Artykuł metodologiczny

Wizualizacja interakcji białko-białko we frakcjach jądrowych i cytoplazmatycznych za pomocą koimmunoprecypitacji i testu ligacji zbliżeniowej in situ

DOI:

10.3791/55218

⸱

16 stycznia 2017

 ,  , 
1University Children's Hospital Basel (UKBB), University of Basel, 2Department of Clinical Research, University of Basel

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Interakcje białko-białko mogą zachodzić zarówno w jądrze, jak i w cytoplazmie komórki. Aby zbadać te interakcje, stosuje się tradycyjną koimmunoprecypitację i nowoczesny test ligacji zbliżeniowej. W tym badaniu porównujemy te dwie metody wizualizacji rozkładu oddziaływań NF90-RBM3 w jądrze i cytoplazmie.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Interakcje białko-białko są zaangażowane w tysiące procesów komórkowych i występują w różnych kontekstach przestrzennych. Tradycyjnie, koimmunoprecypitacja jest popularną techniką wykrywania interakcji białko-białko. Późniejsza analiza Western blot jest najpowszechniejszą metodą wizualizacji białek współimmunoprecypitowanych. Ostatnio test ligacji zbliżeniowej stał się potężnym narzędziem do wizualizacji interakcji białko-białko in situ i daje możliwość ilościowego określenia interakcji białko-białko za pomocą tej metody. Podobnie jak konwencjonalna immunocytochemia, technika ligacji zbliżeniowej również opiera się na dostępności pierwotnych przeciwciał przeciwko antygenom, ale w przeciwieństwie do tego, test ligacji zbliżeniowej wykrywa interakcje białko-białko za pomocą unikalnej techniki obejmującej PCR w okręgu tocznym, podczas gdy konwencjonalna immunocytochemia wykazuje tylko kolokalizację białek.

Czynnik jądrowy 90 (NF90) i białko motywu wiążącego RNA 3 (RBM3) zostały wcześniej wykazane jako partnerzy oddziałujący na siebie. Są one zlokalizowane głównie w jądrze, ale również migrują do cytoplazmy i regulują szlaki sygnałowe w przedziale cytoplazmatycznym. Tutaj porównaliśmy interakcję NF90-RBM3 zarówno w jądrze, jak i cytoplazmie za pomocą testu koimmunoprecypitacji i ligacji zbliżeniowej. Ponadto omówiliśmy zalety i ograniczenia tych dwóch technik w wizualizacji interakcji białko-białko w odniesieniu do rozkładu przestrzennego i właściwości oddziaływań białko-białko.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Czynnik jądrowy 90 (NF90) to białko wieloizoformowe o wielu funkcjach, w tym odpowiedzi na infekcję wirusową, regulacji interleukiny-2 po transkrypcji i regulacji biogenezy miRNA 1-3. RBM3 jest białkiem wiążącym RNA, zaangażowanym w translację i biogenezę miRNA i może być indukowany przez różne czynniki stresogenne, w tym hipotermię i niedotlenienie 4-6. Niedawno znaleźliśmy NF90 i RBM3 w kompleksie białkowym 7. Interakcja NF90 i RBM3 jest niezbędna do modulowania aktywności kinazy białkowej RNA podobnej do kinazy białkowej (PERK) w niesfałdowanej odpowiedzi białkowej 7. Zarówno NF90, jak i RBM3 znajdują się głównie w jądrze, ale niewielka część NF90 i RBM3 przemieszcza się do cytoplazmy i wiąże się tam ze sobą w określonych funkcjach, np. w celu regulacji aktywności PINK. Dlatego ważne jest, aby zobrazować rozkład oddziaływań NF90-RBM3 w przedziale subkomórkowym, co może wskazywać na ich różne role w danym przedziale.

Dekady temu, drożdże dwie hybrydy (Y2H) zostały opracowane do wykrywania interakcji między dwoma białkami 8. Jednak ze względu na sztuczną konstrukcję skondensowanych białek, wyniki fałszywie dodatnie ograniczyły zastosowanie tej metody. Przez długi czas koimmunoprecypitacja była główną techniką analizy oddziaływań białko-białko, zwłaszcza w warunkach endogennych 9. Do analizy koimmunoprecypitowanego kompleksu białkowego najwygodniejszą techniką jest Western blot, podczas gdy spektrometria mas jest stosowana, gdy pożądana jest super czułość i dokładność. W ostatnich latach opracowano test ligacji zbliżeniowej jako nową metodę wykrywania interakcji białko-białko zarówno w komórkach, jak i tkankach in situ 10,11.

