Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie modeli wirusa grypy pręgowanej u ludzi do badań przesiewowych leków przeciwwirusowych i scharakteryzowania odpowiedzi komórek odpornościowych gospodarza

10K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55235

⸱

20 stycznia 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Biomedical Sciences, University of Maine, 2Graduate School of Biomedical Sciences and Engineering, University of Maine, 3School of Biology and Ecology, University of Maine, 4Division of Intramural Research, Immunity, Inflammation and Disease Laboratory, National Institute of Environmental Health Sciences, NIH, 5Department of Chemical and Biological Engineering, University of Maine

W tym artykule

Podsumowanie

Pokazano systemiczne i zlokalizowane modele infekcji wirusa grypy A u ludzi. Korzystając z modelu infekcji ogólnoustrojowej, danio pręgowany może być używany do badań przesiewowych leków przeciwwirusowych. Korzystając z modelu infekcji zlokalizowanej, danio pręgowany może być wykorzystany do scharakteryzowania odpowiedzi komórek odpornościowych gospodarza.

Streszczenie

Każdego roku, sezonowe epidemie grypy mają głęboki wpływ na społeczeństwa na całym świecie. Pomimo globalnych wysiłków, grypa pozostaje trudnym do opanowania obciążeniem dla opieki zdrowotnej. Podstawową strategią ograniczania zakażeń są coroczne szczepienia. U osób, które zachorowały na grypę, leki przeciwwirusowe mogą łagodzić objawy. Istnieje wyraźna i niezaspokojona potrzeba opracowania alternatywnych strategii zwalczania grypy. Stworzono kilka modeli zwierzęcych w celu modelowania interakcji gospodarz-grypa. W tym miejscu opisano protokoły generowania modeli danio pręgowanego dla ogólnoustrojowego i miejscowego zakażenia wirusem grypy A (IAV). Korzystając z ogólnoustrojowego modelu zakażenia IAV, można przeprowadzić badania przesiewowe małych cząsteczek o potencjalnej aktywności przeciwwirusowej. Jako dowód słuszności zasady opisano protokół, który wykazuje skuteczność leku przeciwwirusowego Zanamivir u danio pręgowanego zakażonego IAV. Pokazuje, w jaki sposób można określić ilościowo fenotypy choroby, aby ocenić względną skuteczność potencjalnych leków przeciwwirusowych u danio pręgowanego zakażonego IAV. W ostatnich latach coraz częściej docenia się kluczową rolę, jaką neutrofile odgrywają w odpowiedzi człowieka na zakażenie grypą. Danio pręgowany okazał się niezastąpionym modelem do badań nad biologią neutrofili, co ma bezpośredni wpływ na medycynę ludzką. Opisano protokół generowania zlokalizowanej infekcji IAV w linii zebry Tg(mpx:mCherry) w celu zbadania biologii neutrofili w kontekście zlokalizowanej infekcji wirusowej. Rekrutacja neutrofili do zlokalizowanych miejsc infekcji zapewnia dodatkowy ilościowy fenotyp do oceny manipulacji eksperymentalnych, które mogą mieć zastosowania terapeutyczne. Oba opisane protokoły danio pręgowanego wiernie odwzorowują aspekty zakażenia IAV u ludzi. Model danio pręgowanego ma wiele nieodłącznych zalet, w tym wysoką płodność, przejrzystość optyczną, podatność na badania przesiewowe leków i dostępność linii transgenicznych, w tym tych, w których komórki odpornościowe, takie jak neutrofile, są znakowane białkami fluorescencyjnymi. Opisane tutaj protokoły wykorzystują te zalety i mają potencjał, aby ujawnić krytyczne informacje na temat interakcji gospodarz-IAV, które mogą ostatecznie przełożyć się na wyniki kliniczne.

Wprowadzenie

Według Światowej Organizacji Zdrowia (WHO), wirusy grypy infekują 5-10% dorosłych i 20-30% dzieci rocznie i powodują 3-5 milionów przypadków ciężkich chorób i do 500 000 zgonów na całym świecie1. Coroczne szczepienia przeciwko grypie pozostają najlepszą opcją zapobiegania chorobie. Działania takie jak Globalny Plan Działania WHO przyczyniły się do zwiększenia stosowania szczepionek sezonowych, zdolności produkcyjnych szczepionek oraz badań i rozwoju nad skuteczniejszymi strategiami szczepień w celu zmniejszenia zachorowalności i śmiertelności związanej z wybuchami epidemii grypy sezonowej2. Leki przeciwwirusowe, takie jak inhibitory neuraminidazy (np. Zanamiwir i Oseltamiwir), są dostępne w niektórych krajach i okazały się skuteczne w łagodzeniu objawów, jeśli są podawane w ciągu pierwszych 48 godzin od wystąpienia3,4,5. Pomimo globalnych wysiłków, powstrzymanie wybuchów sezonowej grypy pozostaje obecnie ogromnym wyzwaniem, ponieważ dryf antygenowy wirusa grypy często przekracza obecne możliwości przystosowania się do zmieniającego się genomu wirusa6. Strategie szczepień ukierunkowane na nowe szczepy wirusa muszą być opracowywane z wyprzedzeniem i czasami okazują się mniej niż optymalnie skuteczne z powodu nieprzewidzianych zmian w typach szczepów, które ostatecznie dominują w sezonie grypowym. Z tych powodów istnieje wyraźna potrzeba opracowania alternatywnych strategii terapeutycznych w celu powstrzymania zakażeń i zmniejszenia śmiertelności. Dzięki lepszemu zrozumieniu interakcji gospodarz-wirus możliwe będzie opracowanie nowych leków przeciwgrypowych i terapii uzupełniających7,8.

