Tandemowe oczyszczanie kompleksów białkowych z komórek eukariotycznych

Summary

Opisujemy tutaj nowatorską, solidną i efektywną metodę tandemowego oczyszczania powinowactwa (TAP) do ekspresji, izolacji i charakterystyki kompleksów białkowych z komórek eukariotycznych. Protokół ten może być wykorzystany do biochemicznej charakterystyki dyskretnych kompleksów, a także do identyfikacji nowych interaktorów i modyfikacji potranslacyjnych, które regulują ich funkcję.

Abstract

Oczyszczanie aktywnych kompleksów białko-białko i białko-kwas nukleinowy jest kluczowe dla charakterystyki aktywności enzymatycznej i identyfikacji de novo nowych podjednostek i modyfikacji potranslacyjnych. Systemy bakteryjne pozwalają na ekspresję i oczyszczanie szerokiej gamy pojedynczych polipeptydów i kompleksów białkowych. Jednak system ten nie umożliwia oczyszczania podjednostek białkowych, które zawierają modyfikacje potranslacyjne (np. fosforylację i acetylację) oraz identyfikacji nowych podjednostek regulatorowych, które są obecne/ulegają ekspresji tylko w układzie eukariotycznym. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy opis nowatorskiej, solidnej i wydajnej metody tandemowego oczyszczania powinowactwa (TAP) przy użyciu białek znakowanych STREP i FLAG, która ułatwia oczyszczanie kompleksów białkowych z przejściowo lub stabilnie eksprymowanymi białkami znakowanymi epitopami z komórek eukariotycznych. Protokół ten można zastosować do scharakteryzowania funkcjonalności kompleksu białkowego, do odkrywania modyfikacji potranslacyjnych na podjednostkach złożonych oraz do identyfikacji nowych składników kompleksu regulatorowego za pomocą spektrometrii mas. Warto zauważyć, że ta metoda TAP może być stosowana do badania kompleksów białkowych utworzonych przez składniki eukariotyczne lub chorobotwórcze (wirusowe i bakteryjne), dając w ten sposób szeroki wachlarz dalszych możliwości eksperymentalnych. Proponujemy, aby naukowcy pracujący z kompleksami białkowymi mogli wykorzystać to podejście na wiele różnych sposobów.

Introduction

Interakcje białko-białko (PPI) są kluczowe dla precyzyjnej regulacji procesów biologicznych¹, a dalsze badania nad tymi IPP mogą dostarczyć informacji na temat ich funkcji². Opracowano kilka podejść do badania i charakterystyki IPP, a także do identyfikacji de novo nowych składników białek regulatorowych. W 1989 roku Stanley Fields i współpracownicy opisali test drożdży dwuhybrydowych (Y2H)³. Podejście to pozwala na bezstronną i kompleksową identyfikację interaktorów (ofiar) dla zdefiniowanego białka będącego przedmiotem zainteresowania (przynęty) u Saccharomyces cerevisiae. Oprócz niezwykłej użyteczności w odkrywaniu IPP, test Y2H może być używany do charakteryzowania par białek w komórkach drożdży, definiowania minimalnych domen oddziałujących i identyfikowania mutacji, które znoszą takie interakcje. Modyfikując test Y2H, IPP mogą być również badane w komórkach ssaków⁴. Warianty testu Y2H (np. układ trójhybrydowy drożdży) można również zastosować do badania interakcji białko-RNA i białko-mały ligand organiczny w komórkach.