Tutaj porównaliśmy najpopularniejszą metodę koimmunoprecypitacji i stosunkowo nowatorską metodę ligacji zbliżeniowej w wychwytywaniu interakcji NF90-RBM3 we frakcjach subkomórkowych. Omówiliśmy również zalety i ograniczenia obu technik.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Koimmunoprecypitacja

  1. Nasiona komórek HEK293 w 2 x 10 5 komórek na studzienkę w jednej 6-dołkowej płytce w 2 ml suplementu Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 100 U/ml penicyliny-streptomycyny (Pen-Strep).
  2. Hoduj komórki przez 48 godzin w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
  3. Umyj komórki zimną solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) trzykrotnie. Zbierać komórki przez odwirowanie w temperaturze 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  4. Przygotuj frakcje jądrowe i cytoplazmatyczne przy użyciu komercyjnych odczynników do ekstrakcji jądrowej i cytoplazmatycznej. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta z pewnymi modyfikacjami.
    1. Użyj 3 x 106 komórek do jednego eksperymentu z koimmunoprecypitacją (w przybliżeniu z 90% konfluencją z 3 dołków jednej 6-dołkowej płytki). Dodać 300 μl zimnego roztworu do ekstrakcji cytoplazmatycznej (CER I) i wirować przez 15 sekund z najwyższą prędkością.
    2. Inkubować przez 30 minut na lodzie. Podczas inkubacji wirować przez 5 s co 10 minut.
    3. Dodać 16,5 μl zimnego roztworu do ekstrakcji cytoplazmatycznej II (CER II), wirować przez 5 sekund i inkubować przez 5 minut na lodzie.
    4. Wirować przez 5 sekund i wirować przy 16 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    5. Przenieść supernatant (ekstrakt cytoplazmatyczny) do nowej, wstępnie schłodzonej probówki i przechowywać na lodzie do momentu użycia.
    6. Przemyć nierozpuszczalne granulki (zawierające jądra) trzykrotnie 1 ml zimnego PBS za każdym razem, pipetując w górę i w dół pięć razy. Usuń PBS po umyciu.
    7. Dodać 150 μl zimnego roztworu do ekstrakcji jądrowej (NER), wirować przez 15 sekund i inkubować przez 1 godzinę na lodzie. Podczas inkubacji wirować przez 15 sekund i pipetować 10 razy końcówką o pojemności 200 μl co 10 minut.
    8. Wirować przez 15 s i wirować przy 16 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    9. Przenieść supernatant (ekstrakt jądrowy) do nowej, wstępnie schłodzonej probówki, przechowywać na lodzie do czasu użycia.
  5. Usuń 10% objętości ekstraktów jądrowych i cytoplazmatycznych jako dane wejściowe.
  6. Dodać zimny PBS do pozostałych ekstraktów do końcowej objętości 1 ml. Przechowywać na lodzie do czasu użycia.
    UWAGA: Wstępne oczyszczanie nie jest konieczne w przypadku stosowania kulek magnetycznych sprzężonych z białkiem G. Jeśli jednak tło jest wysokie, należy przeprowadzić wstępne oczyszczanie przez inkubację 40 μl kulek magnetycznych sprzężonych z białkiem G (50% zawiesiny) i 1 ml rozcieńczonego lizatu z tego etapu w temperaturze 4 °C przez 30 minut na rotatorze. Oddzielić supernatant (wstępnie oczyszczony lizat) od kulek za pomocą stojaka magnetycznego. Wyrzuć koraliki.
  7. Aby połączyć przeciwciało pierwszorzędowe z kulkami magnetycznymi sprzężonymi z białkiem G, inkubuj 40 μl kulek magnetycznych sprzężonych z białkiem G (50% zawiesiny) z 4 μg poliklonalnego przeciwciała anty-RBM3 królika lub króliczej IgG (kontrola ujemna) w 200 μl PBS plus bufor Tween 20 (PBST, 0,02% Tween 20) w temperaturze pokojowej (RT) przez 40 minut na rotatorze.
  8. Oddzielić kulki sprzężone z przeciwciałami i supernatant za pomocą stojaka magnetycznego i odrzucić supernatant. Umyj kulki raz 200 μl PBST (0,02%).
  9. Dodać 1 ml rozcieńczonych lizatów (lub, jeśli to konieczne, wstępnie oczyszczonych lizatów) do kulek i inkubować na rotatorze w temperaturze 4 °C przez noc.
  10. Następnego dnia oddziel koraliki i supernatant za pomocą stojaka magnetycznego i wyrzuć supernatant. Przemyć 3 x 10 minut 0,5 ml PBST (0,02%) dla każdej probówki w temperaturze 4 °C na rotatorze o stałej prędkości 20 obr./min.
  11. Elutować białka z kulek, dodając 40 μl buforu do próbek (1x komercyjny bufor do próbek i 50 mM 1,4-ditiotreitol (DTT)). Podgrzewać w temperaturze 70 °C przez 10 min. Zakręć i przenieś płyny do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.
  12. Rozcieńczyć wejściowe lizaty w buforze próbki (stężenie końcowe: 1x komercyjny bufor próbki i 50 mM DTT) i ogrzewać w temperaturze 70 °C przez 10 min. Załaduj dane wejściowe i immunoprecypitowane białka z ostatniego etapu do prefabrykowanego 4-12% żelu bis-Tris. Objętość załadunku każdej studzienki nie powinna przekraczać 20 μl. Wykonaj elektroforezę w 1x komercyjnym buforze do biegania na lodzie przez 35 min.
    UWAGA: Załaduj ekstrakty jądrowe i cytoplazmatyczne w stosunku 1:2 (V/V), który odzwierciedla tę samą początkową ilość komórek.
  13. Przenieś białka do membrany PVDF w 1x komercyjnym buforze transferowym przy 30 V przez 2 godziny w temperaturze 4 °C.
  14. Zablokuj membranę 5% odtłuszczonym mlekiem w PBST (0,1% Tween 20) w temperaturze pokojowej przez 40 minut na shakerze.
  15. Inkubować błonę z pierwszorzędowymi przeciwciałami (oba rozcieńczone w stosunku 1:1 000) w PBST (0,1%) w temperaturze 4 °C przez noc.
  16. Myć 3 x 10 min PBST (0,1%) w temperaturze pokojowej na shakerze.
  17. Inkubować błonę z sprzężonymi z peroksydazą chrzanową (HRP) przeciwciałami drugorzędowymi przeciwko mysim lub królikom (oba rozcieńczone w stosunku 1:5 000) w PBST (0,1%) w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
  18. Myć 3 x 10 min PBST (0,1%) w temperaturze pokojowej na shakerze.
  19. Użyć 0,2 ml mieszaniny substratów ze wzmocnionej chemiluminescencji (ECL) na cm2 membrany, inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Od tego kroku należy unikać wszelkiego światła z wyjątkiem czerwonych świateł.
  20. Wylej płyn i wystaw na kliszę rentgenowską w kasecie z filmem. Wywołaj film za pomocą automatycznej maszyny do obróbki filmu.

