Artykuł metodologiczny

Profilowanie ekspresji genów w pojedynczej komórce za pomocą FACS i qPCR z wewnętrznymi standardami

DOI:

10.3791/55219

⸱

25 lutego 2017

 ,  , 
1Laboratory of Pathology, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, 2Experimental Transplantation and Immunology Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy metodę sortowania pojedynczych komórek ssaków i ilościowego określania ekspresji do 96 docelowych genów w każdej komórce. Metoda ta obejmuje wykorzystanie wewnętrznych wzorców qPCR w celu umożliwienia oszacowania bezwzględnej liczby transkryptów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pomiary ekspresji genów z dużych populacji komórek mogą przesłonić znaczną zmienność transkryptomiczną poszczególnych komórek w tych populacjach. Pomiary ekspresji genów w pojedynczej komórce mogą pomóc w ocenie roli szumu w ekspresji genów, zidentyfikować korelacje w ekspresji par genów i ujawnić subpopulacje komórek, które inaczej reagują na bodziec. W tym miejscu opisujemy procedurę pomiaru ekspresji do 96 genów w pojedynczych komórkach ssaków wyizolowanych z populacji rosnącej w hodowli tkankowej. Komórki są sortowane do buforu lizy przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS), a interesujące nas gatunki mRNA są poddawane odwrotnej transkrypcji i amplifikacji. Ekspresja genów jest następnie mierzona za pomocą mikroprzepływowej maszyny do PCR w czasie rzeczywistym, która wykonuje do 96 testów qPCR na maksymalnie 96 próbkach jednocześnie. Opisujemy również generowanie i stosowanie wzorców amplikonów PCR, aby umożliwić oszacowanie bezwzględnej liczby każdego transkryptu. W porównaniu z innymi metodami pomiaru ekspresji genów w pojedynczych komórkach, podejście to pozwala na ilościowe określenie bardziej odrębnych transkryptów niż RNA FISH przy niższych kosztach niż RNA-Seq.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Poszczególne komórki w populacji mogą wykazywać bardzo różne reakcje na jednolity bodziec fizjologiczny1,2,3,4. Zmienność genetyczna komórek w populacji jest jednym z mechanizmów tej różnorodności reakcji, ale istnieje również kilka czynników niegenetycznych, które mogą zwiększyć zmienność odpowiedzi, nawet w klonalnej populacji komórek. Na przykład poziomy poszczególnych białek i innych ważnych cząsteczek sygnałowych mogą się różnić w zależności od komórki, co powoduje różnice w dalszych profilach ekspresji genów. Dodatkowo, aktywacja genów może zachodzić w krótkotrwałych seriach transkryptów5,6, które mogą być ograniczone do stosunkowo niewielkiej liczby transkryptów na serię7,8,9. Taka stochastyczność w aktywacji genów może w znacznym stopniu przyczynić się do zmienności odpowiedzi biologicznych i może zapewnić selektywną przewagę mikroorganizmom10 oraz w komórkach ssaków1,2 reagujących na bodziec fizjologiczny. Ze względu na zarówno genetyczne, jak i niegenetyczne źródła zmienności, profil ekspresji genów dowolnej komórki w odpowiedzi na bodziec może znacznie różnić się od średniego profilu ekspresji genów uzyskanego z pomiaru odpowiedzi masowej. Określenie zakresu, w jakim poszczególne komórki wykazują zmienność w odpowiedzi na bodziec, wymaga technik izolacji pojedynczych komórek, pomiaru poziomów ekspresji dla interesujących nas transkryptów oraz analizy obliczeniowej uzyskanych danych dotyczących ekspresji.

Istnieje kilka podejść do oznaczania ekspresji genów w pojedynczych komórkach, obejmujących szeroki zakres kosztów, liczbę badanych transkryptów i dokładność kwantyfikacji. Na przykład sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki oferuje szeroką głębokość pokrycia transkryptów i możliwość ilościowego określania tysięcy różnych transkryptów dla genów o najwyższej ekspresji w poszczególnych komórkach; Jednak koszt związany z taką głębokością sekwencjonowania może być zaporowy, chociaż koszty nadal maleją. I odwrotnie, hybrydyzacja in situ fluorescencji jednocząsteczkowego RNA (smRNA FISH) oferuje precyzyjną kwantyfikację transkryptów nawet dla genów o niskiej ekspresji przy rozsądnym koszcie na gen będący przedmiotem zainteresowania; Jednak tylko niewielka liczba genów docelowych może być oznaczona w danej komórce za pomocą tego podejścia. Ilościowe testy oparte na PCR, opisane w niniejszym protokole, zapewniają środek między tymi technikami. Testy te wykorzystują mikroprzepływową maszynę do PCR w czasie rzeczywistym do ilościowego oznaczania do 96 interesujących transkryptów jednocześnie w maksymalnie 96 komórkach. Chociaż każda z wyżej wymienionych metod wiąże się z wymaganymi kosztami sprzętu, koszt każdego indywidualnego testu qPCR jest stosunkowo niski. Protokół ten jest zaadaptowany z protokołu sugerowanego przez producenta mikroprzepływowej maszyny do PCR w czasie rzeczywistym (Protokół ADP 41, Fluidigm). Aby umożliwić oszacowanie bezwzględnej liczby każdego transkryptu w podejściu opartym na PCR, rozszerzyliśmy protokół, aby wykorzystać wewnętrzne kontrole przygotowanych amplikonów genów docelowych, które można wykorzystać w wielu eksperymentach.

