Artykuł metodologiczny

MitoCeption: Przenoszenie izolowanych ludzkich mitochondriów MSC do komórek macierzystych glejaka

DOI:

10.3791/55245

⸱

22 lutego 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Regenerative Medicine and Biotherapy (IRMB), INSERM U1183, Montpellier University, 2Institute of Neurosciences of Montpellier (INM), INSERM U1051, Montpellier University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj przedstawiono protokół (MitoCeption) do transferu mitochondriów, wyizolowanych z ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC), do komórek macierzystych glejaka (GSC), w celu zbadania ich biologicznego wpływu na metabolizm i funkcje GSC. Podobny protokół można dostosować do przenoszenia mitochondriów między innymi typami komórek.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitochondria odgrywają kluczową rolę w metabolizmie komórkowym, produkcji energii i kontroli apoptozy. Stwierdzono, że niewystarczająca funkcja mitochondriów jest odpowiedzialna za bardzo różne choroby, od patologii neurologicznych po raka. Co ciekawe, ostatnio wykazano, że mitochondria wykazują zdolność do przenoszenia między typami komórek, zwłaszcza z ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) do komórek nowotworowych w warunkach kokultury, co ma konsekwencje metaboliczne i funkcjonalne dla komórek biorcy mitochondriów, co jeszcze bardziej zwiększa obecne zainteresowanie właściwościami biologicznymi tych organelli.

Ocena efektów przeniesionych mitochondriów MSC w komórkach docelowych ma zasadnicze znaczenie dla zrozumienia biologicznych wyników takich interakcji komórka-komórka. Opisany tutaj protokół MitoCeption pozwala na transfer mitochondriów wyizolowanych wcześniej z komórek dawcy do komórek docelowych, przy użyciu mitochondriów MSC i komórek macierzystych glejaka (GSC) jako systemu modelowego. Protokół ten był wcześniej używany do przenoszenia mitochondriów, wyizolowanych z MSC, do przylegających komórek nowotworowych MDA-MB-231. Ten protokół transferu mitochondriów jest tutaj dostosowany do GSC, które wykazują specyficzną specyfikę wzrostu jako neurosfery in vitro. Po przeniesieniu izolowanych mitochondriów można przeprowadzić sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) i obrazowanie konfokalne przy użyciu barwników niezbędnych do utrzymania mitochondriów. Wykorzystanie mitochondriów dawcy i komórek docelowych o odrębnych haplotypach (SNP) umożliwia również wykrywanie przenoszonych mitochondriów na podstawie stężenia ich kołowego mitochondrialnego DNA (mtDNA) w komórkach docelowych. Po zatwierdzeniu protokołu pod kątem tych kryteriów, komórki zawierające przeniesione mitochondria mogą być dalej analizowane w celu określenia wpływu egzogennych mitochondriów na właściwości biologiczne, takie jak metabolizm komórkowy, plastyczność, proliferacja i odpowiedź na terapię.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitochondria to organelle znajdujące się w komórkach eukariotycznych, gdzie odgrywają kluczową rolę w pobieraniu składników odżywczych, a także w produkcji energii i metabolitów. Organelle te zawierają koliste mitochondrialne DNA (mtDNA) o długości 16,6 kb, które koduje białka kompleksów łańcucha transportu elektronów, tRNA i rRNA 1. Funkcjonalność tych organelli ma kluczowe znaczenie dla homeostazy komórek, a kilka patologii jest związanych z dysfunkcją mitochondriów 1,2,3. Status mitochondriów został na przykład powiązany ze stanem zapalnym, chorobami zakaźnymi i rakiem, w tym ostatnim przypadku z konsekwencjami dla przerzutów i oporności na terapię 4,5,6,7.

Mitochondria wykazują niezwykłą zdolność do przenoszenia się między komórkami "dawcy" i "celu". Prowadzi to do zmian w metabolizmie energetycznym komórek docelowych, a także w innych modyfikacjach funkcjonalnych, takich jak naprawa tkanek i odporność na chemioterapeutyki, jak ostatnio wykazały różne laboratoria 8,9,10,11,12,13,14,15,16. Ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) wykazują tę zdolność do przenoszenia mitochondriów do szerokiej gamy komórek docelowych, w tym kardiomiocytów, komórek śródbłonka, komórek nabłonka pęcherzyków płucnych, komórek kanalików nerkowych i komórek nowotworowych, co prowadzi do modyfikacji właściwości funkcjonalnych tych komórek 8,9,10,12,17,18.

