Artykuł metodologiczny

Ludzkie komórki dendrytyczne płuc: dystrybucja przestrzenna i identyfikacja fenotypowa w biopsjach wewnątrzoskrzelowych z wykorzystaniem immunohistochemii i cytometrii przepływowej

DOI:

10.3791/55222

⸱

20 stycznia 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Immunology and Allergy Unit, Department of Medicine Solna, Karolinska Institutet, 2Division of Medicine, Department of Public Health and Clinical Medicine, Umeå University, 3Divison of Infectious Diseases, Department of Clinical Microbiology, Umeå University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki odpornościowe rezydujące w płucach, w tym komórki dendrytyczne (DC) u ludzi, są kluczowe dla obrony przed wziewnymi patogenami i alergenami. Jednak ze względu na niedobór ludzkiej tkanki płucnej badania są ograniczone. W pracy przedstawiono protokoły przetwarzania biopsji wewnątrzoskrzelowych błony śluzowej człowieka do badania DC płuc z wykorzystaniem immunohistochemii i cytometrii przepływowej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Płuca są stale narażone na działanie środowiska zewnętrznego, które oprócz nieszkodliwych cząsteczek zawiera również patogeny, alergeny i toksyny. Aby utrzymać tolerancję lub wywołać odpowiedź immunologiczną, układ odpornościowy musi odpowiednio radzić sobie z wdychanymi antygenami. Komórki dendrytyczne płuc (DC) są niezbędne do utrzymania delikatnej równowagi, aby w razie potrzeby zainicjować odporność, nie powodując ubocznych uszkodzeń płuc z powodu przesadnej odpowiedzi zapalnej. Chociaż istnieje szczegółowe zrozumienie fenotypu i funkcji komórek odpornościowych, takich jak DC w ludzkiej krwi, wiedza na temat tych komórek w mniej dostępnych tkankach, takich jak płuca, jest znacznie bardziej ograniczona, ponieważ badania próbek ludzkiej tkanki płucnej, zwłaszcza od zdrowych osób, są rzadkie. W niniejszej pracy przedstawiono strategię generowania szczegółowej charakterystyki przestrzennej i fenotypowej DC rezydujących w tkance płucnej u zdrowych ludzi, którzy przechodzą bronchoskopię w celu pobrania próbek biopsji wewnątrzoskrzelowych. Od każdej osoby można pobrać kilka małych biopsji, które można następnie umieścić w celu ultradrobnego przekroju lub trawić enzymatycznie w celu zaawansowanej analizy cytometrii przepływowej. Przedstawione protokoły zostały zoptymalizowane w celu uzyskania maksymalnych informacji z małych próbek tkanek, które w warunkach stanu ustalonego zawierają tylko niską częstotliwość DC. Podczas gdy obecne prace koncentrują się na DC, opisane metody można bezpośrednio rozszerzyć, aby objąć inne (immunologiczne) komórki będące przedmiotem zainteresowania znajdujące się w błonie śluzowej płuc. Ponadto protokoły mają również bezpośrednie zastosowanie do próbek uzyskanych od pacjentów cierpiących na choroby płuc, w których bronchoskopia jest częścią ustalenia diagnozy, takich jak przewlekła obturacyjna choroba płuc (POChP), sarkoidoza lub rak płuc.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Płuca są w ciągłym kontakcie ze środowiskiem zewnętrznym i są bardzo narażone zarówno na nieszkodliwe cząsteczki, jak i mikroby, które mogą powodować choroby. Dlatego tak ważne jest, aby układ odpornościowy wytworzył silną odpowiedź immunologiczną przeciwko atakującym patogenom, ale równie ważne jest utrzymanie tolerancji na wdychane antygeny, które nie powodują choroby. Aby zapewnić silny nadzór immunologiczny, układ oddechowy jest wyłożony siecią komórek odpornościowych, w tym komórek dendrytycznych (DC). DC to profesjonalne komórki prezentujące antygen z unikalną zdolnością do aktywacji naiwnych limfocytów T. W ludzkich płucach rezydentne DC napotykają antygen, a następnie przetwarzają go i transportują do węzłów chłonnych drenujących płuca w celu prezentacji i aktywacji limfocytów T1,2,3.

W ludzkim układzie odpornościowym DC można podzielić na kilka podzbiorów, z różnymi, ale nakładającymi się na siebie funkcjami: CD1c+ i CD141+ mieloidalne DC (MDC) oraz CD123+ plazmocytoidalne DC (PDC)4,5. Podczas gdy najbardziej szczegółowa wiedza na temat ludzkich DC pochodzi z badań na krwi, obecnie jest oczywiste, że ludzkie płuca zawierają również rzadkie populacje podzbiorów DC o zdolności stymulacyjnej komórek T6,7,8,9. Jednak coraz więcej danych pokazuje, że komórki odpornościowe, w tym DC, różnią się częstotliwością, fenotypem i funkcją w zależności od ich anatomicznej lokalizacji10. Dlatego ważne jest, aby zbadać komórki odpornościowe z odpowiedniej tkanki, aby zrozumieć ich wkład w lokalną odporność i tolerancję. Podsumowując, podkreśla to potrzebę badania DC rezydentów płuc w przypadku chorób płuc, mimo że DC krwi są łatwiej dostępne i dostępne u ludzi.