Jako przykład tej techniki, opisano ilościowe oznaczanie ekspresji genów regulowanych przez supresor guza p53 w ludzkich komórkach raka piersi MCF-711. Komórki są poddawane działaniu środka chemicznego, który indukuje pęknięcia podwójnej nici DNA. Wcześniejsze badania wykazały, że odpowiedź p53 na pęknięcia dwuniciowe DNA wykazuje dużą niejednorodność w poszczególnych komórkach, zarówno pod względem poziomów p5312, jak i aktywacji odrębnych genów docelowych11. Ponadto p53 reguluje ekspresję ponad 100 dobrze scharakteryzowanych genów docelowych zaangażowanych w liczne dalsze szlaki, w tym zatrzymanie cyklu komórkowego, apoptozę i starzenie się13,14. Ponieważ odpowiedź za pośrednictwem p53 w każdej komórce jest zarówno złożona, jak i zmienna, analiza systemu korzysta z podejścia, w którym prawie 100 docelowych genów może być jednocześnie badanych w poszczególnych komórkach, takich jak opisane poniżej. Dzięki niewielkim modyfikacjom (takim jak alternatywne metody izolacji i lizy pojedynczych komórek), protokół można łatwo dostosować do badania szerokiego zakresu typów komórek ssaków, transkryptów i odpowiedzi komórkowych.

Przy odpowiednim przygotowaniu, runda sortowania komórek i pomiaru ekspresji genów może być przeprowadzona zgodnie z tym protokołem przez okres trzech dni. Sugerowany jest następujący czas: z wyprzedzeniem wybierz interesujące Cię transkrypty, zidentyfikuj i zweryfikuj pary starterów, które amplifikują cDNA z tych transkryptów, a następnie przygotuj wzorce i mieszanki starterów przy użyciu tych starterów. W dniu 1, po traktowaniu komórek, zbierz i posortuj komórki, wykonaj odwrotną transkrypcję i specyficzną amplifikację docelową, a następnie potraktuj próbki egzonukleazą w celu usunięcia niewbudowanych starterów. W dniu 2 przeprowadź kontrolę jakości posortowanych komórek za pomocą qPCR. Wreszcie, w dniu 3, zmierz ekspresję genów w posortowanych komórkach za pomocą mikroprzepływowego qPCR. Rysunek 1 podsumowuje wymagane kroki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie z wyprzedzeniem

  1. Wybierz do 96 interesujących nas genów, których ekspresja będzie mierzona.
    UWAGA: Co najmniej jeden z tych genów powinien być "genem porządkowym", takim jak ACTB lub GAPDH, o którym wiadomo, że ulega ekspresji na stosunkowo wysokim i stałym poziomie w warunkach zastosowanych w eksperymencie. Gen ten zostanie wykorzystany do identyfikacji dodatnio posortowanych studzienek (krok 8.1) i amplifikowanych próbek (krok 10.1).
    UWAGA: W przykładowym eksperymencie wybrano dobrze scharakteryzowane, bezpośrednie cele p53 z różnymi znanymi funkcjami11,14 i GAPDH jako kontrolkę porządkowania. Proszę zapoznać się z Bibliografią 11, aby zapoznać się z pełną listą docelowych genów i sekwencji starterów użytych w tym badaniu.
  2. Zidentyfikuj potencjalne pary starterów specyficzne dla interesujących genów (np. korzystając z literatury naukowej lub narzędzia do projektowania starterów, takiego jak Primer-BLAST)15. Zlecić syntezę starterów i utrzymywać je w podstawowym stężeniu 100 μM w wodzie wolnej od nukleaz.
    UWAGA: Te podkłady powinny mieć długość 15-25 zasad; wytwarzać amplikon o długości 90-130 par zasad (bp); objąć złącze eksonowe, jeśli takie istnieje, aby zmniejszyć szansę na amplifikację genomowego DNA; mają temperaturę topnienia 60 ± 1 °C; i mają minimalną drugorzędną strukturę16. Te startery zostaną wykorzystane do zapoczątkowania odwrotnej transkrypcji, amplifikacji cDNA z interesujących transkryptów i pomiaru ekspresji genów w qPCR na bazie barwnika wiążącego DNA.
  3. Zweryfikuj startery.
    1. Najpierw uzyskaj cDNA z interesujących komórek. Zbierz RNA z komórek za pomocą zestawu do zbierania RNA zgodnie z instrukcjami producenta lub standardowymi metodami biologii molekularnej17. Odwrotna transkrypcja RNA na cDNA za pomocą zestawu do odwrotnej transkrypcji z losowymi heksamerami zgodnie z instrukcjami producenta lub standardowymi metodami17.
    2. Dla każdej pary starterów należy skonfigurować qPCR z mieszanką główną barwnika wiążącego DNA, starterami do przodu i do tyłu oraz cDNA z poprzedniego kroku, postępując zgodnie z zaleceniami producenta mieszanki głównej dotyczącymi sugerowanych warunków reakcji. Przeprowadź te reakcje na maszynie do PCR w czasie rzeczywistym, korzystając z protokołu cykli termicznych zalecanego przez producenta mieszanki głównej, który obejmuje akwizycję krzywej topnienia.
    3. Po qPCR uruchom amplifikowane próbki DNA na 2% w/v żelu agarozowym i zwizualizuj DNA za pomocą barwnika interkalacyjnego DNA zgodnie ze standardowym protokołem17.
    4. Określ wydajność pary starterów, konstruując krzywą wzorcową z szeregowych rozcieńczeń cDNA (wykonanych w kroku 1.3.1) zgodnie ze standardowym protokołem16.
      UWAGA: Dobra para starterów da krzywą topnienia z pojedynczym, dobrze zdefiniowanym pikiem i pojedynczym pasmem w oczekiwanym miejscu na gel16,17 (Rysunek 2). Jeśli krzywa topnienia ma wiele pików lub "ramię", lub jeśli żel ma wiele pasm lub rozmaz, startery wzmacniają sekwencję poza celem. Przeprojektuj wszystkie zaobserwowane startery w celu amplifikacji sekwencji poza celem i w razie potrzeby powtórz poprzednie kroki walidacji. Dobra para starterów będzie miała również sprawność 90-110%, przy czym R2 ≥0,985 dla krzywej standardowej16; przeprojektować wszystkie podkłady, dla których sprawność lub R2 mieszczą się poza tymi zakresami.
  4. Przygotuj wzorce z oczyszczonych amplikonów DNA.
    1. Dla każdej zwalidowanej pary starterów:
      1. Amplifikuj obszar zainteresowania z cDNA za pomocą polimerazy DNA o wysokiej wierności zgodnie z zaleceniami producenta polimerazy dotyczącymi stężeń startera i matrycowego DNA, warunków reakcji i warunków cyklicznych PCR lub przy użyciu standardowego protokołu PCR17.
      2. Uruchom amplifikowane cDNA na 2% w/v żelu agarozowym i zwizualizuj pasmo za pomocą barwnika interkalacyjnego DNA17. Za pomocą czystej żyletki należy wyciąć pasmo reprezentujące amplikon i umieścić kawałek żelu w probówce do mikrowirówki.
      3. Oczyść amplikon z żelu za pomocą standardowej procedury ekstrakcji żelu, takiej jak ekstrakcja na bazie agarazy17 lub zestaw do ekstrakcji żelu z kolumną wirową, zgodnie z instrukcjami producenta.
      4. Zmierz stężenie amplikonu za pomocą zestawu do kwantyfikacji dsDNA na bazie fluorescencji zgodnie z instrukcjami producenta. Podzielić zmierzone stężenie dsDNA przez znaną masę cząsteczkową amplikonu na podstawie sekwencji amplikonu, aby uzyskać liczbę cząsteczek amplikonu na μl.
      5. W probówce o niskiej zawartości wiązania o pojemności 2,0 ml dodać 2 μl oczyszczonego amplikonu do objętości buforu zawiesiny DNA tak, aby końcowe stężenie amplikonu wynosiło 5 x 108 cząsteczek/μl.
    2. Gdy wszystkie amplikony zostaną oczyszczone, połączyć 18 μl każdego oczyszczonego amplikonu w probówce mikrowirówkowej o pojemności 2,0 ml o niskiej wiązalności. Dodać bufor zawiesiny DNA, aby uzyskać całkowitą objętość 1 800 μl; Zatem stężenie każdego amplikonu wynosi 5 x 106 cząsteczek/μl.
      UWAGA: Ta mieszanina, która zawiera amplikony cDNA ze wszystkich interesujących genów w znanych ilościach równomolowych, będzie służyć jako standard w qPCR pojedynczej komórki.
    3. Dokładnie wymieszaj ten wzorzec "5e6", wiruj przez 10 sekund przy 2,000 x g i podziel na 20 μl porcji w probówkach PCR o niskiej wiązalności. Przechowywać podwielokrotności w temperaturze -80 °C.
  5. Przygotuj mieszankę starterów do specyficznego wzmocnienia docelowego (STA) (10x).
    1. W stożkowej probówce o pojemności 15 ml wymieszaj 25 μl każdego 100 μM startera podstawowego (do 192). Dodaj bufor zawiesiny DNA, aby uzyskać całkowitą objętość 5,000 μl.
      UWAGA: Stężenie każdego startera w tej mieszaninie wynosi 500 nM. Każda płytka posortowanych komórek zużyje 105,6 μl tej mieszanki starterów do zapoczątkowania odwrotnej transkrypcji i specyficznej amplifikacji docelowej. Podana tutaj objętość mieszanki podkładowej wystarcza do przygotowania 45 płytek do sortowania. Wskazane jest przygotowanie wystarczająco dużej objętości mieszanki podkładowej, aby można ją było wykonać tylko raz; W razie potrzeby skaluj woluminy.
    2. Dokładnie wymieszać przez wirowanie, podzielić na 110 μl porcji i przechowywać porcje w temperaturze -20 °C.
  6. Przygotować mieszaniny testowe, po jednej na każdą parę starterów, do użycia w qPCR na bazie chipów mikroprzepływowych.
    1. W każdym dołku 96-dołkowej płytki do PCR połącz 3,0 μl 100 μM startera do przodu dla danego genu, 3,0 μl odpowiedniego startera odwrotnego 100 μM, 24,0 μl buforu zawiesiny DNA i 30,0 μl odczynnika ładującego 2x test
      2. .
    2. Wirować tę płytkę, wirować przez 10 sekund w temperaturze 500 x g i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  7. Utwórz dwa programy cykli termicznych: RTSTA (odwrotna transkrypcja i specyficzne wzmocnienie docelowe; Tabela 1) i EXOI (leczenie egzonukleazą I; Tabela 2).

