Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ukierunkowana mutageneza in situ genów histonów u pączkujących drożdży

16K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55263

⸱

26 stycznia 2017

 , 
1Biology Department, Hendrix College

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiono strategię generowania mutacji w genach histonów w ich endogennym położeniu u Saccharomyces cerevisiae.

Streszczenie

Opisujemy system oparty na rekombinacji PCR i homologicznej do generowania ukierunkowanych mutacji w genach histonów w pączkujących komórkach drożdży. Powstałe w ten sposób zmutowane allele znajdują się w swoich endogennych miejscach genomowych, a po zabiegu w genomie nie pozostają żadne egzogenne sekwencje DNA. Ponieważ w haploidalnych komórkach drożdży każde z czterech podstawowych białek histonowych jest kodowane przez dwa niealleliczne geny z wysoce homologicznymi otwartymi ramkami odczytu (ORF), ukierunkowanie mutagenezy specyficznie na jeden z dwóch genów kodujących określone białko histonowe może być problematyczne. Strategia, którą tutaj opisujemy, omija ten problem, wykorzystując sekwencje na zewnątrz, a nie wewnątrz, ORF docelowych genów do etapu rekombinacji homologicznej. Inną cechą tego systemu jest to, że regiony DNA napędzające etapy rekombinacji homologicznej mogą być bardzo rozległe, co zwiększa prawdopodobieństwo udanych zdarzeń integracyjnych. Cechy te sprawiają, że strategia ta szczególnie dobrze nadaje się do mutagenezy genów histonów, ale może być również dostosowana do mutagenezy innych genów w genomie drożdży.

Wprowadzenie

Cztery podstawowe białka histonowe H2A, H2B, H3 i H4 odgrywają kluczową rolę w zagęszczeniu, organizacji i funkcjonowaniu chromosomów eukariotycznych. Dwa zestawy każdego z tych histonów tworzą oktamer histonowy, szpulę molekularną, która kieruje owijaniem ~147 par zasad DNA wokół siebie, ostatecznie powodując powstanie nukleosomu1. Nukleosomy są aktywnymi uczestnikami różnych procesów opartych na chromosomach, takich jak regulacja transkrypcji genów oraz tworzenie euchromatyny i heterochromatyny w chromosomach, i jako takie były przedmiotem intensywnych badań w ciągu ostatnich kilku dekad. Opisano szereg mechanizmów, za pomocą których można manipulować nukleosomami w sposób ułatwiający wykonywanie określonych procesów – mechanizmy te obejmują potranslacyjną modyfikację reszt histonowych, remodeling nukleosomów zależny od ATP oraz niezależną od ATP reorganizację nukleosomów i składanie/demontaż2,3.

Pączkujące drożdże Saccharomyces cerevisiae są szczególnie potężnym organizmem modelowym dla zrozumienia funkcji histonów u eukariontów. Można to w dużej mierze przypisać wysokiemu stopniowi ewolucyjnego zachowania białek histonowych w całej domenie eukarya oraz podatności drożdży na różne genetyczne i biochemiczne podejścia eksperymentalne4. Podejścia odwrotnej genetyki u drożdży są szeroko stosowane do badania wpływu określonych mutacji histonów na różne aspekty biologii chromatyny. Do tego typu eksperymentów często lepiej jest używać komórek, w których zmutowane histony są wyrażane z ich natywnych loci genomowych, ponieważ ekspresja z autonomicznych plazmidów może prowadzić do nieprawidłowych wewnątrzkomórkowych poziomów białek histonowych (ze względu na różną liczbę plazmidów w komórkach) i jednoczesnej zmiany środowisk chromatyny, co może ostatecznie zakłócić interpretację wyników.