Interakcja między człowiekiem a wirusem grypy A (IAV) jest złożona. W celu uzyskania wglądu w interakcję gospodarz-wirus opracowano kilka modeli zwierzęcych zakażenia wirusem u ludzi, w tym myszy, świnki morskie, szczury bawełniane, chomiki, fretki i makaki9. Dostarczając ważnych danych, które poszerzyły wiedzę na temat dynamiki relacji gospodarz-IAV, każdy organizm modelowy ma istotne wady, które należy wziąć pod uwagę przy próbie przełożenia wyników na grunt medycyny ludzkiej. Na przykład myszy, które są najczęściej używanym modelem, nie rozwijają łatwo objawów infekcji wywołanej przez IAV, gdy są zakażone ludzkimi izolatami grypy9. Dzieje się tak, ponieważ myszy nie mają naturalnego tropizmu dla izolatów ludzkiej grypy, ponieważ komórki nabłonkowe myszy wyrażają wiązania kwasu sjalowego α-2,3 zamiast wiązań kwasu sjalowego α-2,6 wyrażanych na ludzkich komórkach nabłonka10. Białka hemaglutyniny obecne w ludzkich izolatach IAV korzystnie wiążą i wnikają do komórek gospodarza niosących wiązania kwasu sjalowego α-2,6 poprzez endocytozę za pośrednictwem receptora9,11,12,13. W związku z tym przyjmuje się obecnie, że przy opracowywaniu mysich modeli grypy u ludzi należy zwrócić uwagę na powiązanie odpowiedniego szczepu myszy z odpowiednim szczepem grypy w celu uzyskania fenotypów choroby, które podsumowują aspekty choroby ludzkiej. Natomiast komórki nabłonkowe w górnych drogach oddechowych fretek posiadają α-2,6 wiązań kwasu sjalowego, które przypominają komórki ludzkie14. Zakażone fretki mają wiele wspólnych cech patologicznych i klinicznych obserwowanych w chorobie ludzkiej, w tym patogenność i zdolność przenoszenia wirusów grypy ludzkiej i ptasiej14,15. Są one również wysoce podatne na badania skuteczności szczepionek. Niemniej jednak model fretek w odniesieniu do grypy ludzkiej ma kilka wad związanych głównie z ich wielkością i kosztami hodowli, które utrudniają uzyskanie statystycznie istotnych danych. Ponadto fretki wykazywały wcześniej różnice w farmakokinetyce leków, biodostępności i toksyczności, które utrudniają skuteczność testów. Na przykład fretki wykazują toksyczność dla inhibitora kanałów jonowych M2 amantadyny16. W związku z tym oczywiste jest, że przy wyborze modelu zwierzęcego do badania pytań dotyczących zakażeń IAV u ludzi, ważne jest, aby wziąć pod uwagę jego nieodłączne zalety i ograniczenia, a także aspekt interakcji gospodarz-wirus, który jest badany.

Danio pręgowany, Danio rerio, to model zwierzęcy, który daje unikalne możliwości badania infekcji mikrobiologicznej, odpowiedzi immunologicznej gospodarza i potencjalnych terapii lekowych17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28. Obecność kwasów sjalowych związanych z α-2,6 na powierzchni komórek danio pręgowanego sugerowała jego podatność na IAV, co zostało potwierdzone w badaniach infekcji i zobrazowane in vivo przy użyciu fluorescencyjnego szczepu reporterowego IAV19. U danio pręgowanego zakażonego IAV zwiększona ekspresja przeciwwirusowych transkryptów ifnphi1 i mxa wskazywała, że stymulowana została wrodzona odpowiedź immunologiczna, a patologia wykazywana przez danio pręgowanego zakażonego IAV, w tym obrzęk i zniszczenie tkanek, była podobna do obserwowanej w zakażeniach grypą u ludzi. Co więcej, przeciwwirusowy inhibitor neuraminidazy IAV Zanamivir ograniczał śmiertelność i zmniejszał replikację wirusa u danio pręgowanego19.

W tym raporcie opisany jest protokół inicjowania ogólnoustrojowych infekcji IAV w zarodkach danio pręgowanego. Stosowanie zanamiwiru w klinicznie istotnych dawkach jako dowodu słuszności zasady, wykazano przydatność tego modelu zakażenia IAV danio pręgowanego do badań przesiewowych związków pod kątem aktywności przeciwwirusowej. Ponadto opisano protokół generowania zlokalizowanego, nabłonkowego zakażenia IAV w pęcherzu pławnym danio pręgowanego, narządzie, który jest uważany za anatomicznie i funkcjonalnie analogiczny do płuc ssaków21,29,30,31. Korzystając z tego zlokalizowanego modelu infekcji IAV, można śledzić rekrutację neutrofili do miejsca zakażenia, co umożliwia badania nad rolą biologii neutrofili w zakażeniu IAV i zapaleniu. Te modele danio pręgowanego uzupełniają istniejące modele zwierzęce zakażeń IAV u ludzi i są szczególnie przydatne do testowania małych cząsteczek i odpowiedzi komórek odpornościowych ze względu na możliwość zwiększenia mocy statystycznej, zdolność do testów o umiarkowanej i wysokiej przepustowości oraz możliwości śledzenia zachowania i funkcji komórek odpornościowych za pomocą mikroskopii świetlnej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie prace powinny być wykonywane przy użyciu standardów bezpieczeństwa biologicznego poziomu 2 (lub BSL2) opisanych przez Amerykańskie Centra Kontroli Chorób (CDC) i zgodnie z dyrektywami ustanowionymi przez Instytucjonalne Komitety ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania (IACUC). Prosimy o skonsultowanie się z odpowiednimi urzędnikami w celu zapewnienia bezpieczeństwa i zgodności.

