Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Rozmnażanie na małą skalę ludzkich iPSC w warunkach wolnych od surowicy w rutynowej charakterystyce immunocytochemicznej

7.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55260

⸱

18 lutego 2017

 , 
1Department of Neurology, The University of Arizona

W tym artykule

Podsumowanie

Regularna charakterystyka indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC), w celu zapewnienia utrzymania ich stanu pluripotencjalnego, jest ważnym krokiem przed wykorzystaniem tych komórek do innych zastosowań. W tym miejscu opisujemy metodę rozmnażania ludzkich iPSC na małą skalę, zaprojektowaną specjalnie w celu umożliwienia ich łatwej i rutynowej charakterystyki za pomocą immunocytochemii.

Streszczenie

Istnieje duże zainteresowanie wykorzystaniem ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) do modelowania chorób i terapii komórkowej ze względu na ich specyficzność dla pacjenta i charakterystyczną macierzystość. Jednak pluripotencja iPSC, która ma zasadnicze znaczenie dla ich funkcjonalności, musi zostać potwierdzona, zanim komórki te będą mogły być wykorzystane w takich zastosowaniach. Podczas gdy rygorystyczna charakterystyka iPSC za pomocą różnych testów komórkowych i funkcjonalnych jest niezbędna do ustalenia ich pluripotencji, rutynowa ocena utrzymania pluripotencji może być osiągnięta prościej i skuteczniej za pomocą technik immunocytochemicznych. W tym miejscu przedstawiamy systematyczny protokół hodowli hiPSC, w sposób pomniejszony, aby szczególnie ułatwić weryfikację ich stanu pluripotencjalnego za pomocą immunocytochemii. Dokładniej rzecz ujmując, metodologia ta obejmuje wydajny i opłacalny sposób hodowli iPSC w warunkach wolnych od surowicy i posiewania ich na szkiełkach podstawowych o małej komorze lub szklanych szkiełkach nakrywkowych, idealnych do celów immunocytochemicznych.

Wprowadzenie

Przeprogramowanie ludzkich dorosłych komórek somatycznych na indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) umożliwia uzyskanie potencjalnie nieograniczonej ilości komórek specyficznych dla pacjenta do badania choroby1,2. Rekapitulacja fenotypu choroby in vitro umożliwiłaby zbadanie mechanizmów komórkowych i molekularnych związanych z chorobą, a także usprawniłoby odkrywanie leków i medycynę spersonalizowaną3. Ponadto ludzkie iPSC (hiPSC) oferują możliwość wyprowadzenia określonych typów komórek, które mogą być wykorzystane jako unikalny zasób do zastąpienia martwych lub dysfunkcyjnych komórek i przywrócenia funkcji w kontekście kilku zaburzeń4,5.

Ważnym warunkiem wstępnym do korzystania z iPSC w powyższych aplikacjach jest zapewnienie, że ich pluripotencjalny i niezróżnicowany stan jest utrzymywany podczas ekspansji w hodowli. Zazwyczaj techniki takie jak cytometria przepływowa, western blotting, reakcja łańcuchowa polimerazy i testy funkcjonalne, które wymagają dużej ilości komórek i specjalistycznego sprzętu, są wykorzystywane do szczegółowej analizy pluripotencji iPSC6,7,8,9,10. Jednak rutynowa ocena stanu niezróżnicowanego iPSC może być skutecznie osiągnięta dzięki ograniczonej namnażaniu tych komórek specyficznie dla immunocytochemii (ICC), co wiąże się z redukcją czasu i zasobów.

Ostatnie osiągnięcia pozwalają na wzrost iPSC w określonych warunkach bez surowicy, co jest znaczącym postępem w porównaniu z konwencjonalnymi systemami hodowli, które wymagają warstw zasilających mysie fibroblasty i pożywki zawierającej surowicę. Obecna literatura nie zawiera jednak jasnych protokołów krokowych, które opisywałyby, w jaki sposób przenieść iPSC z warstwy zasilającej do systemów bez zasilania.