Pierwsze badania, które badały DC rezydujące w płucach u ludzi, opierały się głównie na morfologii i ekspresji pojedynczych markerów, takich jak HLA-DR i CD11c, w skrawkach tkanek za pomocą immunohistochemii11,12,13. W przeciwieństwie do tego, nowsze badania zazwyczaj opierały się na analizach cytometrii przepływowej w celu zbadania różnych podzbiorów komórek odpornościowych. Ponieważ jednak trudno jest znaleźć pojedynczy marker powierzchni komórki, który jednoznacznie identyfikuje określony podzbiór DC, potencjalnym ograniczeniem badań z zastosowaniem tylko czterokolorowej cytometrii przepływowej jest ryzyko włączenia populacji komórek o podobnych markerach fenotypowych jak DC. Na przykład CD11c ulega ekspresji we wszystkich szpikowych DC i zdecydowanej większości monocytów. Z drugiej strony, w badaniach wykorzystujących bardziej zaawansowane panele cytometrii przepływowej, zwykle wykorzystywano nienowotworową tkankę płucną z chirurgicznych resekcji pacjentów10,14,15,16, chociaż nie jest jasne, czy te rzadkie populacje są naprawdę reprezentatywne dla DC obecnych u zdrowych osób. Ogólnie rzecz biorąc, badania są ograniczone, głównie ze względu na fakt, że chirurgicznie usunięta lub cała ludzka tkanka płucna jest rzadkością.

Aby przezwyciężyć niektóre z tych ograniczeń, ta praca opisuje, jak przeprowadzić szczegółową analizę rozkładu przestrzennego i fenotypową identyfikację DC w biopsjach wewnątrzoskrzelowych błony śluzowej uzyskanych od zdrowych ochotników, którzy przeszli bronchoskopię. Od każdej osoby można pobrać kilka małych biopsji, które następnie można umieścić w celu przekroju i analizy przy użyciu immunohistochemii lub trawić enzymatycznie w celu zaawansowanej analizy cytometrycznej przepływowej. Wykorzystanie tkanki płucnej w postaci biopsji wewnątrzoskrzelowej uzyskanej z bronchoskopii ma tę zaletę, że umożliwia przeprowadzenie badania na zdrowych ochotnikach, w przeciwieństwie do otwartej chirurgii płuc, która z oczywistych względów jest ograniczona do pacjentów wymagających operacji klatki piersiowej. Co więcej, tkanka, która jest pobierana podczas bronchoskopii od zdrowych ochotników, jest fizjologicznie normalna, w przeciwieństwie do niedotkniętego obszaru tkanki płucnej u pacjentów z chorobą płuc. Z drugiej strony, biopsje są małe, a liczba pobranych komórek, nawet przy łączeniu kilku biopsji, ogranicza rodzaj analiz, które można wykonać.

Chociaż obecna praca skupia się na DCs, opisane metody mogą być bezpośrednio rozszerzone o inne (immunologiczne) komórki będące przedmiotem zainteresowania, które znajdują się w ludzkiej błonie śluzowej płuc. Ponadto protokoły mają również bezpośrednie zastosowanie do próbek uzyskanych od pacjentów cierpiących na choroby płuc, w których bronchoskopia jest częścią ustalenia diagnozy, takich jak przewlekła obturacyjna choroba płuc (POChP), sarkoidoza lub rak płuc.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: To badanie zostało zatwierdzone przez regionalną Komisję Oceny Etyki w Umeå, Szwecja.

