Artykuł metodologiczny

Mapowanie interakcji RNA-RNA na całym świecie przy użyciu biotynylowanego psoralenu

DOI:

10.3791/55255

⸱

24 maja 2017

 ,  ,  , 
1Stem Cell and Regenerative Biology, Genome Institute of Singapore, A*STAR, 2Computational and Systems Biology, Genome Institute of Singapore, A*STAR

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj szczegółowo opisujemy metodę sekwencjonowania Susieciowanych, Ligowanych i Swybranych Hybridów (SPLASH), która umożliwia mapowanie całego genomu wewnątrzcząsteczkowych i międzycząsteczkowych interakcji RNA-RNA in vivo. SPLASH może być stosowany do badania interakcji RNA w organizmach, w tym drożdżach, bakteriach i ludziach.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wiedza o tym, jak RNA oddziałują ze sobą i z innymi, jest kluczem do zrozumienia regulacji genów w komórce opartej na RNA. Chociaż wykazano, że przykłady interakcji RNA-RNA, takich jak interakcje mikroRNA-mRNA, regulują ekspresję genów, pełny zakres, w jakim interakcje RNA zachodzą w komórce, jest nadal nieznany. Poprzednie metody badania interakcji RNA koncentrowały się przede wszystkim na podzbiorach RNA, które oddziałują z określonym gatunkiem białka lub RNA. W tym miejscu szczegółowo opisujemy metodę zwaną sekwencjonowaniem Susieciowanych, Ligowanych i wybranych przez S Hybridów (SPLASH), która umożliwia uchwycenie interakcji RNA w całym genomie in vivo w bezstronny sposób. SPLASH wykorzystuje sieciowanie in vivo, ligację zbliżeniową i sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości w celu identyfikacji wewnątrzcząsteczkowych i międzycząsteczkowych partnerów parowania zasad RNA na całym świecie. SPLASH może być stosowany do różnych organizmów, w tym bakterii, drożdży i komórek ludzkich, a także do różnych warunków komórkowych, aby ułatwić zrozumienie dynamiki organizacji RNA w różnych kontekstach komórkowych. Ukończenie całego eksperymentalnego protokołu SPLASH zajmuje około 5 dni, a obliczeniowy przepływ pracy trwa około 7 dni.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie, jak makromolekuły się fałdują i oddziałują ze sobą, jest kluczem do zrozumienia regulacji genów w komórce. Podczas gdy w ciągu ostatniej dekady wiele wysiłku skupiono na zrozumieniu, w jaki sposób DNA i białka przyczyniają się do regulacji genów, stosunkowo mniej wiadomo na temat potranskrypcyjnej regulacji ekspresji genów. RNA przenosi informacje zarówno w swojej sekwencji liniowej, jak i w swojej drugorzędowej i trzeciorzędowej strukturze1. Jego zdolność do łączenia się w pary z samym sobą i innymi jest ważna dla jego funkcji in vivo. Ostatnie postępy w wysokoprzepustowym badaniu struktury drugorzędowej RNA dostarczyły cennych informacji na temat lokalizacji dwu- i jednoniciowych regionów w transkryptomie2,3,4,5,6,7,8, jednak nadal w dużej mierze brakuje informacji na temat partnerów do interakcji w parowaniu. Aby określić, która sekwencja RNA oddziałuje z innym regionem RNA w transkryptomie, potrzebujemy globalnych informacji dotyczących par.

Mapowanie par oddziaływań RNA w globalny, bezstronny sposób tradycyjnie było dużym wyzwaniem. Podczas gdy poprzednie podejścia, takie jak CLASH9, hiCLIP10 i RAP11, są używane do identyfikacji interakcji RNA w sposób wielkoskalowy, techniki te zazwyczaj mapują parowanie zasad RNA dla podzbioru RNA, które oddziałują z określonym białkiem lub gatunkiem RNA. Ostatnie osiągnięcia w badaniu globalnych oddziaływań RNA obejmują metodę RPL12, która nie stabilizuje oddziaływań RNA in vivo, a zatem może uchwycić tylko podzbiór oddziaływań in vivo. Aby przezwyciężyć te wyzwania, wraz z innymi opracowaliśmy obejmujące cały genom, bezstronne strategie mapowania interakcji RNA in vivo, przy użyciu zmodyfikowanych wersji środka sieciującego psoralen13,14,15. W tym protokole opisujemy szczegóły przeprowadzania sekwencjonowania Susieciowanych krzyżowo, Ligowanych i wybranych przez SH ybridów (SPLASH), które wykorzystuje biotynylowany psoralen do sieciowania RNA parowania zasad in vivo, a następnie ligacji zbliżeniowej i sekwencjonowania o wysokiej przepustowości w celu identyfikacji partnerów parowania zasad RNA w całym genomie (Figura 1)15.