1. Pielęgnacja i utrzymanie danio pręgowanego

  1. Złóż ikrę danio pręgowanego i zbierz wymaganą liczbę zarodków do eksperymentów. W razie potrzeby masowe zbiorniki hodowlane, takie jak te opisane przez Adatto i wsp.32, może być wykorzystany do zebrania dużej liczby zarodków w stadium rozwoju.
  2. Pozwolić zarodkom rozwijać się do pożądanego etapu rozwojowego (48 godzin po zapłodnieniu w przypadku ogólnoustrojowego zakażenia IAV [sekcja 3] lub 5 dni po zapłodnieniu w przypadku miejscowego zakażenia pęcherza pławnego [sekcja 4]) na głębokich szalkach Petriego w niskiej gęstości (<100 zarodków/talerz) w temperaturze 28 °C w sterylnej wodzie jajecznej zawierającej 60 μg/ml soli morskiej (np. Instant Ocean) w wodzie destylowanej.
    1. Usuń martwe zarodki za pomocą plastikowych pipet transferowych i codziennie zmieniaj wodę z jaj, aby zapewnić optymalne zdrowie i rozwój.

2. Przygotowanie materiałów i odczynników

  1. Przygotować roztwór podstawowy Tricaine-S o stężeniu 4 mg/ml (doprowadzić pH do 7,0-7,4) w wodzie destylowanej i przemieścić do autoklawu. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  2. Wyciągnij kapilary ze szkła borokrzemianowego z włóknami za pomocą ściągacza do mikropipet (np. ściągacz do mikropipet z następującymi ustawieniami: ustawienie ciśnienia = 100, ciepło = 550, ciągnięcie = [brak wartości], prędkość = 130, czas = 110).
    UWAGA: Przed przycięciem igły długość od miejsca, w którym igła zaczyna się zwężać, do końca igły powinna wynosić około 12-15 mm. Może się to jednak różnić w zależności od preferencji i zastosowania. Dłuższe, bardziej stopniowe zwężanie się może być bardziej korzystne ze względu na zwiększoną zdolność do przekłuwania zarodka i zmniejszone ryzyko zgięcia lub złamania igły.
  3. Rozpuść 2 g agarozy w 100 ml wody jajecznej za pomocą kuchenki mikrofalowej. Przygotuj płytki, na których ustawisz je w jednej linii i wstrzyknij zarodki, wlewając stopioną agarozę do głębokich szalek Petriego i pozwalając jej zastygnąć.
  4. Przygotować zapas 10 mg/ml zanamiwiru w wodzie wolnej od nukleaz. Podwielokrotność porcji i zamrozić w temperaturze -20 °C.
  5. Rozpuść 0,5 g agarozy w 50 ml wody jajecznej za pomocą kuchenki mikrofalowej, aby uzyskać agarozę montującą zarodek. Przechowywać w łaźni wodnej w temperaturze 50 °C do momentu przygotowania do użycia podczas obrazowania.

3. Ogólnoustrojowe zakażenie IAV (48 godzin po zapłodnieniu)

UWAGA: Wszyscy pracownicy naukowi powinni skonsultować się ze swoimi przełożonymi i lekarzami w sprawie szczepień przed rozpoczęciem pracy z IAV.