W tym kontekście, obecny protokół systematycznie szczegółowo opisuje, w jaki sposób hiPSC hodowane na napromieniowanych warstwach fibroblastów embrionalnych myszy (iMEF) mogą być (1) przystosowane do rozmnażania się w pożywce wolnej od surowicy, oraz (2) hodowane na małą skalę, aby wspierać solidną analizę immunocytochemiczną. Ogólnie rzecz biorąc, metodologia ta stanowi terminową i opłacalną procedurę namnażania ludzkich iPSC w warunkach wolnych od surowicy w celu rutynowego potwierdzania ich pluripotencji przy użyciu immunocytochemii.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

hiPSC pochodziły z ludzkich fibroblastów skórnych wyizolowanych z biopsji 4 mm i przeprogramowanych wewnętrznie za pośrednictwem wirusa Sendai11. Instytucjonalna Komisja Rewizyjna Uniwersytetu Arizony zatwierdziła wszystkie procedury rekrutacji uczestników i pobierania biopsji.

1. Przygotowanie powierzchni pokrytej macierzą zewnątrzkomórkową do hodowli iPSC

  1. Na dzień przed konfluencją kultur hiPSC rosnących na iMEFach należy przygotować płytki pokryte macierzą zewnątrzkomórkową (Matrigel).
  2. Powolne rozmrażanie podwielokrotności macierzy zewnątrzkomórkowej (w zależności od partii, postępować zgodnie z instrukcjami zawartymi w karcie specyfikacji) na lodzie w temperaturze 4 °C przez 2 godziny.
  3. W kapturze bezpieczeństwa biologicznego, używając zimnych końcówek pipet (przechowywanych w temperaturze -20 °C), dodać 1 porcję macierzy zewnątrzkomórkowej do zimnej mieszanki Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 firmy Dulbecco (DMEM/F12/HEPES) zgodnie ze współczynnikiem rozcieńczenia właściwym dla partii.
  4. Dozować ~ 600 μL macierzy zewnątrzkomórkowej na studzienkę z każdej potrzebnej nowej 12-dołkowej płytki poddanej działaniu hodowli komórkowej.
  5. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez kilka godzin. W tym przypadku należy zastosować 3 godziny czasu inkubacji.
    UWAGA: Płytki można zużyć natychmiast lub przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do dwóch tygodni.

2. Przenoszenie hiPSC wyhodowanych na komórkach zasilających iMEF do macierzy zewnątrzkomórkowej w celu rozmnażania

  1. W dniu pasażowania należy zdjąć płytkę pokrytą matrycą z temperatury 4 °C i pozostawić płytkę do aklimatyzacji do temperatury pokojowej przez 1 godzinę w kapturze do hodowli tkankowych.
  2. Odessać pożywkę z 1 dołka z 6-dołkowej płytki kultury hiPSC rosnącej na iMEF i zastąpić 500 μl odczynnikiem dysocjacyjnym kolagenazy (1 mg/ml w podstawowej pożywce hodowlanej).
  3. Inkubować w temperaturze 37 °C przez ~ 10 - 30 minut, aż krawędzie kolonii iPSC zaczną się nieznacznie unosić.
    UWAGA: Czas inkubacji jest zależny od linii i będzie się różnił. Monitoruj dysocjację pod mikroskopem.
  4. Ostrożnie odessać odczynnik dysocjacyjny i delikatnie przemyć 2 razy roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem (PBS, pH 7,4).
  5. Dodać 1 ml kompletnej pożywki mTeSR1 o temperaturze pokojowej z 10 ng/ml inhibitora kinazy białkowej związanej z Rho (inhibitor Y-27632 ROCK) do dołka.
    UWAGA: Sugeruje się użycie mieszaniny pożywki kondycjonowanej iMEF i mTeSR1 w proporcji 50:50 podczas tego początkowego pasażu, co może być korzystne dla przetrwania hiPSC podczas tej przemiany w pożywkę.
  6. Za pomocą mikroskopu z kontrastem fazowym umieszczonym częściowo wewnątrz kaptura, ręcznie naciąć i pobrać 1-2 kolonie hiPSC (~ 700 - 1,000 μm średnicy) za pomocą strzykawki i igły (25 G, 11/2 cala). Wypchnij nacięte kawałki kolonii do pożywki za pomocą końcówki pipety P200.
  7. Odessać i wyrzucić matrycę z nowej płytki, uważając, aby nie naruszyć powłoki.
  8. Przenieść 1 ml zawiesiny komórkowej ze starej studzienki zawierającej nacięte iPSC do nowej studzienki pokrytej matrycą.
  9. Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Kołysz płytką kilkoma szybkimi ruchami w przód iw tył i na boki, aby równomiernie rozłożyć komórki. Nie naruszaj płyty przez 24 godziny.
  10. Wykonuj codzienne pełne zmiany pożywki za pomocą kompletnej pożywki mTeSR1 (dodanie inhibitora Y-27632 ROCK nie jest potrzebne po wstępnym posiewie w kroku 2.5).

