Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Plemniki delfina butlonosego (Tursiops truncatus): zbieranie, kriokonserwacja i heterologiczne zapłodnienie in vitro

13.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55237

⸱

21 sierpnia 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Animal Reproduction, Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (INIA), 2Department of Animal Medicine and Surgery, School of Veterinary Medicine, Universidad Complutense de Madrid, 3Department of Physiology, Faculty of Veterinary Science, University of Murcia, Campus Mare Nostrum, 4Mundomar, Benidorm, 5Veterinary Services, L'Oceanográfic, Ciudad de las Artes y las Ciencias, Junta de Murs i Vals, s/n, 46013

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokoły, które zostały z powodzeniem wykorzystane do pobierania plemników delfinów, krioprezerwacji i heterologicznego wykonywania IVF przy użyciu oocytów bydlęcych.

Streszczenie

Użycie kriokonserwowanych plemników delfinów ułatwia wymianę materiału genetycznego między parkami wodnymi i udostępnia plemniki laboratoriom do badań, które pozwolą nam lepiej zrozumieć rozmnażanie ssaków morskich. Heterologiczne zapłodnienie in vitro, zastępujące homologiczne zapłodnienie in vitro, może stanowić środek do badania potencjału płodności plemników; badanie fizjologii gamet i wczesnego rozwoju zarodka; oraz unikanie wykorzystywania cennych oocytów delfinów, które są trudne do zdobycia. W tym miejscu przedstawiamy protokoły, które z powodzeniem stosowano do pobierania i krioprezerwacji plemników delfinów. Pobieranie nasienia odbywa się poprzez manualną stymulację wyszkolonych delfinów. Kriokonserwację przeprowadza się za pomocą wypełniacza TRIS na bazie żółtka jaja z glicerolem. Ponadto przedstawiamy protokół, który opisuje heterologiczne zapłodnienie in vitro z wykorzystaniem plemników delfinów i oocytów bydlęcych oraz weryfikuje hybrydowy charakter powstałego zarodka za pomocą PCR. Zapłodnienie heterologiczne rodzi pytania dotyczące zapłodnienia i może być wykorzystywane jako narzędzie do badania fizjologii gamet i wczesnego rozwoju zarodka. Ponadto sukces heterologicznego zapłodnienia in vitro pokazuje potencjał tej techniki do testowania zdolności zapłodnienia plemników delfinów, co jest warte dalszych badań.

Wprowadzenie

Technologie wspomaganego rozrodu są słabo rozwinięte u dzikich zwierząt, w tym u ssaków morskich. Brak czułych metod oceny sukcesu zapłodnienia plemników przyczynia się do powolnego rozwoju technologii rozrodczych u gatunków takich jak delfiny. Dopiero niedawno opisano podstawowe parametry nasienne delfina butlonosego (Tursiops truncatus)1,2. Jednak zmienne, takie jak ruchliwość i morfologia, choć szeroko stosowane, dostarczają ograniczonych informacji na temat wydajności reprodukcyjnej. Najlepszym wskaźnikiem jakości nasienia jest ocena potencjału zapłodnienia.

Ostatnio nasza grupa użyła metody do oceny potencjału zapłodnienia plemników delfinów, oceniając tworzenie się męskiego projądrka i/lub formowanie się hybrydowego zarodka po heterologicznym IVF przy użyciu nienaruszonych oocytów bydlęcych zone3. Zastosowanie heterologicznego zapłodnienia in vitro między delfinem a bydłem ma istotne zalety w porównaniu z homologicznym zapłodnieniem in vitro, ponieważ pozwala przezwyciężyć trudności w uzyskaniu oocytów delfinów i ułatwia stosowanie dobrze przebadanych systemów dojrzewania oocytów bydlęcych in vitro. Aby uniknąć specyficzności gatunkowej, nawożenie heterologiczne przeprowadza się na ogół przy braku ZP. Chociaż pozwala na ocenę zdolności plemników reagujących na akrosomy do łączenia się z błoną witelinową, upośledza ocenę innych cech związanych z zapłodnieniem. Opisana procedura wykorzystuje nienaruszone oocyty i pozwala na ocenę następujących parametrów: wiązanie i przyłączanie strefy plemnika, penetracja, polispermia, tworzenie projądra i rozszczepienie zarodka hybrydowego.

