Artykuł metodologiczny
Ten protokół opisuje skalowalną technikę indywidualnego testowania pielęgnacji u Drosophila, która dostarcza solidnych, ilościowych danych do pomiaru zachowań związanych z uwodzeniem. Metoda opiera się na porównaniu różnicy w akumulacji barwnika na ciałach zwierząt niepielęgnowanych i pielęgnowanych w określonym czasie.
Zachowanie pielęgnacyjne Drosophila to złożony, wieloetapowy program lokomotoryczny, który wymaga skoordynowanych ruchów zarówno przednich, jak i tylnych kończyn. W tym miejscu przedstawiamy protokół testu pielęgnacyjnego i nowatorski projekt komory, który jest opłacalny i skalowalny zarówno dla małych, jak i dużych badań nad pielęgnacją Drosophila. Muchy są spraszane całym ciałem barwnikiem Brilliant Yellow i mają czas na usunięcie barwnika z ich ciał w komorze. Muchy są następnie osadzane w ustalonej objętości etanolu w celu rozpuszczenia barwnika. Mierzy się i rejestruje względną absorbancję spektralną próbek barwnika i etanolu dla zwierząt pielęgnowanych i niepielęgnowanych. Protokół dostarcza danych ilościowych dotyczących akumulacji barwnika dla poszczególnych muszek, które można łatwo uśrednić i porównać między próbkami. Dzięki temu projekty eksperymentalne mogą łatwo ocenić zdolność do pielęgnacji na potrzeby badań na zmutowanych zwierzętach lub manipulacji obwodami. Ta wydajna procedura jest zarówno wszechstronna, jak i skalowalna. Pokazujemy przepływ pracy protokołu i dane porównawcze między zwierzętami WT a zwierzętami zmutowanymi dla receptora dopaminy Drosophila typu I (DopR).
Pielęgnacja u Drosophila melanogaster (D. melanogaster ) to silne wrodzone zachowanie, które obejmuje koordynację wielu niezależnych programów motorycznych1. Muszki owocowe oczyszczają swoje ciała z kurzu, drobnoustrojów i innych patogenów, które mogą hamować normalne funkcje fizjologiczne, takie jak widzenie i latanie, lub prowadzić do poważnych problemów immunologicznych. Wyczuwając i reagując zarówno na mechaniczny2, jak i immune activation3, muchy powtarzalnie pocierają nogami o siebie lub o wybrany obszar ciała, dopóki nie będzie wystarczająco czysty, a pielęgnacja przejdzie....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
1. Przygotowanie
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Test szczotkowania daje dane ilościowe umożliwiające ocenę wydolności behawioralnej na podstawie ilości zgromadzonego barwnika pozostałego na ciałach much po ustalonym czasie pomiaru czynności szczotkowania (30 min). Przykładowe obrazy konstrukcji przesuwnych komór do szczotkowania oraz kluczowe etapy testu przedstawiono na ryc. 1. Muchy gromadzą znaczną ilość barwnika bezpośrednio po wysypaniu poprzez wortexowanie w obecności barwnika (ryc. 2d, 2e). Much.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Test pielęgnacji jest stosunkowo prosty, ale ostrzegamy eksperymentatorów, aby zwrócili szczególną uwagę na następujące kwestie. Utrzymanie szczelnego uszczelnienia poprzez dokręcenie na górnej i dolnej płycie po wprowadzeniu muchówek i barwnika ma zasadnicze znaczenie dla uzyskania powtarzalnych wyników. Barwnik Brilliant Yellow jest bardzo drobny, a luźne spoiny pozwolą na utratę barwnika z krawędzi komory. Nieregularność zawartości barwnika w każdym dołku może łatwo zaburzyć kwantyfikację pielęgnacji, ponieważ nierówn.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.
Pragniemy podziękować Brianowi Shepherdowi, Tat Udomritthiruj, Aaronowi Willeyowi, Ruby Froom, Elise Pitmon i Rose Hedreen za wczesną pracę nad testowaniem i ustanawianiem tej metodologii i projektów komór. Dziękujemy Kelly Tellez i Grahamowi Buchanowi za przeczytanie i zredagowanie rękopisu. Dziękujemy Andrew Seeds i Julie Simpson za ich pionierską pracę oraz rady i wsparcie w sugerowaniu stosowania Brilliant Yellow Dye (Sigma). Praca ta jest częściowo wspierana przez Mary E. Groff Surgical and Medical Research and Education Charitable Trust, Bronfman Science Center oraz Hellman Fellows Program.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Przezroczysta rurka PVC High-Flex Tygon | McMaster-Carr | 5229K54 | ID 1/8", OD 1/4", używana z końcówkami do mikropipet i siatką do budowy aspiratorów do ust Końcówki |
| do mikropipet (1 ml i 200 μ L) | Genesee Scientific | 24-165, 24-150R | |
| Nylon Mesh Screen, 2 x 2,6 " | McMaster-Carr | 9318T44 | Służy do budowy komory groomerskiej i aspiratorów do ust |
| Dumont #5 Kleszcze | Roboz | RS-5050 | |
| Brilliant Yellow Dye | Sigma-Aldrich | 201375-25G | Zalecamy używanie rękawic nitrylowych podczas pracy z tym produktem |
| Vortexer | Fisher Scientific | 12-812 | zestaw do "dotyku" |
| Etanol | Carolina Biological Supply | 86-1282 | |
| Probówki do mikrowirówek 1,5 ml VWR | International | 10025-726 | |
| 0,65 ml | VWR International | 20170-293 | mogą być ponownie użyte z kolejnymi testami |
| Płytka UV 96-dołkowa | Corning | ||
| BioTek Synergy HTX Platereader | BioTek | musi pobrać katalog, aby uzyskać dostęp do numeru produktu | |
| http://www.biotek.com/products/microplate_detection/synergy_htx_multimode_microplate_reader.html?tab=overview Gen5 Czytnik mikropłytek i oprogramowanie do imagerów | BioTek | ||
| Microsoft Excel | Microsoft | https://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400?tduid=(65d098c0e83b86c952bdff5b0719c83f)(256380)(2459594)(SRi0yYDlqd0-LI.. ql4M2LoZBEhcBljvIA)() | |
| Drosophila Inkubator | Tritech | DT2-CIRC-TK | |
| 1/4" akryl plastikowy | McMaster-Carr | 8473K341 | |
| 8 - 32 nakrętki | McMaster-Carr | 90257A009 | |
| 8 - z sześciokątnym 32 x 1" | McMaster-Carr | 92185A199 | dolna płyta musi być nagwintowana pod tego rozmiaru |
| 8 - 32 x z sześciokątnym 1/2" | McMaster-Carr | 92185A194 | druga płyta od góry musi być gwintowana |
| 2 - 56 3/8 "maszynowe z płaskim | McMaster-Carr | 91500A088 | utrzymują dwie środkowe płyty razem |
| 0,175 "ID, 1/4" OD, 0,34" rura aluminiowa | McMaster-Carr | 92510A044 | Wyprodukowane we własnym zakresie; Podany produkt ma w przybliżeniu takie same wymiary i powinien działać ze o rozmiarze 8. Działają one jak osłony na 1" i lekko odsuwają nasadkę sześciokątną od powierzchni górnej płyty |
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE
Poproś o pozwolenie