Wymiana mitochondriów pojawia się teraz jako powszechnie stosowany mechanizm, który pozwala wielu różnym typom komórek komunikować się ze sobą i modyfikować ich właściwości biologiczne. Ta wymiana mitochondriów może zachodzić poprzez tworzenie nanorurek tunelowych (TNT), obejmujących połączenia szczelinowe zawierające koneksynę 43 8 lub M-Sec/TNFaip2 i kompleks egzocyst 19. Alternatywnie, wykazano również, że w transferze mitochondriów pośredniczą mikropęcherzyki (ARMM) zawierające białko 1 zawierające arrestinę 20. Co ciekawe, skuteczność transferu mitochondriów była związana z szybkością ekspresji Rho GTPase 1 MIRO1 21, kluczowym czynnikiem wyjaśniającym różnice w skuteczności transferu mitochondriów między iPSC-MSCs a dorosłymi BM-MSCs 22.

Pomimo tego bogactwa danych dotyczących wymiany mitochondriów między komórkami, stosunkowo niewiele wiadomo o metabolicznym i biologicznym wyniku tego transferu mitochondriów. W związku z tym w pełni uzasadnia to ustanowienie odpowiednich narzędzi w celu pełnej oceny biologicznych skutków tego transferu. Na przestrzeni lat zaproponowano kilka podejść technicznych do przenoszenia mitochondriów z komórek dawcy do komórek akceptorowych. Obejmuje to bezpośrednie wstrzykiwanie mitochondriów do oocytów 23,24,25, fuzję komórek w celu wygenerowania cybridów transmishondrialnych 26,27 oraz, ostatnio, transfer izolowanych mitochondriów za pomocą nanoostrzy fototermicznych 28.

My i inni wcześniej wykazaliśmy zdolność izolowanych mitochondriów do internalizacji przez żywe komórki, co zaobserwowano zarówno in vitro, jak i in vivo 29,30,31, poprzez mechanizmy proponowane do udziału w makropinocytozie 32. Następnie opracowaliśmy metodę o nazwie MitoCeption, aby ilościowo przenieść izolowane mitochondria (z MSC) do komórek docelowych, czego przykładem jest (przylegająca) linia komórkowa raka piersi MDA-MB-231 31. Protokół ten został tutaj zaadaptowany do transferu izolowanych ludzkich mitochondriów MSC do komórek macierzystych glejaka wielopostaciowego (GSC).

Glejak wielopostaciowy to agresywne nowotwory złośliwe mózgu, które szybko stają się oporne na leczenie, głównie z powodu komórek macierzystych glejaka (GSC) obecnych w guzie 33. Te GSC rosną jako neurosfery in vitro i generują guzy w modelach ksenoprzeszczepów. Komórki nowotworowe w glejaku mają zdolność do tworzenia połączeń międzykomórkowych, jak wykazano ostatnio w przypadku komórek astrocytowych guza mózgu, które łączą się za pomocą rozszerzonych mikrorurek, przez które mitochondria (a także wapń i jądra komórkowe) mogą migrować, co skutkuje odpornymi na radioterapię sieciami gwiaździaków 34. Glejak wielopostaciowy może rekrutować wiele różnych komórek w mikrośrodowisku guza, w tym MSCs 35,36. Wykazaliśmy, że MSCs mogą nawiązywać połączenia komórka-komórka z GSC w kokulturze i przenosić swoje mitochondria (dane nie pokazane), co ma modyfikować właściwości funkcjonalne GSC. Niniejszy protokół opisuje, w jaki sposób technika MitoCeption może być wykorzystana do transferu mitochondriów, wyizolowanych wcześniej z ludzkich MSC, do ludzkich GSC w celu określenia ich funkcjonalnego wyniku biologicznego. W tym badaniu wykorzystano multipotencjalną i wysoce rakotwórczą linię Gb4 GSC 37.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dzień 1