2. Leczenie

  1. Umieść komórki ssaków na szalce do hodowli tkankowej w taki sposób, aby rosły do pożądanego zbiegu w czasie leczenia, w zależności od warunków badania eksperymentalnego. Dla przykładu przedstawionego w tym badaniu, płytka 4 x 105 MCF-7 p53-Komórki Wenus < sup class = "xref">18 na 6 cm naczynie w RPMI z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 100 U/ml penicyliny, 100 mg / ml streptomycyny i 250 ng / ml amfoterycyny B. Inkubuj komórki przez dwa dni w temperaturze 37 °C z 5% CO2 , aż osiągną 50% zgrywy.
  2. Potraktuj komórki, aby ustalić stan zainteresowania na podstawie badania eksperymentalnego. W przykładzie przedstawionym w tym badaniu inkubuj komórki MCF-7 p53-Venus z 400 ng / ml neokarzynostatyny przez 3 godziny, 8,5 godziny, 14 godzin lub 24 godziny.

3. Przygotowanie buforu do lizy do sortowania komórek

UWAGA: Przygotowanie pojedynczej płytki buforu do lizy zajmuje około 1 godziny. Wskazane jest wykonanie i sortowanie wielu płytek, ponieważ sortowanie komórek może być nieefektywne i prowadzić do powstania wielu studzienek bez wykrywalnej komórki.