2. Immunocytochemia i test ligacji zbliżeniowej

  1. Nasiona komórek HEK293 o wymiarach 1,5 x 104 komórki na komorę w jednym 8-komorowym szkiełku pokrytym poli-D-lizyną w 0,4 ml DMEM uzupełnionym 10% FBS i 100 U/ml Pen-Strep.
  2. Hoduj komórki przez 48 godzin w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
  3. Odessać pożywkę i utrwalić komórki 4% paraformaldehydem (PFA) przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Odessać PFA i przemyć 3 x 10 min 0,5 ml PBS na komorę.
  5. Przepuszczalność i blokowanie komórek za pomocą 0,5% Triton X-100 i 5% normalnej surowicy koziej (NGS) w PBS w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
  6. Inkubować z przeciwciałami pierwszorzędowymi w 0,1% Triton X-100 i 5% NGS w PBS na wytrząsarce w temperaturze 4 °C przez noc. Rozcieńczyć mysie przeciwciało monoklonalne anty-NF90 i poliklonalne przeciwciało anty-RBM3 królika 1:100 w PBS do podwójnego barwienia. W przypadku kontroli ujemnej należy pominąć niezależnie jedno z dwóch przeciwciał pierwszorzędowych i pominąć oba przeciwciała w trzeciej kontroli.
    UWAGA: Nie używaj komercyjnych odczynników blokujących i rozcieńczających.
  7. Myć 3 x 10 min po 0,5 ml PBS na komorę.
  8. Podlega protokołom immunocytochemii lub testu ligacji zbliżeniowej
    1. Immunocytochemia
      1. Inkubować z rozcieńczonymi w stosunku 1:500 przeciwciałami drugorzędowymi przeciwko myszom sprzężonym z zielonym barwnikiem i czerwonymi przeciwciałami drugorzędowymi przeciwko królikom sprzężonym z barwnikiem czerwonym w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Unikaj światła od tego etapu.
      2. Jądra barwnika przeciwstawnego 4′, 6-diamidyn-2-fenylindoldolem (DAPI) rozcieńczone w stosunku 1:5 000 w PBS w temperaturze pokojowej przez 10 min.
      3. Myć 3 x 10 min po 0,5 ml PBS na komorę.
      4. Wyjmij komory ze szkiełka i wysusz. Montaż z 250 μ, średni montaż na prowadnicę.
    2. Test ligacji zbliżeniowej
      1. Przygotuj sondy do oznaczania ligacji zbliżeniowej. Wymieszaj i rozcieńcz dwie sondy do ligacji zbliżeniowej (przeciwciała drugorzędowe przeciwko myszom i królikom przyłączone do różnych oligonukleotydów, które mogą ligować poprzez dodanie dwóch innych oligonukleotydów w roztworze ligacji) zarówno 1:5 w 0,1% Triton X-100, jak i 5% NGS w PBS, o całkowitej objętości 320 μl dla jednego szkiełka 8-komorowego (około 40 μl nacm2). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
      2. Wyjmij komory ze szkiełka i dodaj rozcieńczone sondy. Inkubować w inkubatorze wilgotnościowym w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
      3. Przygotuj roztwór do podwiązywania. Zmieszać 8 μl ligazy, 64 μl 5 x podwiązanie i 248 μl H2O.
      4. Strzepnij płyn ze szkiełka i umyj 2 x 5 minut w 1x buforze myjącym A (dostarczonym z zestawem).
      5. Dodać roztwór do ligacji i inkubować w inkubatorze wilgotnościowym w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
      6. Przygotować roztwór do amplifikacji. Zmieszaj 4 μl polimerazy, 64 μl 5x bulion wzmacniający i 252 μl H2O. Od tego kroku unikaj światła.
      7. Strzepnąć płyn ze szkiełka i umyć 2 x 2 minuty w 1x buforze do płukania A.
      8. Dodać roztwór do amplifikacji i inkubować w inkubatorze o ciemnej wilgotności w temperaturze 37 °C przez 100 minut.
      9. Strzepnij płyn ze szkiełka i umyj 2 x 10 minut w 1x buforze do płukania B (dostarczonym z zestawem). Myć przez 1 minutę w 0,01x buforze do płukania B.
      10. Osusz szkiełko i zamontuj za pomocą 250 μl dostępnego w handlu medium montażowego (z DAPI) na szkiełko.