3. Małe przenoszenie hiPSC na płytach pokrytych matrycą

UWAGA: Generalnie, po początkowym przeniesieniu hiPSC na płytki pokryte matrycą, komórki powinny być ponownie przepasywane w podobny sposób, aby upewnić się, że wszystkie iMEF-y zostały wyeliminowane, a komórki przystosowały się do warunków wolnych od zasilania.

  1. Na dzień przed konfluencją iPSC należy przygotować świeżo pokryte płytki matrycowe, jak omówiono w punkcie 1.
  2. W dniu pasażu wyjąć płytkę pokrytą matrycą z inkubacji w temperaturze 4 °C i pozostawić płytkę do aklimatyzacji do temperatury pokojowej przez 1 godzinę w kapturze do hodowli tkankowej.
  3. Odessać pożywkę z 1 dołka z 6-dołkowej płytki hiPSC (pierwotnie przeniesionej z podajnika do matrycy) i zastąpić 500 μl buforem dysocjacji komórek.
    UWAGA: Zastosowany tutaj komercyjny bufor dysocjacji komórek (patrz tabela materiałów) jest bardziej odpowiedni do stosowania z pożywką mTeSR1 w porównaniu z kolagenazą.
  4. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 3 - 7 minut, aż krawędzie kolonii iPSC wydają się lekko unosić. Jak wspomniano wcześniej, czas inkubacji jest zależny od linii i zmienny. Dlatego monitoruj dysocjację komórkową pod mikroskopem, aby określić optymalny czas.
  5. Ostrożnie odessać bufor dysocjacyjny i delikatnie przemyć 2 razy PBS.
  6. Dodać do studzienki 500 μl kompletnej pożywki mTeSR1 o temperaturze pokojowej z 10 ng/ml inhibitora Y-27632 ROCK.
  7. Zamiast oceniać kolonie, jak w kroku 2.6, wepchnij żądaną liczbę kolonii do pożywki za pomocą końcówki P200 i delikatnie rozetrzyj zawiesinę komórek 2 razy na jednym rogu studzienki, aby rozbić kolonie hiPSC na grudki o wielkości ~ 50 - 200 μm. Na przykład, aby uzyskać 12-dołkową płytkę, wybierz 1-2 kolonie, aby przenieść je do każdej 1 nowej studzienki. Przenieść zawiesinę komórek ze starej studzienki do pojedynczej nowej studzienki z 12-dołkową płytką.
  8. Kołysz płytką kilkoma szybkimi ruchami w przód iw tył i na boki, aby równomiernie rozłożyć komórki, i pozwól płytce spoczywać przez 24 godziny w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  9. Wykonuj codzienną pełną wymianę podłoża za pomocą kompletnego podłoża mTeSR1. Jak wspomniano wcześniej, nie jest konieczne dodawanie inhibitora Y-27632 ROCK po wstępnym posiewie.
    UWAGA: Niewykorzystane kolonie iPSC z kroku 3.7 mogą być w tym momencie łatwo poddane kriokonserwacji.

4. Przygotowanie preparatów komorowych i nakrywkowych do wysiewu hiPSC do immunocytochemii

UWAGA: Poniższy protokół wykorzystuje 4-dołkowe plastikowe szkiełka nakrywkowe i 12-milimetrowe szklane szkiełka nakrywkowe z odpowiednią ilością pożywki w wielodołkach, aby wspierać opłacalną immunocytochemię. Jednak objętość nośników można zwiększyć, jeśli pożądane jest użycie większych rozmiarów studni i szkiełek nakrywkowych.