Tutaj opisujemy technikę opartą na PCR, która pozwala na celową mutagenezę genów histonów w ich natywnych lokalizacjach genomowych, która nie wymaga etapu klonowania i skutkuje generowaniem pożądanej mutacji (mutacji) bez resztek egzogennych sekwencji DNA w genomie. Technika ta wykorzystuje wydajny system rekombinacji homologicznej w drożdżach i ma kilka cech wspólnych z innymi podobnymi technikami opracowanymi przez inne grupy - w szczególności Delitto Perfetto, mutagenezę genomową specyficzną dla miejsca (SSG) i metody zastępowania alleli oparte na PCR bez klonowania5,6,7. Jednak technika, którą opisujemy, ma aspekt, który sprawia, że szczególnie dobrze nadaje się do mutagenezy genów histonowych. W haploidalnych komórkach drożdży każdy z czterech podstawowych histonów jest kodowany przez dwa niealleliczne i wysoce homologiczne geny: na przykład histon H3 jest kodowany przez geny HHT1 i HHT2, a otwarte ramki odczytu (ORF) tych dwóch genów są w ponad 90% identyczne w sekwencji. Ten wysoki stopień homologii może skomplikować eksperymenty zaprojektowane specjalnie na jeden z dwóch genów kodujących histony do mutagenezy. Podczas gdy wyżej wymienione metody często wymagają użycia przynajmniej niektórych sekwencji w ORF genu docelowego do napędzania rekombinacji homologicznej, technika, którą tutaj opisujemy, wykorzystuje sekwencje flankujące ORF genów histonów (które mają znacznie mniejszą homologię sekwencji) na etapie rekombinacji, zwiększając w ten sposób prawdopodobieństwo skutecznego ukierunkowania mutagenezy na pożądane locus. Co więcej, regiony homologiczne, które napędzają rekombinację, mogą być bardzo rozległe, co dodatkowo przyczynia się do efektywnej ukierunkowanej rekombinacji homologicznej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Strategia eksperymentalna dla skierowanej mutagenezy genu histonowego in situ obejmuje kilka etapów (zestawionych na ryc. 1). Etapy te to: (1) zastąpienie docelowego genu histonowego genem URA3, (2) uzyskanie i oczyszczenie produktów PCR odpowiadających dwóm częściowo nachodzącym na siebie fragmentom docelowego genu histonowego przy użyciu starterów zawierających pożądane mutacje, (3) fuzja PCR dwóch częściowo nachodzących na siebie fragmentów w celu uzyskania pełnej długości produktów PCR przeznaczonych do integracji, (4) współtransformacja produktów PCR pełnej długości oraz wektora szkieletowego i selekcja pod kątem znacznika znajdującego się na plazmidzie, (5) wykrywanie transformantów opornych na 5-FOA, (6) oczyszczenie kolonii opornych na 5-FOA oraz utrata plazmidu szkieletowego, oraz (7) analizy molekularne w celu sprawdzenia poprawnej integracji allelu mutantycznego.