1. Oznaczanie mitochondriów mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) (opcjonalnie)

  1. Dwa dni przed przygotowaniem mitochondriów należy wysiać ludzkie MSCs w 100 mm szalce hodowlanej, w 10 ml αMEM/FBS 10%, tak aby w dniu 1 w kulturze znajdowały się 4 x 105 MSC.
  2. Przepłukać MSCs PBS (4 ml) i dodać 4 ml αMEM/FBS 1% (podgrzane do 37 °C).
  3. Dodać wymaganą ilość barwnika witalnego mitochondriów i inkubować komórki przez 30 minut w inkubatorze w temperaturze 37 °C.
  4. Usunąć roztwór barwnika mitochondriów, dwukrotnie przepłukać komórki 4 ml podgrzanego (37 °C) αMEM/FBS 1% i dodać z powrotem 4 ml αMEM/FBS 10%. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C.
  5. Zmienić pożywkę hodowlaną (10 ml αMEM/FBS 10%) po 30 minutach, a innym razem 2 godziny później.

Dzień 1

2. Znakowanie komórek macierzystych glejaka (GSC) (opcjonalnie, zobacz sekcję dyskusji)

Pożywka do hodowli komórkowychkompozycja
Podłoże podstawowe GSC DMEM/F-12 uzupełniony o
Insulina 20 mg/ml
Suplement N2 1x
Glukoza 3 g/L
L-glutamina 2 mM
Medium proliferacyjne GSCDodaj do podłoża podstawowego:
B27 suplement 1x
EGF 10 ng/ml
bFGF 10 ng/ml
Grzyb 10 mg/ml
Fungizon 0,25 mg/ml
Heparyna 2 mg /ml
Ciprofloksacyna 2 μg / ml
Gentamycyna 2 μg/ml
Podłoże proliferacyjne MSC αMEM uzupełniony o
L-glutamina 2 mM
10% FBS
bFGF 2 ng/ml

Tabela 1: Pożywki hodowlane.

  1. Dysocjacja GSC (linia komórkowa Gb4 32 (10 x 106 komórek) hodowane jako neurosfery na kolbach do hodowli komórkowych pokrytych poli-HEMA (patrz kroki 3.1 do 3.12).
  2. Nasiona GSC w 48-dołkowej płytce w10-5 komórkach/baseniku w pożywce proliferacyjnej GSC (500 μl) (patrz Tabela 1).
  3. Odwirować płytkę o masie 270 x g przez 5 minut w temperaturze 20 °C.
  4. Dodać wymaganą ilość barwnika do czynności życiowych komórek i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
  5. Dodać 500 μl podłoża podstawowego GSC (Tabela 1) na dołek płytki 48-dołkowej.
  6. Odwirować płytkę przy 270 x g w temperaturze 20 °C przez 5 minut. Odessać supernatant.
  7. Powtórz kroki od 2.5 do 2.6.
  8. Dodać 500 μl pożywki podstawowej GSC i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
  9. Odwirować płytkę przy 270 x g w temperaturze 20 °C przez 5 minut. Odessać supernatant.
  10. Dodać 500 μl pożywki do proliferacji GSC na dołek płytki 48-dołkowej i inkubować w inkubatorze w temperaturze 37 °C.
    Uwaga: Wskazana ilość GSC (10 x 106 komórek) pozwala na przeprowadzenie różnych eksperymentów dawka-odpowiedź i kontroli FACS. Po dokładniejszym określeniu warunków eksperymentalnych wielkość ta może zostać zmniejszona.