Innym powszechnie używanym narzędziem do badania IPP w systemie homologicznym jest test koimmunoprecypitacji (co-IP)⁵. Wykorzystując przeciwciało do immunoprecypitacji białka będącego przedmiotem zainteresowania, test co-IP umożliwia naukowcom monitorowanie IPP w komórkach pod kątem różnych warunków środowiskowych i sytuacji eksperymentalnych. Zastosowanie białek znakowanych epitopami (np. m.in. FLAG, Myc, STREP i HA) w metodach oczyszczania powinowactwa (AP) ułatwiło izolację białek ze złożonych mieszanin białek do kilku dalszych testów, w tym western blot, barwienia srebrem i analizy enzymatycznej. Jednak żadne z tych wcześniejszych podejść nie umożliwia izolacji dużych ilości kompleksów białkowych w celu dalszej charakterystyki, w tym testów in vitro, odkrywania podjednostek regulatorowych za pomocą spektrometrii mas i identyfikacji modyfikacji potranslacyjnych. Ulepszona wersja metody AP nazywa się Tandem AP (TAP), która jest techniką oczyszczania do badania IPP poprzez tworzenie białka fuzyjnego z dwoma epitopami, które jest oczyszczane przez dwa kolejne APs^6,7. W tym artykule przedstawiamy odmianę metody TAP do oczyszczania kompleksów białkowych, w której dwie podjednostki są znakowane różnymi epitopami, a następnie oczyszczane przez dwa sekwencyjne PAT (STREP AP, a następnie FLAG IP). Najpierw przedstawiamy minimalistyczny przegląd TAP (Rysunek 1), a następnie szczegółowy opis wszystkich etapów eksperymentalnych (Rysunek 2), aby naukowcy mogli zastosować je do interesującego ich kompleksu białkowego.

Aby zademonstrować stosowalność metody TAP, wybraliśmy dobrze scharakteryzowany kompleks cyklina-CDK (określany jako kinaza P-TEFb), który składa się z podjednostki regulatorowej cykliny T1 (CycT1) i kinazy (CDK9), i jest zaangażowany w regulację transkrypcji przez polimerazę RNA II (Pol II)^8,9,10. P-TEFb fosforyluje domenę C-końcową Pol II i związane z nią ujemne czynniki elongacyjne, co łagodzi pauzy transkrypcyjne w promotorze, a tym samym ułatwia wydłużanie transkrypcji^11,12,13. Mając na uwadze tę znaną interakcję, CycT1 znakowany STREP i CDK9 znakowany FLAG ulegały nadekspresji w HEK293T komórkach. Przeprowadzono wzajemny eksperyment TAP z CDK9 znakowanym STREP i CycT1 znakowanym FLAG, aby dodatkowo potwierdzić, że interakcja białkowa jest niezależna od użytych epitopów. Komórki pobrano i poddano lizie 48 godzin po transfekcji. Rozpuszczalny lizat oczyszczono za pomocą TAP (STREP AP, a następnie FLAG IP). Białka wejściowe i oczyszczone analizowano za pomocą western blot i barwienia srebra (ryc. 3).

Protocol

1. Komórki poszycia

1. Na dzień przed transfekcją należy posączyć 3,5 x 10⁶ HEK293T komórek w 10 ml zmodyfikowanego podłoża Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco, uzupełnionego 10% (v/v) płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% (v/v) penicyliny/streptomycyny (10 000 U/ml zapasu) na 100 mm szalki. Talerz 3 - 5 szalek 100 mm na eksperyment/warunek, aby zapewnić wystarczający odzysk białka.
   UWAGA: Liczba płytek musi być określona dla każdego eksperymentu/warunku, który będzie zależał od poziomów ekspresji i rozpuszczalności kompleksu białkowego będącego przedmiotem zainteresowania. Alternatywnie, jeśli potrzebne jest oczyszczanie na większą skalę, linie komórkowe można przystosować do wzrostu w zawiesinach w kolbach obrotowych², ale ta metoda nie zadziała w przypadku transfekcji przejściowych.