  1. Wyczyść stół, pipety, stojak na probówki, uchwyty na zimne płytki PCR i rękawiczki roztworem odkażającym DNA, przygotowując się do PCR.
  2. Rozcieńczyć inhibitor RNAzy do 2,64 U/μl, dodając podstawowy inhibitor RNAzy do wody wolnej od nukleaz w probówce o pojemności 1,5 ml.
    UWAGA: Pozwala to na dodanie inhibitora RNAzy do buforu do lizy bez pipetowania objętości sub-μl.
  3. Sporządzić bufor do lizy dla komórek, łącząc składniki wymienione w tabeli 3.
  4. Przenieś 92,4 μl buforu do lizy dla komórek do oddzielnej probówki; będzie to bufor do lizy dla wzorców amplikonów.
  5. Używając słabo wiążących końcówek do pipet i probówek do mikrowirówek, przygotuj 200 μl i 500 μl DNA E. coli rozcieńczonego odpowiednio do 3,1 pg/μl i 6,2 pg/μl z buforem zawiesiny DNA.
  6. Dodać 184,8 μl 3,1 pg/μl DNA E. coli do buforu do lizy komórek.
    UWAGA: DNA nosiciela E. coli służy do poszerzenia zakresu niespecyficznych możliwości wiązania starterów, a tym samym zmniejszenia prawdopodobieństwa, że dimeryzacja starterów doprowadzi do produktu PCR.
  7. Przygotuj standardy.
    1. Oznaczyć sześć probówek do mikrowirówek o niskim poziomie wiązania jako 5e5, 5e4, ... 5e0.
    2. Dodać 90 μl buforu zawiesiny DNA do probówki "5e5".
    3. Dodaj 90 μl 6,2 pg/μl DNA E. coli do każdej z pozostałych pięciu probówek. Trzymaj wszystkie probówki na lodzie.
      UWAGA: Włączenie nośnego DNA do wzorców sprawia, że całkowita masa DNA w studzienkach wzorcowych jest porównywalna z masą w studzienkach 1-komórkowych; Zmniejsza to prawdopodobieństwo, że na stężenie wzorców będzie miało wpływ wiązanie DNA z probówkami lub końcówkami pipet.
    4. Pobrać podwielokrotność wzorca "5e6" (5 x 106 cząsteczek/μl każdego amplikonu, przygotowanego w kroku 1.4) z magazynu. Krótko odwirować i krótko odwirować (5 sekund przy 500 x g), aby upewnić się, że płyn znajduje się na dnie rurki.
    5. Za pomocą słabo wiążącej końcówki do pipety dodać 10 μl wzorca 5e6 do probówki "5e5". Krótko wirować, wirować (5 sekund przy 500 x g) i odłożyć rurkę z powrotem na lód.
    6. Odpipetować 10 μl z probówki "5e5" do probówki "5e4". Krótko wirować, wirować (5 sekund przy 500 x g) i odkładać z powrotem na lód.
    7. Powtarzać te seryjne rozcieńczenia, przy czym każda probówka otrzymuje 10 μl z poprzedniej probówki, aż wszystkie probówki będą miały rozcieńczony wzorzec.
  8. Przygotuj rząd 12 probówek do PCR z nakrętkami. Rozprowadź 67 μl buforu do lizy "komórek" do każdej probówki. Zakryj probówki i w razie potrzeby krótko odkręć (5 sekund przy 500 x g).
  9. Za pomocą 12-kanałowej pipety rozprowadzić 9 μl "komórkowego" buforu do lizy z rzędu probówek do PCR do każdego dołka z pierwszych 7 rzędów płytki PCR (rysunek 3).
  10. Rozprowadzić 7 μl "standardowego" buforu do lizy do każdego dołka w ostatnim rzędzie płytki (rysunek 3).
  11. Używając słabo wiążących końcówek do pipet, dodaj 2 μl wzorca do każdego dołka w dolnym rzędzie zgodnie z mapą płytek (Rysunek 3).
    UWAGA: 2 μl 5 x 100 cząsteczek/μl wzorca to 10 cząsteczek itd.
  12. Dodaj 2 μl 3,1 pg/μl DNA E. coli do studzienek 10-komórkowych i 100-komórkowych; dodaj 2 μl 6,2 pg/μl DNA E. coli do studzienek bezkomórkowych.
    UWAGA: Każda studzienka 1-komórkowa, 10-komórkowa i 100-komórkowa ma 6,2 pg DNA E. coli, co jest przybliżeniem masy genomowego DNA w pojedynczej komórce ludzkiej. Każda studzienka standardowa i bezkomórkowa ma 12,4 pg DNA E. coli, czyli około dwóch komórek ludzkich.
  13. Uszczelnić płytkę za pomocą sterylnego uszczelnienia termicznego, wirować przez 5 sekund w temperaturze 500 x g i przechowywać w temperaturze 4 °C, aż komórki będą gotowe do sortowania.

4. Ustawienia sortowania komórek

  1. Zaprogramować aktywowany fluorescencją sortownik komórek tak, aby sortował na 96-dołkową płytkę zgodnie z mapą płytki (ryc. 3); żadne komórki nie powinny być sortowane do studzienek H1-H8 lub H11-H12.
  2. Sprawdź, czy sortownik komórek jest dobrze ustawiony do sortowania na płytce PCR.
    1. Ustaw kąt strumienia sortowania na możliwie najmniejsze minimum; to ustawienie zwiększa szansę, że komórki zostaną posortowane na dnie studni, a nie uderzą w boki.
    2. Aby wycelować maszynę, uszczelnij pustą płytkę PCR i użyj strumienia testowego do "sortowania" kropelek PBS na plombie pustej płytki, zgodnie z instrukcjami maszyny19; kropelki powinny wylądować na powierzchni uszczelki w pozycji powyżej środka studni. Aby uzyskać najlepsze wyniki, sprawdź celowanie na całej długości i szerokości płytki.
    3. Jeśli kropelki nie wylądują we właściwej pozycji, zetrzyj je z powierzchni uszczelki, ponownie skalibruj sortownik komórek zgodnie z instrukcjami producenta maszyny i powtarzaj, aż kropelki w strumieniu sortowania zostaną prawidłowo osadzone.