  9. Zbadaj sygnały fluorescencyjne pod mikroskopem za pomocą soczewki okularowej 10X i soczewki obiektywowej 20X. Rejestruj obrazy za pomocą kamery CCD.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 1 pokazuje, że NF90 i RBM3 są białkami jądrowymi i tylko niewielka frakcja jest obecna w cytoplazmie. Warto zauważyć, że istnieją trzy różne pasma zabarwione dodatnio dla RBM3. Najmniejsza nieco poniżej 20 kDa odzwierciedla prawidłowy rozmiar RBM3 (przewidywana masa cząsteczkowa RBM3 wynosi 17 kDa). Pochodzenie dwóch pozostałych pasm pozostaje do zbadania. Eksperymenty z koimmunoprecypitacją z RBM3 jako białkiem przynęty wykazały, że interakcje NF90-RBM3 są główni...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obie metody mają wiele zalet, ale także wad. Jako stosunkowo nowa technika, oczywistą zaletą testu ligacji zbliżeniowej jest możliwość wyjaśnienia interakcji białko-białko na poziomie pojedynczej komórki, a nie partii heterogenicznych komórek. Obrazy o dużej jasności i rozdzielczości (np. za pomocą mikroskopu konfokalnego) dają możliwość kwantyfikacji poprzez zliczanie pojedynczych plamek fluorescencyjnych. W przeciwieństwie do tego, konwencjonalne połączenie techniki koimmunoprecypitacji z Western blot może tyl...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez Szwajcarską Narodową Fundację Nauki (SNSF, 31003A_163305).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zmodyfikowany orzeł Dulbecco" s Medium (DMEM)SigmaD6429Wysoka zawartość glukozy
4,500 mg/L
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Gibco, Thermo Fisher Scientific10270106
Penicylina-Streptomycyna (PenStrep)BioConcept4-01F00-H
NE-PER Odczynniki do ekstrakcji jądrowej i cytoplazmatycznejThermo Fisher Scientific78833
1,4-ditiotreitol (DTT)Carl Roth6908.3
Dynabeads Protein GNovex, Thermo Fisher Scientific10003D
DRBP76 (NF90/NF110)przeciwciało BD Transduction Laboratories612154używać 1:1,000 dla WB i 1:100 dla przeciwciała ICC/PLA
RBM3ProteinTech14363-1-APużywa 1:1,000 dla WB i 1:100 dla ICC/PLA
Przeciwciało A/CTechnologiasygnalizacji komórkowej#2032użyj 1:1,000 dla WB 
anty-GAPDHAbcamab8245użyj 1:1,000 dla WB 
normalny królik IgGSanta Cruzsc-2027
anty-królicze IgG, wtórne przeciwciało sprzężone z HRPTechnologia sygnalizacji komórkowej7074użyj 1:5,000 dla WB 
przeciwciało drugorzędowe przeciw mysim HRPCarl Roth4759.1zastosowanie 1:5,000 dla WB 
Klarowny Western Podłoże do bibułowania ECLBio-Rad#1705060
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris GelNovex, Thermo Fisher ScientificNP0321BOX
NuPAGE LDS Bufor do próbek (4x)Novex, Thermo Fisher ScientificNP0007
NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x)Novex, Thermo Fisher ScientificNP0002
Bufor transferowy NuPAGE (20x)Novex, Thermo Fisher ScientificNP00061
Amersham Hypond P 0,2 Membrana PVDFGE Healthcare Life Sciences10600021
Poly-D-Lysine 8 Well Culture Slide CorningBioCoat354632
Paraformaldehyd (PFA)SigmaP6148
Normalna surowica kozia (NGS)Gibco, Thermo Fisher ScientificPCN5000
Kozia anty-mysia IgG (przeciwciało H+L), koniugat Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-11001
Kozia anty-królicza IgG (przeciwciało H+L), koniugat Alexa Fluor 568Thermo FisherScientific A-11011
4′, 6-Diamidin-2-fenylindol (DAPI)SigmaD9542
Duolink PLA sonda Anti-mouse PLUSSigma DUO92001
Duolink PLA  sonda Anti-rabbit MINUSSigmaDUO92005
Odczynniki do wykrywania Duolink Czerwonemyjące SigmaDUO92008
Duolink FluorescencjaSigmaDUO82049
Duolink Podłoże montażowe z DAPISigmaDUO82040
Charakterystyka 4-88Sigma81381
MikroskopOlympusAX-70
Kamera CCDSPOTInsight 2MP Firewire
Film Xray FujifilmSuper RX
Maszyna do przetwarzania filmówFujifilmFPM-100A
przeciwciało #