W tym manuskrypcie opisujemy kroki, które należy wykonać, aby wykonać SPLASH przy użyciu hodowanych komórek przylegających, w tym przypadku komórek HeLa. Ten sam protokół można łatwo dostosować do zawiesinowych komórek ssaków oraz do komórek drożdży i bakterii. Krótko mówiąc, komórki HeLa są traktowane biotynylowanym psoralenem i napromieniane przy 365 nm w celu sieciowania oddziałujących par zasad RNA in vivo. RNA są następnie ekstrahowane z komórek, fragmentowane i wzbogacane w celu sieciowania regionów za pomocą kulek streptawidyny. Oddziałujące fragmenty RNA są następnie ligowane razem za pomocą ligacji zbliżeniowej i przekształcane w bibliotekę cDNA w celu głębokiego sekwencjonowania. Po sekwencjonowaniu chimeryczne RNA są mapowane na transkryptom/genom w celu zidentyfikowania regionów oddziałujących z RNA, które są ze sobą sparowane. Z powodzeniem wykorzystaliśmy SPLASH do identyfikacji tysięcy interakcji RNA in vivo w drożdżach i różnych komórkach ludzkich, w tym parowania zasad wewnątrzcząsteczkowych i międzycząsteczkowych RNA w różnych klasach RNA, takich jak snoRNA, lncRNA i mRNA, aby przyjrzeć się organizacji strukturalnej i wzorcom interakcji RNA w komórce.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Leczenie komórek HeLa za pomocą biotynylowanego psoralenu i ekstrakcji RNA

  1. Hodowla komórek HeLa w zmodyfikowanym pożywce Eagle (DMEM) firmy Dulbecco uzupełniona 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% streptomycyną penicyliny (PS) na 10 cm płytce.
  2. Umyj komórki HeLa dwukrotnie 5 ml 1x PBS. Całkowicie odcedź nadmiar PBS z naczynia, umieszczając naczynie pionowo na 1 minutę.
  3. Dodać równomiernie do komórek 1 ml PBS zawierającego 200 μM biotynylowanego psoralenu i 0,01% w/v digitoniny do komórek i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Podczas gdy biotynylowany psoralen może dostać się do komórki, jego przepuszczalność jest znacznie wyższa, gdy komórki są wystawione na działanie niewielkich ilości digitoniny (0,01%) przez 5 minut
  4. Zdejmij pokrywkę z 10-centymetrowej płytki zawierającej leczone komórki HeLa i umieść naczynie płasko na lodzie. Naświetlać naczynie zawierające komórki promieniowaniem UV o długości fali 365 nm przez 20 minut na lodzie, w odległości 3 cm od żarówek UV, za pomocą środka sieciującego UV.
  5. Wyizolować całkowite RNA z komórek HeLa przez ekstrakcję tiocyjanianem guanidyny, fenolem i chloroformem zgodnie z protokołem producenta. Dodać 1:1 objętość izopropanolu, aby wytrącić RNA w temperaturze pokojowej przez 30 min.
    Punkt pauzy: RNA może być przechowywane w temperaturze -20 °C w izopropanolu w nieskończoność. Na tym etapie można wykonać badanie punktowe, aby sprawdzić, czy biotynylowany psoralen pomyślnie dostał się do komórek i usieciował RNA in vivo (Ryc. 2).
  6. Odwirować wytrącony RNA przy 20 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C w celu odzyskania RNA. Usuń supernatant i dodaj 1 ml 70% zimnego etanolu do osadu RNA, aby przepłukać RNA.
  7. Odwirować próbki o masie 20 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i suszyć osad na powietrzu przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  8. Dodaj wodę wolną od nukleaz do osadu RNA i określ ilościowo stężenie RNA za pomocą spektrometru UV.
    Punkt pauzy: RNA może być przechowywane w temperaturze -80 °C po błyskawicznym zamrożeniu w ciekłym azocie.

2. Fragmentacja RNA

  1. Rozgrzej 15 μl 2x buforu do fragmentacji RNA i 10 μl próbki RNA (1 μg/μL) pojedynczo w 0,2 ml probówkach PCR, w temperaturze 95 °C przez 1 min. Wymieszaj 10 μl podgrzanego buforu do fragmentacji 2x RNA z 10 μl próbki RNA, pipetując w górę i w dół. Inkubować próbkę w temperaturze 95 °C przez 5 minut. Zatrzymaj reakcję poprzez szybkie schłodzenie reakcji na lodzie.
  2. Przenieś i połącz 2 reakcje fragmentacji do probówki do mikrofuge o pojemności 1,5 ml. Do reakcji dodać 40 μl wody wolnej od nukleaz, 10 μl 3 M octanu sodu, 1 μl glikogenu i 300 μl 100% etanolu do reakcji fragmentacji. Inkubować RNA w temperaturze -20 °C przez co najmniej 1 godzinę w celu wytrącenia RNA.
  3. Odwirować wytrącony RNA przy 20 000 x g przez 30 minut, usunąć supernatant i przemyć RNA przy użyciu 1 ml 70% etanolu.
  4. Odwirować RNA przy 20 000 x g przez 15 minut, usunąć supernatant i rozpuścić RNA w 20 μl wody wolnej od nukleaz.