  1. Na dzień przed konfluencją hiPSC należy przygotować szkiełka komorowe świeżo pokryte macierzą zewnątrzkomórkową, jak omówiono w punkcie 1. Dodać wystarczającą ilość roztworu matrycowego (~ 300 - 500 μL na studzienkę 4-dołkowego szkiełka podstawowego), aby w pełni pokryć każdą studzienkę bez obawy o parowanie. Alternatywnie, po umieszczeniu 1 oczyszczonego i wysterylizowanego szkiełka nakrywkowego w każdym dołku 24-dołkowej płytki, pokryj 500 μl macierzą zewnątrzkomórkową i upewnij się, że szkiełko nakrywkowe nie unosi się na wierzchu roztworu.
  2. W dniu przejścia usunąć powlekane szkiełka komorowe/szkiełka nakrywkowe z 4 °C i pozostawić do aklimatyzacji do temperatury pokojowej przez 1 godzinę w kapturze do hodowli tkankowych.
  3. Odessać pożywkę z 1 dołka z 12-dołkowej płytki hiPSC i zastąpić 500 μl buforem dysocjacyjnym
    4. .
  4. Inkubować w temperaturze pokojowej przez ~ 3 - 7 minut, aż krawędzie kolonii iPSC wydają się lekko unosić.
  5. Ostrożnie odessać bufor dysocjacyjny i dodać do studzienki 1 ml kompletnej pożywki mTeSR1 o temperaturze pokojowej z 10 ng/ml inhibitora Y-27632 ROCK.
  6. Używając mikroskopu z małym kontrastem fazowym umieszczonego w kapturze do hodowli tkankowych, ręcznie wybierz 1 kolonię/nowy dołek z 4-dołkowego szkiełka podstawowego lub 1 nowe szkiełko nakrywkowe do posiewu (o średnicy ~ 1 000 - 1 500 μm) za pomocą końcówki pipety P200, popychając ją z powierzchni płytki do pożywki.
  7. Zassać matrycę z nowego szkiełka nakrywkowego/szkiełka nakrywkowego, uważając, aby nie naruszyć powłoki.
  8. Delikatnie rozcieraj zawiesinę komórkową 2 razy o jeden róg studzienki, aby rozbić kolonie hiPSC na grudki o wielkości ~ 50 - 200 μm. Przenieść 250 μl zawiesiny komórek ze starej studzienki do każdej nowej studzienki 4-dołkowego szkiełka nakrywkowego/szkiełka nakrywkowego.
  9. Zwiększ objętość każdej nowej studzienki do 500 μl za pomocą mTeSR1 zawierającego 10 ng/ml inhibitora Y-27632 ROCK.
  10. Umieścić szkiełko komorowe/szkiełka nakrywkowe w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
  11. Po 24 godzinach wykonuj codzienną pełną wymianę pożywki za pomocą kompletnej pożywki mTeSR1. Ponownie, jak wspomniano wcześniej, dodanie inhibitora Y-27632 ROCK nie jest konieczne po wstępnym posiewaniu.

5. Przygotowanie iPSC do immunocytochemii

  1. Po zlaniu należy zachować kolonie hiPSC poprzez utrwalenie, usuwając pożywkę ze studzienek i dodając wstępnie podgrzany UWAGA 4% paraformaldehydu (~ 300 μL/studzienkę 4-dołkowego szkiełka podstawowego/szkiełka nakrywkowego). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
  2. Wyrzuć paraformaldehyd zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi zagrożeń biologicznych i bezpieczeństwa chemicznego.
  3. Umyj komórki 3 razy po 5 minut na wytrząsarce stołowej z PBS.
    UWAGA: Na tym etapie komórki na szkiełkach nakrywkowych/szkiełkach nakrywkowych mogą być przechowywane z dużą ilością PBS w temperaturze 4 °C przez czas nieokreślony. Alternatywnie można je od razu wykorzystać do ICC.