2. Transfekcja komórek lub indukowanie stabilnych linii komórkowych

1. Następnego dnia sprawdź komórki pod mikroskopem. Komórki muszą być zlewane w 70 - 80% przed kontynuowaniem.
2. Transfekować komórki całkowitą mieszaniną 7 μg plazmidowego DNA i 21 μl odczynnika do transfekcji na 100 mm szalkę. Komórki transfekcyjne z wektorem wyrażającym GFP (Tabela 1) jako kontrola skuteczności transfekcji.
   UWAGA: W przypadku użycia HEK293-T-REx lub podobnej stabilnej linii komórkowej, która indukuje ekspresję dwóch lub więcej złożonych podjednostek w odpowiedzi na doksycyklinę^14,15, induktor będzie musiał zostać dodany do komórek i inkubowany przez 48 godzin. Podobnie, stabilna linia komórkowa, która indukuje ekspresję GFP po dodaniu induktora, byłaby również wymagana do celów walidacji. Przejdź do kroku 2.7.
3. Przygotuj mieszaninę transfekcji na 100 mm szalka. W probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml wymieszać 500 μl nieuzupełnionego DMEM z 7 μg całkowitego plazmidowego DNA (co odpowiada dwóm lub więcej plazmidom). W oddzielnej probówce do mikrowirówki zmieszać 500 μl nieuzupełnionego DMEM z 21 μl odczynnika do transfekcji. Powtórz tę czynność dla każdej reakcji transfekcji.
4. Odpipetować roztwór odczynnika do transfekcji do roztworu plazmidowego DNA (nie mieszać roztworów w odwrotnej kolejności). Wymieszać pipetując co najmniej 4 razy.
5. Inkubować tę mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 10 - 15 minut, ale nie dłużej niż 15 minut.
6. Przechylić płytkę, aby utworzyć zbiornik na pożywkę i ostrożnie pipetować mieszaninę transfekcji kroplami na wewnętrzną stronę płytki, nie naruszając komórek. Przywróć naczynie do pierwotnej płaskiej pozycji i delikatnie obracaj, aby rozprowadzić mieszankę.
7. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze do hodowli komórkowych z 5% stężeniem CO₂ (stan ten jest dalej określany jako "inkubator do hodowli tkankowych"). Wymień nośnik 5 godzin po transfekcji (opcjonalnie).

3. Sprawdzanie wydajności transfekcji lub indukcji

1. Po 24 godzinach od transfekcji zwizualizuj komórki pod mikroskopem fluorescencyjnym, aby sprawdzić skuteczność transfekcji (lub indukcji kontrolnej HEK293T-REx stabilnej linii komórkowej eksprymującej GFP). Inkubować przez kolejne 24 godziny.