3. Wybór wielkości RNA i elucja

  1. Dodaj 20 μl barwnika ładującego RNA do odzyskanego RNA w probówce do mikrofuge. Podgrzewać RNA za pomocą barwnika ładującego RNA w temperaturze 95 °C przez 3 minuty i umieszczać go na lodzie na 2 minuty.
  2. Dodaj 3 μl barwnika ładującego RNA do 0,25 μl 10 nt drabinki DNA w probówce do mikrofuge. Podgrzej drabinę w temperaturze 95 °C przez 3 minuty i umieść ją na lodzie na 2 minuty.
  3. Załaduj zdenaturowaną drabinę i próbki na żel mocznikowy 6% TBE o wymiarach 8,6 cm x 6,8 cm i frakcjonuj rozmiar za pomocą elektroforezy przez 40 minut przy napięciu 180 V. Zabarwić żel w 10 ml buforu TBE zawierającego 1:10 000 barwnika żelu z kwasem nukleinowym przez 5 minut w ciemności.
  4. Nakłuć czystą probówkę o pojemności 0,6 ml na dnie za pomocą igły 24 G i umieścić ją w probówce do mikrofugi o pojemności 2 ml.
  5. Uwidocznij pasma na poplamionym żelu za pomocą transiluminatora i wytnij plasterek żelu odpowiadający 90-110 nt. Przenieś plasterek żelu do przebitej probówki do mikrofugi o pojemności 0,6 ml w probówce do mikrofugi o pojemności 2 ml. Ten wybór wielkości jest wykonywany, aby umożliwić chimerycznym fragmentom minimalną długość do odwzorowania do transkryptomu i rozróżnienie produktów ligowanych zbliżeniowo od produktów nieligowanych na dalszych etapach wyboru wielkości.
  6. Odwiruj plastry żelu w temperaturze 12 000 x g w temperaturze pokojowej przez 2 minuty, aby rozdrobnić plasterek żelu i zebrać go w probówce do mikrofugi o pojemności 2 ml. Wyrzuć pustą probówkę o pojemności 0,6 ml do mikrofuge. Dodać 700 μl buforu elucyjnego do rozdrobnionego plastra żelu w probówce do mikrofug o pojemności 2 ml i inkubować w temperaturze 4 °C przez noc ze stałą rotacją, aby umożliwić dyfuzję próbek do buforu.
  7. Przenieść plastry żelu i bufor elucyjny do filtra w probówce wirówkowej i odwirowywać przy 20 000 x g przez 2 minuty. Plastry żelu zostaną uwięzione w górnej komorze filtra. Wyrzuć plastry żelu i górną komorę.
  8. Dodać 1 μl glikogenu i 700 μl 100% izopropanolu do filtratu w probówce do mikrofuge i wytrącić RNA w temperaturze -20 °C przez co najmniej 1 godzinę lub przez noc.
    Punkt pauzy: RNA może być wytrącane w izopropanolu w nieskończoność w temperaturze -20 °C.
  9. Odwirować wytrącony RNA przy 20 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C w celu odzyskania RNA. Usuń supernatant i dodaj 1 ml 70% zimnego etanolu, aby przemyć osad RNA. Odwirować przemyty osad o sile 20 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
  10. Usunąć bufor płuczący i dodać 20 μl wody wolnej od nukleaz w celu ponownego zawieszenia RNA. Określić ilościowo stężenie RNA za pomocą spektrometru UV.
    Punkt pauzy: RNA może być przechowywane w temperaturze -80 °C po błyskawicznym zamrożeniu w ciekłym azocie.

4. Wzbogacanie regionów sieciujących RNA

  1. Kulki magnetyczne pokryte streptawidyną Vortex energicznie, aby równomiernie zawiesić kulki w probówce. Przenieś 100 μl kulek do probówki do mikrofugi o pojemności 1,5 ml i umieść ją na stojaku magnetycznym na 1 minutę, aby kulki przykleiły się do magnetycznej strony probówki. Ostrożnie wyjmij bufor do przechowywania z koralików i wyjmij rurkę ze stojaka magnetycznego.
  2. Dodaj 1 ml buforu do lizy do kulek w probówce do mikrofuge i pipetuj w górę iw dół. Umieść mikrofugę zawierającą kulki na stojaku magnetycznym na 1 minutę, aby oddzielić kulki od bufora myjącego. Powtórz to w sumie 3 prania.
  3. Usuń bufor płuczący z kulek, umieszczając mikrofugę zawierającą kulki na stojaku magnetycznym na 1 minutę. Dodaj inhibitor RNazy (1:200) do buforu do lizy i dodaj 100 μl buforu do lizy do przemytych kulek w probówce do mikrofuge.
  4. Dodać 2 ml świeżo przygotowanego buforu hybrydyzacyjnego, 1 ml uzupełnionego buforu do lizy, 1,5 μg frakcjonowanego RNA i 100 μl ponownie zawieszonych kulek do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Delikatnie przekręć rurkę.
  5. Inkubować stożkową probówkę wirówkową o pojemności 15 ml w temperaturze 37 °C przez 30 minut, obracając się od końca do końca. Podgrzej bufor do płukania w temperaturze 37 °C.
  6. Umieść stożkowe probówki wirówkowe o pojemności 15 ml na stojaku magnetycznym na probówki 15 ml na 2 minuty, aby oddzielić kulki od bufora. Ostrożnie odpipetować bufor z probówki i wyrzucić go.
  7. Dodaj 1 ml wstępnie podgrzanego buforu do płukania do kulek, pipetuj w górę iw dół i przenieś kulki do probówki do mikrofugi o pojemności 1,5 ml. Inkubować przy kulkach w temperaturze 37 °C przez 5 minut, obracając się od końca do końca.
  8. Krótko odwirować zawartość probówki do mikrofuge. Umieść umyte kulki o pojemności 1,5 ml w probówkach do mikrofug na stojaku magnetycznym na probówki o pojemności 2 ml na 1 minutę, aby oddzielić kulki od bufora do mycia. Usuń bufor z kulek, delikatnie odpipetowując bufor z probówki do mikrofuge.
  9. Dodaj 1 ml wstępnie podgrzanego buforu do płukania do kulek i pipetuj w górę iw dół, aby powtórzyć pranie. Wykonaj w sumie 5 prań. Pod koniec 5prania usuń bufor do mycia, umieszczając mikrofugę zawierającą kulki na stojaku magnetycznym na 1 minutę.