5. Zbieranie i sortowanie komórek

  1. Trypsynizuj komórki zgodnie z potrzebami linii komórkowej. Na przykład w przypadku komórek MCF-7 należy odessać pożywkę z komórek, przepłukać komórki 1 ml 0,05% trypsyny i inkubować komórki z 2 ml 0,05% trypsyny przez 5 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  2. Dodać 8 ml pożywki do hodowli komórkowych do trypsynizowanych komórek i przenieść wszystkie 10 ml zawiesiny komórkowej do probówki o pojemności 15 ml. Wirować przez 4 minuty przy 400 x g.
  3. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w PBS + 2% FBS.
    UWAGA: Mniejsza objętość resuspension powoduje koncentrację komórek i ułatwia sortowanie komórek; Objętość do ponownego zaparcia 500 μl dobrze sprawdza się w przypadku 6-centymetrowej płytki komórek przy 50% zlewności.
  4. Przenieść zawiesinę komórek do probówki do cytometrii przepływowej o pojemności 5 ml, pipetując przez filtr 40 μm w celu usunięcia grudek komórek.
  5. Odwirować płytkę buforu do lizy o sile 400 x g przez 30 sekund w temperaturze 4 °C przed sortowaniem komórek w celu upewnienia się, że ciecz znajduje się na dnie studzienek.
  6. Włóż probówkę z zawiesiną komórek do sortera komórek. Otwórz uszczelkę na płytce buforu do lizy i ostrożnie posortuj interesujące komórki na płytce zgodnie z mapą płytki i postępując zgodnie z instrukcjami producenta sortera komórek19. Aby upewnić się, że pojedyncze komórki są sortowane z maksymalną czystością, uruchom maszynę w trybie "pojedynczej komórki" i użyj standardowego bramkowania cytometrii przepływowej opartego na rozproszeniu do przodu i na bok19.
    UWAGA: W przykładowym eksperymencie bramkuj komórki w oparciu o fluorescencję p53-Venus, aby wyizolować najjaśniejsze 15% pojedynczych komórek11.
  7. Uszczelnić płytkę nową, sterylną uszczelką termiczną i odwirować przy 400 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C. Umieścić płytkę w termocyklerze i uruchomić program RTSTA (patrz krok 1.7).
    UWAGA: Powoduje to odwrotną transkrypcję mRNA z posortowanych komórek, a następnie amplifikację cDNA interesujących nas transkryptów.

6. Leczenie egzonukleazą

  1. Wymieszać rozcieńczoną egzonukleazę I, łącząc składniki wymienione w tabeli 4. Przygotuj rząd 12 probówek do PCR z nakrętkami. Rozprowadź 30,5 μl rozcieńczonej egzonukleazy I do każdej probówki. Zakręć probówki i krótko wiruj (5 sekund przy 500 x g), aby upewnić się, że płyn znajduje się na dnie probówki.
  2. Po zakończeniu RTSTA obracać płytkę próbki przez 5 sekund przy 500 x g. Za pomocą 12-kanałowej pipety rozprowadzić 3,6 μl rozcieńczonej egzonukleazy I do każdego dołka płytki.
  3. Uszczelnij płytkę sterylnym uszczelnieniem termicznym i krótko wiruj (5 sekund przy 500 x g). Umieść płytkę w termocyklerze i uruchom program EXOI (patrz krok 1.7).
    UWAGA: Ten krok degraduje wszelkie startery pozostałe po określonej amplifikacji docelowej, tak aby nie zakłócały przyszłego PCR.

7. Rozcieńczenie próbki

  1. Po zakończeniu obróbki egzonukleazą dodać 32,4 μl buforu TE do każdego dołka płytki z próbką; jest to opcjonalny punkt zatrzymania, a próbki mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C przez kilka dni.

8. Sortuj kontrolę jakości za pomocą qPCR

UWAGA: Ponieważ sortowanie komórek nie jest idealnie efektywne, ten krok jest konieczny do określenia, które dołki na posortowanej płycie faktycznie otrzymały komórkę. Próbki te można następnie wykorzystać do dalszej analizy.

  1. Zmierzyć ekspresję genów porządkowych w każdej próbce za pomocą qPCR.
    1. Przygotować 900 μl barwnika wiążącego DNA qPCR master mix dla 96 reakcji zgodnie z protokołem producenta polimerazy przy użyciu starterów dla jednego z genów porządkowych wybranych w kroku 1.1; dokładne stężenia buforu reakcyjnego, polimerazy, starterów itp. dla tej reakcji będą zależeć od konkretnej użytej polimerazy.
    2. Rozprowadzić 9 μl mieszanki wzorcowej do każdego dołka 96-dołkowej płytki PCR. Dodać 1 μl próbki z płytki do pobierania próbek do odpowiedniego dołka na płytce do PCR.
    3. Uruchom płytkę na maszynie do PCR w czasie rzeczywistym, korzystając z protokołu cykli termicznych sugerowanego przez producenta mieszanki wzorcowej lub zgodnie ze standardowym protokołem20.
  2. Przeanalizuj dane qPCR20; przykład danych qPCR z kroków kontroli jakości sortowania wymienionych poniżej pokazano na rysunku 4.
    1. Sprawdź, czy pomiary z dołków bezkomórkowych wykazują niski (tła) poziom ekspresji genów lub brak ekspresji w ogóle.
    2. Sprawdź, czy pomiary z dołków 1-komórkowych wyraźnie dzielą się na dwie grupy: próbki dodatnie z wysoką ekspresją genów i próbki ujemne z poziomami ekspresji tła lub bez ekspresji, podobnie jak w przypadku studzienek bezkomórkowych.
      UWAGA: Próbki o wysokiej ekspresji genów reprezentują rzeczywiste posortowane komórki; te, które wyrażają się w tle, powinny być wyłączone z dalszej analizy.
    3. Sprawdź, czy pomiary z dołków 10-komórkowych i 100-komórkowych odzwierciedlają wyższą ekspresję genów niż w dodatnich studzienkach 1-komórkowych, dopuszczając możliwość, że nieefektywne sortowanie może spowodować, że te studzienki będą miały mniej komórek niż pożądane.
    4. Sprawdzić, czy pomiary ze studzienek wzorcowych są równomiernie rozłożone w przestrzeni logarytmicznej (tj. czy wartości Ct są równomiernie rozłożone).
  3. Po zidentyfikowaniu wszystkich dodatnich próbek 1-komórkowych wykonaj mapę płytkową "Sample Mixes", aby odwzorować dodatnie próbki 1-komórkowe na nowej 96-dołkowej płytce. Uwzględnij osiem studni dla standardów na tej mapie płytowej. Zobacz rysunek 5, aby zapoznać się z przykładem.