4. Oczyszczanie powinowactwa STREP (STREP AP)

1. Zbieranie komórek
   1. Po 48 godzinach od transfekcji usuń pożywkę i dodaj 8 ml zimnej soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS). Pipetować w górę i w dół, aby odłączyć komórki od płytki.
   2. Zebrać i przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml i wirować komórki w temperaturze 800 x g przez 4 minuty w temperaturze 4 °C.
   3. Usunąć supernatant PBS. Powtórzyć odwirowywanie w dół (800 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C), aby usunąć wszelkie pozostałości PBS. Przechowuj osad komórkowy w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości lub postępuj zgodnie z poniższą procedurą, aby kontynuować oczyszczanie białka.
2. Liza komórek
   1. Ponownie zawiesić granulki komórkowe za pomocą 5× objętości osadu komórkowego (~ 250 μl na płytkę) pasywnego buforu do lizy (PLB: 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 1,5 mM MgCl₂, 1 mM DTT, tabletka koktajlowa inhibitora proteazy, 5% v/v glicerolu i 1,0% NP-40) i przenieść zawiesinę komórkową do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
   2. Krótko wirować zawiesinę i nutować przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
   3. Wirować zawiesinę komórek w temperaturze 10 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
   4. Przenieś rozpuszczalne lizaty do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml i wyrzuć granulki komórek. Zaoszczędź 10% końcowej objętości rozpuszczalnego lizatu jako "STREP AP Input." Przechowywać w temperaturze 4 °C.
3. Równoważenie koralików STREP
   UWAGA: Użyj koralików STREP w pierwszym kroku AP! Kompleksy ściągnięte za pomocą kulek STREP odzyskują znacznie więcej białka niż te ściągnięte za pomocą kulek FLAG.
   1. Pobrać (n × 40 μl) + n μl 50% zawiesiny z kulek STREP (n = liczba próbek) i odwirowywać w dół przy 1 500 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Do pipetowania koralików używaj końcówek z szerokimi otworami.
   2. Usunąć supernatant i dodać 500 μl PLB do kulek. Nutować mieszaninę kulek przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Wirować w temperaturze 1 500 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C.
      1. Powtórz w sumie 3 prania. Zawiesić kulki w PLB do końcowej objętości n × 40 μl.
   3. Dodać 40 μl 50% zawiesiny kulki STREP do każdej próbki lizatu komórkowego i nutować przez 2 godziny w temperaturze 4 °C.
4. PAK PA (ang.)
   1. Wirować roztwór o stężeniu 1 500 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C.
   2. Usunąć supernatant i przechowywać w temperaturze 4 °C jako "STREP AP Flow-through (FT)".
   3. Do kulek dodać 500 μl STREP AP Wash Buffer I (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 250 mM NaCl, 1,5 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 5% glicerolu i 0,2% NP-40). Mieszaninę kulek należy nutować przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odwirowywać w temperaturze 1 500 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
      1. Powtórz w sumie 4 prania.
         UWAGA: Przed czwartym płukaniem przenieś roztwór kulek do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml, aby zredukować tło białkowe. Ten krok jest niezbędny.
   4. Dodaj 500 μl buforu do przemywania II (100 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl i 1 mM EDTA) i zrównoważyć kulki, odwracając probówki. Wirować w temperaturze 1 500 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C i wyrzucić supernatant.
   5. Eluować interesujące białko za pomocą 50 μl buforu elucyjnego STREP (100 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA i 2,5 mM Destiobiotyny). Wirować przy 800 obr./min przez 15 min w temperaturze 4 °C.
   6. Wirować kulki w temperaturze 1 500 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C. Zebrać supernatant. Frakcja ta odpowiada próbce "STREP AP Elution".
   7. Zachowaj frakcję kulek w temperaturze 4 °C do drugiej elucji, która może dać do połowy ilości białka uzyskanej przy pierwszej elucji. Porcja 10% wymywania STREP AP do barwienia srebrem i/lub western blotting¹⁶.
5. Równoważenie koralików FLAG
   1. Wyjąć (n x 16 μl) + n μl roztworu kulek FLAG (n = liczba próbek) i odwirowywać w temperaturze 1 500 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Do pipetowania koralików używaj końcówek z szerokimi otworami.
   2. Usunąć supernatant i dodać 500 μl buforu płuczącego FLAG (100 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA i 0,1% NP-40) do kulek. Wirować w temperaturze 1 500 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C. Powtórz tę czynność, w sumie 3 prania.
   3. Zawiesić kulki w buforze do płukania FLAG do końcowej objętości n x 16 μl.
   4. Dodać 16 μl zawiesiny perełkowej FLAG do pozostałej elucji STREP AP i nutować przez noc w temperaturze 4 °C.