Tutaj prezentujemy kilka protokołów pobierania nasienia, podstawowej analizy nasienia, zamrażania plemników, a także oceny funkcjonalności plemników delfinów poprzez ocenę tworzenia się męskiego zarodka przedjądrowego i/lub hybrydowego po heterologicznym IVF przy użyciu nienaruszonych oocytów bydlęcych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Oświadczenie etyczne: Wszystkie procedury eksperymentalne zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (INIA). Wszystkie doświadczenia przeprowadzono zgodnie z Przewodnikiem opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych, przyjętym przez Towarzystwo Badań nad Rozrodem, oraz zgodnie z ustawą o dobrostanie zwierząt w zakresie opieki nad ssakami morskimi.

1. Pobieranie i kriokonserwacja nasienia delfinów

  1. preparat
    1. Przygotować pożywkę FERT (wolną od heparyny i hipotauryny). Przygotować pożywkę FERT-TALP uzupełnioną 25 mM wodorowęglanem, 22 mM mleczanem sodu, 1 mM pirogronianem sodu, 6 mg/ml BSA bez kwasów tłuszczowych i 10 mg/ml heparyny (pH 7,4).
      UWAGA: Przygotuj to podłoże w dniu użycia i przechowuj je w temperaturze 38,5 °C, w atmosferze 5% CO2 i w powietrzu o maksymalnej wilgotności przez co najmniej 2 godziny przed użyciem.
    2. Przygotować TRIS bufor na bazie żółtka jaja. Rozpuść 30,28 g/l Tris, 16,75 g/l kwasu cytrynowego, 12,5 g/l fruktozy i 0,5 g/l streptomycyny w ultraczystej wodzie (pH 7,3, osmolalność = 310 mOsm/kg). Dodaj 20% żółtka (v/v).
  2. Wytrenuj sprawdzonego samca delfina butlonosego hodowlanego, aby leżał w pozycji leżącej grzbietowej w pobliżu krawędzi basenu w celu dobrowolnego pobrania nasienia.
    UWAGA: Samiec delfina powinien być szkolony przez 6 miesięcy poprzez pozytywne wzmocnienie, jak opisano wcześniej4.
  3. Wykonuj różne stymulacje dotykowe, delikatnie naciskając obszar czaszki rowka narządów płciowych delfina, aby wywołać dobrowolne wysunięcie penisa z rowka narządów płciowych.
  4. Po osiągnięciu pełnej erekcji skieruj końcówkę penisa do sterylnego pojemnika, aby uzyskać ejakulat.
  5. Utrzymać próbkę nasienia w temperaturze 37 °C do czasu analizy. Powtórz kroki 1.3 i 1.4 dla kolejnych kolekcji ejakulatu, za każdym razem używając nowego szkła propylenowego.
  6. Natychmiast po pobraniu należy oznaczyć objętość za pomocą szklanego cylindra z podziałką uprzednio ogrzanego do temperatury 37 °C. Ocenić barwę, pH i osmolarność (za pomocą mikroosmometru) ejakulatu.
  7. Aby ocenić stężenie plemników w ejakulacie, należy dodać 10 μl zawiesiny nasienia do probówki eppendorfa zawierającej 90 μl wody destylowanej. Określ stężenie plemników za pomocą komory do liczenia plemników.
    UWAGA: Podczas oceny utrzymuj pozostałą część ejakulatu w temperaturze 37 °C.
  8. Oceń parametry ruchliwości.
    1. Weź 10 μl próbki nasienia i umieść ją we wstępnie podgrzanej komorze nasienia.
    2. Oceń ruchliwość za pomocą wspomaganego komputerowo systemu analizy nasienia, wcześniej zwalidowanego dla delfina butlonosego, aby obiektywnie ocenić ruchliwość plemników2.
      UWAGA: W razie potrzeby rozcieńczyć próbkę nasienia pożywką FERT (wolną od heparyny i hipotauryny) w celu odpowiedniej wizualizacji ruchliwości plemników. Podczas oceny należy utrzymywać próbkę w temperaturze 37 °C na podgrzewanym stoliku mikroskopowym.
  9. Pobrać 20 μl próbki nasienia i ocenić żywotność oraz morfologię plemników zgodnie z wcześniejszym opisem5.
  10. Przenieś próbkę nasienia do probówki wirówkowej. Odwirować próbkę nasienia o masie 250 x g przez 5 minut. Po określeniu stężenia plemników za pomocą komory zliczającej, dostosuj stężenie plemników do 400 x 106 plemników/ml.
    UWAGA: W razie potrzeby rozcieńczyć osad z zagęszczonych ejakulatów wyizolowanym osoczem nasiennym z nadmiaru objętości tego samego ejakulatu przez odwirowanie (250 x g, 10 min).
    1. W ciągu 5 minut powoli rozcieńczać próbkę nasienia w stosunku 1:1 (v/v) buforem na bazie żółtka jaja TRIS zawierającym 1,5% glicerolu. Umieścić probówkę zawierającą zawiesinę nasienia w temperaturze 5 °C na 1 h 30 min.
    2. Przeprowadzić drugie rozcieńczenie zawiesiny nasienia za pomocą buforu TRIS na bazie żółtka jaja zawierającego glicerol, aby uzyskać 3% końcowe stężenie glicerolu i końcowe stężenie 200 x10,6 plemników/ml. Zawiesinę nasienia należy utrzymywać w temperaturze 5 °C przez 10 minut.
  11. Załaduj zawiesinę nasienia do słomek o pojemności 0,25 ml. Zgrzej słomki. Umieść słomki w stojaku 4,5 cm nad ciekłym azotem na 10 minut. Zanurz słomki w ciekłym azocie i przechowuj do oceny.

