Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Profilowanie ekspresji genów w pojedynczej komórce za pomocą FACS i qPCR z wewnętrznymi standardami

16.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55219

⸱

25 lutego 2017

 ,  , 
1Laboratory of Pathology, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, 2Experimental Transplantation and Immunology Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy metodę sortowania pojedynczych komórek ssaków i ilościowego określania ekspresji do 96 docelowych genów w każdej komórce. Metoda ta obejmuje wykorzystanie wewnętrznych wzorców qPCR w celu umożliwienia oszacowania bezwzględnej liczby transkryptów.

Streszczenie

Pomiary ekspresji genów z dużych populacji komórek mogą przesłonić znaczną zmienność transkryptomiczną poszczególnych komórek w tych populacjach. Pomiary ekspresji genów w pojedynczej komórce mogą pomóc w ocenie roli szumu w ekspresji genów, zidentyfikować korelacje w ekspresji par genów i ujawnić subpopulacje komórek, które inaczej reagują na bodziec. W tym miejscu opisujemy procedurę pomiaru ekspresji do 96 genów w pojedynczych komórkach ssaków wyizolowanych z populacji rosnącej w hodowli tkankowej. Komórki są sortowane do buforu lizy przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS), a interesujące nas gatunki mRNA są poddawane odwrotnej transkrypcji i amplifikacji. Ekspresja genów jest następnie mierzona za pomocą mikroprzepływowej maszyny do PCR w czasie rzeczywistym, która wykonuje do 96 testów qPCR na maksymalnie 96 próbkach jednocześnie. Opisujemy również generowanie i stosowanie wzorców amplikonów PCR, aby umożliwić oszacowanie bezwzględnej liczby każdego transkryptu. W porównaniu z innymi metodami pomiaru ekspresji genów w pojedynczych komórkach, podejście to pozwala na ilościowe określenie bardziej odrębnych transkryptów niż RNA FISH przy niższych kosztach niż RNA-Seq.

Wprowadzenie

Poszczególne komórki w populacji mogą wykazywać bardzo różne reakcje na jednolity bodziec fizjologiczny1,2,3,4. Zmienność genetyczna komórek w populacji jest jednym z mechanizmów tej różnorodności reakcji, ale istnieje również kilka czynników niegenetycznych, które mogą zwiększyć zmienność odpowiedzi, nawet w klonalnej populacji komórek. Na przykład poziomy poszczególnych białek i innych ważnych cząsteczek sygnałowych mogą się różnić w zależności od komórki, co powoduje różnice w dalszych profilach ekspresji genów. Dodatkowo, aktywacja genów może zachodzić w krótkotrwałych seriach transkryptów5,6, które mogą być ograniczone do stosunkowo niewielkiej liczby transkryptów na serię7,8,9. Taka stochastyczność w aktywacji genów może w znacznym stopniu przyczynić się do zmienności odpowiedzi biologicznych i może zapewnić selektywną przewagę mikroorganizmom10 oraz w komórkach ssaków1,2 reagujących na bodziec fizjologiczny. Ze względu na zarówno genetyczne, jak i niegenetyczne źródła zmienności, profil ekspresji genów dowolnej komórki w odpowiedzi na bodziec może znacznie różnić się od średniego profilu ekspresji genów uzyskanego z pomiaru odpowiedzi masowej. Określenie zakresu, w jakim poszczególne komórki wykazują zmienność w odpowiedzi na bodziec, wymaga technik izolacji pojedynczych komórek, pomiaru poziomów ekspresji dla interesujących nas transkryptów oraz analizy obliczeniowej uzyskanych danych dotyczących ekspresji.

Istnieje kilka podejść do oznaczania ekspresji genów w pojedynczych komórkach, obejmujących szeroki zakres kosztów, liczbę badanych transkryptów i dokładność kwantyfikacji. Na przykład sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki oferuje szeroką głębokość pokrycia transkryptów i możliwość ilościowego określania tysięcy różnych transkryptów dla genów o najwyższej ekspresji w poszczególnych komórkach; Jednak koszt związany z taką głębokością sekwencjonowania może być zaporowy, chociaż koszty nadal maleją. I odwrotnie, hybrydyzacja in situ fluorescencji jednocząsteczkowego RNA (smRNA FISH) oferuje precyzyjną kwantyfikację transkryptów nawet dla genów o niskiej ekspresji przy rozsądnym koszcie na gen będący przedmiotem zainteresowania; Jednak tylko niewielka liczba genów docelowych może być oznaczona w danej komórce za pomocą tego podejścia. Ilościowe testy oparte na PCR, opisane w niniejszym protokole, zapewniają środek między tymi technikami. Testy te wykorzystują mikroprzepływową maszynę do PCR w czasie rzeczywistym do ilościowego oznaczania do 96 interesujących transkryptów jednocześnie w maksymalnie 96 komórkach. Chociaż każda z wyżej wymienionych metod wiąże się z wymaganymi kosztami sprzętu, koszt każdego indywidualnego testu qPCR jest stosunkowo niski. Protokół ten jest zaadaptowany z protokołu sugerowanego przez producenta mikroprzepływowej maszyny do PCR w czasie rzeczywistym (Protokół ADP 41, Fluidigm). Aby umożliwić oszacowanie bezwzględnej liczby każdego transkryptu w podejściu opartym na PCR, rozszerzyliśmy protokół, aby wykorzystać wewnętrzne kontrole przygotowanych amplikonów genów docelowych, które można wykorzystać w wielu eksperymentach.

Jako przykład tej techniki, opisano ilościowe oznaczanie ekspresji genów regulowanych przez supresor guza p53 w ludzkich komórkach raka piersi MCF-711. Komórki są poddawane działaniu środka chemicznego, który indukuje pęknięcia podwójnej nici DNA. Wcześniejsze badania wykazały, że odpowiedź p53 na pęknięcia dwuniciowe DNA wykazuje dużą niejednorodność w poszczególnych komórkach, zarówno pod względem poziomów p5312, jak i aktywacji odrębnych genów docelowych11. Ponadto p53 reguluje ekspresję ponad 100 dobrze scharakteryzowanych genów docelowych zaangażowanych w liczne dalsze szlaki, w tym zatrzymanie cyklu komórkowego, apoptozę i starzenie się13,14. Ponieważ odpowiedź za pośrednictwem p53 w każdej komórce jest zarówno złożona, jak i zmienna, analiza systemu korzysta z podejścia, w którym prawie 100 docelowych genów może być jednocześnie badanych w poszczególnych komórkach, takich jak opisane poniżej. Dzięki niewielkim modyfikacjom (takim jak alternatywne metody izolacji i lizy pojedynczych komórek), protokół można łatwo dostosować do badania szerokiego zakresu typów komórek ssaków, transkryptów i odpowiedzi komórkowych.