6. Barwienie immunologiczne hiPSC za pomocą markerów pluripotencji

UWAGA: Immunostainy hiPSC ze standardowymi przeciwciałami pluripotencji. Na przykład, tutaj komórki są podwójnie barwione przeciwciałami skierowanymi przeciwko jednemu antygenowi powierzchniowemu i 1 antygenowi wewnątrzkomórkowemu w sposób sekwencyjny w następujący sposób: antyspecyficzny antygen embrionalny-4 (SSEA4) z białkiem wiążącym anty-oktamery 4 (OCT-4) i anty-Tra-1-60 z genem 2 HMG BOX związanym z anty-SRY (SOX2) (szczegółowe informacje na temat przeciwciał można znaleźć w tabeli materiałów).

  1. Odessać PBS ze studzienek i dodać 500 μl/dołek roztworu blokującego bez Triton-X-100. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  2. Przygotować z góry określone stężenie (w tym przypadku należy użyć 1:200) przeciwciał powierzchniowych, SSEA4 lub Tra-1-60, rozcieńczając w roztworze blokującym bez Triton X-100.
    1. W przypadku szkiełek komorowych należy przygotować 300 μl/dołek 4-dołkowego szkiełka podstawowego, mieszając 298,5 μl roztworu blokującego powyżej i 1,5 μl przeciwciała pierwszorzędowego anty-SSEA4 lub Tra-1-60.
    2. W przypadku szkiełek nakrywkowych należy przygotować 40 μl/szkiełko nakrywkowe, mieszając 199 μl roztworu blokującego i 1 μl przeciwciała pierwszorzędowego anty-SSEA4 lub Tra-1-60.
  3. Odessać roztwór blokujący ze szkiełka komory i dozować przeciwciało pierwszorzędowe do odpowiednich studzienek. W przypadku szkiełek nakrywkowych należy umieścić kawałek parafilmu na szalce Petriego i nanieść 40 μl przeciwciała pierwszorzędowego na wierzch w postaci kropelki. Używając zgiętej igły strzykawki i kleszczyków, ostrożnie wyjmij szkiełko nakrywkowe z hodowli i umieść je komórką do dołu na kropli przeciwciała na parafilmie. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
  4. Następnego ranka przemyj komórki 3 razy po 5 - 10 minut każda, usuwając przeciwciało ze szkiełka komory i dodając PBS. W przypadku szkiełek nakrywkowych należy zdjąć każdy z nich z parafilmu i umieścić go z powrotem w dołku na 24-dołkowej płytce, komórką do góry. Ostrożnie dodaj PBS.
  5. Przygotować odpowiednie przeciwciała drugorzędowe w stosunku 1:500 w roztworze blokującym.
    1. W przypadku szkiełek komorowych należy przygotować 300 μl/studzienkę 4-dołkowego szkiełka komorowego, mieszając 499 μl roztworu blokującego i 1 μl koziego anty-mysiego IgG3 Alexa Fluor 488 (dla SSEA4) lub 1 μl koziego anty-mysiego IgM Alexa Fluor 488 (dla Tra-1-60).
    2. W przypadku szkiełek nakrywkowych należy przygotować 40 μl/szkiełko nakrywkowe, mieszając 499 μl roztworu blokującego i 1 μl koziego anty-mysiego IgG3 Alexa Fluor 488 (dla SSEA4) lub 1 μl koziego anty-mysiego IgM Alexa Fluor 488 (dla Tra-1-60).
  6. Odessać PBS ze szkiełka komory i dozować przeciwciało wtórne do odpowiednich studzienek. W przypadku szkiełek nakrywkowych, postępując zgodnie z krokiem 6.2, odwróć szkiełka nakrywkowe na roztwór przeciwciała umieszczony na parafilmie w temperaturze pokojowej przez 2 godziny
    UWAGA: W przypadku stosowania przeciwciał drugorzędowych znakowanych fluorescencyjnie, komórki muszą być chronione przed światłem. Umieść szkiełka komorowe i szkiełka nakrywkowe w ciemnym otoczeniu podczas inkubacji i przemywania się.
  7. Umyj komórki 3 razy przez 5 - 10 minut każda, usuwając przeciwciało ze szkiełka komory i dodając PBS. W przypadku szkiełek nakrywkowych należy ostrożnie wyjąć każde z nich z parafilmu i umieścić z powrotem w dołku z 24-dołkową płytką, komórką do góry. Delikatnie dodawaj PBS podczas prania.
  8. Przed sondowaniem w poszukiwaniu drugiego antygenu, w tym przypadku wewnątrzkomórkowego OCT-4 lub SOX2, należy ponownie inkubować w roztworze blokującym przygotowanym z odczynnikiem do permeabilizacji (Triton-X-100) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  9. Aby przeprowadzić barwienie immunologiczne na OCT-4 lub SOX2, po prostu postępuj zgodnie z metodologią opisaną w krokach 6.1-6.6 w celu zastosowania przeciwciał pierwszorzędowych i wtórnych. Do celów niniejszego protokołu należy użyć OCT-4 i SOX2 w stężeniu 1:200 oraz drugorzędowego przeciwciała koziego anty-królika IgG Alexa Fluor 594 w stężeniu 1:500.
  10. Po wyżej wymienionych pierwotnych i wtórnych zabiegach z przeciwciałami, przemyć komórki 3 razy przez 5 - 10 minut za pomocą PBS i przeciwbarwić 4',6'-diamidino-2-fenyloindolem, dichlorowodorkiem (DAPI) zgodnie ze standardowymi protokołami, jeśli pożądana jest wizualizacja jądrowa.