2. Heterologiczne zapłodnienie in vitro z wykorzystaniem nienaruszonych oocytów bydlęcych Zona

  1. preparat
    1. Przygotować roztwór barwiący i podłoże montażowe.
      1. Przygotować roztwór podstawowy Hoechsta, rozpuszczając 1 mg Hoechst w 1 ml wody destylowanej. Przygotować 30 μl porcji i przechowywać je w ciemności w temperaturze -20 °C do czasu użycia. Przygotować roztwór barwiący, dodając 25 μl roztworu podstawowego Hoechst do 5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) uzupełnionej 1 g/l PVA. Dobrze wymieszać i przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
      2. Przygotować podłoże mocujące, mieszając 6,25 ml PBS z 6,25 ml glicerolu i 6,25 μl roztworu podstawowego Hoechsta. Dobrze wymieszać i przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
    2. Przygotuj pożywkę do pobrania komórek jajowych i zapłodnienia in vitro.
      1. Przygotuj roztwór soli fizjologicznej, dodając 0,5 ml gentamycyny do 0,9% wody destylowanej NaCl.
      2. Przygotuj podstawową pożywkę dojrzewającą, dodając 10 ng/ml naskórkowego czynnika wzrostu (EGF) i 10% płodowej surowicy cielęcej (FCS) do 10 ml TCM-199. Oba media należy utrzymywać w temperaturze 38,5 °C, w atmosferze 5% CO2 i w powietrzu o maksymalnej wilgotności przez co najmniej 2 godziny przed użyciem.
  2. Jajniki należy pobrać w rzeźni w roztworze soli fizjologicznej w temperaturze 33–35 °C i przetransportować do laboratorium w ciągu 4 godzin od pobrania.
  3. Po znalezieniu się w laboratorium należy trzykrotnie przemyć jajniki w celu usunięcia zanieczyszczeń i krwi za pomocą roztworu soli fizjologicznej podgrzanego uprzednio do 37 °C. Podczas tego procesu należy utrzymywać jajniki w roztworze soli fizjologicznej w temperaturze 37 °C.
  4. Odessać od 2 do 8 mm pęcherzyków za pomocą igły 18G i strzykawki o pojemności 10 ml. Pobrać odessany płyn pęcherzykowy do probówek o pojemności 50 ml.
  5. Pozostawić płyn pęcherzykowy zawierający oocyty na około 15 minut w temperaturze 37 °C, aż komórki osiądą. Usunąć supernatant z probówki za pomocą pipety Pasteura i ponownie zawiesić osad w PBS.
  6. Odzyskaj kompleksy wzgórek-oocyty (COC) w naczyniach o średnicy 90 mm pod mikroskopem stereoskopowym.
  7. Umyj COC trzy razy w PBS i raz w pożywce do dojrzewania.
  8. Przenieś morfologicznie normalne COC do 4-dołkowych szalek, z których każda zawiera 500 ml pożywki do dojrzewania, w grupach po 50 COC na studzienkę.
    UWAGA: W tym przypadku użyto trzech studzienek – jednej studzienki do heterologicznego zapłodnienia in vitro, jednej studzienki kontrolnej do homologicznego zapłodnienia in vitro i jednej studzienki zawierającej tylko dojrzałe COC jako kontrolę partenogenetyczną.
  9. Inkubować COC przez 24 godziny w temperaturze 38,5 °C, w atmosferze 5% CO2 i w powietrzu o maksymalnej wilgotności.
  10. Przygotuj podłoże i gradient gęstości.