Dzień 2

3. Wysiewanie komórek macierzystych glejaka

  1. Zebrać neurosfery GSC (10 x 106 komórek) przez odwirowanie w temperaturze 270 x g przez 5 minut, w temperaturze 20 °C w probówce o pojemności 50 ml.
  2. Przemyć komórki 5 ml HBSS i odwirować przy 270 x g przez 5 minut w temperaturze 20 °C.
  3. Odessać supernatant.
  4. Delikatnie zawiesić osad GSC w 100 μl trypsyny-EDTA (0,25%) (na 10 x 106 komórek)
  5. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 minuty.
  6. Dodać 10 μl CaCl2 (20 mM) i 2 μl DNazy I (10 mg/ml).
  7. Oddziel neurosfery, delikatnie pipetując w górę i w dół (30-50x) za pomocą pipety P200. Unikaj bąbelków. Sprawdź pod mikroskopem, czy wszystkie GSC są zdysocjowane.
  8. Dodać 10 μl inhibitora trypsyny (5%) i 10 ml HBSS.
  9. Odwirować GSC przy 270 x g przez 7 minut w temperaturze 20 °C.
  10. Odrzucić supernatant i dodać 10 ml pożywki podstawowej GSC (tabela 1).
  11. Policzyć GSC w komorze liczącej Thoma, a następnie odwirować komórki przy 270 x g przez 7 minut w temperaturze 20 °C.
  12. Dodać odpowiednią objętość pożywki do proliferacji GSC (Tabela 1), aby osiągnąć stężenie komórkowe 10-6 GSC/ml.
  13. Wysiew 105 GSC (100 μl zawiesiny komórkowej) na basenik płytki 96-dołkowej.
  14. Odwirować płytki o sile 270 x g przez 7 minut w temperaturze 20 °C, aby na dnie studzienek znalazły się GSC.
  15. Inkubować 96-dołkową płytkę w temperaturze 37 °C do sekcji 5.

Dzień 2

4. Izolacja mitochondriów MSC

  1. Ustawić temperaturę wirówki z mikroprobówkami na 4 °C.
  2. Przygotować dwie probówki "A" i "C" o pojemności 1,5 ml zawierające odczynniki do ekstrakcji mitochondriów (200 μl odczynnika A i 400 μl odczynnika C, obie zawierające inhibitory proteazy wolne od EDTA). Przygotuj 2 inne probówki, oznaczone "MSC" i "Mito". Trzymaj wszystkie probówki na lodzie. Przygotuj również probówki do seryjnych rozcieńczeń mitochondriów.
  3. Umyć MSC 10 ml podgrzanego (37 °C) PBS.
  4. Przemyj MSCs 2 ml trypsyny (bez EDTA) przez 10 sekund i dodaj 1 ml trypsyny (bez EDTA). Inkubować komórki przez 5-10 minut w temperaturze 37 °C.
  5. Odzyskaj MSCs, dodając 10 ml αMEM/FBS 10%, przenieś do probówki o pojemności 50 ml.
  6. Odwirować komórki przy 270 x g przez 5 minut w temperaturze 20 °C.
  7. Odrzucić supernatant i dodać 10 ml αMEM/FBS 10% do osadu komórkowego.
  8. Policz MSC za pomocą komory liczącej Malassez.
  9. Odwirować MSC (4-5 x 105) przy 270 x g przez 5 minut w temperaturze 20 °C.
  10. Odrzucić supernatant, dodać 1 m lodowaty αMEM/FBS 10% do osadu komórkowego i przenieść komórki do probówki znakowanej "MSC" (przygotowanej w kroku 4.2). Trzymaj probówkę na lodzie.
  11. Odwirować probówkę zawierającą MSCs o sile 900 x g przez 5 minut, w temperaturze 4 °C.
  12. Usuń wszystkie resztki pożywki z probówki.
  13. Dodać 200 μl odczynnika A do izolacji mitochondriów (zawierającego inhibitory proteazy wolne od EDTA). Wiruj ze średnią prędkością przez 5 sekund i pozostaw rurki na lodzie dokładnie na 2 minuty.
  14. Dodać 2,5 μl odczynnika do izolacji mitochondriów B. Wirować z maksymalną prędkością przez 10 sekund, a następnie pozostawić probówki na lodzie. Powtarzaj co 30 sekund przez 5 minut.
  15. Dodać 200 μl odczynnika C do izolacji mitochondriów (zawierającego inhibitory proteazy wolne od EDTA). Wymieszaj, przechylając rurkę (około 30 razy, nie wirować). Odwirować probówkę o sile 700 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  16. Przenieść supernatant (zawierający mitochondria MSC) do probówki "Mito" (przygotowanej w kroku 4.2).
  17. Odwirować przy 3 000 x g, 15 minut w temperaturze 4 °C, aby uzyskać osad mitochondriów. Odrzucić supernatant. Osad zawiera izolowane mitochondria.
  18. Przepłukać osad mitochondriów 200 μl odczynnika C. Następnie odwirować przy 12 000 x g, 5 minut w temperaturze 4 °C, aby uzyskać osad mitochondriów.