9. Pomiar ekspresji genów za pomocą mikroprzepływowego qPCR

UWAGA: Na każdym kroku w tej sekcji, pipetuj tylko do pierwszego punktu, aby zminimalizować powstawanie pęcherzyków w odczynnikach.

  1. Otwórz rząd 8 probówek do PCR. Jeśli jest wiele płytek z próbkami, otwórz drugi rząd 8 probówek do PCR i oznacz probówki jako 1-8. Ten wiersz będzie dotyczył poolingu standardów z wielu tablic.
  2. W probówce o pojemności 1,5 ml wymieszaj 360 μl barwnika wiążącego DNA qPCR master mix z 36 μl odczynnika ładującego próbkę barwnika wiążącego DNA. Krótko wirować i wirować przez 10 sekund przy 2,000 x g. Podzielić tę mieszaninę (396 μl) na nieoznakowany rząd 8 probówek PCR, umieszczając 48 μl w każdej probówce.
  3. Za pomocą pipety 8-kanałowej rozprowadź 3,3 μl mieszaniny odczynnika głównego mieszania/próbki ładującej do każdej studzienki nowej 96-dołkowej płytki do PCR. Oznacz tę tabliczkę jako "Sample Mixes".
  4. Dla każdej płytki PCR z próbkami:
    1. Wirować płytkę przez 10 sekund i wirować przez 10 sekund przy 500 x g. Zdjąć pokrywę i przenieść 2,7 μl każdej dodatniej próbki 1-komórkowej do odpowiedniego dołka na płytce do mieszania próbek dla studzienek 1-komórkowych wskazanych na mapie płytki.
    2. Jeżeli jest tylko jedna płytka z próbkami, przenieść 2,7 μl każdego amplifikowanego wzorca do odpowiadającego mu dołka na płytce do mieszania próbek zgodnie z mapą płytki.
    3. Jeżeli istnieje wiele płytek z próbkami, przenieść 2,7 μl każdego amplifikowanego wzorca do odpowiedniego miejsca w oznaczonym rzędzie probówek do PCR. Dodaj wzorce z bieżącej płyty z próbkami do wszystkich wzorców, które już tam są. Po zakończeniu uszczelnij płytkę z próbkami za pomocą folii uszczelniającej.
  5. W przypadku kilku płytek z próbkami:
    1. Wirować rząd probówek PCR zawierających wzorce przez 10 sekund i wirować przez 10 sekund przy 2,000 x g. Przenieść 2,7 μl z każdej probówki z mieszanymi wzorcami do odpowiedniego dołka na płytce Sample Mixes zgodnie z mapą płytki.
  6. Załaduj studnie NTC 2,7 μl wody wolnej od nukleaz w miejscu wskazanym na mapie płytowej. Uszczelnić płytkę z mieszankami próbek i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu, gdy będzie potrzebna.
  7. Odklej naklejkę od spodu nowego mikroprzepływowego chipa qPCR. Używając strzykawki z płynem z przewodu kontrolnego z nadal założoną nasadką, wciśnij każdą sprężynę akumulatora, aby ją poluzować, i wstrzyknij do każdego akumulatora 150-200 μl płynu z przewodu kontrolnego.
  8. Włóż chip do maszyny ładującej i uruchom skrypt "Prime". Trwa to ~20 min.
  9. Po zakończeniu zalewania należy odwirować i odwirować płytki mieszanin testowych (przygotowanych w kroku 1.6) i mieszanin próbek.
  10. Za pomocą pipety 8-kanałowej przenieś 4,5 μl każdej mieszanki testowej na lewą stronę mikroprzepływowego chipa qPCR zgodnie ze schematem na rysunku 6. Pipetować bardzo ostrożnie, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza na dnie studzienek. Po zakończeniu zamknąć płytkę z mieszankami testowymi i przechowywać w temperaturze -20 °C do wykorzystania w przyszłości.
  11. Przenieść 4,5 μl każdej mieszaniny próbek na prawą stronę mikroprzepływowego chipa qPCR zgodnie z rysunkiem 6. Włóż chip do maszyny ładującej i uruchom skrypt "Load Mix". Trwa to ~90 min.
  12. Włącz mikroprzepływową maszynę do PCR w czasie rzeczywistym, uruchom oprogramowanie do zbierania danych i włącz lampę, aby ją rozgrzać. Trwa to ~20 min.
  13. Po zakończeniu skryptu Load Mix sprawdź, czy w poprzek układu nie ma żadnych linii - wskazywałoby to na problem z ładowaniem. Ostrożnie usuń wszelkie cząsteczki kurzu z chipa za pomocą taśmy klejącej lub taśmy laboratoryjnej. Włóż chip do mikroprzepływowej maszyny do PCR w czasie rzeczywistym i uruchom skrypt zbierania danych. Użyj oprogramowania analitycznego, aby sprawdzić wyniki i wyeksportować dane do dalszej analizy.

