 25 °C przez ~15 min (z szybkością ~0,05 - 0,1 °C/s). Cykl ogrzewania i chłodzenia ma zapewnić optymalną hybrydyzację między aptamerem Gd a QS. Częściowa hybrydyzacja powoduje niepełne wygaszenie i wyższą fluorescencję tła czujnika. Jeśli termocykler nie jest dostępny, przeprowadź ten proces za pomocą gorącej kąpieli wodnej.
5. Po schłodzeniu do temperatury 25 °C należy natychmiast użyć roztworu lub przechowywać w termocyklerze (do około 2 godzin) do momentu, gdy będzie gotowy do użycia. Gdy do ogrzewania używana jest łaźnia wodna, pozostaw rurki w wannie, ponieważ woda powoli schładza się do temperatury pokojowej.

3. Konstruowanie krzywej kalibracji fluorescencji i wykrywanie obecności niechelatowanego Gd³⁺ w roztworze środka kontrastowego Gd

1. Rozpuścić GdCl₃ w postaci stałej w buforze do oznaczania (tym samym buforze, co w kroku 2.1).
2. Poprzez seryjne rozcieńczanie przygotować po 100 μl każdego z 6 różnych roztworów Gd³⁺ w probówkach do mikrowirówek o podwójnym stężeniu końcowym pożądanym dla krzywej kalibracyjnej (2x roztwory).
   1. Na przykład, aby skonstruować kalibrację dla 0 (tylko bufor bez GdCl₃), 50, 100, 200, 400 i 800 nM Gd³⁺, przygotuj roztwory zawierające 0, 100, 200, 400, 800 i 1,600 nM jonu. Należy upewnić się, że jako kontrolę ujemną należy zawsze uwzględnić "ślepą próbę" z 0 nM Gd³⁺
   .
3. Rozpuścić badany środek kontrastowy w buforze do oznaczania. Przygotować 2 lub 3 różne stężenia roztworów środka kontrastowego za pomocą seryjnego rozcieńczania.
   UWAGA: Zaleca się przetestowanie 3 różnych stężeń roztworu środka kontrastowego. Ma to na celu zapewnienie, że stężenia te mieszczą się w zakresie liniowym. Jeżeli badane próbki nie wykazują zależności liniowej, należy zmniejszyć stężenia zastosowanego środka kontrastowego.
4. Wyjmij z termocyklera probówki PCR zawierające roztwór 2x czujnika Gd z kroku 2.5.
5. Dodaj 50 μl każdego roztworu Gd³⁺ z kroku 3.2 do 6 z 9 probówek PCR zawierających 2x roztwór czujnika Gd. Mieszać, pipetując w górę i w dół. Każda probówka PCR zawiera teraz pożądane stężenie Gd³⁺ do testowania, 100 nM Gd-aptameru i 200 nM QS.
6. Do pozostałych probówek PCR zawierających 2x roztwór czujnika Gd, dodaj 50 μl roztworów środka kontrastowego z kroku 3.3. Dobrze wymieszaj, pipetując kilka razy w górę i w dół.
7. Roztwory należy inkubować w probówkach do PCR przez około 5 minut w temperaturze pokojowej. Można je odstawić na maksymalnie 30 minut.
8. Przenieść 45 μl każdej probówki do płytki 384-dołkowej. Każda probówka PCR da zduplikowane dołki.
9. Zapisać fluorescencję każdej studzienki na czytniku płytek. Fluorofor (FAM) zastosowany w konstrukcji czujnika Gd ma maksima wzbudzenia i emisji odpowiednio 495 i 520 nm, zgodnie z podaniem na stronie internetowej dostawcy. Wybierz odpowiednie długości fal wzbudzenia i emisji lub filtry w zależności od tego, czy czytnik płytek jest oparty na monochromatorze czy filtrze.
10. Wykreśl wykres fluorescencji w dowolnych jednostkach fluorescencji (AFU) w stosunku do stężenia Gd³⁺.
11. Wykreśl wykres jako zmianę fałdowania fluorescencji w stosunku do stężenia Gd³⁺. Obliczyć zmianę krotności fluorescencji, dzieląc jednostkę AFU każdego stężenia przez jednostkę AFU roztworu "ślepej" próby ślepej (przy 0 nM Gd³⁺). Zmiana fałdu fluorescencji pozwoli na normalizację wyników, jeśli AFU wykazuje pewne okresowe (różne dni itp.) zmiany.
12. Porównać emisję fluorescencji roztworu zawierającego środek kontrastowy i "ślepej próby", która jest roztworem zawierającym 0 nM GdCl₃ (tylko bufor).
    UWAGA: Wyższa fluorescencja roztworu GBCA implikuje obecność niechelatowanego Gd³⁺, co może wymagać dalszego oczyszczania środka kontrastowego. Ilość obecnego niechelatowanego Gd³⁺ można oszacować za pomocą krzywej kalibracyjnej skonstruowanej w kroku 3.10 lub 3.11.