  1. Ręcznie dechorionuj zarodki w dniu eksperymentu za pomocą kleszczy #5. Należy zachować ostrożność, aby usunąć i poddać eutanazji zarodki, które zostały uszkodzone w tym procesie, w roztworze trikainy o stężeniu 200 μg/ml.
  2. Przygotowanie IAV do mikroiniekcji
    UWAGA: Szczepy, w przypadku których wykazano zakażenie zarodków danio pręgowanego to grypa A/PR/8/34 (H1N1) (APR8), grypa A X-31 A/Aichi/68 (H3N2) (X-31) oraz fluorescencyjny szczep wirusa grypy reporterowej NS1-GFP33. Szczegółowe informacje na temat APR8 i X-31 oraz innych szczepów można znaleźć w Bazie Danych Badań nad Grypą
    1. Rozmnażaj szczep NS1-GFP IAV w zarodkach jaj kurzych zgodnie z wcześniejszym opisem34,35. Zbierz, podwielokrotnić i mianować płyn omoczniowy zawierający IAV i przechowywać w temperaturze -80 °C. Wstępnie odmieńcze wirusy APR8 i X-31 można nabyć w handlu.
      1. Tuż przed zakażeniem należy szybko rozmrozić podwielokrotność IAV w dłoniach w rękawiczkach, a następnie szybko umieścić na lodzie, aby zmniejszyć utratę miana.
    2. Rozcieńczenie wirusa
      1. W przypadku stosowania wirusów APR8 lub X-31 należy rozcieńczyć do 3,3 x 106 dawki zakaźnej jaj 50% (EID50)/ml w sterylnym, lodowatym PBS uzupełnionym 0,25% czerwienią fenolową (w celu ułatwienia wizualizacji) w okapie z przepływem laminarnym. Jednocześnie należy skonfigurować kontrolę zawierającą sterylny PBS z 0,25% czerwieni fenolowej.
      2. W przypadku stosowania szczepu NS1-GFP 33, rozcieńczyć do ~1,5 x 102 jednostek tworzących płytkę nazębną (PFU) na nl w sterylnym, lodowatym PBS zawierającym 0,25% czerwieni fenolowej (w celu ułatwienia wizualizacji) w okapie z przepływem laminarnym. Jednocześnie należy skonfigurować kontrolę zawierającą płyn omoczniowy z niezakażonych jaj kurzych, rozcieńczony jak wirus w sterylnym PBS z 0,25% czerwienią fenolową.
      3. Utrzymuj IAV na lodzie, aż będzie gotowy do użycia.
    3. Roztwór wirusa należy wlać do igieł do mikroiniekcji za pomocą końcówek mikroładowarki tuż przed użyciem. Wprowadzić igłę do mikroiniekcji do odpowiedniego uchwytu aparatu iniekcyjnego (np. ciśnieniowego systemu iniekcyjnego MPPI-3).
    4. Podczas oglądania pod mikroskopem stereoskopowym delikatnie przytnij końcówkę igły do mikroiniekcji ostrymi, wysterylizowanymi kleszczami #5.
      UWAGA: Zaleca się stopniowe przycinanie końcówki do mikroiniekcji.
    5. Wciśnij pedał nożny systemu wtrysku ciśnieniowego i wstrzyknij do kropli mikroskopowego olejku immersyjnego na szkiełku kalibracyjnym z mikrometrem. Zmierz średnicę kropli. Oblicz objętość kropli za pomocą równania V=4/3πr3, gdzie V to objętość w nl, a r to promień w μm.
      UWAGA: Jeśli średnica kropli jest zbyt mała, dodatkowe szkło może zostać przycięte lub można dostosować ustawienia ciśnienia i czasu. Jeśli średnica kropli jest zbyt duża, można dostosować ustawienia ciśnienia i czasu.
    6. Wyreguluj ustawienia ciśnienia i czasu na wtryskiwaczu ciśnieniowym i/lub ponownie zaciśnij końcówkę igły, aż do uzyskania żądanej objętości wstrzyknięcia (zwykle 1-3 nl). Typowe są ustawienia ciśnienia w zakresie od 20 do 30 psi i ustawienia czasu trwania impulsu od 40 do 80 ms. Dostosuj ciśnienie wsteczne tak, aby przeciwdziałało ciśnieniu kapilarnemu, ale nie przeciekało IAV (ciśnienie zerowe netto).
  3. Wyrównaj zarodki do wstrzyknięcia
    1. Znieczulenie zdekorionowanych zarodków w 200 μg/ml trikainy.
    2. Po ustaniu ruchu przenieść 10-20 zarodków na 2% płytkę z agarozy (przygotowaną w punkcie 2.3) za pomocą plastikowej pipety. Użyj plastikowej pipety, aby usunąć nadmiar płynu.
    3. Delikatnie wyrównaj zarodki do mikroiniekcji za pomocą wypolerowanej ogniowo i uszczelnionej kapilary ze szkła borokrzemianowego. Za pomocą mikroskopu stereoskopowego delikatnie ustaw zarodki tak, aby przewód Cuviera lub tylna żyła kardynalna znajdowały się w jednej linii z igłą do mikroiniekcji (ryc. 1A).
  4. Mikroiniekcja IAV
    1. Delikatnie wprowadzić igłę do mikroiniekcji do przewodu Cuviera lub tylnej żyły kardynalnej. Wciśnij pedał nożny, aby wstrzyknąć żądaną objętość IAV do układu krążenia zarodka (ryc. 1A). W razie potrzeby zarodki mogą być wstrzykiwane więcej niż jeden raz.
      UWAGA: Bolus iniekcyjny należy zmieść do krążenia i rozprowadzić po całym ciele. Jeśli objętość wstrzyknięcia zbierze się w miejscu wstrzyknięcia, należy usunąć zarodek z eksperymentu i poddać eutanazji.
    2. Powtórzyć wstrzyknięcia na różnych zarodkach roztworem kontrolnym właściwym dla wybranego szczepu wirusa. W przypadku APR8 i X-31 należy użyć urządzenia sterującego opisanego w sekcji 3.2.2.1; dla NS1-GFP należy użyć elementu sterującego opisanego w ppkt 3.2.2.2.
  5. Przenieść zarodki na znakowane szalki Petriego zawierające sterylną wodę z jaj i umieścić w inkubatorach w temperaturze 33 °C.
    UWAGA: Zakażone zarodki powinny być hodowane w temperaturze 33 °C, aby wspierać zwiększoną replikację wirusa. Ponadto inkubacja w temperaturze 33 °C bardziej naśladuje temperaturę górnych dróg oddechowych człowieka, które są w bliskim kontakcie z niższymi temperaturami w środowisku zewnętrznym i są miejscem, w którym dochodzi do zakażeń IAV. Zarodki mogą aklimatyzować się w szerokim zakresie temperatur34.