    1. Aby przygotować pożywkę do nawożenia (FERT), należy uzupełnić pożywkę FERT-TALP o 25 mM wodorowęglanu, 22 mM mleczanu sodu, 1 mM pirogronianu sodu, 6 mg/ml BSA bez kwasów tłuszczowych i 10 mg/ml heparyny. Przechowywać w temperaturze 38,5 °C, w atmosferze 5% CO2 i w powietrzu o maksymalnej wilgotności przez co najmniej 2 godziny przed użyciem.
    2. Przygotować gradient gęstości, dodając 1 ml pożywki o gradientze gęstości do probówki o pojemności 15 ml i 3 ml roztworu myjącego do probówki o pojemności 15 ml. Utrzymuj je w temperaturze 38,5 °C przez co najmniej 1 godzinę.
  11. Dojrzałe oocyty in vitro należy przemyć dwukrotnie w pożywce FERT.
  12. Przenieś oocyty do 4-dołkowych szalek, z których każda zawiera 50 COC w 250 ml FERT. Utrzymuj 4-dołkowe szalki w temperaturze 38,5 °C, w atmosferze 5% CO2 i w powietrzu o maksymalnej wilgotności, przygotowując plemniki do zapłodnienia.
  13. Rozmrozić zamrożoną słomkę zawierającą plemniki delfina w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przez 50 s.
    UWAGA: Nasienie bydła do homologicznego zapłodnienia in vitro musi być przetwarzane równolegle, zgodnie ze standardowym protokołem dla homologicznego zapłodnienia in vitro bydła.
  14. Pobrać 10 μl próbki nasienia i umieścić ją we wstępnie podgrzanej komorze do liczenia nasienia. Oceń ruchliwość za pomocą wspomaganego komputerowo systemu analizy nasienia, wcześniej zwalidowanego dla tego gatunku, aby obiektywnie ocenić ruchliwość plemników. W tym czasie utrzymuj próbkę nasienia w temperaturze 38,5 °C.
  15. Dodaj próbkę nasienia do probówki gradientu gęstości (krok 2.10.2). Wirować przez 10 minut przy 250 x g.
  16. Ostrożnie usunąć supernatant za pomocą pipety Pasteura. Dodać 3 ml roztworu myjącego do probówki zawierającej osad. Ponownie zawiesić granulkę, delikatnie mieszając.
  17. Wirować przez 5 minut przy 250 x g. Usunąć supernatant za pomocą pipety Pasteura do objętości plemników 300 μl.
  18. Dodać 5 μl zawiesiny nasienia do mikrowirówki zawierającej 95 μl wody destylowanej. Utrzymać zawiesinę nasienia w temperaturze 38,5 °C. Napełnić komorę do liczenia komórek 10 μl roztworu plemników w stosunku 1:20 i zmierzyć stężenie. Obliczyć ilość pożywki FERT, którą należy dodać do 100 μl plemników, aby uzyskać 2 x 106 plemników/ml.
  19. Dodaj obliczony FERT i objętość plemników do probówki o pojemności 15 ml i delikatnie wymieszaj za pomocą pipety Pasteura.
  20. Dodać 250 μl zawiesiny plemników-FERT do każdego dołka 4-dołkowej płytki zawierającej pożywkę FERT z dojrzałymi oocytami, aby uzyskać końcowe stężenie 1 x10,6 plemników/ml.
  21. Współinkubować gamety przez 18 godzin w temperaturze 38,5 °C, w atmosferze 5% CO2 i w powietrzu o maksymalnej wilgotności.
  22. Przygotować pożywkę hodowlaną na bazie syntetycznego płynu jajowodowego uzupełnionego 5% FCS. Przygotuj 25 μl syntetycznych kropelek kultury płynu jajowodowego w 35-milimetrowych naczyniach pokrytych 3 ml oleju mineralnego. Przechowywać w temperaturze 38,5 °C, w atmosferze 5% CO2 i w powietrzu o maksymalnej wilgotności przez co najmniej 2 godziny przed użyciem.