7. Przygotowanie do oglądania

  1. W przypadku szkiełek komorowych ostrożnie wyjmij górną komorę z prowadnicy, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie spłucz w wodzie destylowanej i dodaj podłoże montażowe i szkło nakrywkowe, aby umożliwić mikroskopię.
  2. W przypadku szkiełek nakrywkowych należy odwrócić szkiełka nakrywkowe na kroplę podłoża mocującego umieszczoną na szklanym szkiełku mikroskopowym.
  3. Obraz pod standardowym lub konfokalnym mikroskopem fluorescencyjnym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Niniejszy protokół zawiera opis krok po kroku procesu przenoszenia ludzkich iPSC z warstwy feederów do warunków bezfeederowych, a następnie ich ograniczonej propagacji, aby w sposób kosztowo efektywny umożliwić przeprowadzenie immunocytochemii w celu potwierdzenia zachowania pluripotencji. Rycina 1 przedstawia schematyczną reprezentację tego protokołu. Rycina 2A pokazuje kolonie hiPSC rosnące na iMEF w płytkach 6-dołkowych. Kolonie te wykazują typową morf...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawiony tutaj systematyczny protokół oferuje oszczędzającą czas i opłacalną metodę w postaci techniki hodowli w zmniejszonej skali, zaprojektowanej specjalnie w celu wspierania skutecznej analizy pluripotencji za pomocą immunocytochemii.