5. Transfer izolowanych mitochondriów MSC do GSC (MitoCeption)

  1. Dodać 200 μl wstępnie schłodzonej (0 °C) pożywki do proliferacji GSC do osadu mitochondriów wyizolowanego z MSCs (4 x 105).
  2. Rozcieńczyć preparat mitochondriów (w pożywce proliferacyjnej GSC), aby konsekwentnie dodawać 20 μl zawiesiny mitochondrialnej do GSC.
  3. Dodać objętość wyizolowanych mitochondriów do studzienek 96-dołkowej płytki zawierającej GSC (od kroku 3.15), w żądanym stężeniu (0,1 do 10 μg). Dodawaj mitochondria powoli, blisko dna studzienki, pokrywając przynajmniej raz całą powierzchnię.
  4. W celu kontrolowania wycieku barwnika witalnego w mitochondriach MSC, należy dodać takie same ilości preparatu mitochondriów (0,1 do 10 μg) do studzienek 96-dołkowej płytki zawierającej tylko pożywkę proliferacyjną GSC (bez GSC) (patrz część 6.2 w celu wykrywania wycieku barwnika przyżyciowego).
  5. Odwirować 96-dołkową płytkę zawierającą biorcę mitochondriów z mitochondriami MSC (etap 5.3) i płytką kontrolną (etap 5.4) w temperaturze 1 500 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
  6. Umieścić płytki hodowlane w inkubatorze komórkowym w temperaturze 37 °C natychmiast po odwirowaniu.
    Uwaga: Protokół transferu mitochondriów opiera się na odwirowaniu zawiesiny mitochondriów na hodowanych komórkach przy odpowiedniej sile wirowania, z liczbą wirowań, które można dostosować w zależności od systemu komórek dawcy/biorcy mitochondriów.

Dzień 3

6. Analiza transferu mitochondriów za pomocą FACS i obrazowania konfokalnego

  1. Przygotowanie próbek GSC do analizy FACS
    Uwaga: Jeśli mitochondria MSC zostały wcześniej oznaczone barwnikiem życiowym (sekcja 1), wydajność można monitorować za pomocą FACS 24 godziny po transferze mitochondriów.
    1. Odwirować 96-dołkową płytkę z MitoCepted GSC o sile 270 x g przez 5 minut w temperaturze 20 °C.
    2. Odrzucić supernatant.
    3. Dodaj 100 μl trypsyny (bez EDTA) do każdej studzienki. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 minuty. Pibułuj w górę iw dół, aby oddzielić neurosfery powstałe w ciągu 24 godzin.
    4. Dodać 100 μl podłoża podstawowego GSC.
    5. Odwirować płytkę o sile 270 x g przez 5 minut w temperaturze 20 °C i odrzucić supernatant.
    6. Ponownie zawiesić GSC w 300 μl pożywki podstawowej GSC i przenieść do probówek dostosowanych do FACS.
    7. Wykonaj analizę FACS.
  2. Kontrola wycieku barwnika życiowego mitochondriów z izolowanych mitochondriów (FACS)
    Uwaga: Celem tego kroku jest określenie sygnału FACS w tle, który nie odzwierciedlałby prawdziwego transferu mitochondriów MSC, ale raczej zwykły wyciek ważnego barwnika z oznaczonych mitochondriów MSC używanych do MitoCeption (krok 5.3).
    1. Umieść komórki GSC w grupach opisanych w krokach od 3.1 do 3.15.
    2. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
    3. Odwirować 96-dołkową płytkę zawierającą tylko mitochondria (od kroku 5.4 do 5.6) w temperaturze 1 500 x g przez 5 minut w temperaturze 20 °C.
    4. Odessać pożywkę hodowlaną z 96-dołkowej płytki GSC (etap 6.2.2) i zastąpić ją pożywką inkubowaną tylko z mitochondriami (supernatant z etapu 6.2.3).
    5. Inkubować 96-dołkową płytkę zawierającą GSC w temperaturze 37 °C przez 2 godziny.
    6. Postępuj jak w krokach od 6.1.1 do 6.1.7 dla analizy FACS.
  3. Przygotowanie próbek GSC do obrazowania konfokalnego
    Uwaga: Jeśli transfer mitochondriów MSC do GSC ma być analizowany za pomocą obrazowania fluorescencyjnego, zarówno MSC, jak i GSC muszą być wcześniej znakowane, odpowiednio mitochondriami (krok 1) i komórkami (krok 2) życiodajnymi barwnikami.
    1. Przygotować SGR jak w krokach od 6.1.1 do 6.1.5.
    2. Zawiesić GSC w 2 ml pożywki proliferacyjnej GSC zawierającej 2% FBS i nasiona w szalkach hodowlanych o średnicy 35 mm (szklane dno).
    3. Wykonaj obrazowanie konfokalne na GSC z przeniesionymi fluorescencyjnymi mitochondriami MSC 24 godziny później.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kroki proceduralne opisujące izolację mitochondriów z mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) i ich transfer do docelowych komórek macierzystych glejaka (GSC) za pomocą MitoCeption są pokazane na rysunku 1. GSC to rakowe komórki macierzyste hodowane jako neurosfery w celu zachowania ich właściwości komórek macierzystych. W przypadku protokołu, GSC są wysiewane jako pojedyncze komórki na kilka godzin przed transferem mitochondriów (krok 3), aby umożliwić wyższą wydajno...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Coraz więcej badań pokazuje, że komórki mogą wymieniać mitochondria i że te mitochondria mają głęboki wpływ na metabolizm i funkcje komórek docelowych. Dlatego konieczne jest opanowanie narzędzi do ilościowego przenoszenia mitochondriów z komórek dawcy do komórek docelowych, aby umożliwić dokładne badanie ich skutków biologicznych.

