Tutaj prezentujemy protokoły, które zostały z powodzeniem wykorzystane do pobierania plemników delfinów, krioprezerwacji i heterologicznego wykonywania IVF przy użyciu oocytów bydlęcych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Plemniki delfina butlonosego (Tursiops truncatus): zbieranie, kriokonserwacja i heterologiczne zapłodnienie in vitro
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Użycie kriokonserwowanych plemników delfinów ułatwia wymianę materiału genetycznego między parkami wodnymi i udostępnia plemniki laboratoriom do badań, które pozwolą nam lepiej zrozumieć rozmnażanie ssaków morskich. Heterologiczne zapłodnienie in vitro, zastępujące homologiczne zapłodnienie in vitro, może stanowić środek do badania potencjału płodności plemników; badanie fizjologii gamet i wczesnego rozwoju zarodka; oraz unikanie wykorzystywania cennych oocytów delfinów, które są trudne do zdobycia. W tym miejscu przedstawiamy protokoły, które z powodzeniem stosowano do pobierania i krioprezerwacji plemników delfinów. Pobieranie nasienia odbywa się poprzez manualną stymulację wyszkolonych delfinów. Kriokonserwację przeprowadza się za pomocą wypełniacza TRIS na bazie żółtka jaja z glicerolem. Ponadto przedstawiamy protokół, który opisuje heterologiczne zapłodnienie in vitro z wykorzystaniem plemników delfinów i oocytów bydlęcych oraz weryfikuje hybrydowy charakter powstałego zarodka za pomocą PCR. Zapłodnienie heterologiczne rodzi pytania dotyczące zapłodnienia i może być wykorzystywane jako narzędzie do badania fizjologii gamet i wczesnego rozwoju zarodka. Ponadto sukces heterologicznego zapłodnienia in vitro pokazuje potencjał tej techniki do testowania zdolności zapłodnienia plemników delfinów, co jest warte dalszych badań.
Wprowadzenie
Technologie wspomaganego rozrodu są słabo rozwinięte u dzikich zwierząt, w tym u ssaków morskich. Brak czułych metod oceny sukcesu zapłodnienia plemników przyczynia się do powolnego rozwoju technologii rozrodczych u gatunków takich jak delfiny. Dopiero niedawno opisano podstawowe parametry nasienne delfina butlonosego (Tursiops truncatus)1,2. Jednak zmienne, takie jak ruchliwość i morfologia, choć szeroko stosowane, dostarczają ograniczonych informacji na temat wydajności reprodukcyjnej. Najlepszym wskaźnikiem jakości nasienia jest ocena potencjału zapłodnienia.
Ostatnio na....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Oświadczenie etyczne: Wszystkie procedury eksperymentalne zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (INIA). Wszystkie doświadczenia przeprowadzono zgodnie z Przewodnikiem opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych, przyjętym przez Towarzystwo Badań nad Rozrodem, oraz zgodnie z ustawą o dobrostanie zwierząt w zakresie opieki nad ssakami morskimi.
1. Pobieranie i kriokonserwacja nasienia delfinów
- preparat
- Przygotować pożywkę FERT (wolną od heparyny i hipotauryny). Przygotowa....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Wszystkie zaprezentowane tutaj wyniki, tabele i rysunki (1 i 2) zostały powielone za zgodą3.
Plemniki delfinów wykazują wysoką ruchliwość po zamrożeniu i rozmrożeniu
W zamrożonych i rozmrożonych ejakulatach delfina odnotowano wartości (% ± SD) na poziomie 84,5 ± 5,3 dla całkowitej ruchliwości oraz 69,1 ± 5,1 dla ruchliwości progresywnej plemników. .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W przypadku wielu różnych gatunków ssaków stosowanie mrożonych i rozmrożonych nasienia ma różne zalety. Należą do nich zdolność do przenoszenia cennego materiału genetycznego, możliwość dystrybucji na całym świecie, niskie ryzyko zanieczyszczenia oraz zdolność do zachowania męskich gamet przez dziesięciolecia. Stosowanie krioprezerwowanych nasień jest niezbędne w przypadku delfina butlonosego, ponieważ gatunek ten jest chroniony na mocy załącznika II do CITES, który ogranicza transport i wymianę zwierząt między różnymi p.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
jego praca została sfinansowana przez hiszpańskie Ministerstwo Gospodarki i Konkurencyjności (AGL2015-70140-R dla D. Rizosa, AGL2015-66145R dla A. Gutierrez-Adan i J. F. Pérez-Gutiérrez) oraz Seneca Foundation of Murcia (Grant 20040/GERM/16 dla F. García-Vázquez)
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| FERT-TALP średni | Merck | ||
| TCM-199 | Sigma | M-4530 | |
| Hoechst 33342 | Sigma | B-2261 | |
| Naczynia 4-dołkowe | Nunc | 176740 | |
| Gradient gęstości BoviPure | Nidacon International | BP-100 | |
| Roztwór myjący Boviwash | Nidacon International | BW-100 | |
| Chlorek magnezu | Promega | A35 1H | |
| Sterylna woda | Mili Q sintesis A10 Millipore | A35 1H | |
| Bufor Tris Boran EDTA | Sigma | T4415 | |
| MB agaroza | Biotools | 20.012 | |
| 5X GoTaq elastyczny bufor | Mili Q sintesis A10 Milipore | M 890 A | |
| MB agaroza | Biotools | 20.012 | |
| Polimeraza Taq | Promega | ||
| SafeView | NBS Biologicals Ltd. | M 890 A | |
| Komora licząca Makler | Sefi Medical | ||
| Komora Thoma | Hecht-Assistant | ||
| pHmetr MicropH 2000 | Crison Instruments Osmometr | ||
| Zaawansowany mikro osmometr 3300 | Norwood | ||
| Komputerowy system analizy nasienia | Projekty y Serveis B+D | ||
| Mikroskop stereoskopowy MZ 95 | Leica | ||
| Optyka epifluorescencyjna Eclipse Te300 | Nikon | ||
| Oprogramowanie Confocal assistant 4.02 | analizy 3D | Bio-Rad | |
| Konfokalna laserowa mikroskopia skaningowa | Bio-Rad | ||
| Micropippetes (P2. P20, P200, P1000) | Probówki do | ||
| VWR | |||
| UV iluminator | Bio-Rad | ||
| PCR Termocykler Primus 96 Plus | MWG AG Biotech |
Bibliografia
- Montano, G. A., et al. Evaluation of motility, membrane status and DNA integrity of frozen-thawed bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) spermatozoa after sex-sorting and recryopreservation. Reproduction. 143 (6), 799-813 (2012).
- Sánchez-calabuig, M. J., et al.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