10. Analiza danych

  1. Usuń pomiary, dla których krzywe amplifikacji qPCR wykazują słabą jakość (tj. dla których krzywe nie przypominają standardowej krzywej amplifikacji sigmoidalnej)20.
  2. Usuń próbki z więcej niż 30 pomiarami niskiej jakości lub zerowymi pomiarami lub dla których ekspresja genów porządkowych (patrz krok 1.1) jest znacznie niższa niż w przypadku większości innych próbek (Figura 7).
  3. Dla każdego genu należy oszacować prawidłową lokalizację piku topnienia jako medianę lokalizacji pików topnienia z każdej próbki. Jeśli w pomiarze pik topnienia znajduje się w odległości większej niż 1 °C od mediany, należy usunąć ten pomiar z rozważań20.
  4. Dla każdego genu utwórz krzywą standardową, aby oszacować liczbę mRNA w każdej próbce za pomocą arkusza kalkulacyjnego lub języka skryptowego20.
    UWAGA: Standardy w tym eksperymencie składają się z 10, 100, 1000 lub 10 000 cząsteczek dsDNA odpowiadających każdemu interesującemu nas transkryptowi. Gdyby odwrotna transkrypcja była całkowicie wydajna, standardy odpowiadałyby 20, 200, 2000 i 20 000 cząsteczek mRNA, ponieważ mRNA i cDNA są jednoniciowe. W praktyce tak nie jest, dlatego pomiary wyrażamy jako oszacowanie w jednostkach cząsteczek × ERT, gdzie ERT to wydajność odwrotnej transkrypcji.
    1. Dla każdej studzienki wzorcowej zidentyfikuj m, liczbę cząsteczek ssDNA (dwukrotność liczby cząsteczek dsDNA) przed amplifikacją (np. 20 cząsteczek, 200 cząsteczek itp.).
    2. Dla każdej studzienki standardowej zidentyfikuj wartość Ct z qPCR20.
    3. Z wartościami m i Ct wykonaj regresję liniową przy użyciu następującego równania, aby wygenerować krzywą standardową z parametrami a i b dla każdego genu i znajdź wartość R2 jako wskaźnik dobroci dopasowania:
      figure-protocol-1
    4. Na podstawie krzywej wzorcowej oblicz wydajność PCR E dla każdego genu:
      figure-protocol-2
      UWAGA: Wartość E znacznie większa niż 1,0 (np. E > 1,1) nie jest fizycznie realistyczna; wartość R2 dla regresji liniowej znacznie mniejsza niż 1,0 (np. R2 < 0,985) oznacza, że normy nie działają niezawodnie. Problemy te na ogół wskazują, że najniższy wzorzec amplikonu spada poniżej progu wiarygodnej kwantyfikacji, a zatem najniższy standard powinien być wyłączony z regresji liniowej. Jeśli nie można przeprowadzić odpowiedniej regresji liniowej przy użyciu co najmniej trzech unikalnych standardów, należy odrzucić pomiary ekspresji genu.
    5. Jeśli regresja liniowa jest odpowiednia, należy użyć wynikowych parametrów dopasowania a i b dla każdego genu, aby oszacować liczbę cząsteczek mRNA m est (w jednostkach cząsteczek × ERT) dla odpowiedniego genu w każdej próbce pojedynczej komórki ze zmierzonej wartości Ct:
      figure-protocol-3
    6. Oznacz dowolny pomiar mest < 1 jako mest = 0. Należy również oznaczyć każdy pomiar bez amplifikacji w qPCR, a tym samym bez wartości Ct, jako mest = 0,
      UWAGA: Pomiary, w których mest jest mniejszy niż najniższa lub większa niż najwyższa norma zastosowana w regresji, są uzyskiwane przez ekstrapolację z krzywej standardowej. Szacunki te niekoniecznie są błędne, ale należy do nich podchodzić z ostrożnością.
  5. Wizualizacja danych dotyczących ekspresji genów w pojedynczej komórce.
    1. Zrób wykres roju pszczół (Dorn, J. i Holy, T., 2012, http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/37105), w którym każdy punkt reprezentuje ekspresję genu w określonej komórce; przykład pokazano na rysunku 8.
    2. Zrób wykres skrzypiec (Dorn, J., 2012, http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/23661), na którym szerokość "skrzypiec" reprezentuje częstotliwość pomiarów ekspresji genów wokół określonego poziomu w populacji analizowanych komórek; przykład pokazano na rysunku 8.
      UWAGA: Bardziej wyrafinowane analizy mogą badać relacje w ekspresji między parami genów21,22 i mogą wnioskować o sieciach ekspresji genów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ogólny przegląd protokołu jest pokazany na rysunku 1, w tym etapy leczenia komórek, izolację pojedynczych komórek za pomocą FACS, generowanie i wstępną amplifikację bibliotek cDNA z lizatów jednokomórkowych, potwierdzanie bibliotek cDNA pojedynczej komórki w posortowanych studzienkach oraz pomiar ekspresji genów za pomocą qPCR.

W ramach przygotowań do izolacji pojedynczej komórki i analizy ekspresji genów, konie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiliśmy metodę izolowania pojedynczych komórek ssaków z populacji przylegających komórek hodowanych w kulturze i oznaczania ekspresji około 96 genów w każdej komórce. Dobre wcześniejsze przygotowanie ma kluczowe znaczenie, aby ta metoda działała dobrze. W szczególności projektowanie i testowanie par starterów specyficznych dla interesujących nas transkryptów (kroki 1.2-1.3) jest czasochłonnym, ale ważnym krokiem, ponieważ startery decydują o jakości pomiarów jednokomórkowych. Po uzyskaniu wiarygodnych par starter...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować V. Kapoor z CCR ETIB Flow Cytometry Core za pomoc w sortowaniu komórek podczas opracowywania tego protokołu. Dziękujemy również M. Raffeldowi i Jednostce Diagnostyki Molekularnej CCR LP oraz J. Zhu i NHLBI DNA Sequencing and Genomics Core za ich pomoc w przeprowadzeniu qPCR podczas opracowywania tego protokołu. Badania te były wspierane przez Program Stacjonarny NIH.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
RNeasy Plus Mini KitQiagen74134
Zestaw do odwrotnej transkrypcji cDNA o dużej pojemności z inhibitorem RNazyThermoFisher4374966
Phusion Polimeraza DNA o wysokiej wiernościNew England BioLabsM0530S
QIAquick Zestaw do ekstrakcji żeluQiagen28704
Quant-iTo wysokiej czułościThermoFisherQ33120 
2,0 ml probówki wirówkowe do mikrowirówek o niskiej przyczepności USAScientific1420-2600
Bufor zawiesinowy DNATeknovaT0221
Axygen 0,2 ml Cienkościenne probówki PCR Maxymum RecoveryCorningPCR-02-L-C
GE 96.96 Dynamiczna próbka barwnika wiążącego DNA i Test Ładowanie zestawu odczynnikówFluidigm100-3415
HyClone RPMI 1640 mediaGE Healthcare Life SciencesSH30027.01
Surowica bydlęca płodu, certyfikowana (USA)ThermoFisher16000-044
Roztwór antybiotykowo-przeciwgrzybiczyCorning30-004-CI
NeokarzinostatynaSigmaN9162
ELIMINazaDecon Labs1101
SUPERase-InThermoFisherAM2696
CellsDirect One-Step qRT-PCR KitThermoFisher11753500
E. coli DNAAffymetrix14380 10 MG
Folia uszczelniająca ThermalSeal, sterylnaExcelScientific STR-THER-PLT
BD FACSAria IIuBD Biosciences
HyClone Trypsin 0,05%GE Opieka zdrowotna Nauki przyrodniczeSH30236.01
PBS, 1xCorning21-040-CV
Falcon 40 &mikro; m Sitko komórkoweCorning352340
Egzonukleaza INew England BioLabsM0293S
SsoFast EvaGreen Supermix z niskim ROXBio-Rad172-5210
96.96 Dynamic Array IFC do ekspresji genów (mikroprzepływowy chip qPCR)FluidigmBMK-M-96.96
Kontroler IFC HX (maszyna ładująca)Fluidigm
Oprogramowanie do analizy PCR w czasie rzeczywistym BioMark lub BioMark HD (mikroprzepływowa maszyna qPCR)Fluidigm
 Oprogramowanie Fluidigm
MATLABMathWorks