Schemat edycji genów z krokami mutacji HHF1, HHT1, obrazujący proces modyfikacji DNA.
Rycina 1: Schematyczny przegląd strategii celowanego mutagenezy in situ genów histonowych u drożdży pączkujących. W tym przykładzie celem jest gen HHT2, jednak każdą inną histonową gen można również zmienić za pomocą tej strategii. (A) Komórki drożdży haploidalnych zawierają dwa geny kodujące histon H3 (HHT1 i HHT2) oraz dwa geny kodujące histon H4 (HHF1 i HHF2), ułożone tak, jak pokazano na rycinie (geny HHT1 i HHF1 znajdują się na chromosomie II, a geny HHT2 i HHF2 – na chromosomie XIV – strzałki wskazują kierunek transkrypcji). W pierwszym kroku procedury otwarty ramek odczytu (ORF) genu HHT2 jest zastępowany genem URA3, co prowadzi do powstania szczepu hht2Δ::URA3. (B) W części 1, jako matrycę do dwóch reakcji PCR wykorzystuje się dziką kopię genu HHT2 z próbki DNA genomowego, aby wygenerować dwa częściowo nakładające się fragmenty genu. Odwrotny starter pierwszej reakcji zawiera jeden lub więcej niestandardowych nukleotydów (oznaczonych czerwonym okręgiem), odpowiadających pożądanym mutacjom wprowadzanym do genomu. Starter w kierunku prostopadłym w drugiej reakcji posiada równoważną niestandardowość w konfiguracji komplementarnej (również oznaczonej czerwonym okręgiem). Dwa produkty PCR uzyskane w części 1 (produkty a i b) są następnie używane jako matryca do fuzji PCR z wykorzystaniem dwóch starterów, które wiążą się z produktami a i b w sposób pokazany w części 2. Powstaje w ten sposób pełnowymiarowy produkt PCR (produkt c w części 3) zawierający pożądane mutacje. (C) Następnie szczep hht2Δ::URA3 jest ko-transformowany z pełnowymiarowymi produktami PCR i szkieletem plazmidowym (w tym przykładzie plazmid oznakowany HIS3), a komórki są selekcjonowane pod kątem obecności plazmidu (na podłożu pozbawionym histydyny w tym przykładzie). Transformanty są następnie badane pod kątem oporności na 5-FOA – komórki oporne są kandydatami do przejścia zdarzenia rekombinacji homologicznej, prowadzącego do integracji produktu PCR i wycięcia genu URA3, jak pokazano. Kolejna utrata szkieletu plazmidowego w wyniku mitotycznego podziału komórek prowadzi do ostatecznego, pożądanego szczepu histonowego mutanty. Stwierdziliśmy, że wybór szkieletu plazmidowego, a następnie badanie oporności na 5-FOA, prowadzi do znacznie wyższej częstości identyfikacji poprawnych zdarzeń integracji w porównaniu do bezpośredniego wyboru na płytach z 5-FOA, które w większości identyfikują komórki, które nabyły spontaniczne mutacje genu URA3. (Rycina została zmodyfikowana z odniesienia14). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

1. Zastąpienie genu histonowego genem URA3

  1. Przeprowadź standardowe jednoetapowe zakłócenie genu metodą PCR, zastępując ORF docelowego genu histonowego URA3 gen8,9.
    UWAGA: Użycie komórek drożdżowych zawierających ura3Δ0 zaleca się, ponieważ ta mutacja usuwa całe endogenne URA3 ORF, unikając w ten sposób integracji produktu PCR do URA3 lokus8. Alternatywnie, K. lactis URA3 gen może być skutecznie wykorzystany do generowania wymiany histonów w dowolnym ura3 tło, ponieważ jest funkcjonalne w S. cerevisiae ale wykazuje jedynie częściową homologię sekwencji z S. cerevisiae URA3 gen. Straina powinna być również autotroficzna co najmniej pod względem jednego związku, co umożliwi selekcję plazmidu szkieletowego w eksperymencie transformacji (zobacz krok 4 niniejszego protokołu). Ten krok nie jest konieczny, jeśli gen histonowy docelowyΔ::URA3 szczep jest już dostępny

2. Generacja i oczyszczanie produktów PCR odpowiadających dwóm częściowo nakładającym się fragmentom genu histonowego za pomocą starterów zawierających pożądane mutacje