Główne zalety opisanej metodologii są następujące. Tradycyjnie potrzeba więcej niż 3 do 4 pasaży, aby przejść iPSC z warstw zasilających do warunków hodowli bez karmienia, w celu wyeliminowania szczątkowych iMEF pozostałych po zastosowaniu technik dysocj...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Źródła finansowania: Uniwersytet Arizony, Fundacja Jima Himelica i Centrum Biologii Chorób Złożonych w Arizonie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DMEM-F12/HEPESLife Technologies11330032
Technologie zastępowania surowicy nokautującej 10828028
L-glutamineLife Technologies25030081
MEM-NEAALife Technologies11140050
2-merkaptoetanolLife Technologies21985023
Rekombinowany ludzki FGF-Podstawowenauki o komórkachCRF001B
Y-27632 ROCK InhibitorR& D1254
Kolagenaza typu IVLife Technologies17104019
Matrigel z kwalifikacją hESC MatrixCorning354277
mTeSR1 Basal MediumStemCell Technologies05850
mTeSR1 5x SuplementStemCell Technologies05850
Delikatny bufor dysocjacyjnykomórek Technologie komórek07174
0,1 M PO4 Buforwłasnynie dotyczy
paraformaldehydu, prylMikroskopia elektronowa Nauki19202
1x sól fizjologiczna buforowana fosforanemn/a n/a
Normalna surowica koziaTechnologies16210072
Albumina surowicy bydlęcejSigma-AldrichA2153
Triton-X-100Sigma-AldrichX100
Oct-4A (C30A3) MAb królika,
Sox2 (D6D9) MAb królika,
SSEA4 (MC813) MAb myszy,
TRA-1-60(S) (TRA-1-60(S)) Mysia mAb		Sygnalizacja komórkowa
Sygnalizacja komórkowa
Sygnalizacja komórkowa
Sygnalizacja komórkowa		2840
3579
4755
4746		Alternatywnie, kombinację 6 pierwszorzędowych przeciwciał pluripotencji można kupić razem jako zestaw w katalogu #9656
Goat anti-Ms IgM Alexa Fluor 488Life TechnologiesA21042
Goat anti-Ms IgG3 Alexa Fluor 488Life TechnologiesA21151
Goat anti-Rb IgG Alexa Fluor 594Life TechnologiesA11037
Multiwell Cell Culture PlatesFisher Naukowy 0720080/0720081Dostępne w rozmiarach 6, 12, 24, 48, 96 dołków
Zjeżdżalnie komoroweFisher Scientific 12 565 21Dostępne w wersji ze szkła lub tworzywa permanoksowego W rozmiarach 1, 2, 4, 8, 16 dołków
Szkło nakrywkowe do uprawyFisher Scientific 12 545 82Dostępne w rozmiarach 12, 15, 18, 22 i 25 mm
macierzystych Life

Bibliografia

  1. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
  2. Park, I. H., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134, 877-886 (2008).
  3. Hallett, P. J., et al. Successful function of autologous iPSC-derived dopamine neurons following transplantation in a non-human primate model of Parkinson's disease. Cell stem cell. 16, 269-274 (2015).
  4. Haston, K. M., Finkbeiner, S. Clinical Trials in a Dish: The Potential of Pluripotent Stem Cells to Develop Therapies for Neurodegenerative Diseases. Annu rev pharm toxicol. 56, 489-510 (2016).
  5. Zhang, L., et al. Derivation and high engraftment of patient-specific cardiomyocyte sheet using induced pluripotent stem cells generated from adult cardiac fibroblast. Circ heart fail. 8, 156-166 (2015).
  6. Byrne, J. A., Nguyen, H. N., Reijo Pera, R. A. Enhanced generation of induced pluripotent stem cells from a subpopulation of human fibroblasts. PloS one. 4, 7118(2009).
  7. Sivapatham, R., Zeng, X. Generation and Characterization of Patient-Specific Induced Pluripotent Stem Cell for Disease Modeling. Methods mol bio. 1353, 25-44 (2016).
  8. Park, I. H., et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451, 141-146 (2008).
  9. Ruff, D., Lieu, P. T. Profiling stem cells using quantitative PCR protein assays. Methods mol bio. 997, 225-236 (2013).
  10. Pripuzova, N. S., et al. Development of a protein marker panel for characterization of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) using global quantitative proteome analysis. Stem cell res. 14, 323-338 (2015).
  11. Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc jpn acad ser B phys biol sci. 85, 348-362 (2009).
  12. Bigdeli, N., et al. Adaptation of human embryonic stem cells to feeder-free and matrix-free culture conditions directly on plastic surfaces. J Biotechnol. 133, 146-153 (2008).
  13. Stover, A. E., Schwartz, P. H. Adaptation of human pluripotent stem cells to feeder-free conditions in chemically defined medium with enzymatic single-cell passaging. Methods mol bio. 767, 137-146 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Hodowla bezsurowicowaszkie ka z komorszkie ka nakrywkiinhibitor ROCKmedium mTeSRmarkery pluripotencjimikroskopia konfokalna
Rozmnażanie na małą skalę ludzkich iPSC w warunkach wolnych od surowicy w rutynowej charakterystyce immunocytochemicznej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.