5. Podwiązanie zbliżeniowe

  1. Dodać 1 ml zimnego buforu kinazy polinukleotydowej T4 (PNK) do przemytych kulek i inkubować kulki przez 5 minut w temperaturze 4 °C, obracając się od końca do końca. Umieść probówkę z granulkami na pasku magnetycznym na 1 minutę i delikatnie wyjmij bufor T4 PNK. Powtórz ten krok, w sumie 2 prania i usuń bufor T4 PNK po ostatnim praniu.
  2. Dodaj do koralików, zgodnie z tabelą 1. Aby umożliwić ligację końców 3' fragmentu RNA do adapterów 3' poniżej, inkubować kulki w buforze w temperaturze 37 °C przez 4 godziny ze stałym mieszaniem w celu przekształcenia cyklicznej grupy fosforanowej 3' na końcu RNA w 3'OH.
  3. Dodać do poprzedniej reakcji, zgodnie z tabelą 2. Aby końcówka 5' fragmentów RNA była zdolna do ligacji, należy inkubować reakcję w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę ze stałym mieszaniem w obecności ATP, aby przekształcić 5' OH na RNA w 5' fosforan.
  4. Dodać bufor do poprzedniej reakcji, aby przeprowadzić ligację zbliżeniową, zgodnie z tabelą 3. Inkubować reakcję w temperaturze 16 °C przez 16 godzin, stale mieszając,
  5. Umieść mikrofugę zawierającą ligated RNA na stojaku magnetycznym na 1 minutę. Ostrożnie usuń supernatant i dodaj 1 ml buforu do przemywania o temperaturze pokojowej do kulek. Zawiesić pipetując w górę i w dół.
  6. Umieść probówkę do mikrofuge na stojaku magnetycznym na 1 minutę i ostrożnie wyjmij bufor do mycia. Wykonaj w sumie 2 prania i usuń bufor do mycia ze ściegów pod koniec drugiego prania.
  7. Dodać 100 μl buforu PK RNA do kulek i ponownie zawiesić, pipetując w górę i w dół. Podgrzewać próbki w temperaturze 95 °C przez 10 minut na bloku grzewczym.
  8. Schłodzić próbkę na lodzie przez 1 minutę i dodać do próbki 500 μl tiocyjanianu guanidyny-fenolu-chloroformu. Mieszaj, energicznie wirując przez 10 sekund. Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 10 min.
    Punkt pauzy: RNA może być przechowywane w tiocyjanian-fenolu-chloroformie guanidyny w temperaturze -80 °C przez kilka miesięcy.
  9. Dodać 100 μl chloroformu do próbek ekstrahowanych tiocyjanianianem fenolu i chloroformem guanidyny. Wiruj energicznie przez 10 s. Odwirować próbki o masie 20 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
  10. Przenieś 400 μl warstwy wodnej do nowej probówki do mikrofuge o pojemności 1,5 ml. Dodać 800 μl (2 objętości) 100% etanolu i mieszać, pipetując w górę i w dół.
  11. Przenieś roztwór RNA do kolumn czyszczących RNA i odzyskaj RNA zgodnie z instrukcjami producenta, upewniając się, że nawet małe RNA zostaną zachowane. Eluuj RNA w 100 μl wody wolnej od nukleaz.
    Punkt pauzy: RNA może być przechowywane w temperaturze -80 °C po błyskawicznym zamrożeniu w ciekłym azocie.

6. Odwrotne sieciowanie biotynylowanego psoralenu

  1. Przenieść 100 μl eluowanych próbek do dołka na płytce 24-dołkowej. Zdjąć pokrywę i napromienić próbkę w promieniowaniu UV 254 nm przez 5 minut na lodzie.
  2. Przenieś usieciowaną próbkę do czystej probówki do mikrofuge. Dodać 10 μl octanu sodu, 1 μl glikogenu i 300 μl 100% etanolu i wytrącić RNA w temperaturze -20 °C przez co najmniej 1 godzinę lub przez noc.
    Punkt pauzy: RNA może być wytrącane w etanolu w nieskończoność w temperaturze -20 °C.
  3. Odwirować wytrącony RNA przy 20 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C w celu odzyskania RNA. Usuń supernatant i dodaj 1 ml 70% zimnego etanolu, aby przemyć osad RNA.
  4. Odwirować przemyty osad o sile 20 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć bufor płuczący i dodać 4,25 μl wody wolnej od nukleaz w celu ponownego zawieszenia RNA. Przenieś RNA do probówki PCR o pojemności 0,2 ml.
    Punkt pauzy: RNA może być przechowywane w temperaturze -80 °C po błyskawicznym zamrożeniu w ciekłym azocie.