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Patiño, C., Haenni, A. L., Urcuqui-Inchima, S. NF90 isoforms, a new family of cellular proteins involved in viral replication? Biochimie. 108, 20-24 (2015).
  2. Shim, J., Lim, H., R Yates, J., Karin, M. Nuclear export of NF90 is required for interleukin-2 mRNA stabilization. Mol Cell. 10 (6), 1331-1344 (2002).
  3. Sakamoto, S., et al. The NF90-NF45 complex functions as a negative regulator in the microRNA processing pathway. Mol Cell Biol. 29 (13), 3754-3769 (2009).
  4. Dresios, J., et al. Cold stress-induced protein Rbm3 binds 60S ribosomal subunits, alters microRNA levels, and enhances global protein synthesis. Proc Natl Acad Sci. 102 (6), 1865-1870 (2005).
  5. Danno, S., Itoh, K., Matsuda, T., Fujita, J. Decreased expression of mouse Rbm3, a cold-shock protein, in Sertoli cells of cryptorchid testis. Am J Pathol. 156 (5), 1685-1692 (2000).
  6. Wellmann, S., et al. Oxygen-regulated expression of the RNA-binding proteins RBM3 and CIRP by a HIF-1-independent mechanism. J Cell Sci. 117 (Pt 9), 1785-1794 (2004).
  7. Zhu, X., Zelmer, A., Kapfhammer, J. P., Wellmann, S. Cold-inducible RBM3 inhibits PERK phosphorylation through cooperation with NF90 to protect cells from endoplasmic reticulum stress. FASEB J. 30 (2), 624-634 (2016).
  8. Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).
  9. Verhelst, J., De Vlieger, D., Saelens, X. Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein. J Vis Exp. (98), (2015).
  10. Söderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nat Methods. 3 (12), 995-1000 (2007).
  11. Jarvius, M., et al. In situ detection of phosphorylated platelet-derived growth factor receptor beta using a generalized proximity ligation method. Mol Cell Proteomics. 6 (9), 1500-1509 (2007).
  12. Liu, C. H., et al. Analysis of protein-protein interactions in cross-talk pathways reveals CRKL protein as a novel prognostic marker in hepatocellular carcinoma. Mol Cell Proteomics. 12 (5), 1335-1349 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Frakcje j drowo cytoplazmatyczneanaliza Western blotimmunocytochemiakom rki HEK293interakcja NF90 RBM3analiza przedzia w kom rkowychmikroskopia fluorescencyjna

Powiązane artykuły