  1. Wygeneruj produkty PCR odpowiadające dwóm częściowo nakładającym się fragmentom badanego genu histonowego.
    1. Przygotuj dwie reakcje PCR w następujący sposób:
      1. Aby wygenerować produkty PCR odpowiadające pierwszej połowie genu (produkt a w Rycina 1B), przygotuj następującą reakcję: 1 μl szablonowy DNA, 5 μl10 μM starter w kierunku wstępnym, 5 μl10 μM primer odwrotny, 0.5 μl (1,25 U) termostabilna polimeraza DNA, 10 μl 5x bufor polimerazy DNA, 5 μl mieszanina dNTP (po 2 mM), i 23.5 μl H₂O2O.
        UWAGA: DNA matrycowe może być DNA genomowym wyizolowanym z szczebla typu dzikiego pod względem badanego genu histonowego, przy użyciu standardowych procedur10Aby uwzględnić różnice w stężeniu DNA oraz poziomie zanieczyszczeń w różnych przygotowaniach genomu, zaleca się zoptymalizowanie reakcji poprzez użycie niemianego DNA lub różnych rozcieńczeń przygotowań genomowych (np. 1:10 i 1:100). Primer w kierunku wstępnym powinien przyłączać się do regionu położonego w górnej strumieniowej części genu docelowego. Primer odwrotny powinien przyłączać się w obrębie ORF, mieć około 40 nukleotydów długości i zawierać pożądane mutacje w środkowej części (patrz Rysunek 1B-1 i sekcja Wyniki reprezentatywne zawierają przykłady). Zaleca się stosowanie polimerazy DNA o wysokiej wierności, aby zmniejszyć częstość niepożądanych mutacji podczas syntezy produktów PCR.
      2. Aby wygenerować produkty PCR odpowiadające drugiej połowie genu (produkt b w Rycina 1B), przygotuj reakcję zgodnie z punktem 2.1.1.1, ale z użyciem innych starterów.
        UWAGA: Starter w kierunku wstępnym powinien wiązać się z regionem ORF, mieć długość około 40 nukleotydów i zawierać pożądane mutacje w środkowej części. Należy pamiętać, że mutacje w tym starterze stanowią komplementarny odwrotny ciąg mutacji znajdujących się w starterze odwrotnym w kroku 2.1.1.1. Starter odwrotny powinien wiązać się z regionem położonym w dół strumienia względem genu docelowego (patrz Rysunek 1B-1 i sekcję Przykładowe wyniki dla przykładów).
    2. Umieścić mieszaniny w termocyklerze z następującymi ustawieniami: 94 °C 30 sek; 30 cykli następujących warunków: 98 °C 10 sek, 60 °C 5 sek, 72 °C 1,5 min; oraz 72 °C 10 min.
      Uwaga: Optymalizacja parametrów PCR może być konieczna dla określonych zestawów starterów i badanego genu histonowego.
  2. Uruchomienie 20 - 50 μl materiału z reakcji PCR w żelu agarozowym o niskiej temperaturze topnienia (0,9%) w buforze TBE (89 mM Tris, 89 mM kwas borowy, 2,5 mM EDTA)
  3. Wytnij fragmenty żelu agarozowego zawierające produkty PCR z żelu za pomocą czystego skalpela lub brzytwy i przenieś każdy do rurki mikrocentryfugowej o pojemności 1,5 ml. Przechowuj fragmenty żelu agarozowego zawierające produkty PCR w temperaturze -20 °C, aż do momentu użycia.

