Przedstawiono strategię generowania mutacji w genach histonów w ich endogennym położeniu u Saccharomyces cerevisiae.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Ukierunkowana mutageneza in situ genów histonów u pączkujących drożdży
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Opisujemy system oparty na rekombinacji PCR i homologicznej do generowania ukierunkowanych mutacji w genach histonów w pączkujących komórkach drożdży. Powstałe w ten sposób zmutowane allele znajdują się w swoich endogennych miejscach genomowych, a po zabiegu w genomie nie pozostają żadne egzogenne sekwencje DNA. Ponieważ w haploidalnych komórkach drożdży każde z czterech podstawowych białek histonowych jest kodowane przez dwa niealleliczne geny z wysoce homologicznymi otwartymi ramkami odczytu (ORF), ukierunkowanie mutagenezy specyficznie na jeden z dwóch genów kodujących określone białko histonowe może być problematyczne. Strategia, którą tutaj opisujemy, omija ten problem, wykorzystując sekwencje na zewnątrz, a nie wewnątrz, ORF docelowych genów do etapu rekombinacji homologicznej. Inną cechą tego systemu jest to, że regiony DNA napędzające etapy rekombinacji homologicznej mogą być bardzo rozległe, co zwiększa prawdopodobieństwo udanych zdarzeń integracyjnych. Cechy te sprawiają, że strategia ta szczególnie dobrze nadaje się do mutagenezy genów histonów, ale może być również dostosowana do mutagenezy innych genów w genomie drożdży.
Wprowadzenie
Cztery podstawowe białka histonowe H2A, H2B, H3 i H4 odgrywają kluczową rolę w zagęszczeniu, organizacji i funkcjonowaniu chromosomów eukariotycznych. Dwa zestawy każdego z tych histonów tworzą oktamer histonowy, szpulę molekularną, która kieruje owijaniem ~147 par zasad DNA wokół siebie, ostatecznie powodując powstanie nukleosomu1. Nukleosomy są aktywnymi uczestnikami różnych procesów opartych na chromosomach, takich jak regulacja transkrypcji genów oraz tworzenie euchromatyny i heterochromatyny w chromosomach, i jako takie były przedmiotem intensywnych badań w ciągu ostatnich kilku dekad. Opisano szereg mechanizmów, za pomocą których można ma....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
UWAGA: Strategia eksperymentalna dla skierowanej mutagenezy genu histonowego in situ obejmuje kilka etapów (zestawionych na ryc. 1). Etapy te to: (1) zastąpienie docelowego genu histonowego genem URA3, (2) uzyskanie i oczyszczenie produktów PCR odpowiadających dwóm częściowo nachodzącym na siebie fragmentom docelowego genu histonowego przy użyciu starterów zawierających pożądane mutacje, (3) fuzja PCR dwóch częściowo nachodzących na siebie fragmentów w celu uzyskania pełnej długości produktów PCR przeznaczonych do integracji, (4) współtransformacja produktów PCR pełnej długości oraz wektora szkieletowego i selekcja pod kątem znacznik....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Opisujemy generowanie allelu hht2 wykazującego ekspresję zmutowanego białka histony H3, zawierającego substytucję w pozycji 53 z argininy na kwas glutaminowy (mutant H3-R53E), jako reprezentatywny przykład strategii celowanej mutagenezy in situ .
Wygenerowaliśmy szczep, w którym cała otwarta ramka odczytu (ORF) genu HHT2 została zastąpiona genem URA3 (patrz krok 1 protokołu). Szczep ten, yA.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Wysoki poziom homologii sekwencji między dwoma nieallelicznymi genami, które kodują każde z czterech podstawowych białek histonowych w haploidalnych komórkach S. cerevisiae, może stanowić wyzwanie dla badaczy, którzy chcą specyficznie ukierunkować jeden z dwóch genów na mutagenezę. Wcześniej opisane metodologie mutagenezy drożdży, w tym Delitto Perfetto, mutageneza genomowa specyficzna dla miejsca (SSG) i metody zastępowania alleli oparte na PCR bez klonowania 5,6,7
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Dziękujemy Reine Protacio za pomocne komentarze podczas przygotowywania tego manuskryptu. Wyrażamy wdzięczność Narodowej Fundacji Nauki (granty nr 1243680 i 1613754) oraz Hendrix College Odyssey Program za wsparcie finansowe.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 1 kb Drabinka DNA (standardy DNA) | New England BioLabs | N3232L | |