Opisany tutaj protokół został pierwotnie opracowany w celu przeniesienia mitochondriów wyizolowanych z ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych do przylegając...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale), z którym C.J. i M-L.V. są powiązane, złożył wniosek patentowy dotyczący techniki MitoCeption (EP14306154.7).

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Andrei Parmeggiani (L2C i DIMNP, Montpellier), Benoit Charlotowi (IES, Montpellier) oraz członkom laboratorium za pomocne dyskusje, Christophe'owi Duperrayowi za pomoc w analizie FACS, ośrodkowi obrazowania Montpellier RIO (MRI) za zapewnienie odpowiedniego środowiska dla FACS i mikroskopii konfokalnej. B.N.M był wspierany przez stypendium dla absolwentów LabEx Numev (konwencja ANR-10-LABX-20). A.B. była stypendystką Uniwersytetu Warszawskiego i Unii Europejskiej (nr POKL.04.01.02-00-221/12). M.L.V jest pracownikiem naukowym w Narodowym Centrum Badań Naukowych (CNRS).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zestaw do izolacji mitochondriów dla tkanek Fisher Naukowy 
Suplement N-2 (100x)Fisher Scientific11520536
B-27 Suplement W/O VIT A (50x)Fisher Scientific 
HBSS bez Ca2+ bez Mg2+  SigmaH4385
poly hem Sigma P3932
aMEM bez glutaminyOzymeBE12-169F
DMEM/F-12 bez glutaminyFisher Scientific 
L-glutamina Invitrogen 25030-024 
Glukoza Sigma G7021
Insulina Sigma I 1882 
Człowiek  bFGF R& D Systems233-FB-025
Człowiek EGF Peprotech AF-100-15 
HeparynaSigmaH3149 
CaCl2MERCK2382
Inhibitor trypsynySigma T9003
DNase ISIGMA 
Trypsyna 0,25% / EDTA 1  mMInvitrogen 
TrypsynaGibco 15090-046
Inhibitory proteazy wolne od EDTASigma4693159001
Ciprofloksacyna Sigma17850-5G-F
Grzyby Invivogenant-fn-1
Fungizone Thermofisher15290018
GentamycinEuromedexEU0410
MitoTracker Zielone sondymolekularneM7514
MitoTracker Czerwone Sondymolekularne  Sondy molekularne FM M7512
MitoTracker Deep Red  M22426 
CellTracker Zielonesondy molekularneC7025
molekularneCellTracker Blue CMF2HCC12881
RIPASanta Cruzsc-24948
FluoroDish Sterylne naczynie do hodowliWorld Precision InstrumentsFD35-100
HemacytometrFisher Scientific267110
Rurki FACSBeckman Coulter2,523,749
Aparat FACSGallios   3L 10C
LC SZYBKI START DNA MASTER PLUS Roche3515885001
1057966311500446115405661010415900125200056 FM CMXRos CMFDA Sondy zwierząt