7. Odwrotna transkrypcja i cyrkularyzacja cDNA

  1. Dodać 0,75 μl łącznika RNA (0,5 μg/μl) do ponownie zawieszonej próbki w probówce do PCR i podgrzewać w temperaturze 80 °C przez 90 s. Umieścić próbkę na lodzie na 2 minuty.
  2. Dodać do zdenaturowanej próbki w celu ligacji 3' za pomocą adaptera, zgodnie z tabelą 4. Inkubować reakcję w temperaturze 25 °C przez 2,5 godziny.
  3. Przenieść reakcję do probówki do mikrofuge o pojemności 1,5 ml. Do reakcji dodać 90 μl wody wolnej od nukleaz, a następnie 10 μl octanu sodu, 1 μl glikogenu i 300 μl 100% etanolu. Wytrącać RNA w temperaturze -20 °C przez co najmniej 1 godzinę lub przez noc.
    Punkt pauzy: RNA może być wytrącane w etanolu w nieskończoność w temperaturze -20 °C.
  4. Odwirować wytrącony RNA przy 20 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C w celu odzyskania RNA. Usuń supernatant i dodaj 1 ml 70% zimnego etanolu, aby przemyć osad RNA.
  5. Odwirować przemyty osad o stężeniu 20 000 g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć bufor do płukania, ponownie zawiesić osad w 5 μl wody wolnej od nukleaz.
  6. Dodaj 5 μl barwnika ładującego RNA do odzyskanego RNA w probówce do mikrofuge. Podgrzewać RNA za pomocą barwnika ładującego RNA w temperaturze 95 °C przez 3 minuty i umieszczać go na lodzie na 2 minuty.
  7. Dodaj 3 μl barwnika ładującego RNA do 0,25 μl 10 nt drabinki DNA w probówce do mikrofuge. Podgrzej drabinę w temperaturze 95 °C przez 3 minuty i umieść ją na lodzie na 2 minuty.
  8. Przeprowadzić frakcjonowanie według wielkości przy użyciu żelu mocznikowego 6% TBE o wymiarach 8,6 cm x 6,8 cm, jak w krokach 3.3 i 3.4.
  9. Wizualizuj żel zabarwiony barwnikiem kwasów nukleinowych za pomocą transiluminatora i wytnij plasterek żelu odpowiadający 110-140 nt na drabinie. Przenieś plasterek żelu do przebitej probówki o pojemności 0,6 ml w probówce o pojemności 2 ml i postępuj zgodnie z protokołem z kroków 3.6-3.9.
  10. Dodaj 5 μl wody wolnej od nukleaz, aby ponownie zawiesić osad RNA. Przenieś RNA do probówki PCR o pojemności 0,2 ml.
    Punkt pauzy: RNA może być przechowywane w temperaturze -80 °C po błyskawicznym zamrożeniu w ciekłym azocie.
  11. Dodać 1 μl startera RT o stężeniu 1,25 μM do RNA w probówce do PCR i ogrzewać w temperaturze 80 °C przez 2 min. Umieścić próbkę na lodzie na 2 min.
  12. Dodać do odwrotnej transkrypcji zgodnie z tabelą 5. Inkubować reakcję w temperaturze 50 °C przez 30 minut.
  13. Dodać 1,1 μl 1 N NaOH do reakcji i ogrzewać w temperaturze 98 °C przez 20 minut. Umieścić reakcję na lodzie.
  14. Przenieść reakcję do probówki do mikrofuge o pojemności 1,5 ml. Do reakcji dodać 90 μl wody wolnej od nukleaz, a następnie 10 μl octanu sodu, 1 μl glikogenu i 300 μl 100% etanolu. Wytrącać DNA w temperaturze -20 °C przez co najmniej 1 godzinę lub przez noc.
    Punkt pauzy: DNA można wytrącać w etanolu w nieskończoność w temperaturze -20 °C.
  15. Odwirować wytrącone DNA w temperaturze 20 000 g przez 30 minut w temperaturze 4 °C w celu odzyskania DNA. Usuń supernatant i dodaj 1 ml 70% zimnego etanolu, aby przepłukać osad DNA. Odwirować przemyty osad o sile 20 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć bufor do płukania, ponownie zawiesić osad w 5 μl wody wolnej od nukleaz.
  16. Przeprowadzić frakcjonowanie według wielkości przy użyciu żelu mocznikowego 6% TBE o wymiarach 8,6 cm x 6,8 cm, jak w krokach 3.3 i 3.4.
  17. Zwizualizuj poplamiony żel za pomocą transiluminatora i wytnij plasterek żelu odpowiadający 200-240 nt na drabinie. Odwrotnie transkrybowane cDNA jest teraz o 96 zasad dłuższe niż fragment RNA ze względu na dodanie startera RT o 96 zasadach. Przenieś plasterek żelu do przebitej probówki o pojemności 0,6 ml w probówce do mikrofugi o pojemności 2 ml.
  18. Odwiruj plastry żelu w temperaturze 12 000 x g w temperaturze pokojowej przez 2 minuty, aby rozdrobnić plasterek żelu i zebrać go w probówce do mikrofugi o pojemności 2 ml. Wyrzuć pustą probówkę o pojemności 0,6 ml do mikrofuge.
  19. Dodać 700 μl buforu elucyjnego do rozdrobnionego plastra żelu w probówce do mikrofuge o pojemności 2 ml i inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 godziny ze stałą rotacją. Postępuj zgodnie z protokołem opisanym w krokach 3.7-3.8.
  20. Dodaj 6 μl wody wolnej od nukleaz, aby ponownie zawiesić osad DNA. Przenieś DNA do probówki PCR o pojemności 0,2 ml.
    Punkt pauzy: DNA może być przechowywane w temperaturze -80 °C po błyskawicznym zamrożeniu w ciekłym azocie.
  21. Dodać do reakcji cyrkularyzacji cDNA, zgodnie z tabelą 6. Inkubować reakcję w temperaturze 60 °C przez 1 godzinę i ogrzewać w temperaturze 80 °C przez 10 minut w celu dezaktywacji reakcji.
  22. Przenieść reakcję do probówki do mikrofuge o pojemności 1,5 ml. Oczyść krążone cDNA za pomocą kolumny do oczyszczania DNA zgodnie z instrukcjami producenta. Dodać 20 μl wody wolnej od nukleaz do kolumny, aby wymyć oczyszczone cDNA.
    Punkt pauzy: DNA może być przechowywane w temperaturze -20 °C przez kilka miesięcy.