Przy odpowiednim przygotowaniu, runda sortowania komórek i pomiaru ekspresji genów może być przeprowadzona zgodnie z tym protokołem przez okres trzech dni. Sugerowany jest następujący czas: z wyprzedzeniem wybierz interesujące Cię transkrypty, zidentyfikuj i zweryfikuj pary starterów, które amplifikują cDNA z tych transkryptów, a następnie przygotuj wzorce i mieszanki starterów przy użyciu tych starterów. W dniu 1, po traktowaniu komórek, zbierz i posortuj komórki, wykonaj odwrotną transkrypcję i specyficzną amplifikację docelową, a następnie potraktuj próbki egzonukleazą w celu usunięcia niewbudowanych starterów. W dniu 2 przeprowadź kontrolę jakości posortowanych komórek za pomocą qPCR. Wreszcie, w dniu 3, zmierz ekspresję genów w posortowanych komórkach za pomocą mikroprzepływowego qPCR. Rysunek 1 podsumowuje wymagane kroki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie wstępne

  1. Wybierz maksymalnie 96 genów docelowych, których ekspresja będzie mierzona.
    UWAGA: Przynajmniej jeden z tych genów powinien być „genem referencyjnym” (housekeeping gene), takim jak ACTB lub GAPDH, o znanej względnie wysokiej i stałej ekspresji w warunkach stosowanych w eksperymencie. Gen ten zostanie wykorzystany do identyfikacji poprawnie posortowanych studzienek (krok 8.1) oraz zamplifikowanych próbek (krok 10.1).
    UWAGA: W eksperymencie przykładowym wybrano dobrze scharakteryzowane bezpośrednie cele p53 o różnych znanych funkcjach11,14 oraz GAPDH jako kontrolę referencyjną. Pełna lista genów docelowych i sekwencji starterów użytych w tym badaniu znajduje się w publikacji nr 11.
  2. Zidentyfikuj potencjalne pary starterów specyficznych dla genów docelowych (np. korzystając z literatury naukowej lub narzędzia do projektowania starterów, takiego jak Primer-BLAST)15. Zleć syntezę starterów i przechowuj je w stężeniu zapasowym 100 μM w wodzie wolnej od nukleaz.
    UWAGA: Startery powinny mieć długość 15–25 zasad, generować amplikon o długości 90–130 par zasad (bp), obejmować złącze eksonowe (jeśli występuje), aby zmniejszyć ryzyko amplifikacji DNA genomicznego, posiadać temperaturę topnienia 60 ± 1 °C oraz minimalną strukturę drugorzędową16. Startery te będą służyć do inicjacji odwrotnej transkrypcji, amplifikacji cDNA z transkrypty docelowego oraz pomiaru ekspresji genów w qPCR opartym na barwnikach wiążących DNA.
  3. Zwaliduj startery.
    1. Najpierw uzyskaj cDNA z wybranych komórek. Wyizoluj RNA z komórek za pomocą zestawu do izolacji RNA zgodnie z instrukcjami producenta lub standardowymi metodami biologii molekularnej17. Przeprowadź odwrotną transkrypcję RNA do cDNA przy użyciu zestawu do odwrotnej transkrypcji z losowymi heksamerami, zgodnie z instrukcjami producenta lub standardowymi metodami17.
    2. Dla każdej pary starterów przygotuj reakcję qPCR z master mixem zawierającym barwnik wiążący DNA, starterami prawym i lewym oraz cDNA z poprzedniego kroku, postępując zgodnie z zaleceniami producenta master mixu dotyczącymi warunków reakcji. Przeprowadź te reakcje w termocyklerze czasu rzeczywistego (qPCR), stosując protokół cykliczny zalecany przez producenta master mixu, obejmujący analizę krzywej topnienia.
    3. Po qPCR rozdziel zamplifikowane próbki DNA w 2% w/v żelu agarozowym i zwizualizuj DNA za pomocą barwnika interkalującego zgodnie ze standardowym protokołem17.
    4. Określ wydajność pary starterów poprzez sporządzenie krzywej wzorcowej z rozcieńczeń seryjnych cDNA (przygotowanych w kroku 1.3.1) zgodnie ze standardowym protokołem16.
      UWAGA: Dobra para starterów powinna generować krzywą topnienia z jednym, wyraźnie zdefiniowanym pikiem oraz pojedynczym prążkiem w oczekiwanym miejscu na żelu16,17 (Rycina 2). Jeśli krzywa topnienia wykazuje wiele pików lub „ramię”, a żel zawiera wiele prążków lub smugi, oznacza to, że startery amplifikują sekwencję niespecyficzną. Należy zaprojektować na nowo wszystkie startery wykazujące niespecyficzną amplifikację i w razie potrzeby powtórzyć poprzednie kroki walidacji. Dobra para starterów powinna również cechować się wydajnością 90–110% oraz współczynnikiem R2 ≥0,985 dla krzywej wzorcowej16; zaprojektuj na nowo startery, dla których wydajność lub R2 wykraczają poza te zakresy.
  4. Przygotuj standardy z oczyszczonych amplikonów DNA.
    1. Dla każdej zwalidowanej pary starterów:
      1. Zamplifikuj interesujący region z cDNA, używając polimerazy DNA o wysokiej wierności zgodnie z zaleceniami producenta polimerazy dotyczącymi stężeń starterów i matrycy DNA, warunków reakcji oraz cykli PCR, lub stosując standardowy protokół PCR17.
      2. Rozdziel zamplifikowane cDNA w 2% w/v żelu agarozowym i zwizualizuj prążek za pomocą barwnika interkalującego17. Wytnij prążek reprezentujący amplikon za pomocą czystego ostrza do żeli i umieść fragment żelu w probówce do mikrocentryfugi.
      3. Oczyść amplikon z żelu, stosując standardową procedurę ekstrakcji z żelu, taką jak ekstrakcja z użyciem agarazy17 lub zestawu do ekstrakcji z żelu z kolumienką spinową, zgodnie z instrukcją producenta.
      4. Zmierz stężenie amplikonu za pomocą zestawu do ilościowego oznaczania dsDNA opartego na fluorescencji, zgodnie z instrukcją producenta. Podziel zmierzone stężenie dsDNA przez znaną masę cząsteczkową amplikonu (wyznaczoną na podstawie jego sekwencji), aby obliczyć liczbę cząsteczek amplikonu na µl.
      5. Do probówki do mikrocentryfugi o niskiej wiązalności (low-binding) o pojemności 2,0 ml dodaj 2 µl oczyszczonego amplikonu do objętości buforu do zawiesiny DNA w taki sposób, aby końcowe stężenie amplikonu wynosiło 5 x 108 cząsteczek/µl.
    2. Po oczyszczeniu wszystkich amplikonów połącz po 18 µl każdego z nich w probówce do mikrocentryfugi o niskiej wiązalności o pojemności 2,0 ml. Dodaj bufor do zawiesiny DNA, aby uzyskać całkowitą objętość 1 800 µl; w ten sposób stężenie każdego amplikonu wyniesie 5 x 106 cząsteczek/µl.
      UWAGA: Mieszanina ta, zawierająca amplikony cDNA ze wszystkich badanych genów w znanych ilościach ekvimolarnych, będzie służyć jako standard w qPCR dla pojedynczych komórek.
    3. Dokładnie wymieszaj ten standard „5e6” na wortexie, wiruj przez 10 s przy 2 000 x g i rozdziel na aliquoty po 20 µl w probówkach PCR o niskiej wiązalności. Przechowuj aliquoty w temperaturze -80 °C.
  5. Przygotuj mieszaninę starterów do specyficznej amplifikacji celu (STA) (10x).
    1. W stożkowej probówce o pojemności 15 ml połącz po 25 µl każdego startera zapasowego o stężeniu 100 µM (do 192). Dodaj bufor do zawiesiny DNA, aby uzyskać całkowitą objętość 5 000 µl.
      UWAGA: Stężenie każdego startera w tej mieszaninie wynosi 500 nM. Do każdej płytki z posortowanymi komórkami zostanie zużyte 105,6 µl tej mieszaniny starterów w celu inicjacji odwrotnej transkrypcji i specyficznej amplifikacji celu. Podana objętość mieszaniny starterów wystarcza do przygotowania 45 płytek do sortowania. Zaleca się przygotowanie odpowiednio dużej objętości mieszaniny, aby nie trzeba było jej sporządzać wielokrotnie; w razie potrzeby należy proporcjonalnie zwiększyć objętości.
    2. Wymieszaj dokładnie na wortexie, rozdziel na aliquoty po 110 µl i przechowuj w temperaturze -20 °C.
  6. Przygotuj mieszaniny do testu (assay mixes), jedną dla każdej pary starterów, do zastosowania w qPCR opartym na chipie mikrofluidycznym.
    1. W każdej studzience płytki PCR 96-dołkowej połącz 3,0 µl startera prawego 100 µM dla danego genu, 3,0 µl odpowiadającego mu startera lewego 100 µM, 24,0 µl buforu do zawiesiny DNA oraz 30,0 µl 2x odczynnika do załadunku testu.
    2. Wymieszaj płytkę na wortexie, wiruj przez 10 s przy 500 x g i przechowuj w temperaturze -20 °C.
  7. Stwórz dwa programy cykliczne: RTSTA (odwrotna transkrypcja i specyficzna amplifikacja celu; Tabela 1) oraz EXOI (traktowanie egzonukleazą I; Tabela 2).