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vafai, S. B., Mootha, V. K. Mitochondrial disorders as windows into an ancient organelle. Nature. 491 (7424), 374-383 (2012).
  2. Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: in sickness and in health. Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).
  3. Chandel, N. S. Mitochondria as signaling organelles. BMC Biol. 12 (1), 34(2014).
  4. Schulze, A., Harris, A. L. How cancer metabolism is tuned for proliferation and vulnerable to disruption. Nature. 491 (7424), 364-373 (2012).
  5. Peiris-Pages, M., Martinez-Outschoorn, U. E., Pestell, R. G., Sotgia, F., Lisanti, M. P. Cancer stem cell metabolism. Breast Cancer Res. 18 (1), 55(2016).
  6. LeBleu, V. S., et al. PGC-1alpha mediates mitochondrial biogenesis and oxidative phosphorylation in cancer cells to promote metastasis. Nat Cell Biol. 16 (10), 992-1003 (2014).
  7. Liu, S., Feng, M., Guan, W. Mitochondrial DNA sensing by STING signaling participates in inflammation, cancer and beyond. Int J Cancer. 139 (4), 736-741 (2016).
  8. Islam, M. N., et al. Mitochondrial transfer from bone-marrow-derived stromal cells to pulmonary alveoli protects against acute lung injury. Nat Med. 18 (5), 759-765 (2012).
  9. Pasquier, J., et al. Preferential transfer of mitochondria from endothelial to cancer cells through tunneling nanotubes modulates chemoresistance. J Transl Med. 11, 94(2013).
  10. Plotnikov, E. Y., Khryapenkova, T. G., Galkina, S. I., Sukhikh, G. T., Zorov, D. B. Cytoplasm and organelle transfer between mesenchymal multipotent stromal cells and renal tubular cells in co-culture. Exp Cell Res. 316 (15), 2447-2455 (2010).
  11. Spees, J. L., Olson, S. D., Whitney, M. J., Prockop, D. J. Mitochondrial transfer between cells can rescue aerobic respiration. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (5), 1283-1288 (2006).
  12. Liu, K., et al. Mesenchymal stem cells rescue injured endothelial cells in an in vitro ischemia-reperfusion model via tunneling nanotube like structure-mediated mitochondrial transfer. Microvasc Res. 92, 10-18 (2014).
  13. Bukoreshtliev, N. V., et al. Selective block of tunneling nanotube (TNT) formation inhibits intercellular organelle transfer between PC12 cells. FEBS Lett. 583 (9), 1481-1488 (2009).
  14. Gurke, S., et al. Tunneling nanotube (TNT)-like structures facilitate a constitutive, actomyosin-dependent exchange of endocytic organelles between normal rat kidney cells. Exp Cell Res. 314 (20), 3669-3683 (2008).
  15. Vallabhaneni, K. C., Haller, H., Dumler, I. Vascular smooth muscle cells initiate proliferation of mesenchymal stem cells by mitochondrial transfer via tunneling nanotubes. Stem Cells Dev. 21 (17), 3104-3113 (2012).
  16. Wang, X., Gerdes, H. H. Transfer of mitochondria via tunneling nanotubes rescues apoptotic PC12 cells. Cell Death Differ. 22 (7), 1181-1191 (2015).
  17. Plotnikov, E. Y., et al. Cell-to-cell cross-talk between mesenchymal stem cells and cardiomyocytes in co-culture. J Cell Mol Med. 12 (5A), 1622-1631 (2008).
  18. Acquistapace, A., et al. Human mesenchymal stem cells reprogram adult cardiomyocytes toward a progenitor-like state through partial cell fusion and mitochondria transfer. Stem Cells. 29 (5), 812-824 (2011).
  19. Hase, K., et al. M-Sec promotes membrane nanotube formation by interacting with Ral and the exocyst complex. Nat Cell Biol. 11 (12), 1427-1432 (2009).
  20. Phinney, D. G., et al. Mesenchymal stem cells use extracellular vesicles to outsource mitophagy and shuttle microRNAs. Nat Commun. 6, 8472(2015).