4. Zlokalizowane, Zakażenie IAV pęcherza pławnego u transgenicznego danio pręgowanego Tg(mpx:mCherry) (5 dni po zapłodnieniu)

  1. Przygotowanie IAV do mikroiniekcji
    1. Rozcieńczyć szczep NS1-GFP i kontrolny roztwór do wstrzykiwań, jak opisano w sekcji 3.2.
    2. Przygotować igły zgodnie z opisem w punkcie 2.2.
    3. Wyrównaj Tg(mpx:mCherry)35 larw zawierających napompowane pęcherze pławne, jak opisano w sekcji 3.3 z następującym wyjątkiem. Wyrównaj larwy w taki sposób, aby igła mogła przebić pęcherz pławny, a wirus mógł zdeponować się w tylnej części pęcherza pławnego, jak opisano wcześniej36 (Rysunek 2A).
  2. Mikroiniekcja IAV
    1. Delikatnie wprowadzić igłę do mikroiniekcji do pęcherza pławnego i wstrzyknąć żądaną objętość (np. 5 nl) w kierunku tylnej części struktury (ryc. 2A).
      UWAGA: Bolus do wstrzykiwań powinien zbierać się w kierunku tylnym, a pęcherzyk powietrza pęcherza pławnego powinien być przemieszczony do przodu. Ekspresję GFP należy zacząć obserwować po 3 godzinach od wstrzyknięcia.
    2. Powtórzyć wstrzyknięcia roztworem kontrolnym właściwym dla wybranego szczepu wirusa, jak opisano w sekcji 3.4.2.
  3. Przenieść larwy na szalki Petriego zawierające sterylną wodę z jaj i umieścić w inkubatorach w temperaturze 33 °C.

5. Leczenie przeciwwirusowe

UWAGA: Poniższy protokół opisuje leczenie Zanamivirem wcześniej pokazane w Gabor et al. 19. Ten protokół może być modyfikowany do badania przesiewowego innych leków przeciwwirusowych i ma potencjał do modyfikacji w celu przesiewania wielu związków w 96-dołkowym formacie płytkowym o wysokiej przepustowości.

  1. Po 3 godzinach od zakażenia zastąp wodę z jaj ryb zakażonych NS1-GFP i ryb zakażonych z grupy kontrolnej sterylną wodą jajeczną zawierającą 0, 16,7 lub 33,3 ng/ml Zanamivir.
    UWAGA: Stężenia te zostały wybrane w celu próby odtworzenia fizjologicznych poziomów osiągniętych po podaniu Zanamiwiru u ludzi (100, 200 lub 600 mg dożylnie, dwa razy na dobę lub 10 mg wziewnie, dwa razy na dobę). Stężenia w surowicy u ludzi wahały się od 9,83 do 45,3 ng/ml36.
  2. W ciągu 5 dni należy zmieniać wodę z jaj co 12 godzin i zastępować ją sterylną wodą jajeczną zawierającą odpowiednią ilość zanamiwiru.
  3. Śledź przebieg infekcji.
    1. Znieczulić danio pręgowanego w 200 μg/ml trikainy. Monitoruj ekspresję GFP za pomocą mikroskopii stereofluorescencyjnej, aby wizualnie zaobserwować różnice we wzorcach infekcji między rybami zakażonymi IAV i kontrolnymi oraz między rybami zanurzonymi w różnych stężeniach leków.
    2. Śledź zachorowalność i śmiertelność w ciągu 5 dni.
      1. Zapisuj obserwacje dotyczące dynamiki infekcji związanej z patologią choroby, w tym oznaki letargu i dowody obrzęku, różnice w pigmentacji, deformacje oczu i twarzoczaszki oraz lordozę. Patologia choroby zwykle ujawnia się u zakażonych ryb w grupie kontrolnej po 24-48 godzinach od wstrzyknięcia, w zależności od ilości wstrzykniętego wirusa. Zbieraj obrazy 24 godziny po wstrzyknięciu.
      2. Co 24 godziny przez 5 dni po zakażeniu rejestruj liczbę martwych, chorobliwych i zdrowych larw. Śmierć jest definiowana przez brak dostrzegalnego bicia serca. Wykreśl dane zgodnie z potrzebami. Na przykład wykreśl dane jako skumulowany wykres słupkowy z procentami zdrowych, chorobliwych lub martwych ryb wykreślonymi na osi y, a grupą leczoną na osi x. 19
        UWAGA: Śmiertelność może być oceniana na podstawie szacunków przeżycia Kaplana-Meiera. W zależności od zastosowania właściwe może być opracowanie alternatywnych podejść do oceny zachorowalności ryb, w tym matrycy punktacji, która może określać ilościowo stopień zachorowalności w oparciu o wyżej zaobserwowane cechy patologiczne.
      3. Skonsultuj się ze statystykiem, aby zastosować odpowiednie analizy statystyczne
        4. .

6. Migracja neutrofili

UWAGA: Poniższy protokół opisuje metodę śledzenia migracji neutrofili do pęcherza pławnego po zlokalizowanym, nabłonkowym zakażeniu IAV. Opisane metody mogą być modyfikowane w celu zbadania skutków manipulacji genetycznych i chemicznych. Za pomocą tej techniki możliwe będzie scharakteryzowanie mechanizmów leżących u podstaw zachowania neutrofili podczas infekcji IAV.