  23. Po 2,5 godziny od jednoczesnej inkubacji należy wyjąć 20 oocytów z szalki; pozostałe oocyty należy utrzymać w inkubatorze w tych samych warunkach.
    1. Usuń luźno przyczepione plemniki, energicznie pipetując połowę oocytów przez pipetę Pasteura o wąskim otworze 10 razy.
    2. Utrwalić 20 oocytów w 50 μl 0,5% aldehydu glutarowego przez 30 min. Myć oocyty w PBS przez 5 min. Przenieść oocyty do 50 μl roztworu barwiącego Hoechst przez 15 min i myć oocyty w PBS przez 5 min.
    3. Przenieś oocyty pojedynczo do 2 μl kropelek pożywki montażowej w ilości 10 oocytów na szkiełko. Delikatnie przykryj szkiełkiem nakrywkowym i uszczelnij lakierem do paznokci.
    4. Policz liczbę plemników przyczepionych do oocytów bydlęcych za pomocą mikroskopu z kontrastem fazowym wyposażonego w epifluorescencyjną optykę i filtr wzbudzenia 361 nm przy 40-krotnym powiększeniu.
  24. Po 12 godzinach wspólnej inkubacji należy usunąć 10 przypuszczalnych zygot z szalek 4-dołkowych; pozostałe przypuszczalne zygoty należy utrzymać w inkubatorze w tych samych warunkach.
    1. Przenieś 10 przypuszczalnych zygot do 15-mililitrowej probówki wirówkowej zawierającej 2 ml PBS i delikatnie wiruj przez 2 minuty, aby usunąć komórki wzgórka. Umyć dwukrotnie w PBS, utrwalić i zabarwić, jak opisano wcześniej (krok 2.23.2).
  25. Po 18, 20, 22 i 24 godzinach wspólnej inkubacji usuń 10 przypuszczalnych zygot z 4-dołkowych szalek i wiruj, utrwalaj i barwij je zgodnie z wcześniejszym opisem (krok 2.23.2). Utrzymuj resztę przypuszczalnych zygot w inkubatorze w tych samych warunkach.
    1. Oceń tworzenie przedjądrka i polispermię pod mikroskopem kontrastowo-fazowym/epifluorescencyjnym zarówno w homologicznych, jak i heterologicznych grupach IVF, barwiąc Hoechstem.
    2. Oceń tworzenie się jądra w 10 losowo wybranych przypuszczalnych zygotach hybrydowych na próbkę. Potwierdź tworzenie się projądrka pod konfokalnym laserowym mikroskopem skaningowym przy wzbudzeniu laserem argonowym 488 nm i detekcji od 515 do 530 nm.
    3. Optycznie wycinaj przypuszczalne zygoty sekwencyjnie (2 mm) i zbieraj obrazy za pomocą oprogramowania do obrazowania. Wizualizacja za pomocą pakietu oprogramowania do analizy 3D.
    4. Po 24 godzinach wspólnej inkubacji przemyć 50 przypuszczalnych zygot cztery razy w PBS i dwukrotnie w pożywce hodowlanej.
  26. Przenieś je w grupach po 25 mikrokropelek pożywki uprzednio przygotowanej i zrównoważonej.
  27. Przechowywać w temperaturze 38,5 °C w atmosferze 5%O2/5% CO2 i w powietrzu o maksymalnej wilgotności.
  28. Po 26 i 28 godzinach wspólnej inkubacji usuń 10 przypuszczalnych zygot z szalek i zwiruj je, utrwal i zabarw, jak opisano wcześniej (krok 2.23.2).
  29. Po 48 godzinach hodowli obserwuj rozszczepienie pod mikroskopem stereoskopowym.
  30. Usunąć osłonkę przejrzystą (ZP), przenosząc zarodki do roztworu proteazy o stężeniu 5 mg/ml.
  31. Indywidualnie umyj każdy zarodek trzy razy w PBS. Zamroź je błyskawicznie w ciekłym azocie w probówkach do mikrowirówek o pojemności 0,2 ml. Przechowywać je w temperaturze -80 °C do czasu analizy.