  21. Ahmad, T., et al. Miro1 regulates intercellular mitochondrial transport & enhances mesenchymal stem cell rescue efficacy. Embo J. 33 (9), 994-1010 (2014).
  22. Zhang, Y., et al. iPSC-MSCs with High Intrinsic MIRO1 and Sensitivity to TNF-a Yield Efficacious Mitochondrial Transfer to Rescue Anthracycline-Induced Cardiomyopathy. Stem Cell Reports. 7 (4), 749-763 (2016).
  23. Takeda, K., et al. Influence of intergeneric/interspecies mitochondrial injection; parthenogenetic development of bovine oocytes after injection of mitochondria derived from somatic cells. J Reprod Dev. 58 (3), 323-329 (2012).
  24. Takeda, K., et al. Microinjection of cytoplasm or mitochondria derived from somatic cells affects parthenogenetic development of murine oocytes. Biol Reprod. 72 (6), 1397-1404 (2005).
  25. Van Blerkom, J., Sinclair, J., Davis, P. Mitochondrial transfer between oocytes: potential applications of mitochondrial donation and the issue of heteroplasmy. Hum Reprod. 13 (10), 2857-2868 (1998).
  26. Ishikawa, K., et al. ROS-generating mitochondrial DNA mutations can regulate tumor cell metastasis. Science. 320 (5876), 661-664 (2008).
  27. Kaipparettu, B. A., Ma, Y., Wong, L. J. Functional effects of cancer mitochondria on energy metabolism and tumorigenesis: utility of transmitochondrial cybrids. Ann N Y Acad Sci. 1201, 137-146 (2010).
  28. Wu, T. H., et al. Mitochondrial Transfer by Photothermal Nanoblade Restores Metabolite Profile in Mammalian Cells. Cell Metab. 23 (5), 921-929 (2016).
  29. Masuzawa, A., et al. Transplantation of autologously derived mitochondria protects the heart from ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 304 (7), H966-H982 (2013).
  30. Kitani, T., et al. Direct human mitochondrial transfer: a novel concept based on the endosymbiotic theory. Transplant Proc. 46 (4), 1233-1236 (2014).
  31. Caicedo, A., et al. MitoCeption as a new tool to assess the effects of mesenchymal stem/stromal cell mitochondria on cancer cell metabolism and function. Sci Rep. 5, 9073(2015).
  32. Kesner, E. E., Saada-Reich, A., Lorberboum-Galski, H. Characteristics of Mitochondrial Transformation into Human Cells. Sci Rep. 6, 26057(2016).
  33. Lathia, J. D., Mack, S. C., Mulkearns-Hubert, E. E., Valentim, C. L., Rich, J. N. Cancer stem cells in glioblastoma. Genes Dev. 29 (12), 1203-1217 (2015).
  34. Osswald, M., et al. Brain tumour cells interconnect to a functional and resistant network. Nature. 528 (7580), 93-98 (2015).
  35. Shinojima, N., et al. TGF-beta mediates homing of bone marrow-derived human mesenchymal stem cells to glioma stem cells. Cancer Res. 73 (7), 2333-2344 (2013).
  36. Velpula, K. K., Dasari, V. R., Rao, J. S. The homing of human cord blood stem cells to sites of inflammation: unfolding mysteries of a novel therapeutic paradigm for glioblastoma multiforme. Cell Cycle. 11 (12), 2303-2313 (2012).
  37. Guichet, P. O., et al. Cell death and neuronal differentiation of glioblastoma stem-like cells induced by neurogenic transcription factors. Glia. 61 (2), 225-239 (2013).
  38. Lyons, E. A., Scheible, M. K., Sturk-Andreaggi, K., Irwin, J. A., Just, R. S. A high-throughput Sanger strategy for human mitochondrial genome sequencing. BMC Genomics. 14, 881(2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Transfer mitochondri wmezenchymalne kom rki macierzysteizolacja mitochondri wsortowanie kom rek aktywowane fluorescencjobrazowanie konfokalneanaliza mitochondrialnego DNAocena metabolizmu kom rkowegohodowla neurosfernanorurki tunelowe

Powiązane artykuły