1. Bronchoskopia do pobierania próbek biopsji wewnątrzoskrzelowych od ludzi

  1. Uzyskaj świadomą zgodę od wszystkich uczestników.
  2. Pacjentów należy leczyć doustnym midazolamem (4-8 mg) i dożylnie glikopironium (0,2-04 mg) 30 minut przed bronchoskopią. Zastosuj znieczulenie miejscowe z lidokainą w krtań i oskrzelach. Pozwól pacjentowi przepłukać gardło ~ 3 ml lidokainy 4% i nałóż 3 ml na podstawę języka i do krtani za pomocą strzykawki do krtani. Zoptymalizuj znieczulenie miejscowe za pomocą 8-10 dawek lidokainy w sprayu. Wykonaj ten krok, gdy obiekt siedzi.
  3. Wprowadzić elastyczny wideobronchoskop przez usta przez plastikowy ustnik z pacjentem w pozycji leżącej. Użyj specjalnie przygotowanego cewnika w sprayu, aby zakończyć znieczulenie miejscowe dystalnej tchawicy i oskrzeli za pomocą bronchoskopu. Tutaj użyj dawki około 5-10 ml lidokainy 2%.
  4. Wykonaj 6-9 biopsji błony śluzowej oskrzeli z głównej cariny i głównych podziałów oskrzeli za pomocą kleszczy fenestrowanych (ryc. 1). Po bronchoskopii, a przed opuszczeniem szpitala, pozwól pacjentowi odpocząć przez 2-4 godziny i zapewnij mu lekki posiłek.

2. Osadzanie biopsji w żywicy glikolu metyloakrylanu (GMA)

UWAGA: Protokół barwienia immunologicznego GMA został pierwotnie opracowany na Uniwersytecie w Southampton, Histochemistry Research Unit17.

  1. Utrwalenie: Do celów immunohistochemicznych należy usunąć biopsje z kleszczy i umieścić je bezpośrednio w szklanych fiolkach zawierających 3 ml lodowato odwodnionego acetonu i inhibitorów proteazy (fluorek fenylometylosulfonylu (35 mg/100 ml acetonu) i jodoacetamid (370 mg/100 ml acetonu)). Utrwalić tkankę przez noc w temperaturze -20 °C (ryc. 2).
    UWAGA: Poniższe czynności należy wykonywać w dygestorium w odpowiednich rękawicach nitrylowych. Zestaw do zatapiania zawiera składniki, które mogą powodować uczulenie, podrażnienie i/lub alergiczne reakcje skórne. Wszystkie odpady należy utylizować jako odpady niebezpieczne.
  2. Odwodnienie: Usuń aceton z inhibitorami i zastąp go świeżym odwodnionym acetonem (bez inhibitorów) na 15 minut w temperaturze pokojowej (RT). Usuń aceton i zastąp go benzoesanem metylu na 15 minut.
  3. Infiltracja: Przygotować roztwór do przetwarzania 5% roztworu benzoesanu metylu w monomerze metakrylanu glikolu; 10 ml wystarcza na jedną fiolkę. Za pomocą plastikowych pipet Pasteura odessać roztwór benzoesanu metylu i zastąpić go 3 ml roztworu do przetwórstwa. Inkubować biopsje i nadmiar roztworu do przetwarzania w temperaturze 4 °C przez 2 godziny; Pipety Pasteura mogą być używane do wszystkich kolejnych zmian roztworu, w tym do zatapiania roztworu.
  4. Roztwór do przetwarzania należy wymieniać co 2 godziny (inkubacje 3 x 2 godziny), tak aby całkowity czas infiltracji biopsji w roztworze do przetwarzania wynosił co najmniej 6 godzin. Włóż papierowe etykiety do górnego końca kapsułek do zatapiania, aby zidentyfikować biopsje.
  5. Przygotować roztwór do zatapiania 75 mg nadtlenku benzoilu w 10 ml monomeru metakrylanu glikolu. Dodać 0,25 ml poli(tlenku etylenu) N,N-dimetyloaniliny (akceleratora) do roztworu do zatapiania, aby rozpocząć reakcję polimeryzacji. Usunąć roztwór do przetwarzania i umieścić jedną biopsję w odpowiedniej kapsułce do osadzania za pomocą kleszczy.
  6. Powoli napełnić kapsułkę do osadzania do góry roztworem do zatapiania i zamknąć nakrętkę. Unikaj zakłócania biopsji i tworzenia dużych pęcherzyków powietrza. Inkubować kapsułki w temperaturze 4 °C aż do całkowitej polimeryzacji żywicy.
  7. Osadzone biopsje należy przechowywać w temperaturze -20 °C w probówce o pojemności 50 ml zawierającej około 5 g żelu krzemionkowego.