| Agaroza | Sigma | A5093-100G | |
| Kwas borowy | Sigma | B0394-500G | |
| Mieszanka dNTP (10 mM każdy) | ThermoFisher Scientific | R0192 | |
| Roztwór EDTA (0,5 M, pH 8,0) | AmericanBio | AB00502-01000 | |
| Etanol (200 dowodów) | Fisher Scientific | 16-100-824 | |
| Sól disodowa kwasu etylenodiaminotetraoctowego dwuwodna (EDTA)) | Sigma | E4884-500G | |
| Dwuwodny octan litu | Sigma | L6883-250G | |
| MyCycler Thermal Cycler | BioRad | 170-9703 | |
| Poli(glikol etylenowy) (PEG) | Sigma | P3640-1KG | |
| PrimeSTAR HS DNA Polymerase (polimeraza DNA o wysokiej wierności) i 5x bufor | Fisher Scientific | 50-443-960 | |
| Roztwór DNA plemników łososia | ThermoFisher Scientific | 15632-011 | |
| Sigma 7-9 (baza Tris, postać proszku) | Sigma | T1378-1KG | |
| Trójwodny octan sodu | Sigma | 236500-500G | |
| Supra Sieve GPG Agaroza (agaroza o niskiej temperaturze mieszania) | AmericanBio | AB00985-00100 | |
| Polimeraza Taq i 10x Bufor | New England BioLabs | M0273X | |
| Wykałaczki | Fisher Scientific | S67859 | |
| Tris-HCl (1 M, pH 8,0) | AmericanBio | AB14043-01000 | |
| a-D(+)-Glukoza | Fisher Scientific | AC170080025 | do pożywek drożdżowych |
| Agar | Fisher Scientific | DF0140-01-0 | do pożywki drożdżowej |
| Peptone | Fisher Scientific | DF0118-07-2 | dla pożywki YPD |
| Ekstrakt drożdżowy | Fisher Scientific | DF0127-17-9 | dla pożywki YPD |
| Kwas 4-aminobenzoesowy | Sigma | A9878-100G | dla kompletnego minimalnego podłoża dropout |
| Adenine | Sigma | A8626-100G | dla kompletnego zminimalizowanego podłoża dropout |
| Chlorowodorek glicyny | Sigma | G2879-100G | dla kompletnego zminimalizowanego odpadania podłoża |
| L-Alanine | Sigma | A7627-100G | dla kompletnego minimalnego dropoutu średniego |
| Monochlorowodorek L-argininy | Sigma | A5131-100G | dla kompletnego zminimalizowanego odpadania podłoża |
| L-Asparagina monohydrat | Sigma | A8381-100G | dla kompletnego minimalnego dropoutu medium |
| Monohydrat soli sodowej kwasu L-asparaginowego | Sigma | A6683-100G | dla kompletnego minimalnego dropoutu |
| Jednowodny chlorowodorek L-cysteiny | Sigma | C7880-100G | dla kompletnego podłoża o minimalnym odpadaniu |
| Chlorowodorek kwasu L-glutaminowego | Sigma | G2128-100G | dla kompletnego podłoża o minimalnym odpadaniu |
| L-Glutamina | Sigma | G3126-100G | dla kompletnego minimalnego podłoża dropout |
| Monochlorowodorek L-histydyny monohydrat | Sigma | H8125-100G | dla kompletnego minimalnego podłoża dropout |
| L-Isoleucine | Sigma | I2752-100G | dla kompletnego zminimalizowanego dropoutu medium |
| L-Leucine | Sigma | L8000-100G | dla kompletnego minimalnego dropoutu medium |
| Monochlorowodorek L-lizyny | Sigma | L5626-100G | dla kompletnego minimalnego podłoża dropout |
| L-Methionine | Sigma | M9625-100G | dla kompletnego zminimalizowanego podłoża dropout |
| L-fenyloalanina | Sigma | P2126-100G | dla kompletnego zminimalizowanego dropout medium |
| L-Proline | Sigma | P0380-100G | dla kompletnego minimalnego dropoutu medium |
| L-Serine | Sigma | S4500-100G | dla kompletnego zminimalizowanego odstępu powietrza |
| L-Treonina | Sigma | T8625-100G | dla kompletnego zminimalizowanego dropoutu medium |
| L-Tryptofan | Sigma | T0254-100G | dla kompletnego minimalnego podłoża dropout |
| L-Tyrozyna | Sigma | T3754-100G | dla kompletnego minimalnego dropoutu medium |
| L-Valine | Sigma | V0500-100G | dla kompletnego minimalnego dropoutu średniego |
| myo-Inositol | Sigma | I5125-100G | dla kompletnego minimalnego dropoutu medium |
| Uracil | Sigma U0750-100G | dla całkowicie minimalnego podłoża dropout | |
| Siarczan amonu | Fisher Scientific | A702-500 | dla kompletnego podłoża o minimalnym spadku aktywności |
| Drożdżowa baza azotowa | Fisher Scientific | DF0919-07-3 | dla kompletnego zminimalizowanego odpadania podłoża |
| Kwas 5-fluoroorotyczny (5-FOA) | AmericanBio | AB04067-00005 | dla Pożywki 5-FOA |
Bibliografia
- Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
- Campos, E. I., Reinberg, D. Histones: annotating chromatin. Annu Rev Genet. 43, 559-599 (2009).
- Rand....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