2. Traktowanie

  1. Wysiej komórki ssaków na szalkę do hodowli tkanek w taki sposób, aby w momencie traktowania osiągnęły pożądaną konfluencję, zależnie od warunków badania eksperymentalnego. W przykładzie przedstawionym w niniejszym badaniu wysiej 4 x 105 komórek MCF-7 p53-Venus18 na szalkę 6 cm w pożywce RPMI z dodatkiem 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 100 U/ml penicyliny, 100 mg/ml streptomycyny oraz 250 ng/ml amfoterycyny B. Inkubuj komórki przez dwa dni w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 aż do osiągnięcia 50% konfluencji.
  2. Potraktuj komórki w celu wywołania badanego stanu, zgodnie z badaniem eksperymentalnym. W przykładzie przedstawionym w niniejszym badaniu inkubuj komórki MCF-7 p53-Venus z 400 ng/ml neokarcynostatyny przez 3 h, 8,5 h, 14 h lub 24 h.

3. Przygotowanie buforu lizującego do sortowania komórek

UWAGA: Przygotowanie pojedynczej płytki z buforem lizującym zajmuje około 1 h. Zaleca się przygotowanie i sortowanie wielu płytek, ponieważ sortowanie komórek może być mało wydajne i skutkować powstaniem wielu studzienek, w których nie wykryto komórek.