3. Sekcja biopsji wewnątrzoskrzelowych osadzonych w GMA

  1. Powłoka szkiełek mikroskopowych: Umyj szkiełka mikroskopowe w zmywarce w normalnym cyklu. Przykryj szkiełka i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu.
  2. Przygotować roztwór powlekający z 10% roztworu poli-L-lizyny (PLL) w wodzie destylowanej. Zanurz szkiełka w roztworze powłokowym na 5 minut, a następnie pozostaw do wyschnięcia na powietrzu. Suche szkiełka z powłoką PLL należy przechowywać w oryginalnych pudełkach.
  3. Umyj paski szkła z 0,1% Tween 20 w wodzie destylowanej. Opłucz szklankę 70% etanolem i osusz ręcznikami papierowymi. Wytnij szklane ostrza z paska szkła za pomocą noża. Przechowuj ostrza w pojemniku, który zapobiega ruchomości, aby krawędź tnąca nie została uszkodzona ani wyszczerbiona.
  4. Przycinanie biopsji: Umieść kapsułkę do biopsji w rozdzielaczu kapsułek i odetnij każdą stronę za pomocą ostrza o pojedynczej krawędzi ze stali węglowej. Wyjmij biopsję wbudowaną w GMA i umieść ją mocno w imadle. Odetnij nadmiar GMA z okolic biopsji za pomocą stalowego ostrza.
  5. Podział na sekcje GMA.
    1. Przygotuj 0,05% roztwór amoniaku z wodą destylowaną. Umieść szklany nóż i biopsję w mikrotomie. Ostrożnie wyrównaj blok biopsyjny z ostrzem, regulując uchwyt noża i kąt bloku biopsyjnego tak, aby ostrze spoczywało płasko na powierzchni bloku.
    2. Wytnij odcinki o grubości 2 μm za pomocą mikrotomu z małą prędkością cięcia i użyj kleszczy do przenoszenia i wypływu sekcji na wodzie amoniakalnej. Unosić sekcje przez 45-90 sekund, umożliwiając delikatne pobranie antygenu i rozwinięcie sekcji.
    3. Podnieś sekcje za pomocą szkiełka mikroskopowego. Sprawdź histologię biopsji, szybko barwiąc błękitem toluidyny.
    4. Wysuszyć szkiełka na płycie grzejnej ustawionej na 50 °C i nanieść 500 μl przefiltrowanego barwnika toluidynowego na wycinek za pomocą plastikowej pipety Pasteura. Ogrzej część na płycie grzejnej, aż na krawędzi plamy zacznie pojawiać się zielony pierścień, a następnie zmyj go wodą.
    5. Za pomocą mikroskopu świetlnego sprawdź histologię biopsji. Skrawki stosowane do immunohistochemii powinny zawierać dobre obszary nieuszkodzonej blaszki właściwej i nabłonka, z jak najmniejszą liczbą gruczołów i jak najmniejszą ilością mięśni gładkich.
    6. Podobnie jak w sekcji 3.4.2, należy wyciąć odcinki o dobrej histologii i zebrać je za pomocą szkiełek mikroskopowych pokrytych PLL w celu barwienia immunohistochemicznego. Wytnij co najmniej dwa skrawki z każdej biopsji do analizy. Suszyć szkiełka przez co najmniej 1 godzinę. Po wyschnięciu skrawki można zawinąć w folię aluminiową i przechowywać w temperaturze -20 °C do 2 tygodni lub można je natychmiast wybarwić immunologicznie.

4. Barwienie immunohistochemiczne biopsji wewnątrzoskrzelowych wbudowanych w GMA

UWAGA: Azydek sodu jest toksyczny. Przygotować 0,1% roztwór azydku sodu w dygestoriach, z dala od kwasów. Kontakt z kwasami uwalnia toksyczne gazy.

  1. Narysuj sekcje za pomocą pisaka z diamentową końcówką i ułóż slajdy na stojaku do barwienia.
  2. Wykonaj blok peroksydazy. Przygotować roztwór blokowy peroksydazy składający się z 0,3% nadtlenku wodoru w 0,1% roztworze azydku sodu. Nanieść 1 ml bloku peroksydazy na skrawki i inkubować przez 30 minut.
  3. Przygotować roztwór płuczący z 0,05 M soli fizjologicznej buforowanej trisem (TBS), pH 7,6. Umyj szkiełka w TBS, 3x 5 min.
  4. Przygotować 1% roztwór blokowy BSA w DMEM. Zrób to z wyprzedzeniem i w dużych ilościach, podwielokrotn i zamroź do czasu, aż będzie potrzebny. Opróżnić szkiełka i inkubować skrawki w roztworze blokowym przez 30 minut, aby zablokować niespecyficzne wiązanie przeciwciał. Jeśli nadal występuje niespecyficzne wiązanie, należy przeprowadzić 30-minutowy etap inkubacji z 5% blokiem surowicy tego samego gatunku co przeciwciało drugorzędowe.
  5. Rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe (CD45 lub CD1a) w TBS do pożądanego stężenia (CD45 rozcieńczone w stosunku 1:1,000; CD1a rozcieńczony w stosunku 1:1,00) i nakładać na szkiełka podstawowe. Szkiełko nakrywkowe należy nakryć skrawki i inkubować przez noc w temperaturze pokojowej.
  6. Umyj slajdy w TBS trzy razy. Rozcieńczyć biotynylowane przeciwciało drugorzędowe (skierowane przeciwko pierwszorzędowemu gatunkowi przeciwciała gospodarza, w tym przypadku króliczemu przeciwciału anty-myszemu F(ab'2)) w TBS do pożądanego stężenia (rozcieńczenie 1:300) i nałożyć na szkiełka. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
  7. Przygotować kompleks biotyny i peroksydazy streptawidyny co najmniej 30 minut przed użyciem. Upewnij się, że jest wystarczająco dużo, aby zakryć wszystkie slajdy. Umyj szkiełka w TBS trzy razy. Nanieść roztwór na szkiełka i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
  8. Umyj szkiełka w TBS trzy razy. Przygotować roztwór substratu peroksydazy 3-amino-9-etylokarbazolu (AEC) (wykonany zgodnie z instrukcjami producenta). Nałóż go na szkiełka i inkubuj przez 20-30 minut lub do momentu uzyskania pożądanej intensywności plamy.
  9. Opłucz szkiełka pod bieżącą wodą z kranu przez 5 minut. Przeciwbarwić skrawki przefiltrowanym roztworem hematoksyliny Mayera przez 2 minuty. Myj szkiełka pod bieżącą wodą z kranu przez 5 minut.
  10. Opróżnij szkiełka i przykryj sekcje trwałym wodnym medium montażowym. Wysuszyć szkiełka w temperaturze 80 °C w suszarce. Poczekaj, aż szkiełka ostygną, a następnie zamontuj je za pomocą DPX i umieść szkiełko nakrywkowe.