  1. Montaż danio pręgowanego do obrazowania
    1. Znieczulenie larw należy zobrazować w 200 μg/ml trikainy.
    2. Przenieś pojedynczą larwę Tg(mpx:mCherry), która została zainfekowana NS1-GFP, do studzienki z 24-dołkową, szklaną płytką dolną w małej kropli wody jajowej (~50-100 μl). Powtórz z innymi rybami zakażonymi IAV i kontrolnymi.
    3. Powoli dodawać 1% pożywki do mocowania zarodków agarozy do każdej studzienki (sekcja 2.5), uważając, aby nie wprowadzić dużych pęcherzyków.
      1. Delikatnie dostosuj pozycję larwy tak, aby była zamontowana na boku. Goody i Henry37 opisują, jak zrobić sondy, które dobrze sprawdzają się w tym zastosowaniu, używając pinezek przeciw owadom, które są zamontowane w kapilarnach ze szkła borokrzemianowego z włóknami i sklejone na miejscu.
    4. Gdy agaroza stwardnieje, delikatnie napełnij poszczególne studzienki wodą jajeczną zawierającą 200 μg/ml trikainy.
    5. Za pomocą mikroskopu konfokalnego można wykonać serię obrazów w jasnym polu i fluorescencji za pomocą obiektywu 20X skupionego na pęcherzu pławnym.
      1. Ustaw górną i dolną granicę tak, aby wychwytywały wszystkie widoczne zielone i czerwone fluorescencje.
      2. Rejestruj obrazy z szybkością 2,0 μs/piksel z krokami ≤ 4 μm. Wydłużenie czasu na piksel i zmniejszenie odległości między krokami (np. 0,5 – 1,0 μm) zwiększa rozdzielczość i jakość obrazu.
      3. Wygeneruj dwuwymiarowy obraz, scalając warstwy.
      4. Porównaj liczbę neutrofili mpx-mCherry-dodatnich obecnych w pęcherzach pławnych zebrywanego zakażonego IAV i kontrolnego, któremu wstrzyknięto
        5. kontrolę.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W niniejszym opracowaniu przedstawiono dane wykazujące, w jaki sposób systemowa infekcja IAV u danio pręgowanych może być wykorzystana do testowania skuteczności leków (Rycina 1A). Zarodki w 48 h po zapłodnieniu są wstrzykiwane z APR8 (Ryciny 1C, 1F), X-31 (Ryciny 1D, 1G) lub NS1-GFP (Ryciny 1H-1I) poprzez przewód Cuviera w celu zainicjowania infekcji wirusowej. Inna grupa zarodków w 48 h po zapłodnieniu została poddana i...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Aby zmaksymalizować korzyści płynące z wykorzystania małego zwierzęcia do modelowania interakcji człowiek-gospodarz-patogen, ważne jest, aby formułować pytania badawcze i testować hipotezy, które wykorzystują nieodłączne zalety systemu modelowego. Jako model zakażenia wirusem wewnątrzżytkowym u ludzi, danio pręgowany ma kilka mocnych stron, w tym wysoką płodność, przejrzystość optyczną, podatność na badania przesiewowe leków i dostępność linii transgenicznych, które znakują komórki odpornościowe, takie jak neutrofile. Da...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy pragną podziękować Markowi Nilanowi za opiekę i utrzymanie danio pręgowanego oraz Meghan Breitbach i Deborah Bouchard za propagowanie NS1-GFP i określanie mian IAV. Badania te były wspierane przez grant NIGMS NIH P20GM103534 oraz Maine Agricultural and Forest Experiment Station (numer publikacji 3493).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Instant OceanSpectrum BrandsSS15-10
100 mm x 25 mm sterylne jednorazowe szalki Petriego VWR89107-632
Pipety transferowe Fisherbrand13-711-7M
Tricaine-S (MS-222)Western Chemical Kapilara
szkła borokrzemianowego z żarnikiem Instrument Suttera BF120-69-10
Ściągacz do mikropipet płomieniowo-brązowy Instrument SutterP-97
AgaroseLonza50004
ZanamivirAK ScientificG939
Dumont #5 kleszcze Mikroskopia elektronowa Sciences72700-D
Końcówki do mikroładowarekEppendorf930001007
Olejek immersyjny do mikroskopuOlympusIMMOIL-F30CC
Szkiełko do kalibracji stolika mikroskopu AmScopeMR095
MPPI-3 Stosowane oprzyrządowanie
Mikroskop stereoskopowyOlympusSZ61
Jednostka ciśnienia zwrotnegoStosowane oprzyrządowanie naukoweZestaw
Stosowane oprzyrządowanie naukoweMPIP
Przełącznik nożnyStosowane oprzyrządowanie naukoweMikromanipulator FSW
Stosowane Oprzyrządowanie NaukoweMM33
Podstawa magnetycznaStosowane Oprzyrządowanie NaukoweBaza
Fenol czerwony Sigma-Aldrich P-4758
Inkubator niskotemperaturowyVWR2020
SteREO Discovery.V12Zeiss
IlluminatorZeissHXP 200C
Źródło zimnego światłaZeiss CL6000 LED
szklanym dnem, 24-dołkowaMattekP24G-0-13-F
OlympusIX-81 z laserowym skaningowym systemem konfokalnym FV-1000
Rzeka Charles 490710
Grypa A X-31, A/Aichi/68 (H3N2) Rzeka Charles 
Grypa NS1-GFPWspomniana w Manicassamy et al. 2010
Tg(mpx:mCherry)Wspomniana w Lam et al. 2013
ze Wtryskiwacz ciśnieniowy naukowe uchwytów do mikropipet BPU magnetyczna Płytka wielodołkowa ze Mikroskop konfokalny Oprogramowanie Fluoview Olympus Prism v6 GraphPad Wirus grypy A/PR/8/34 (H1N1) 490715