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Feinerman, O., Veiga, J., Dorfman, J. R., Germain, R. N., Altan-Bonnet, G. Variability and Robustness in T Cell Activation from Regulated Heterogeneity in Protein Levels. Science. 321 (5892), 1081-1084 (2008).
  2. Spencer, S. L., Gaudet, S., Albeck, J. G., Burke, J. M., Sorger, P. K. Non-genetic origins of cell-to-cell variability in TRAIL-induced apoptosis. Nature. 459 (7245), 428-432 (2009).
  3. Geva-Zatorsky, N., Rosenfeld, N., et al. Oscillations and variability in the p53 system. Mol. Syst. Biol. 2 (1), (2006).
  4. Colman-Lerner, A., Gordon, A., et al. Regulated cell-to-cell variation in a cell-fate decision system. Nature. 437 (7059), 699-706 (2005).
  5. Chong, S., Chen, C., Ge, H., Xie, X. S. Mechanism of Transcriptional Bursting in Bacteria. Cell. 158 (2), 314-326 (2014).
  6. Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. Stochastic mRNA Synthesis in Mammalian Cells. PLoS Biol. 4 (10), e309+(2006).
  7. Senecal, A., Munsky, B., et al. Transcription Factors Modulate c-Fos Transcriptional Bursts. Cell Rep. 8 (1), 75-83 (2014).
  8. Dey, S. S., Foley, J. E., Limsirichai, P., Schaffer, D. V., Arkin, A. P. Orthogonal control of expression mean and variance by epigenetic features at different genomic loci. Mol. Syst. Biol. 11 (5), 806+(2015).
  9. Dar, R. D., Razooky, B. S., et al. Transcriptional burst frequency and burst size are equally modulated across the human genome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (43), 17454-17459 (2012).
  10. Thattai, M., van Oudenaarden, A. Stochastic gene expression in fluctuating environments. Genetics. 167 (1), 523-530 (2004).
  11. Porter, J. R., Fisher, B. E., Batchelor, E. p53 Pulses Diversify Target Gene Expression Dynamics in an mRNA Half-Life-Dependent Manner and Delineate Co-regulated Target Gene Subnetworks. Cell Syst. 2 (4), 272-282 (2016).
  12. Lahav, G., Rosenfeld, N., et al. Dynamics of the p53-Mdm2 feedback loop in individual cells. Nat. Genet. 36 (2), 147-150 (2004).
  13. Levine, A. J., Oren, M. The first 30 years of p53: growing ever more complex. Nat. Rev. Cancer. 9 (10), 749-758 (2009).
  14. Riley, T., Sontag, E., Chen, P., Levine, A. Transcriptional control of human p53-regulated genes. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (5), 402-412 (2008).
  15. Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I., Cutcutache, I., Rozen, S., Madden, T. L. Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinf. 13 (1), 134(2012).
  16. PCR Technologies: A Technical Guide. , Sigma-Aldrich. St. Louis, MO. (2014).
  17. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2001).
  18. Batchelor, E., Mock, C. S., Bhan, I., Loewer, A., Lahav, G. Recurrent initiation: a mechanism for triggering p53 pulses in response to DNA damage. Mol. Cell. 30 (3), 277-289 (2008).
  19. Flow Cytometry: Principles and Applications. , Humana Press. Totowa, NJ. (2007).
  20. Real-time PCR. , Taylor & Francis. (2006).
  21. Song, L., Langfelder, P., Horvath, S. Comparison of co-expression measures: mutual information, correlation, and model based indices. BMC Bioinf. 13 (1), 328(2012).
  22. Margolin, A. A., Nemenman, I., et al. ARACNE: An Algorithm for the Reconstruction of Gene Regulatory Networks in a Mammalian Cellular Context. BMC Bioinf. 7 (Suppl 1), (2006).
  23. Haff, L. A. Improved quantitative PCR using nested primers. PCR Methods Appl. 3 (6), 332-337 (1994).
  24. Hashimshony, T., Senderovich, N., et al. CEL-Seq2: sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq. Genome Biol. 17, 77(2016).
  25. Ronander, E., Bengtsson, D. C., Joergensen, L., Jensen, A. T. R., Arnot, D. E. Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH). J. Vis. Exp. (68), e4073(2012).
  26. Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat. Methods. 5 (10), 877-879 (2008).
  27. Lubeck, E., Cai, L. Single-cell systems biology by super-resolution imaging and combinatorial labeling. Nat. Methods. 9 (7), 743-748 (2012).
  28. Battich, N., Stoeger, T., Pelkmans, L. Image-based transcriptomics in thousands of single human cells at single-molecule resolution. Nat. Methods. 10 (11), 1127-1133 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Sortowanie FACSmikroprzep ywowe qPCRabsolutna kwantyfikacja transkrypt wbufor do lizy kom rekrozcie czenia seryjneprogram RT STAtraktowanie egzonukleaz Iprotok analizy danych

Powiązane artykuły