5. Analiza barwienia

  1. Analizuj przekroje przy 40-krotnym powiększeniu za pomocą mikroskopu świetlnego z zamontowaną kamerą podłączoną do komputera.
    UWAGA: W celu analizy komórkowej policz dodatnio wybarwione, jądrzaste komórki w blaszce właściwej oskrzeli i nienaruszonym nabłonku, z wyłączeniem obszarów mięśni gładkich, gruczołów, dużych naczyń krwionośnych oraz niedopasowanych lub uszkodzonych tkanek.
  2. Uśrednić liczbę komórek i skorygować średnią liczbę komórek dla obszaru blaszki właściwej i długości nabłonka. Powierzchnię blaszki właściwej i długość nabłonka można obliczyć za pomocą programu do analizy obrazu.

6. Trawienie enzymatyczne biopsji wewnątrzoskrzelowych

  1. Biopsje myjące: Za pomocą sterylnych kleszczy umieść nienaruszone biopsje w stożkowej probówce o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml buforowanego roztworu soli fizjologicznej Hanka (HBSS) (ryc. 3). Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej na platformie kołyszącej z prędkością 30 obr./min. Przenieść biopsje do sterylnego naczynia, dekantując zawartość probówki o pojemności 15 ml za pomocą HBSS.
  2. Zakłócanie wydzielania śluzu za pomocą DTT: Zastąp HBSS w probówce 10 ml HBSS zawierającym 5 mM 1,4-ditiotreitolu (DTT). Przenieś biopsje z powrotem do probówki o pojemności 15 ml za pomocą sterylnych kleszczy. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej na platformie kołyszącej z prędkością 30 obr./min.
  3. Delikatnie obracać probówkę przez 15 sekund. Przenieść biopsje na sterylne naczynie, dekantując zawartość probówki o pojemności 15 ml za pomocą HBSS i DTT.
  4. Przenoszenie biopsji do pożywki hodowlanej: Zastąp HBSS i DTT w probówce 10 ml pożywki hodowlanej RPMI 1640. Przenieś biopsje z powrotem do probówki o pojemności 15 ml za pomocą sterylnych kleszczy. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej na platformie kołyszącej z prędkością 30 obr./min.
  5. Biopsje trawienne z kolagenazą i DNazą.
    1. Przygotować roztwór trawiący kolagenazy II (0,25 mg/ml) i DNazy (0,2 mg/ml) we wstępnie podgrzanym RPMI zawierającym 1 M roztwór HEPES. Dodać 500 μl roztworu trawiącego do każdego dołka na 48-dołkowej płytce do hodowli tkankowej.
    2. Umieścić 1 biopsję na studzienkę w roztworze trawiącym. Inkubować płytkę na platformie wytrząsającej przez 60 minut w temperaturze 37 °C przy 220 obr./min. Po 30 minutach pipetować w górę i w dół, aby ponownie rozproszyć biopsje, a po 60 minutach, aby całkowicie zdezagregować tkankę.
  6. Przygotowanie zawiesin jednokomórkowych.
    1. Zebrać strawione biopsje ze studzienek w probówce o pojemności 50 ml, przepuszczając ją przez sitko do komórek o wielkości 40 μm. Zebrać pozostałe komórki, przemywając studzienki lodowatym buforem FACS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) zawierająca 2% płodowej surowicy bydlęcej).
    2. Wycisnąć pozostałą tkankę na sitko do komórek za pomocą tylnej części tłoka strzykawki. Odwirować strawione komórki w temperaturze 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 5 ml lodowatego buforu FACS. Policz komórki ręcznie za pomocą hemocytometru i niebieskiego barwnika Trypana, aby ocenić żywotność komórek.