8. Amplifikacja PCR (PCR na małą skalę)

  1. Dodać do reakcji zgodnie z tabelą 7 dla amplifikacji PCR, aby przetestować minimalną liczbę cykli potrzebnych do amplifikacji bibliotecznej.
  2. Ustaw warunki cykliczne PCR zgodnie z tabelą 8. Wstrzymać reakcję i przenieść 5 μl reakcji PCR w 10, 15 i 20 cyklach do oddzielnych probówek do mikrofuge o pojemności 1,5 ml.
  3. Dodaj 1 μl 6x barwnika ładującego żel DNA do każdej z 5 μl reakcji PCR w różnych cyklach. Wykonaj elektroforezę żelową na 3% żelu agarozowym, przy 120 V, przez 1 godzinę w celu wizualizacji produktów PCR.
    1. Użyj najmniejszej liczby cykli PCR (Y), które wykazują amplifikację przy około 250 zasadach (w Rysunek 3, istnieje silne pasmo po 15 cyklach amplifikacji i słabe pasmo po 10 cyklach. 12 cykli amplifikacji PCR na dużą skalę prawdopodobnie wygeneruje wystarczającą ilość materiału do głębokiego sekwencjonowania, ponieważ ilość użytego cDNA jest 10 razy większa niż w przypadku amplifikacji PCR na małą skalę).

9. Amplifikacja PCR (PCR na dużą skalę) i oczyszczanie

  1. Dodać do reakcji zgodnie z tabelą 9 dla amplifikacji PCR dla PCR na dużą skalę.
  2. Ustaw warunki cykliczne PCR zgodnie z tabelą 10.
  3. Dodaj 5 μl 6x barwnika ładującego żel DNA do 25 μl reakcji PCR i załaduj do studzienki 3% żelu agarozowego. Załaduj 1 kb plus drabinkę DNA do osobnej studzienki. Wykonać elektroforezę żelową przy napięciu 100 V przez 1,5 godziny.
  4. Wizualizacja gotowego żelu za pomocą transiluminatora UV.
  5. Rozmiar Ekstrahuj plasterek żelu zawierający produkty PCR z 200-300 zasad i przenieś żel do czystej probówki do mikrofuge o pojemności 2 ml.
  6. Dodać 1 ml buforu rozpuszczalności żelu z zestawu do ekstrakcji żelu DNA do wycinka żelu i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut lub do momentu rozpuszczenia żelu, stale mieszając.
  7. Dodać 200 μl izopropanolu do rozpuszczonego żelu i dobrze wymieszać pipetując. Przenieść 700 μl próbki do kolumny oczyszczającej do ekstrakcji żelu DNA i odwirować przy 13 000 x g przez 30 s. Kontynuuj przenoszenie rozpuszczonej próbki do kolumny, aż cała próbka zostanie załadowana do kolumny.
  8. Dodać 500 μl buforu rozpuszczalności w żelu, a następnie 700 μl buforu do przemywania kolumny do kolumny, zgodnie z protokołem producenta. Dodaj 12 μl wody wolnej od nukleaz do środka kolumny, aby uniknąć DNA. Punkt pauzy: DNA może być przechowywane w temperaturze -20 °C.
  9. Określić ilościowo stężenie DNA za pomocą kwantyfikacji fluorometrycznej. Jeśli wiele bibliotek jest konstruowanych i łączonych razem na potrzeby sekwencjonowania, dodaj równą ilość każdej próbki do puli, aby uzyskać sekwencjonowanie o wysokiej przepływności.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 1 przedstawia schemat przepływu pracy SPLASH. Po dodaniu biotynylowanego psoralenu w obecności 0,01% digitoniny i usieciowaniu UV, całkowity RNA jest ekstrahowany z komórek i przeprowadza się kropkę, aby upewnić się, że sieciowanie biotynylowane do RNA nastąpiło skutecznie (Rysunek 2). Używamy biotynylowanych 20-zasadowych oligonukleukleotów jako kontroli pozytywnej do miareczkowania ilości biotynylowanego psoralenu, który ma być d...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu szczegółowo opisujemy eksperymentalny i obliczeniowy przepływ pracy dla SPLASH, metody, która pozwala nam identyfikować interakcje RNA parami w sposób obejmujący cały genom. Z powodzeniem wykorzystaliśmy SPLASH w hodowlach bakterii, drożdży i ludzi i przewidujemy, że strategia ta może być szeroko stosowana do różnych organizmów w różnych stanach komórkowych. Jednym z krytycznych kroków w protokole jest rozpoczęcie od co najmniej 20 μg usieciowanego RNA, aby uzyskać odpowiedni materiał do dalszych procesów. ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy członkom laboratorium Wan i laboratorium Nagarajan za pouczające dyskusje. Projekt N.Nagarajan jest finansowany przez A*STAR. Y.Wan jest wspierany przez fundusze A*STAR i Society in Science-Branco Weiss Fellowship.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały


Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1 kb Plus Drabina DNALife Technologies Holdings Pte Ltd10787026Drabinka
DNA 10 pz Drabinka DNALife Technologies Holdings Pte Ltd10821-015Drabinka DNA
20% roztwór SDSPierwszaBAZA BUF-2052-1L   
20x SSCFirst BASEBUF-3050-20X1L
3,0 M roztwór octanu soduPierwsza bazaBUF-1151-1L-pH 5.2   Wymagane do wytrącania kwasów nukleinowych
40% roztwór akrylamidu/bis, 19:1Bio-Rad1610145TBE Składnik żelu mocznikowego
Zestaw buforowyAmbion Life Technologies Holdings Pte LtdAM9010
Nadsiarczan amonu, klasa molekularna   PromegaV3131 Składnik żelu mocznikowego TBE
Błękit bromofenolowySigma-AldrichB0126-25G
Chloroform Ekstrakcja RNAMerck1.02445.1000
Ligaza DNA jednoniciowaEpicentrumCL9025KCircLigase II ssDNA Ligaza
Filtry probówkoweSigma-AldrichCLS8160-96EACostar Spin-X Filtry probówkowe wirówki
D5628-1G DIGITONINA KRYSTALICZNASigma-AldrichD5628-1GDo leczenia komórek
Nadajnik ciemnego czytnika Clare Chemical ResearchDark Reader Nadajnik DR89X Nadajnikniebieskiego
Barwnik ładujący żel DNA (6x)Life Technologies Holdings Pte LtdR0611Wymagany do elektroporacji żelu agarozowego
Dulbecco's Modified Eagle MediumPan BioTechP04-03500Do hodowli komórek Hela
Koraliki magnetyczne StreptawidynyLife Technologies Holdings Pte Ltd65002Dynabeads MyOne Streptawidyna C1 
Stojak magnetyczny na 15  Probówki mLLife Technologies Holdings Pte Ltd12301DDynaMag-15
Stojak magnetyczny na 15  probówki mLLife Technologies Holdings Pte Ltd12321DDynaMag-2
ThermoMixerEppendorf5382 000.015Eppendorf ThermoMixer  C
Biotynylowany psoralenLife Technologies Holdings Pte Ltd29986EZ-Link Psoralen-PEG3-Biotyna
F8T5/BL HitachiF8T5/BL Żarówka UV 365 nm
Surowica bydlęca płoduLife Technologies Holdings Pte Ltd10270106   Składniki pożywki Hela
FormamidPromegaH5052   Składnik w buforze hybrydyzacyjnym
G8T5Sankyo-DenkiG8T5Żarówka UV 254 nm
GlycogenLife Technologies Holdings Pte Ltd10814010Wymagana do wytrącania kwasów nukleinowych
NanodropLife Technologies Holdings Pte LtdNanodrop 2000do kwantyfikacji kwasów nukleinowych
Woda wolna od nukleaz Pierwsza BAZABUF-1180-500ml   
Penicylina Streptomycyna   Life Technologies Holdings Pte Ltd15140122   Składniki pożywki Hela
Polimeraza DNA o wysokiej wierności (2x)Life Technologies Holdings Pte LtdF531L Phusion High-Fidelity PCR Master Mix z buforem HF (2x)
Zestaw podkładów 1New England BiolabsE7335L Startery PCR
Zestaw do ekstrakcji żelu DNAQIAgen28106QIAquick Zestaw do ekstrakcji żelu
Zestaw do kwantyfikacji fluorometrycznejLife Technologies Holdings Pte LtdQ32854Zestaw do oznaczania kubitów dsDNA HS
Zestaw do czyszczenia RNAQiagen74106RNeasy Mini Kit Kolumna z membraną krzemionkową
Inhibitor rnazyLife Technologies Holdings Pte LtdAM2696SUPERase In
Odwrotna transkryptazaLife Technologies Holdings Pte Ltd18080400SuperScript III Synteza pierwszej nici SuperMix
Żel kwasu nukleinowego StainLife Technologies Holdings Pte LtdS11494SYBR GOLD NUCLEIC ACID 500 UL
T4 Kinaza polinukleotydowaNew England BiolabsM0201LEnzym naprawy końca
Ligaza RNA T4New England BiolabsM0204LEnzym do ligacja zbliżeniowa
T4 RNA Ligaza 2, skrócona KQNew England BiolabsM0373LEnzym do ligacji adaptorowej
TemedBio-Rad1610801TBE Składnik żelu mocznikowego
Guanidinium tiocyjanian-fenol-chloroformLife Technologies Holdings Pte Ltd15596018TRIzol® Odczynnik do ekstrakcji RNA
MocznikFirst BASEBIO-2070-5kg   
Sieciownik UVStratagene400072UV Stratalinker 1800
Oświetlacz UVP95-0417-01Do wizualizacji pasm
Ksylen Cyanol FFSigma-AldrichX4126-10G
Oczyszczanie DNA ZymoResearch D4004Koncentrator DNA Zymo-5 
Lista wymaganego oprogramowania
Oprogramowanie FastQC0.11.4http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/
Oprogramowanie SeqPrep1.0.7https://github.com/jstjohn/SeqPrep
Oprogramowanie BWA0.7.12http://bio-bwa.sourceforge.net/
Oprogramowanie SAMTOOLS1.2.1Oprogramowanie http://www.htslib.org/
PULLSEQ1.0.2https://github.com/bcthomas/pullseq
Oprogramowanie STAR2.5.0chttps://github.com/alexdobin/STAR
rem_dups.py skrypt PYTHONPYTHON PYTHON 2.7.11https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src
find_chimeras.py Skrypt PYTHONPYTHON 2.7.11
pickJunctionReads.awk Skrypt AWKAWK GNU 4.1.2https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src
Skład bufora
Elution buffer
0.3 M octan
< strong>Lysis Buffer
50 mM Tris-Cl pH 7,0
10 mM EDTA
1% SDS
Zawsze dodawaj Superase-in świeżo przed użyciem, z wyjątkiem prania kulek
Proteinase K Buffer 
100 mM NaCl
10 mM Tris-Cl pH 7,0
1 mM EDTA
0,5% SDS
Hybridization Buffer
750 mM NaCl
1% SDS
50 mM Tris-Cl pH 7,0
1 mM EDTA
15% formamid (przechowywać w ciemności w temperaturze 4 & C)
Zawsze dodawaj Superase-in świeżo przed użyciem
< strong > 2x bufor do płukania SSC< / strong >
2x NaCl i cytrynian sodu (SSC) (rozcieńczony z 20x zapasu SSC Invitrogen)
0,5% SDS
strong>2x bufor do fragmentacji RNA
18 mM MgCl2
450 mM KCl
300 mM Tris-Cl pH 8,3
2x ładowanie RNA Barwnik
95% Formamid
0,02% SDS
0,02% błękit
0,01% Xylene Cyanol
1 mM EDTA
Sekwencja starterów RT:
AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGGC/iSp18/CACTCA/iSp18/TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTATTGATGGTGCCTACAG
światła Spektrofotometr 1 https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src sodu< bromofenolowy<td colspan="4">3' sekwencja adaptera RNA: 5rAppCTGTAGGCACCATCAAT/3ddC