  1. Oczyścić blat, pipety, statyw na probówki, chłodne uchwyty na płytki PCR oraz rękawiczki roztworem do dekontaminacji DNA w ramach przygotowania do PCR.
  2. Rozcieńczyć inhibitor RNAzy do stężenia 2,64 U/µl, dodając zapasowy inhibitor RNAzy do wody wolnej od nukleaz w probówce 1,5 ml.
    UWAGA: Pozwala to na dodanie inhibitora RNAzy do buforu lizującego bez konieczności pipetowania objętości poniżej 1 µl.
  3. Przygotować bufor lizujący dla komórek, łącząc składniki wymienione w Tabeli 3.
  4. Przenieść 92,4 µl buforu lizującego dla komórek do oddzielnej probówki; będzie to bufor lizujący dla standardów amplikonów.
  5. Używając końcówek do pipet o niskiej adsorpcji (low-binding) i probówek do mikrocentryfugi, przygotować 200 µl i 500 µl DNA E. coli rozcieńczonego odpowiednio do stężeń 3,1 pg/µl i 6,2 pg/µl w buforze do zawieszenia DNA.
  6. Dodać 184,8 µl DNA E. coli o stężeniu 3,1 pg/µl do buforu lizującego dla komórek.
    UWAGA: Nośnikowe DNA E. coli służy do rozszerzenia zakresu możliwości nieswoistego wiązania starterów, co zmniejsza prawdopodobieństwo, że dimeryzacja starterów doprowadzi do powstania produktu PCR.
  7. Przygotować standardy.
    1. Oznakować sześć probówek do mikrocentryfugi o niskiej adsorpcji jako 5e5, 5e4, … 5e0.
    2. Dodać 90 µl buforu do zawieszenia DNA do probówki „5e5”.
    3. Dodać 90 µl DNA E. coli o stężeniu 6,2 pg/µl do każdej z pozostałych pięciu probówek. Wszystkie probówki przechowywać w lodzie.
      UWAGA: Wprowadzenie nośnikowego DNA do standardów sprawia, że całkowita masa DNA w dołkach ze standardem jest porównywalna z masą w dołkach z jedną komórką; zmniejsza to prawdopodobieństwo, że na stężenie standardów wpłynie wiązanie DNA do ścianek probówek lub końcówek pipet.
    4. Wyjąć z przechowywania alikwot standardu „5e6” (5 x 106 cząsteczek/µl każdego amplikonu, przygotowany w kroku 1.4). Krótko wymieszać w wirówce typu vortex i krótko odwirować (5 s przy 500 x g), aby upewnić się, że ciecz znajduje się na dnie probówki.
    5. Używając końcówki do pipet o niskiej adsorpcji, dodać 10 µl standardu 5e6 do probówki „5e5”. Krótko wymieszać w vortexie, odwirować (5 s przy 500 x g) i ponownie umieścić probówkę w lodzie.
    6. Pipetować 10 µl z probówki „5e5” do probówki „5e4”. Krótko wymieszać w vortexie, odwirować (5 s przy 500 x g) i ponownie umieścić w lodzie.
    7. Powtarzać te rozcieńczenia seryjne, dodając 10 µl z poprzedniej probówki do następnej, aż we wszystkich probówkach znajdzie się rozcieńczenie standardu.
  8. Przygotować rząd 12 probówek PCR z zakrętkami. Rozdzielić 67 µl buforu lizującego „komórkowego” do każdej probówki. Zakręcić probówki i w razie potrzeby krótko odwirować (5 s przy 500 x g).
  9. Używając pipety 12-kanałowej, rozdzielić 9 µl buforu lizującego „komórkowego” z rzędu probówek PCR do każdego dołka w pierwszych 7 rzędach płytki PCR (Rysunek 3).
  10. Rozdzielić 7 µl buforu lizującego „standardowego” do każdego dołka w ostatnim rzędzie płytki (Rysunek 3).
  11. Używając końcówek do pipet o niskiej adsorpcji, dodać 2 µl standardu do każdego dołka w dolnym rzędzie zgodnie z mapą płytki (Rysunek 3).
    UWAGA: 2 µl standardu o stężeniu 5 x 100 cząsteczek/µl odpowiada 10 cząsteczkom, itp.
  12. Dodać 2 µl DNA E. coli o stężeniu 3,1 pg/µl do dołków z 10 i 100 komórkami; dodać 2 µl DNA E. coli o stężeniu 6,2 pg/µl do dołków bez komórek.
    UWAGA: Każdy dołek z 1, 10 i 100 komórkami zawiera 6,2 pg DNA E. coli, co odpowiada masie genomicznego DNA w pojedynczej ludzkiej komórce. Każdy dołek ze standardem i dołek bez komórek zawiera 12,4 pg DNA E. coli, co odpowiada masie DNA w około dwóch ludzkich komórkach.
  13. Zapieczętować płytkę za pomocą sterylnej folii termicznej, odwirować przez 5 s przy 500 x g i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu przygotowania komórek do sortowania.

4. Konfiguracja sortera komórek

  1. Zaprogramuj sorter komórek aktywowany fluorescencją, aby sortowanie odbywało się do płytki 96-dołkowej zgodnie z mapą płytki (Rysunek 3); do dołków H1-H8 oraz H11-H12 nie należy sortować żadnych komórek.
  2. Zweryfikuj, czy sorter komórek jest odpowiednio ustawiony do sortowania do płytki PCR.
    1. Ustaw kąt strumienia sortowania na minimalny; takie ustawienie zwiększa prawdopodobieństwo, że komórki zostaną posortowane na dno dołków, a nie uderzą w ich ścianki.
    2. Aby wycelować urządzenie, zapieczętuj pustą płytkę PCR i użyj strumienia testowego, aby „posortować” krople PBS na uszczelkę pustej płytki, zgodnie z instrukcją obsługi urządzenia19; krople powinny spadać na powierzchnię uszczelki w pozycji nad środkiem dołka. Aby uzyskać najlepsze rezultaty, zweryfikuj celność wzdłuż całej długości i szerokości płytki.
    3. Jeśli krople nie spadają w odpowiednie miejsce, wytrzyj je z powierzchni uszczelki, ponownie skalibruj sorter komórek zgodnie z instrukcjami producenta i powtarzaj czynność do momentu, aż krople ze strumienia sortowania będą osadzane prawidłowo.