Wyniki

Typową zmianę fluorescencji roztworu sensora Gd w obecności niechelatowanego Gd³⁺ przedstawiono na Rysunku 2. Emisję można przedstawić jako krotność zmiany fluorescencji (Rysunek 2A) lub surowy odczyt fluorescencji (Rysunek 2B) w jednostkach arbitralnych (AFU). Oba wykresy dają bardzo podobne krzywe kalibracyjne z zakresem liniowym dla stężeń Gd³⁺ poniżej 1 μM i nasyceniem sygnału przy > 3 μM. Granica wykrywalnośc...

Dyskusja

Za pomocą czujnika Gd opartego na aptamierze obserwuje się wzrost emisji fluorescencji, który jest proporcjonalny do stężenia niechelatowanego Gd³⁺ . Aby zminimalizować ilość użytej próbki, test można przeprowadzić na 384-dołkowej mikropłytce o całkowitej objętości próbki 45 μl na studzienkę. W tym projekcie wybór fluoresceiny (FAM) i dabcylu (Dab) opierał się przede wszystkim na koszcie odczynników; Aby zmodyfikować długość fali emisji, można zastosować inną parę fluoroforu i wygaszacza¹¹.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Gd-aptamer	IDTDNA	Sekwencja wejściowa i modyfikacja fluoroforu w postaci zamówienia	Można zastosować fluorofor o innej długości fali emisji. Aptamer można również zamówić w innej firmie.
Nić hartownicza	IDTDNA	Sekwencja wejściowa i modyfikacja wygaszacza w formularzu zamówienia	Można zastosować inny moduł wygaszający w celu optymalnego transferu energii z fluoroforu. Aptamer można również zamówić w innej firmie.
		klasy biologii molekularnej	Brak konkretnego producenta, zarówno DEPC, jak i bez DEPC działają równie dobrze
Chlorek gadolinu(III) bezwodny	Strem	936416	Toksyczny
HEPES	Fisher Scientific	BP310-500
Chlorek magnezu bezwodny	MP Biomedicals	0520984480 - 100 g
Chlorek sodu	Acros Organics
Chlorek potasu	Fisher Scientific	P333-500
Wodorotlenek sodu, granulki	Fisher Scientific	BP359
kwas solny	Fisher Scientific	SA49	Toksyczne i
384-dołkowe czarne płaskie płyty polistyrenowe NBS z niskim kołnierzem	Corning	3575	Płytki odpowiednie do fluorescencji czytanie jest wymagane.
Sterylny jednorazowy filtr do butelki Nalgene Rapid-Flow	Thermo Scientific	5680020	Nakrętka butelki jest wyposażona w membranę PES 0,2 mikrona
Jednorazowe sterylne butelki 250 ml	Corning	430281	Można użyć większej lub mniejszej butelki
1,5 ml probówek			Brak konkretnego producenta, o ile są to
probówki			0,2 ml PCR wolne od DNAzy i RNAzyBrak konkretnego producenta, o ile są to
			Brak konkretnego producenta
Końcówki do pipet (bez filtra) o odpowiednich rozmiarach			Brak konkretnego producenta, o ile są wolne od DNAzy i RNAzy
Equipment
Czytnik płytek	Biotek Synergy H1		Równie dobrze sprawdzą się czytniki płytek innych producentów

Woda 327300025 do mikrowirówek mikropipety wolne od DNAzy i RNAzy