Bibliografia

  1. W.H.O. Influenza (Seasonal). , Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs211/en/ (2014).
  2. W.H.O. W.H.O. Global Action Plan.. , Available from: http://www.who.int/influenza_vaccines_plan/en/ (2011).
  3. De Clercq, E. Antiviral agents active against influenza A viruses. Nat Rev Drug Discov. 5 (12), 1015-1025 (2006).
  4. von Itzstein, M. The war against influenza: discovery and development of sialidase inhibitors. Nat Rev Drug Discov. 6 (12), 967-974 (2007).
  5. Fiore, A. E., et al. Antiviral Agents for the Treatment and Chemoprophylaxis of Influenza. Centers for Disease Control and Prevention. , 1-26 (2011).
  6. Krammer, F., Palese, P. Advances in the development of influenza virus vaccines. Nat Rev Drug Discov. 14 (3), 167-182 (2015).
  7. Ren, H., Zhou, P. Epitope-focused vaccine design against influenza A and B viruses. Curr Opin Immunol. 42, 83-90 (2016).
  8. Webster, R. G., Govorkova, E. A. Continuing challenges in influenza. Ann N Y Acad Sci. 1323, 115-139 (2014).
  9. Bouvier, N. M., Lowen, A. C. Animal Models for Influenza Virus Pathogenesis and Transmission. Viruses. 2 (8), 1530-1563 (2010).
  10. Ibricevic, A., et al. Influenza virus receptor specificity and cell tropism in mouse and human airway epithelial cells. J Virol. 80 (15), 7469-7480 (2006).
  11. Skehel, J. J., Wiley, D. C. RECEPTOR BINDING AND MEMBRANE FUSION IN VIRUS ENTRY: The Influenza Hemagglutinin. Annu Rev Biochem. 69 (1), 531(2000).
  12. Rust, M. J., Lakadamyali, M., Zhang, F., Zhuang, X. Assembly of endocytic machinery around individual influenza viruses during viral entry. Nat Struct Mol Biol. 11 (6), 567-573 (2004).
  13. Stencel-Baerenwald, J. E., Reiss, K., Reiter, D. M., Stehle, T., Dermody, T. S. The sweet spot: defining virus-sialic acid interactions. Nature Rev Microbiol. 12 (11), 739-749 (2014).
  14. Herlocher, M. L., et al. Ferrets as a Transmission Model for Influenza: Sequence Changes in HA1 of Type A (H3N2) Virus. J Infect Dis. 184 (5), 542-546 (2001).
  15. Belser, J. A., Katz, J. M., Tumpey, T. M. The ferret as a model organism to study influenza A virus infection. Dis Model Mech. 4 (5), 575-579 (2011).
  16. Cochran, K. W., Maassab, H. F., Tsunoda, A., Berlin, B. S. Studies on the antiviral activity of amantadine hydrochloride. Ann N Y Acad Sci. 130 (1), 432-439 (1965).
  17. de Oliveira, S., Boudinot, P., Calado, A., Mulero, V. Duox1-derived H2O2 modulates Cxcl8 expression and neutrophil recruitment via JNK/c-JUN/AP-1 signaling and chromatin modifications. J Immunol. 194 (4), 1523-1533 (2015).
  18. de Oliveira, S., et al. Cxcl8 (IL-8) mediates neutrophil recruitment and behavior in the zebrafish inflammatory response. J Immunol. 190 (8), 4349-4359 (2013).
  19. Gabor, K. A., et al. Influenza A virus infection in zebrafish recapitulates mammalian infection and sensitivity to anti-influenza drug treatment. Dis Model Mech. 7 (11), 1227-1237 (2014).
  20. Galani, I. E., Andreakos, E. Neutrophils in viral infections: Current concepts and caveats. J Leukoc Biol. 98 (4), 557-564 (2015).
  21. Gratacap, R. L., Rawls, J. F., Wheeler, R. T. Mucosal candidiasis elicits NF-kappaB activation, proinflammatory gene expression and localized neutrophilia in zebrafish. Dis Model Mech. 6 (5), 1260-1270 (2013).
  22. Henry, K. M., Loynes, C. A., Whyte, M. K., Renshaw, S. A. Zebrafish as a model for the study of neutrophil biology. J Leukoc Biol. 94 (4), 633-642 (2013).
  23. Mathias, J. R., et al. Live imaging of chronic inflammation caused by mutation of zebrafish Hai1. J Cell Sci. 120 (19), 3372-3383 (2007).
  24. Shelef, M. A., Tauzin, S., Huttenlocher, A. Neutrophil migration: moving from zebrafish models to human autoimmunity. Immunol Rev. 256 (1), 269-281 (2013).
  25. Walters, K. B., Green, J. M., Surfus, J. C., Yoo, S. K., Huttenlocher, A. Live imaging of neutrophil motility in a zebrafish model of WHIM syndrome. Blood. 116 (15), 2803-2811 (2010).
  26. Yoo, S. K., et al. Differential regulation of protrusion and polarity by PI3K during neutrophil motility in live zebrafish. Dev Cell. 18 (2), 226-236 (2010).
  27. Yoo, S. K., Huttenlocher, A. Spatiotemporal photolabeling of neutrophil trafficking during inflammation in live zebrafish. J Leukoc Biol. 89 (5), 661-667 (2011).
  28. Yoo, S. K., et al. The role of microtubules in neutrophil polarity and migration in live zebrafish. J Cell Sci. 125 (23), 5702-5710 (2012).
  29. Winata, C. L., et al. Development of zebrafish swimbladder: The requirement of Hedgehog signaling in specification and organization of the three tissue layers. Dev Biol. 331 (2), 222-236 (2009).
  30. Perry, S. F., Wilson, R. J., Straus, C., Harris, M. B., Remmers, J. E. Which came first, the lung or the breath? Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 129 (1), 37-47 (2001).
  31. Gratacap, R. L., Bergeron, A. C., Wheeler, R. T. Modeling mucosal candidiasis in larval zebrafish by swimbladder injection. J Vis Exp. (93), e52182(2014).