3. PCR

  1. Materiały i odczynniki
    UWAGA: Odczynniki, materiały i sprzęt używane do wykonania protokołu PCR są wyszczególnione w Tabeli materiałów i obejmują stojak na probówki do PCR i zestaw mikropipet (P2, P20, P200, P1000), probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml, probówki i nakrętki do PCR, termocykler, oświetlacz UV, żel agarozowy i bufor (Tris Borate EDTA (TBE)).
    1. Delikatnie rozmrozić wszystkie odczynniki na lodzie. Utrzymuj je w lodzie przez cały czas trwania eksperymentu. Stosować deoksynukleotydy (dNTP; dATP, dCTP, dTTP i dGTP), docelowe startery na genie odniesienia kodującym białko rybosomalne delfina 18 S (DQ404537.1); R1: TTGGACACACCCACGGTGCGG i F2: CAGAAGGACGTGAAGGATGGA), polimeraza DNA, 5-krotny bufor dla polimerazy DNA, matryca DNA, sterylna woda i chlorek magnezu (MgCl2 w końcowym stężeniu 5,0 mM).
    2. Żel agarozowy i przygotowanie próbki.
      1. Przygotuj próbki DNA plemników delfinów i bydła.
        1. Rozmrażać zamrożoną słomkę każdego gatunku w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przez 50 s. Dodać 3 ml roztworu myjącego. Wirować przy 250 x g przez 10 min. Usunąć supernatant. Dodać 30 μl buforu do lizy STES (50 mM Tris-HCl, pH 8; 20 mM NaCl; i 1 mM 0,1% SDS), 2 μl proteinazy K (20 mg/ml) i 5 μl ditiotreitolu (DTT); stężenie końcowe: 150 mM. Przechowywać przez noc w temperaturze 55 °C. Dodać 200 μl ultraczystej wody. Wirować przy 250 x g przez 5 min. Zachować supernatant. Zmierzyć stężenie DNA za pomocą spektrofotometru.
      2. Wykonaj seryjne rozcieńczenia DNA z plemników delfinów (tj. 40, 4 i 0,4 ng/ml) ultraczystą wodą, aby sprawdzić, czy warunki PCR są w stanie wykryć niewielką ilość DNA delfina.
      3. Wykonaj seryjne rozcieńczenia DNA plemników bydlęcych (tj. 4 000, 400, 40 i 4 ng / ml) ultraczystą wodą, aby sprawdzić, czy warunki PCR są w stanie wykryć niewielką ilość bydlęcego DNA.
      4. Przygotuj zarodki delfina i bydła. Rozmrozić zarodki na lodzie. Dodać 8 μl 100 μg/ml proteinazy K i utrzymywać przez noc w temperaturze 55 °C. Aby zatrzymać reakcję, należy umieścić próbki w temperaturze 96 °C na 5 minut.
      5. Przygotować 2% bufor do żelu agarozowego do KZM i dodać 20 μl barwnika kwasem nukleinowym przy użyciu standardowych technik.
    3. Przygotowanie do PCR.
      1. Oznaczone probówki do PCR: seryjne rozcieńczenia delfinów (40, 4 i 0,4 ng/ml), seryjne rozcieńczenia bydła (4,000, 400, 40 i 4 ng/ml), homologiczny dwukomórkowy zarodek bydlęcy, dwukomórkowe przypuszczalnie heterologiczne zarodki i kontrola ujemna.
      2. Przygotować mieszaninę wzorcową w sterylnej probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml do końcowej objętości 25 μl na reakcję.
        1. Dodać 5 μL elastycznego buforu 5X polimerazy DNA, 0,5 μL dNTP (10 mM), 1,5 μL MgCl2 (25 mM), 0,5 μL startera do przodu i do tyłu (10 μM), 1,5 μL matrycy DNA (plemniki) lub 8 μL matrycy DNA (zarodki dwukomórkowe), 0,07 μL polimerazy Taq, i sterylna woda destylowana do 25 μl końcowej objętości. Dobrze wymieszaj.
  2. Protokół amplifikacji
    1. Umieść probówki w termocyklerze. Wybierz następujący program: 94 °C przez 3 min; 40 cykli w temperaturze 94 °C przez 15 s, 59 °C przez 25 s, 72 °C przez 20 s; i 72 °C przez 5 min. Uruchom program.
    2. Przechowywać probówki w temperaturze 4 °C. Dodać 2,5 μl buforu ładującego do każdego produktu PCR w temperaturze 4 °C i załadować 15 μl mieszaniny do studzienek z 2% żelem agarozowym. Użyj markera drabinkowego DNA, aby dokładnie oszacować rozmiar fragmentów PCR.
    3. Wykonuj elektroforezę przez 15 minut, aby umożliwić migrację DNA. Wizualizacja pasm za pomocą oświetlacza UV.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wszystkie zaprezentowane tutaj wyniki, tabele i rysunki (1 i 2) zostały powielone za zgodą3.