5. Zbiór i sortowanie komórek

  1. Poddać komórki trypsynizacji zgodnie z wymaganiami danej linii komórkowej. Na przykład w przypadku komórek MCF-7 należy odessać pożywkę, przepłukać komórki 1 ml 0,05% trypsyny, a następnie inkubować je z 2 ml 0,05% trypsyny przez 5 min w temperaturze 37 °C i 5% CO2.
  2. Do trypsynizowanych komórek dodać 8 ml pożywki do hodowli komórkowych i przenieść całą 10 ml zawiesiny komórkowej do probówki 15 ml. Wirować przez 4 min przy 400 x g.
  3. Odessać nadosad i resuspendować osad komórkowy w PBS + 2% FBS.
    UWAGA: Mniejsza objętość resuspensji pozwala na zagęszczenie komórek i ułatwia ich sortowanie; objętość resuspensji 500 µl jest odpowiednia dla komórek z szalki 6 cm przy 50% konfluencji.
  4. Przenieść zawiesinę komórkową do probówki do cytometrii przepływowej o pojemności 5 ml, pipetując przez filtr 40 µm w celu usunięcia skupisk komórek.
  5. Przed sortowaniem komórek wirować płytkę z buforem lizującym przy 400 x g przez 30 sek w 4 °C, aby upewnić się, że ciecz znajduje się na dnie dołków.
  6. Wstawić probówkę z zawiesiną komórkową do sortera komórkowego. Zdjąć folię z płytki z buforem lizującym i ostrożnie posortować interesujące komórki do płytki zgodnie z mapą płytki i instrukcjami producenta sortera komórkowego19. Aby zapewnić sortowanie pojedynczych komórek z maksymalną czystością, należy uruchomić urządzenie w trybie „single cell” i zastosować standardowe bramkowanie cytometrii przepływowej w oparciu o rozproszenie przednie i boczne (forward and side scatter)19.
    UWAGA: W eksperymencie przykładowym bramkowanie komórek należy przeprowadzić w oparciu o fluorescencję p53-Venus, aby wyizolować 15% najjaśniejszych pojedynczych komórek11.
  7. Zapieczętować płytkę nową, sterylną folią termiczną i wirować przy 400 x g przez 1 min w 4 °C. Umieścić płytkę w termocyklerze i uruchomić program RTSTA (patrz krok 1.7).
    UWAGA: Operacja ta przeprowadza odwrotną transkrypcję mRNA z posortowanych komórek, a następnie amplifikuje cDNA interesujących transkryptów.

6. Obróbka egzonukleazą

  1. Przygotować rozcieńczoną egzonukleazę I, łącząc składniki wymienione w Tabeli 4. Przygotować rząd 12 probówek PCR z zakrętkami. Do każdej probówki rozdzielić 30,5 µl rozcieńczonej egzonukleazy I. Zakręcić probówki i krótko wirować (5 s przy 500 x g), aby upewnić się, że ciecz znajduje się na dnie probówki.
  2. Po zakończeniu etapu RTSTA wirować płytkę z próbkami przez 5 s przy 500 x g. Za pomocą pipety 12-kanałowej rozdzielić 3,6 µl rozcieńczonej egzonukleazy I do każdego dołka płytki.
  3. Uszczelnić płytkę sterylną folią termiczną i krótko wirować (5 s przy 500 x g). Umieścić płytkę w termocyklerze i uruchomić program EXOI (patrz krok 1.7).
    UWAGA: Krok ten degraduje wszelkie primery pozostałe po specyficznej amplifikacji celu, aby nie zakłócały one przyszłych reakcji PCR.

7. Rozcieńczanie próbek

  1. Po zakończeniu traktowania egzonukleazą należy dodać 32,4 µl buforu TE do każdego dołka płytki z próbkami; jest to opcjonalny punkt przerwania procedury, a próbki mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C przez kilka dni.

8. Kontrola jakości sortowania za pomocą qPCR

UWAGA: Ponieważ sortowanie komórek nie jest w pełni wydajne, ten etap jest niezbędny do zidentyfikowania, które studzienki posortowanej płytki rzeczywiście otrzymały komórkę. Próbki te mogą następnie zostać wykorzystane do dalszych analiz.

  1. Zmierz ekspresję genu housekeepingowego w każdej próbce za pomocą qPCR.
    1. Przygotuj 900 µl master mixu do qPCR z barwnikiem wiążącym DNA dla 96 reakcji zgodnie z protokołem producenta polimerazy, używając starterów dla jednego z genów housekeepingowych wybranych w kroku 1.1; dokładne stężenia buforu reakcyjnego, polimerazy, starterów itp. dla tej reakcji będą zależeć od stosowanej polimerazy.
    2. Rozdziel 9 µl master mixu do każdego dołka płytki PCR 96-dołkowej. Dodaj 1 µl próbki z płytki z próbkami do odpowiadającego jej dołka płytki PCR.
    3. Przeprowadź reakcję na urządzeniu do PCR w czasie rzeczywistym, stosując protokół cyklicznego ogrzewania i chłodzenia sugerowany przez producenta master mixu lub zgodnie ze standardowym protokołem20.
  2. Przeanalizuj dane qPCR20; przykład danych qPCR z kroków kontroli jakości sortowania wymienionych poniżej przedstawiono na Rysunku 4.
    1. Zweryfikuj, czy pomiary z dołków bez komórek wykazują niski (tła) poziom ekspresji genu lub brak ekspresji.
    2. Zweryfikuj, czy pomiary z dołków 1-komórkowych dzielą się wyraźnie na dwie grupy: próbki pozytywne z wysoką ekspresją genu oraz próbki negatywne z poziomem ekspresji tła lub całkowitym brakiem ekspresji, podobnie jak w dołkach bez komórek.
      UWAGA: Próbki z wysoką ekspresją genu reprezentują faktycznie posortowane komórki; próbki z ekspresją tła powinny zostać wykluczone z dalszych analiz.
    3. Zweryfikuj, czy pomiary z dołków 10-komórkowych i 100-komórkowych odzwierciedlają wyższą ekspresję genu niż w pozytywnych dołkach 1-komórkowych, uwzględniając możliwość, że niewydajne sortowanie mogło spowodować obecność w tych dołkach mniejszej liczby komórek niż zamierzono.
    4. Zweryfikuj, czy pomiary z dołków standardowych są równomiernie rozłożone w przestrzeni logarytmicznej (t.j. czy wartości Ct są rozłożone równomiernie).
  3. Po zidentyfikowaniu wszystkich pozytywnych próbek 1-komórkowych, stwórz mapę płytki „Sample Mixes”, aby przypisać pozytywne próbki 1-komórkowe do nowej płytki 96-dołkowej. Uwzględnij na tej mapie osiem dołków dla standardów. Przykład przedstawiono na Rysunku 5.

9. Pomiar ekspresji genów z wykorzystaniem mikroprzepływowego qPCR

UWAGA: W każdym kroku w tej sekcji pipetuj tylko do pierwszego stopnia, aby zminimalizować powstawanie pęcherzyków powietrza w odczynnikach.