7. Analiza cytometryczna przepływowa pojedynczych komórek biopsji wewnątrzoskrzelowej po trawieniu enzymatycznym

  1. Zawiesić osad komórkowy na około 1 x 106 komórek w 200 μl buforu FACS.
  2. Dodaj barwnik żywotności komórek w celu wykluczenia martwych komórek zgodnie z protokołem producenta.
  3. Dodać 5 μl odczynnika blokującego FcR i inkubować przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  4. Dodać przeciwciała powierzchniowe przeciwko CD45 (2 μl), linii (CD3, CD20, CD56, CD66abce i CD14; po 2 μl), CD16 (0,5 μl), HLA-DR (3 μl), CD11c (5 μl), CD123 (5 μl), CD1c (3 μl) i CD103 (2 μl) i inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Szczegóły dotyczące przeciwciał można znaleźć w sekcji dotyczącej metod, ale miareczkować i optymalizować przeciwciała do używanego precyzyjnego cytometru przepływowego. Nadmiar przeciwciał zmyć PBS przez 5 minut przy 400 x g. Próbki należy pobrać świeżo za pomocą cytometru przepływowego lub utrwalić komórki w 1% paraformaldehydzie przed późniejszym pobraniem.
  5. Zidentyfikuj ludzkie DC w biopsjach płuc za pomocą testu cytometrii przepływowej18 (Rysunek 4).
    UWAGA: Korzystając z oprogramowania do analizy cytometrii przepływowej, komórki odpornościowe odróżnia się od innych komórek płuc poprzez bramkowanie na CD45. Martwe komórki można wykluczyć jako komórki, które są dodatnie dla barwnika ALIVE/DEAD. Spośród wszystkich żywych komórek CD45 + komórki liniowe (limfocyty B, limfocyty T, komórki NK, neutrofile i monocyty) można wykluczyć za pomocą koktajlu przeciwciał przeciwko CD20, CD3, CD56, CD66abce, CD14 i CD16 w jednym kanale. Następnie komórki HLA-DR+ pozwolą na identyfikację wszystkich ludzkich DC. MDC można odróżnić od PDC na podstawie odpowiednio ekspresji CD11c lub braku CD11c. MDC można dalej podzielić na CD1c+ MDC lub CD141+.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania charakteryzujące ludzkie komórki odpornościowe rezydujące w tkance oddechowej, w tym DC, są ograniczone, głównie ze względu na fakt, że chirurgicznie usunięta lub cała ludzka tkanka płucna jest rzadkością. W tym miejscu przedstawiono mniej inwazyjną metodę pozyskiwania tkanki płucnej z biopsji wewnątrzoskrzelowej (EBB) zdrowych ochotników oraz opracowane protokoły badania komórek odpornościowych w tkance za pomocą immunohistochemii lub cytometrii przepływowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W artykule opisano, jak uzyskać szczegółową charakterystykę przestrzenną i fenotypową DC rezydujących w tkance płucnej u zdrowych ludzi przy użyciu immunohistochemii i cytometrii przepływowej w biopsjach błony śluzowej wewnątrzoskrzelowej pobranych podczas bronchoskopii. W poniższych punktach szczegółowo omówiono kluczowe etapy protokołu.

Krytyczne kroki z protokołem

Sekcja i immunohistochemia: Bardzo ważne jest, aby utrzymać bloki biopsji w temperaturze -20 °C, gdy ic...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować ochotnikom, którzy dostarczyli materiał kliniczny do tego badania. Jesteśmy również wdzięczni personelowi Departamentu Zdrowia Publicznego i Medycyny Klinicznej, Oddziału Medycyny/Medycyny Układu Oddechowego, Szpitala Uniwersyteckiego, Umeå (Norrlands universitetssjukhus) za zebranie całego materiału klinicznego.