Plemniki delfinów wykazują wysoką ruchliwość po zamrożeniu i rozmrożeniu

W zamrożonych i rozmrożonych ejakulatach delfina odnotowano wartości (% ± SD) na poziomie 84,5 ± 5,3 dla całkowitej ruchliwości oraz 69,1 ± 5,1 dla ruchliwości progresywnej plemników. ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W przypadku wielu różnych gatunków ssaków stosowanie mrożonych i rozmrożonych nasienia ma różne zalety. Należą do nich zdolność do przenoszenia cennego materiału genetycznego, możliwość dystrybucji na całym świecie, niskie ryzyko zanieczyszczenia oraz zdolność do zachowania męskich gamet przez dziesięciolecia. Stosowanie krioprezerwowanych nasień jest niezbędne w przypadku delfina butlonosego, ponieważ gatunek ten jest chroniony na mocy załącznika II do CITES, który ogranicza transport i wymianę zwierząt między różnymi p...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

jego praca została sfinansowana przez hiszpańskie Ministerstwo Gospodarki i Konkurencyjności (AGL2015-70140-R dla D. Rizosa, AGL2015-66145R dla A. Gutierrez-Adan i J. F. Pérez-Gutiérrez) oraz Seneca Foundation of Murcia (Grant 20040/GERM/16 dla F. García-Vázquez)