  1.  Otwórz pasek 8 probówek do PCR. W przypadku wielu płytek z próbkami otwórz drugi pasek 8 probówek do PCR i ponumeruj je od 1 do 8. Ten pasek będzie służył do łączenia standardów z wielu płytek.
  2. W probówce 1,5 ml zmieszaj 360 µl qPCR master mix z barwnikiem wiążącym DNA z 36 µl odczynnika do nakładania próbek z barwnikiem wiążącym DNA. Krótko wymieszaj w wirówce typu vortex i wiruj przez 10 sec przy 2 000 x g. Podziel tę mieszaninę (396 µl) do nieoznakowanego paska 8 probówek do PCR, dozując po 48 µl do każdej probówki.
  3. Za pomocą pipety 8-kanałowej rozdziel 3,3 µl mieszaniny master mix/odczynnika do nakładania próbek do każdego dołka nowej 96-dołkowej płytki PCR. Oznacz tę płytkę jako „Sample Mixes” (Mieszaniny Próbek).
  4. Dla każdej płytki PCR z próbkami:
    1. Mieszaj płytkę w wirówce typu vortex przez 10 sec i wiruj przez 10 sec przy 500 x g. Zdejmij pokrywkę i przenieś 2,7 µl każdej pozytywnej próbki 1-komórkowej do odpowiadającego jej dołka na płytce Sample Mixes, zgodnie z dołkami dla próbek 1-komórkowych wskazanymi na mapie płytki.
    2. Jeśli dostępna jest tylko jedna płytka z próbkami, przenieś 2,7 µl każdego amplifikowanego standardu do odpowiedniego dołka na płytce Sample Mixes zgodnie z mapą płytki.
    3. Jeśli dostępnych jest wiele płytek z próbkami, przenieś 2,7 µl każdego amplifikowanego standardu do odpowiedniej pozycji w oznakowanym pasku probówek do PCR. Dodaj standardy z aktualnej płytki próbek do standardów już tam znajdujących się. Po zakończeniu szczelnie zamknij płytkę z próbkami za pomocą folii uszczelniającej.
  5. W przypadku wielu płytek z próbkami:
    1. Mieszaj pasek probówek do PCR zawierający standardy w wirówce typu vortex przez 10 sec i wiruj przez 10 sec przy 2 000 x g. Przenieś 2,7 µl z każdej probówki z mieszaniną standardów do odpowiedniego dołka na płytce Sample Mixes zgodnie z mapą płytki.
  6. Wypełnij dołki NTC 2,7 µl wody wolnej od nukleaz w miejscach wskazanych na mapie płytki. Zamknij płytkę Sample Mixes i przechowuj w temperaturze 4 °C do czasu użycia.
  7. Odklej naklejkę z dna nowego mikrofluidycznego chipa qPCR. Używając strzykawki z płynem do linii kontrolnej (z pozostawionym nakładek), naciśnij każdą sprężynę akumulatora, aby ją poluzować, a następnie wstrzyknij do każdego akumulatora 150-200 µl płynu do linii kontrolnej.
  8. Włóż chip do urządzenia do załadunku i uruchom skrypt „Prime”. Trwa to ok. 20 min.
  9. Po zakończeniu przygotowania (priming), wymieszaj w wirówce typu vortex i odwirowuj płytki z mieszaninami analizy (przygotowane w kroku 1.6) oraz mieszaninami próbek.
  10. Za pomocą pipety 8-kanałowej przenieś 4,5 µl każdej mieszaniny analizy do lewej strony mikrofluidycznego chipa qPCR zgodnie ze schematem na Ryc. 6. Pipetuj bardzo ostrożnie, aby uniknąć powstania pęcherzyków powietrza na dnie dołków. Po zakończeniu zamknij płytkę z mieszaninami analizy i przechowuj w temperaturze -20 °C do przyszłego użycia.
  11. Przenieś 4,5 µl każdej mieszaniny próbek na prawą stronę mikrofluidycznego chipa qPCR zgodnie z Ryc. 6. Włóż chip do urządzenia do załadunku i uruchom skrypt „Load Mix”. Trwa to ok. 90 min.
  12. Włącz mikrofluidyczne urządzenie do PCR w czasie rzeczywistym, uruchom oprogramowanie do gromadzenia danych i włącz lampę, aby ją rozgrzać. Trwa to ok. 20 min.
  13. Po zakończeniu skryptu Load Mix sprawdź, czy na chipie nie ma linii – ich obecność wskazywałaby na problem z załadunkiem. Ostrożnie usuń wszelkie cząstki kurzu z chipa za pomocą taśmy klejącej lub taśmy laboratoryjnej. Włóż chip do mikrofluidycznego urządzenia do PCR w czasie rzeczywistym i uruchom skrypt gromadzenia danych. Użyj oprogramowania analitycznego do sprawdzenia wyników i wyeksportuj dane do dalszej analizy.