Ta praca była wspierana przez granty dla AS-S od Szwedzkiej Rady ds. Badań, Szwedzkiej Fundacji Heart-Lung, Szwedzkiej Fundacji Badań Strategicznych i Karolinska Institutet.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Bronchoskopia
Bronchoskop BF1T160OlympusBF1T160
Źródło światła OlympusExera CV-160
Kleszcze z otworemOlympusFB21CSłuży do wykonywania biopsji
Blok zgryzowyConmed142920 mm x 27 mm
Glukoza 25% 500 ml dożylnie
bromek glikopironium 0,2 mg/mldożylnie. Zapobiega wydzielaniu śluzu/śliny
Mixt. Midazolam 1 mg/ml p.oMoże być stosowany dla dodatkowego relaksu
Lidokaina, 40 mg/mlPodawanie do ust i gardła / Płukanie gardła
Lidokaina 100 mg/ml sprayPodawany na tylną część gardła
Lidokaina 20 mg/ml sprayPodawany za pomocą bronchoskopu do dróg oddechowych
GMA przetwarzanie i osadzanie
Fiolki szklane5 ml
AcetonSigma-Aldrich32201-1L
Sita molekularne, 4 ÅAlfa Aesar88120Granulki o średnicy 3-4 mm Fluorek
fenylometylosulfonyluSigma-AldrichP-76260,035 g/100 ml aceton
JodoacetamidSigma-AldrichI-61250,37 g/100 ml aceton
Polietylen-płaski  Kapsułki do zatapiania TAABLaboratoria TAABC094o średnicy 500 x 8 mm, polietylenowe, kapsułki z płaskim dnem
Uchwyt nakapsułki Laboratoria TAABC054Mieści 25 kapsułek 8 mm
Zestaw do zatapiania JB-4 GMAPolysciences00226Zawiera JB-4 roztwór A (0026A-800), JB-4 roztwór B (0026B-3.8), nadtlenek benzoilu (02618-12)
Benzoesan metyluSigma-Aldrich27614-1L
Żel krzemionkowy ze wskaźnikiem wilgotnościScharlauGE00432,5-6 mm 
GMA sectioning
Glass Szkiełka mikroskopoweThermoFisher Scientific10143562CEFKrawędzie cięte, matowy koniec
Roztwór poli-L-lizynySigma-AldrichP8920-500mL1:10 do roztworu roboczego
Paski szklane do ultramikrotomiiAlkar
Tween 20Sigma-AldrichP2287Wash roztwór (0,1% Tween20)
LKB 7800B KnifemakerLKB
Rozdzielacz kapsułekLaboratoria TAABC065
Ostrza jednoostrzowe ze stali węglowejLaboratoria TAABB054
Vice
Amoniak, 25%VWR1133.10002 ml w 1 L, 1:500 (0.05%)
MikrotomLeicaLeica RM 2165
Źródło światłaMikroskop LeicaLeica CLS 150 XE
ze statywem na ramieniu wahadłowymLeicaLeica MZ6
GMA ImmunohistochemistryPióro
z diamentową końcówkąHistolab5218
Nadtlenek wodoru 30% roztwórAnalaR Normapur23619.264
Azydek soduSigma-AldrichS8032
TrisRoche10708976001
Chlorek soduChemikalia VWR27810.295
Albumina surowicy bydlęcejMillipore82-045-2Probumin BSA klasy diagnostycznej
Zmodyfikowane podłoże orła Dulbecco (DMEM)Sigma-AldrichD5546
Przeciwciało anty-ludzkie CD45BioLegend304002Mysz monoklonalna, klon HI30, izotyp IgG1k. Stężenie robocze 500 ng / ml
Przeciwciało anty-ludzkie CD1aAbD SerotechMCA80GAMysz monoklonalna, klon NA1 / 34-HLK, izotyp IgG2a. Stężenie robocze 10 i mikro; g / ml
Mysia kontrola izotypu monoklonalnego IgG1Abcamab27479
Mysza monoklonalna kontrola izotypu IgG2aDakoX094301-2
Vectastain ABC Elite standardowy zestawVector LabsPK-6100
Latawiec substratu peroksydazy AEC (3-amino-9-etylokarbazolu)Vector LabsSK-4200
Hematoksylina MayersaHistoLab01820
Trwały roztwór wodnyAbD SerotechBUF058C
Suszarka
suszenia DPX do montażu na stałe Mikroskop świetlny VWR360292F
Aparat mikroskopowy
LeicaLeica Qwin V3
Trawienie enzymatyczne
Ditiotreitol (DTT)Sigma-AldrichDTT-RO
Kolagenaza IISigma-AldrichC6885
DNazaSigma-Aldrich10104159001  ROCHE
RPMI 1640Sigma-AldrichR8758
Kleszcze
Platforma kołyskowaInstrumenty grantowePMR-30
50 ml rurki stożkoweFalcon14-432-22
40 µ m sitko do komórekFalcon352340
cytometria przepływowa
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)
LIVE/DEAD Aqua zestaw do naprawy martwych komórekLife TechnologiesL34957
CD45BD555485
CD3BD557757
CD20BD
CD56Biolegend318332
CD66abceMiltenyi130-101-132
HLA-DRBD
CD14BD557831
130-098-009
CD141Miltenyi130-090-514
CD103Biolegend350212
ParaformaldehydSigma-AldrichF8775
LSR II Cytometr przepływowyBDCytometr przepływowy
FlowJoFlowJoOprogramowanie do analizy
do Leica Leica DMLB Oprogramowanie analityczne Leica Leica DFC 320Zbilansowany roztwór soli Hanka (HBSS)Sigma-Aldrich 55021C 335829 555813 CD16 Biolegend 302026 CD11c BD 560369 CD1c Miltenyi