5. FLAGA IP

1. Zawiesinę kulek FLAG należy obracać w temperaturze 1.500 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C. Zachowaj supernatant i przechowuj go jako "FLAG IP Flow-through" (FT) w temperaturze 4 °C.
2. Do roztworu dodać 500 μl buforu do płukania FLAG. Nutować przez 5 minut w temperaturze 4 °C i wirować w temperaturze 1 500 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C. Powtarzać w sumie przez 4 płukania i usuwać sklarowany nad osadem po każdym przemyciu.
   UWAGA: Przed czwartym płukaniem przenieś roztwór kulek białkowych do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml w celu zmniejszenia tła. Ten krok jest niezbędny.
3. Usunąć supernatant z ostatniego wirowania i dodać 30 μl buforu płuczącego FLAG zawierającego 200 ng/μl peptydu FLAG do kulek. Wirować przy 800 obr./min przez 2 godziny w temperaturze 4 °C.
4. Odwirowywać zawiesinę w temperaturze 1 500 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C. Zebrać supernatant i przechowywać w temperaturze 4 °C jako "FLAG IP Elution"
   UWAGA: Próbki elucji można potwierdzić za pomocą barwienia srebrem i/lub western blot przy użyciu standardowych protokołów¹⁶ i są gotowe do dalszych testów białkowych. Podczas ustawiania western blot uruchom wszystkie następujące próbki: (1) wejście STREP AP, (2) STREP AP FT, (3) ELUCJA STREP AP, (4) FLAG IP FT i (5) ELUCJA FLAG IP. Załadowane woluminy będą musiały zostać określone dla każdego eksperymentu. Wszystkie pobrane próbki i kulki można przechowywać w temperaturze 4 °C w przypadku krótkotrwałego przechowywania i w temperaturze -80 °C w przypadku długotrwałego przechowywania. Próbki TAP mogą być analizowane za pomocą spektrometrii mas w celu zweryfikowania tożsamości ich składników, identyfikacji nowych modyfikacji potranslacyjnych (PTM) i/lub odkrycia jakiejkolwiek nowej interakcji białkowej z oczyszczonym kompleksem^2,17. W tym celu, po nałożeniu żelu coomassie lub srebrnej plamy, opaski można wyciąć z żelu za pomocą czystego skalpela. Wcześniej opublikowano kilka doskonałych recenzji omawiających metody spektrometrii mas^18,19.

Results

W tym artykule pokazujemy możliwość zastosowania metody TAP do dobrze scharakteryzowanego kompleksu CycT1-CDK9 (znanego również jako kinaza P-TEFb).

Plazmidy kodujące cyklinę T1-STREP (CycT1:S) i CDK9-FLAG (CDK9:F), lub CDK9-STREP (CDK9:S) i Cyklinę T1-FLAG (CycT1:F) (Tabela 1), zostały transfekowane do komórek HEK293T. Kontrole ujemne obejmowały transfekcje z pustym wektorem i plazmidami CDK9:F lub CycT1:F (

Discussion

Opisany tutaj protokół ekspresji i izolacji kompleksów białkowych z komórek eukariotycznych nie ogranicza się do biochemicznej charakterystyki takich zespołów molekularnych, ale może być również wykorzystany do identyfikacji nowych interaktorów i modyfikacji potranslacyjnych, które mogłyby regulować ich funkcję. Wykorzystanie znaczników powinowactwa nie jest ograniczone do tego, co jest wymienione w tym protokole; ale nasze doświadczenie sugeruje, że użycie STREP jako pierwszego kroku AP znacznie zwiększa wydajność końco...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	GE Healthcare Life Sciences/Hyclone	SH3002.2FS
Surowica bydlęca	płodu GE Healthcare Life Sciences/Hyclone	SH30071
Penicylina/Streptomycyna	MP Biomedicals	MP091670049
PolyJet	SignaGen Laboratories	SL100688
Koktajl inhibitorów proteazy	Roche
STREP-Tactin Superflow	IBA Lifesciences	2-1208-010
Bufor elucyjny STREP-tag	IBA Lifesciences	2-1000-025
EZview Czerwony ANTI-FLAG M2 Affinity Gel	Sigma-Aldrich	F2426
Corning 100 mm i razy; Naczynie w stylu 20 mm Hodowla komórkowa polistyren niepirogenny 20/rękaw	Corning
Protein Lo-Bind Eppendorf Eppendorf		022431081
Cyfrowy mieszalnik wirowy	Fisher Scientific	02-215-370
48-otworowy stojak piankowy z mikrorurkami	Fisher Scientific	02-215-386
Rożen wytrząsarki do labquake	Termo	Numer katalogowy: 415110