10. Analiza danych

  1. Usuń pomiary, dla których krzywe amplifikacji qPCR wykazują niską jakość (tj. krzywe nie przypominają standardowej sigmoidalnej krzywej amplifikacji)20.
  2. Usuń próbki, które mają więcej niż 30 pomiarów o niskiej jakości lub zerowych, lub dla których ekspresja genu housekeepingowego (patrz krok 1.1) jest znacznie niższa niż w większości pozostałych próbek (Rycina 7).
  3. Dla każdego genu oszacuj prawidłowe położenie piku topnienia jako medianę położenia piku topnienia ze wszystkich próbek. Jeśli pomiar ma pik topnienia oddalony o więcej niż 1 °C od mediany, usuń ten pomiar z analizy20.
  4. Dla każdego genu stwórz krzywą wzorcową w celu oszacowania liczby cząsteczek mRNA w każdej próbce, korzystając z arkusza kalkulacyjnego lub języka skryptowego20).
    UWAGA: Wzorce w tym eksperymencie składają się z 10, 100, 1 000 lub 10 000 cząsteczek dsDNA odpowiadających każdemu analizowanemu transkryptowi. Gdyby odwrotna transkrypcja była idealnie wydajna, wzorce odpowiadałyby 20, 200, 2 000 i 20 000 cząsteczkom mRNA, ponieważ mRNA i cDNA są jednoniciowe. W praktyce tak nie jest, dlatego pomiary wyrażamy jako szacunek w jednostkach cząsteczek × ERT, gdzie ERT to wydajność odwrotnej transkrypcji.
    1. Dla każdej studzienki wzorca określ m, czyli liczbę cząsteczek ssDNA (dwukrotność liczby cząsteczek dsDNA) przed amplifikacją (np. 20 cząsteczek, 200 cząsteczek, itp.).
    2. Dla każdej studzienki wzorca określ wartość Ct z qPCR20.
    3. Wykorzystując wartości m i Ct, przeprowadź regresję liniową za pomocą następującego równania, aby wygenerować krzywą wzorcową z parametrami a i b dla każdego genu, i wyznacz wartość R2 jako wskaźnik jakości dopasowania:
      Formuła równowagi statycznej, Ct=a ln(m)+b, diagram do badań edukacyjnych nad koncepcjami logarytmicznymi.
    4. Na podstawie krzywej wzorcowej oblicz wydajność PCR E dla każdego genu:
      Równanie ilustrujące funkcję wykładniczą, E = e^(1/a) - 1, koncepcja matematyczna.
      UWAGA: Wartość E znacznie większa niż 1,0 (np. E > 1,1) nie jest realistyczna fizycznie; wartość R2 dla regresji liniowej znacznie mniejsza niż 1,0 (np. R2 < 0,985) oznacza, że wzorce nie działają wiarygodnie. Problemy te zazwyczaj wskazują, że najniższy wzorzec amplikonu spada poniżej progu wiarygodnej kwantyfikacji, w związku z czym najniższy wzorzec powinien zostać wykluczony z regresji liniowej. Jeśli nie można przeprowadzić odpowiedniej regresji liniowej przy użyciu co najmniej trzech unikalnych wzorców, odrzuć pomiary ekspresji dla danego genu.
    5. Jeśli regresja liniowa jest prawidłowa, użyj uzyskanych parametrów dopasowania a i b dla każdego genu, aby oszacować liczbę cząsteczek mRNA mest (w jednostkach cząsteczek × ERT) dla odpowiadającego genu w każdej próbce pojedynczej komórki na podstawie zmierzonej wartości Ct:
      Równanie zaniku wykładniczego, \(m_{est} = e^{\frac{c_{t}-b}{a}}\), formuła matematyczna.
    6. Każdy pomiar mest < 1 przyjmij jako mest = 0. Również każdy pomiar, w którym nie nastąpiła amplifikacja w qPCR, a tym samym brak jest wartości Ct, przyjmij jako mest = 0.
      UWAGA: Pomiary, w których mest jest mniejszy od najniższego lub większy od najwyższego wzorca użytego w regresji, są wyznaczane poprzez ekstrapolację z krzywej wzorcowej. Szacunki te nie sąkoniecznie błędne, ale należy podchodzić do nich z ostrożnością.
  5. Wizualizuj dane ekspresji genów w pojedynczych komórkach.
    1. Stwórz wykres beeswarm (Dorn, J. and Holy, T., 2012, http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/37105), w którym każdy punkt reprezentuje ekspresję genu w konkretnej komórce; przykład pokazano na Rycini 8.
    2. Stwórz wykres skrzypcowy (violin plot) (Dorn, J., 2012, http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/23661), w którym szerokość „skrzypiec” reprezentuje częstotliwość pomiarów ekspresji genu wokół danego poziomu w analizowanej populacji komórek; przykład pokazano na Rycini 8.
      UWAGA: Bardziej zaawansowane analizy mogą badać zależności w ekspresji między parami genów21,22 i mogą służyć do wnioskowania o sieciach ekspresji genów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Ogólny przegląd protokołu przedstawiono na Rysunku 1, obejmujący etapy traktowania komórek, izolacji pojedynczych komórek metodą FACS, generowania i preamplifikacji bibliotek cDNA z lizatów pojedynczych komórek, potwierdzenia obecności bibliotek cDNA pojedynczych komórek w posortowanych studzienkach oraz pomiaru ekspresji genów za pomocą qPCR.

W ramach przygotowań do izolacji pojedynczych komórek i analizy ekspr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawiliśmy metodę izolowania pojedynczych komórek ssaków z populacji przylegających komórek hodowanych w kulturze i oznaczania ekspresji około 96 genów w każdej komórce. Dobre wcześniejsze przygotowanie ma kluczowe znaczenie, aby ta metoda działała dobrze. W szczególności projektowanie i testowanie par starterów specyficznych dla interesujących nas transkryptów (kroki 1.2-1.3) jest czasochłonnym, ale ważnym krokiem, ponieważ startery decydują o jakości pomiarów jednokomórkowych. Po uzyskaniu wiarygodnych par starter...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować V. Kapoor z CCR ETIB Flow Cytometry Core za pomoc w sortowaniu komórek podczas opracowywania tego protokołu. Dziękujemy również M. Raffeldowi i Jednostce Diagnostyki Molekularnej CCR LP oraz J. Zhu i NHLBI DNA Sequencing and Genomics Core za ich pomoc w przeprowadzeniu qPCR podczas opracowywania tego protokołu. Badania te były wspierane przez Program Stacjonarny NIH.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
RNeasy Plus Mini KitQiagen74134
Zestaw do odwrotnej transkrypcji cDNA o dużej pojemności z inhibitorem RNazyThermoFisher4374966
Phusion Polimeraza DNA o wysokiej wiernościNew England BioLabsM0530S
QIAquick Zestaw do ekstrakcji żeluQiagen28704
Quant-iTo wysokiej czułościThermoFisherQ33120 
2,0 ml probówki wirówkowe do mikrowirówek o niskiej przyczepności USAScientific1420-2600
Bufor zawiesinowy DNATeknovaT0221
Axygen 0,2 ml Cienkościenne probówki PCR Maxymum RecoveryCorningPCR-02-L-C
GE 96.96 Dynamiczna próbka barwnika wiążącego DNA i Test Ładowanie zestawu odczynnikówFluidigm100-3415
HyClone RPMI 1640 mediaGE Healthcare Life SciencesSH30027.01
Surowica bydlęca płodu, certyfikowana (USA)ThermoFisher16000-044
Roztwór antybiotykowo-przeciwgrzybiczyCorning30-004-CI
NeokarzinostatynaSigmaN9162
ELIMINazaDecon Labs1101
SUPERase-InThermoFisherAM2696
CellsDirect One-Step qRT-PCR KitThermoFisher11753500
E. coli DNAAffymetrix14380 10 MG
Folia uszczelniająca ThermalSeal, sterylnaExcelScientific STR-THER-PLT
BD FACSAria IIuBD Biosciences
HyClone Trypsin 0,05%GE Opieka zdrowotna Nauki przyrodniczeSH30236.01
PBS, 1xCorning21-040-CV
Falcon 40 &mikro; m Sitko komórkoweCorning352340
Egzonukleaza INew England BioLabsM0293S
SsoFast EvaGreen Supermix z niskim ROXBio-Rad172-5210
96.96 Dynamic Array IFC do ekspresji genów (mikroprzepływowy chip qPCR)FluidigmBMK-M-96.96
Kontroler IFC HX (maszyna ładująca)Fluidigm
Oprogramowanie do analizy PCR w czasie rzeczywistym BioMark lub BioMark HD (mikroprzepływowa maszyna qPCR)Fluidigm
 Oprogramowanie Fluidigm
MATLABMathWorks