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wan, Y., Kertesz, M., Spitale, R. C., Segal, E., Chang, H. Y. Understanding the transcriptome through RNA structure. Nat.Rev.Genet. 12 (9), 641-655 (2011).
  2. Kertesz, M., et al. Genome-wide measurement of RNA secondary structure in yeast. Nature. 467 (7311), 103-107 (2010).
  3. Wan, Y., et al. Genome-wide Measurement of RNA Folding Energies. Mol.Cell. 48 (2), 169-181 (2012).
  4. Wan, Y., Qu, K., Ouyang, Z., Chang, H. Y. Genome-wide mapping of RNA structure using nuclease digestion and high-throughput sequencing. Nat.Protoc. 8 (5), 849-869 (2013).
  5. Wan, Y., et al. Landscape and variation of RNA secondary structure across the human transcriptome. Nature. 505 (7485), 706-709 (2014).
  6. Spitale, R. C., et al. Structural imprints in vivo decode RNA regulatory mechanisms. Nature. 519 (7544), 486-490 (2015).
  7. Ding, Y., et al. In vivo genome-wide profiling of RNA secondary structure reveals novel regulatory features. Nature. 505 (7485), 696-700 (2014).
  8. Rouskin, S., Zubradt, M., Washietl, S., Kellis, M., Weissman, J. S. Genome-wide probing of RNA structure reveals active unfolding of mRNA structures in vivo. Nature. 505 (7485), 701-705 (2014).
  9. Kudla, G., Granneman, S., Hahn, D., Beggs, J. D., Tollervey, D. Cross-linking, ligation, and sequencing of hybrids reveals RNA-RNA interactions in yeast. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 108 (24), 10010-10015 (2011).
  10. Sugimoto, Y., et al. hiCLIP reveals the in vivo atlas of mRNA secondary structures recognized by Staufen 1. Nature. 519 (7544), 491-494 (2015).
  11. Engreitz, J. M., et al. RNA-RNA interactions enable specific targeting of noncoding RNAs to nascent Pre-mRNAs and chromatin sites. Cell. 159 (1), 188-199 (2014).
  12. Ramani, V., Qiu, R., Shendure, J. High-throughput determination of RNA structure by proximity ligation. Nat.Biotechnol. , (2015).
  13. Lu, Z., et al. RNA Duplex Map in Living Cells Reveals Higher-Order Transcriptome Structure. Cell. 165 (5), 1267-1279 (2016).
  14. Sharma, E., Sterne-Weiler, T., O'Hanlon, D., Blencowe, B. J. Global Mapping of Human RNA-RNA Interactions. Mol.Cell. 62 (4), 618-626 (2016).
  15. Aw, J. G., et al. In Vivo Mapping of Eukaryotic RNA Interactomes Reveals Principles of Higher-Order Organization and Regulation. Mol.Cell. 62 (4), 603-617 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Metoda SPLASHsieciowanie UVligacja blisko ciowasekwencjonowanie wysokoprzepustoweekstrakcja RNAelektroforeza w elukulki magnetycznepotok obliczeniowy

Powiązane artykuły