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
FERT-TALP średniMerck
TCM-199SigmaM-4530
Hoechst 33342SigmaB-2261
Naczynia 4-dołkoweNunc176740
Gradient gęstości BoviPureNidacon InternationalBP-100
Roztwór myjący BoviwashNidacon InternationalBW-100
Chlorek magnezuPromegaA35 1H
Sterylna wodaMili Q sintesis A10 MilliporeA35 1H
Bufor Tris Boran EDTASigmaT4415
MB agarozaBiotools20.012
5X GoTaq elastyczny buforMili Q sintesis A10 MiliporeM 890 A
MB agarozaBiotools20.012
Polimeraza TaqPromega
SafeViewNBS Biologicals Ltd.M 890 A
Komora licząca MaklerSefi Medical
Komora ThomaHecht-Assistant
pHmetr MicropH 2000Crison Instruments Osmometr
Zaawansowany mikro osmometr 3300Norwood
Komputerowy system analizy nasieniaProjekty y Serveis B+D
Mikroskop stereoskopowy MZ 95Leica
Optyka epifluorescencyjna Eclipse Te300Nikon
Oprogramowanie Confocal assistant 4.02analizy 3DBio-Rad
Konfokalna laserowa mikroskopia skaningowaBio-Rad
Micropippetes (P2. P20, P200, P1000)Probówki do
VWR
UV iluminatorBio-Rad
PCR Termocykler Primus 96 PlusMWG AG Biotech
Oprogramowanie do mikrowirówek Gilson

Bibliografia

  1. Montano, G. A., et al. Evaluation of motility, membrane status and DNA integrity of frozen-thawed bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) spermatozoa after sex-sorting and recryopreservation. Reproduction. 143 (6), 799-813 (2012).
  2. Sánchez-calabuig, M. J., et al. Validation of a field based chromatin dispersion assay to assess sperm DNA fragmentation in the bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Reprod Domest Anim. 49 (5), 761-768 (2014).
  3. Sánchez-calabuig, M. J., et al. Heterologous murine and bovine IVF using bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) spermatozoa. Theriogenology. 84 (6), 983-994 (2015).
  4. Keller, K. V. Training of the Atlantic bottlenose dolphins (Tursiops truncatus) for artificial insemination. IAAAM. 14 (22), 22-24 (1986).
  5. Robeck, T. R., O'brien, J. K. Effect of cryopreservation methods and precryopreservation storage on bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) spermatozoa. Biol Reprod. 70 (5), 1340-1348 (2004).
  6. Coy, P., et al. Hardening of the zona pellucida of unfertilized eggs can reduce polyspermic fertilization in the pig and cow. Reproduction. 135 (1), 19-27 (2008).
  7. Seager, S., W, G., Moore, L., Platz, C., Kirby, V. Semen collection (electroejaculation), evaluation and freezing in the Atlantic bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Proceedings of the American Association of Zoo Veterinarians. 136, (1981).
  8. Schroeder, J. P. Breeding Bottlenose Dolphins in captivity. The Bottlenose dolphin. Leatherwood, S., Reeves, R. R. , Academic Press. San Diego. 447-460 (1990).
  9. Sánchez-Calabuig, M. J., et al. Effect of cryopreservation on the sperm DNA fragmentation dynamics of the bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Reprod Domest Anim. 50 (2), 227-235 (2015).
  10. Robeck, T. R., et al. Estrous cycle characterisation and artificial insemination using frozen-thawed spermatozoa in the bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Reproduction. 129 (5), 659-674 (2005).
  11. Robeck, T. R., et al. Development and evaluation of deep intra-uterine artificial insemination using cryopreserved sexed spermatozoa in bottlenose dolphins (Tursiops truncatus). Anim Reprod Sci. 139 (1-4), 168-181 (2013).
  12. Schroeder, J. P. Breeding Bottlenose Dolphins in captivity. The Bottlenose dolphin. Leatherwood, S., Reeves, R. R. , Academic Press. San Diego. 447-460 (1990).
  13. Madeddu, M., et al. Effect of cooling rate on the survival of cryopreserved rooster sperm: Comparison of different distances in the vapor above the surface of the liquid nitrogen. Anim Reprod Sci. , (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

plemniki delfinaheterologiczne IVFoocyty bydl ceb ona przejrzystaformowanie si j der przednichtempo podzia wanaliza PCRruchliwo plemnik wciek y azot
Plemniki delfina butlonosego (Tursiops truncatus): zbieranie, kriokonserwacja i heterologiczne zapłodnienie in vitro
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.