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells. Nat Immunol. 16 (1), 36-44 (2015).
  2. Condon, T. V., Sawyer, R. T., Fenton, M. J., Riches, D. W. Lung dendritic cells at the innate-adaptive immune interface. J Leukoc Biol. 90 (5), 883-895 (2011).
  3. Lambrecht, B. N., Hammad, H. Biology of lung dendritic cells at the origin of asthma. Immunity. 31 (3), 412-424 (2009).
  4. Schlitzer, A., McGovern, N., Ginhoux, F. Dendritic cells and monocyte-derived cells: Two complementary and integrated functional systems. Semin Cell Dev Biol. 41, 9-22 (2015).
  5. Ziegler-Heitbrock, L., et al. Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood. Blood. 116 (16), e74-e80 (2010).
  6. Demedts, I. K., Brusselle, G. G., Vermaelen, K. Y., Pauwels, R. A. Identification and characterization of human pulmonary dendritic cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 32 (3), 177-184 (2005).
  7. Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D. Identification rare-event detection and analysis of dendritic cell subsets in broncho-alveolar lavage fluid and peripheral blood by flow cytometry. Front Biosci. 8, s1175-s1180 (2003).
  8. Masten, B. J., et al. Characterization of myeloid and plasmacytoid dendritic cells in human lung. J Immunol. 177 (11), 7784-7793 (2006).
  9. Ten Berge, B., et al. A novel method for isolating dendritic cells from human bronchoalveolar lavage fluid. J Immunol Methods. 351 (1-2), 13-23 (2009).
  10. Yu, C. I., et al. Human CD1c+ dendritic cells drive the differentiation of CD103+ CD8+ mucosal effector T cells via the cytokine TGF-beta. Immunity. 38 (4), 818-830 (2013).
  11. Nicod, L. P., Lipscomb, M. F., Toews, G. B., Weissler, J. C. Separation of potent and poorly functional human lung accessory cells based on autofluorescence. J Leukoc Biol. 45 (5), 458-465 (1989).
  12. Sertl, K., et al. Dendritic cells with antigen-presenting capability reside in airway epithelium, lung parenchyma, and visceral pleura. J Exp Med. 163 (2), 436-451 (1986).
  13. van Haarst, J. M., de Wit, H. J., Drexhage, H. A., Hoogsteden, H. C. Distribution and immunophenotype of mononuclear phagocytes and dendritic cells in the human lung. Am J Respir Cell Mol Biol. 10 (5), 487-492 (1994).
  14. Schlitzer, A., et al. IRF4 transcription factor-dependent CD11b+ dendritic cells in human and mouse control mucosal IL-17 cytokine responses. Immunity. 38 (5), 970-983 (2013).
  15. Yu, Y. A., et al. Flow Cytometric Analysis of Myeloid Cells in Human Blood, Bronchoalveolar Lavage, and Lung Tissues. Am J Respir Cell Mol Biol. , (2015).
  16. Haniffa, M., et al. Human tissues contain CD141hi cross-presenting dendritic cells with functional homology to mouse CD103+ nonlymphoid dendritic cells. Immunity. 37 (1), 60-73 (2012).
  17. Britten, K. M., Howarth, P. H., Roche, W. R. Immunohistochemistry on resin sections: a comparison of resin embedding techniques for small mucosal biopsies. Biotech Histochem. 68 (5), 271-280 (1993).
  18. Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system. Nat Rev Immunol. 4 (8), 648-655 (2004).
  19. Baharom, F., et al. Dendritic Cells and Monocytes with Distinct Inflammatory Responses Reside in Lung Mucosa of Healthy Humans. J Immunol. 196 (11), 4498-4509 (2016).
  20. Salvi, S., et al. Acute inflammatory responses in the airways and peripheral blood after short-term exposure to diesel exhaust in healthy human volunteers. Am J Respir Crit Care Med. 159 (3), 702-709 (1999).
  21. Schon-Hegrad, M. A., Oliver, J., McMenamin, P. G., Holt, P. G. Studies on the density, distribution, and surface phenotype of intraepithelial class II major histocompatibility complex antigen (Ia)-bearing dendritic cells (DC) in the conducting airways. J Exp Med. 173 (6), 1345-1356 (1991).
  22. Saeys, Y., Gassen, S. V., Lambrecht, B. N. Computational flow cytometry: helping to make sense of high-dimensional immunology data. Nat Rev Immunol. 16 (7), 449-462 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Tissue DigestionBronchoscopy SamplesMucosal ImmunologyCell Isolation

Powiązane artykuły