Bibliografia

  1. Feinerman, O., Veiga, J., Dorfman, J. R., Germain, R. N., Altan-Bonnet, G. Variability and Robustness in T Cell Activation from Regulated Heterogeneity in Protein Levels. Science. 321 (5892), 1081-1084 (2008).
  2. Spencer, S. L., Gaudet, S., Albeck, J. G., Burke, J. M., Sorger, P. K. Non-genetic origins of cell-to-cell variability in TRAIL-induced apoptosis. Nature. 459 (7245), 428-432 (2009).
  3. Geva-Zatorsky, N., Rosenfeld, N., et al. Oscillations and variability in the p53 system. Mol. Syst. Biol. 2 (1), (2006).
  4. Colman-Lerner, A., Gordon, A., et al. Regulated cell-to-cell variation in a cell-fate decision system. Nature. 437 (7059), 699-706 (2005).
  5. Chong, S., Chen, C., Ge, H., Xie, X. S. Mechanism of Transcriptional Bursting in Bacteria. Cell. 158 (2), 314-326 (2014).
  6. Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. Stochastic mRNA Synthesis in Mammalian Cells. PLoS Biol. 4 (10), e309+(2006).
  7. Senecal, A., Munsky, B., et al. Transcription Factors Modulate c-Fos Transcriptional Bursts. Cell Rep. 8 (1), 75-83 (2014).
  8. Dey, S. S., Foley, J. E., Limsirichai, P., Schaffer, D. V., Arkin, A. P. Orthogonal control of expression mean and variance by epigenetic features at different genomic loci. Mol. Syst. Biol. 11 (5), 806+(2015).
  9. Dar, R. D., Razooky, B. S., et al. Transcriptional burst frequency and burst size are equally modulated across the human genome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (43), 17454-17459 (2012).
  10. Thattai, M., van Oudenaarden, A. Stochastic gene expression in fluctuating environments. Genetics. 167 (1), 523-530 (2004).
  11. Porter, J. R., Fisher, B. E., Batchelor, E. p53 Pulses Diversify Target Gene Expression Dynamics in an mRNA Half-Life-Dependent Manner and Delineate Co-regulated Target Gene Subnetworks. Cell Syst. 2 (4), 272-282 (2016).
  12. Lahav, G., Rosenfeld, N., et al. Dynamics of the p53-Mdm2 feedback loop in individual cells. Nat. Genet. 36 (2), 147-150 (2004).
  13. Levine, A. J., Oren, M. The first 30 years of p53: growing ever more complex. Nat. Rev. Cancer. 9 (10), 749-758 (2009).
  14. Riley, T., Sontag, E., Chen, P., Levine, A. Transcriptional control of human p53-regulated genes. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (5), 402-412 (2008).
  15. Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I., Cutcutache, I., Rozen, S., Madden, T. L. Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinf. 13 (1), 134(2012).
  16. PCR Technologies: A Technical Guide. , Sigma-Aldrich. St. Louis, MO. (2014).
  17. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2001).
  18. Batchelor, E., Mock, C. S., Bhan, I., Loewer, A., Lahav, G. Recurrent initiation: a mechanism for triggering p53 pulses in response to DNA damage. Mol. Cell. 30 (3), 277-289 (2008).
  19. Flow Cytometry: Principles and Applications. , Humana Press. Totowa, NJ. (2007).
  20. Real-time PCR. , Taylor & Francis. (2006).
  21. Song, L., Langfelder, P., Horvath, S. Comparison of co-expression measures: mutual information, correlation, and model based indices. BMC Bioinf. 13 (1), 328(2012).
  22. Margolin, A. A., Nemenman, I., et al. ARACNE: An Algorithm for the Reconstruction of Gene Regulatory Networks in a Mammalian Cellular Context. BMC Bioinf. 7 (Suppl 1), (2006).
  23. Haff, L. A. Improved quantitative PCR using nested primers. PCR Methods Appl. 3 (6), 332-337 (1994).
  24. Hashimshony, T., Senderovich, N., et al. CEL-Seq2: sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq. Genome Biol. 17, 77(2016).
  25. Ronander, E., Bengtsson, D. C., Joergensen, L., Jensen, A. T. R., Arnot, D. E. Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH). J. Vis. Exp. (68), e4073(2012).
  26. Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat. Methods. 5 (10), 877-879 (2008).
  27. Lubeck, E., Cai, L. Single-cell systems biology by super-resolution imaging and combinatorial labeling. Nat. Methods. 9 (7), 743-748 (2012).
  28. Battich, N., Stoeger, T., Pelkmans, L. Image-based transcriptomics in thousands of single human cells at single-molecule resolution. Nat. Methods. 10 (11), 1127-1133 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Sortowanie FACSmikroprzep ywowe qPCRabsolutna kwantyfikacja transkrypt wbufor do lizy kom rekrozcie czenia seryjneprogram RT STAtraktowanie egzonukleaz Iprotok analizy danych
Profilowanie ekspresji genów w pojedynczej komórce za pomocą FACS i qPCR z wewnętrznymi standardami
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.