  32. Adatto, I., Lawrence, C., Thompson, M., Zon, L. I. A New System for the Rapid Collection of Large Numbers of Developmentally Staged Zebrafish Embryos. PLoS ONE. 6 (6), e21715(2011).
  33. Manicassamy, B., et al. Analysis of in vivo dynamics of influenza virus infection in mice using a GFP reporter virus. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (25), 11531-11536 (2010).
  34. Lawrence, C. The husbandry of zebrafish (Danio rerio): a review. Aquaculture. 269 (1), 1-20 (2007).
  35. Lam, P. -y, Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Heat Shock Modulates Neutrophil Motility in Zebrafish. PLoS ONE. 8 (12), e84436(2013).
  36. Shelton, M. J., et al. Zanamivir pharmacokinetics and pulmonary penetration into epithelial lining fluid following intravenous or oral inhaled administration to healthy adult subjects. Antimicrob Agents Chemother. 55 (11), 5178-5184 (2011).
  37. Sullivan, C., Kim, C. H. Zebrafish as a model for infectious disease and immune function. Fish Shellfish Immunol. 25 (4), 341-350 (2008).
  38. MacRae, C. A., Peterson, R. T. Zebrafish as tools for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 14 (10), 721-731 (2015).
  39. Brandes, M., Klauschen, F., Kuchen, S., Germain, R. N. A systems analysis identifies a feedforward inflammatory circuit leading to lethal influenza infection. Cell. 154 (1), 197-212 (2013).
  40. Narasaraju, T., et al. Excessive neutrophils and neutrophil extracellular traps contribute to acute lung injury of influenza pneumonitis. Am J Pathol. 179 (1), 199-210 (2011).
  41. Pillai, P. S., et al. Mx1 reveals innate pathways to antiviral resistance and lethal influenza disease. Science. 352 (6284), 463-466 (2016).
  42. Stifter, S. A., et al. Functional Interplay between Type I and II Interferons Is Essential to Limit Influenza A Virus-Induced Tissue Inflammation. PLoS Pathog. 12 (1), e1005378(2016).
  43. Vlahos, R., Stambas, J., Selemidis, S. Suppressing production of reactive oxygen species (ROS) for influenza A virus therapy. Trends Pharmacol Sci. 33 (1), 3-8 (2012).
  44. Palic, D., Andreasen, C. B., Ostojic, J., Tell, R. M., Roth, J. A. Zebrafish (Danio rerio) whole kidney assays to measure neutrophil extracellular trap release and degranulation of primary granules. J Immunol Methods. 319 (1-2), 87-97 (2007).
  45. Renshaw, S. A., et al. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
  46. Mathias, J. R., et al. Characterization of zebrafish larval inflammatory macrophages. Dev Comp Immunol. 33 (11), 1212-1217 (2009).
  47. Pase, L., et al. Neutrophil-delivered myeloperoxidase dampens the hydrogen peroxide burst after tissue wounding in zebrafish. Curr Biol. 22 (19), 1818-1824 (2012).
  48. Drescher, B., Bai, F. Neutrophil in viral infections, friend or foe? Virus Res. 171 (1), 1-7 (2013).
  49. Iwasaki, A., Pillai, P. S. Innate immunity to influenza virus infection. Nat Rev Immunol. 14 (5), 315-328 (2014).
  50. Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nat Rev Immunol. 13 (3), 159-175 (2013).
  51. Summers, C., et al. Neutrophil kinetics in health and disease. Trends Immunol. 31 (8), 318-324 (2010).
  52. Tate, M. D., Brooks, A. G., Reading, P. C. The role of neutrophils in the upper and lower respiratory tract during influenza virus infection of mice. Respir Res. 9, 57(2008).
  53. Tate, M. D., et al. Neutrophils ameliorate lung injury and the development of severe disease during influenza infection. J Immunol. 183 (11), 7441-7450 (2009).
  54. Tumpey, T. M., et al. Pathogenicity of influenza viruses with genes from the 1918 pandemic virus: functional roles of alveolar macrophages and neutrophils in limiting virus replication and mortality in mice. J Virol. 79 (23), 14933-14944 (2005).
  55. Wheeler, J. G., Winkler, L. S., Seeds, M., Bass, D., Abramson, J. S. Influenza A virus alters structural and biochemical functions of the neutrophil cytoskeleton. J Leukoc Biol. 47 (4), 332-343 (1990).
  56. de Oliveira, S., et al. Cxcl8-l1 and Cxcl8-l2 are required in the zebrafish defense against Salmonella Typhimurium. Dev Comp Immunol. 49 (1), 44-48 (2015).
  57. Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Neutrophils in host defense: new insights from zebrafish. J Leukoc Biol. 98 (4), 523-537 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Model grypy u rybek zebraprzesiewowe badanie lek w przeciwwirusowychrekrutacja neutrofilisystemowa infekcja wirusowamodel infekcji zlokalizowanejrybki zebra Tg mpx mCherrytechnika mikroiniekcjiobrazowanie w mikroskopii konfokalnejtest skuteczno ci zanamiwiruodpowied immunologiczna gospodarza
Wykorzystanie modeli wirusa grypy pręgowanej u ludzi do badań przesiewowych leków przeciwwirusowych i scharakteryzowania odpowiedzi komórek odpornościowych gospodarza
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.