3. PCR fuzji dwóch częściowo nakładających się fragmentów w celu uzyskania pełnej wielkości produktów PCR do integracji

  1. Przygotuj szablon do reakcji PCR
    1. Stop fragmenty żelu agarozowego z kroku 2.3, umieszczając probówki wirowarkowe w bloku grzewczym ustawionym na 65 °C na 5 min (lub aż do całkowitego stopnienia). Wirowanie powtarzaj co 1–2 min, aby przyspieszyć proces topnienia.
    2. Przenieś ustaloną objętość stopionego żelu z każdego próbnika (n.p. po 50 μl, razem 100 μl) do jednej probówki wirowarkowej i wymieszaj przez krótkie wirowanie. Użyj tego roztworu jako szablonu w reakcjach fuzji PCR. Przechowuj probówkę w temperaturze -20 °C do momentu użycia.
  2. Powiel dużą ilość PCR produktu o pełnej długości (produkt c na rysunku 1B)
    1. Przygotuj sześć reakcji PCR, każda zawierającą następujące składniki: 2 μl DNA-szablonu, 10 μl startera wstecznego (10 μM), 10 μl startera odwrotnego (10 μM), 1 μl (2,5 U) termo-stabilnej polimerazy DNA, 20 μl buforu 5x do polimerazy DNA, 10 μl mieszaniny dNTP (po 2 mM), oraz 47 μl H2O.
      UWAGA: Liczbę reakcji można dostosować w zależności od wydajności PCR. DNA-szablon (patrz 3.1.2) należy podgrzać do 65 °C aż do stopnienia, wymieszać przez wirowanie i dodać jako ostatni składnik do mieszaniny reakcyjnej PCR. Po dodaniu delikatnie, ale dokładnie wymieszaj, pobierając i odprowadzając roztwór kilkakrotnie pipetą. Ze względu na możliwe różnice w stężeniu DNA w różnych próbkach, zaleca się wstępne optymalizowanie reakcji poprzez użycie nierzodowanego szablonu lub jego różnych rozcieńczeń (n.p. 1:10 i 1:100). Dwa używane startery powinny wiązać się z dwoma częściowo nakładającymi się fragmentami genu docelowego, jak pokazano na rysunku 1B-2, i powinny być zaprojektowane tak, aby końcowe produkty PCR zawierały co najmniej 40 par zasad z każdej strony homologicznych do regionów otaczających ORF URA3, które będą kierować etapem rekombinacji homologicznej (patrz sekcja Przykładowe Wyniki dla przykładów). Zaleca się użycie polimerazy DNA o wysokiej wierności, aby zmniejszyć częstość niepożądanych mutacji podczas syntezy produktów PCR.
    2. Umieść probówki w termocyklerze ustawionym na następujące parametry: 94 °C przez 30 sek; 30 cykli składających się z: 98 °C przez 10 sek, 50 °C przez 15 sek, 72 °C przez 1,5 min; oraz końcowe wytrzymanie 72 °C przez 10 min.
      UWAGA: Może być konieczna optymalizacja parametrów PCR dla konkretnych zestawów starterów i genu histonowego.

4. Kointegracja produktów PCR pełnej wielkości i szkieletu plazmidu oraz selekcja markera na plazmidzie

  1. Stężenie produktów PCR
    1. Połącz sześć reakcji PCR (łącznie 600 μl) z kroku 3.2.2 w jednej probówce mikrowirówkowej i wymieszaj przez wirówkowanie.
    2. Podziel próbkę na trzy alikwoty po 200 μl do probówek mikrowirówkowych. Osadź DNA w każdej probówce poprzez dodanie 20 μl 3M octanu sodu (pH 5,2) oraz 550 μl etanolu 100%. Roztwór dokładnie wymieszaj i umieść na lodzie na co najmniej 15 min. DNA zbiierz przez odwirowanie przy ~14 000 x g przez 10 min, przepłucz osad 200 μl etanolu 70% i wysusz powietrzem.
    3. Wstrząśnij każdy osad DNA w 25 μl wody dH2O i połącz wszystkie do jednej probówki (łącznie 75 μl).
  2. Kotransformacja drożdży
    1. Przygotuj 10 ml nocnej hodowli szczepu wygenerowanego w sekcji 1 w płynnym medium ekstraktu drożdżowego, peptonu i dekstrozy (YPD)11.
    2. Następnego dnia zaszczep 400 mL płynnego medium YPD 8 ml nasycanej nocnej hodowli i inkubuj przy wstrząsaniu w 30 °C przez 4–5 h, aby komórki osiągnęły fazę wzrostu logarytmicznego.
    3. Zbierz komórki przez odwirowanie przy ~3220 x g przez 10 min, odrzuć płynne medium i wstrząśnij komórki w jednej objętości roztworu 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA, 0,1 M octanu litu (TE/LiAc).
    4. Zbierz komórki przez odwirowanie przy ~3220 x g przez 10 min i odrzuć roztwór TE/LiAc.
    5. Wstrząśnij komórki w 1 ml roztworu TE/LiAc.
    6. Przygotuj następujący koktajl reakcyjny w probówce mikrowirówkowej: 800 μl komórek z kroku 4.2.5, 40 μl wrzonych przez 5 min DNA z nasienia łososia o stężeniu 10 mg/ml (schłodzone na lodzie przez co najmniej 5 min przed użyciem), łącznie 12,5 μg DNA plazmidu szkieletowego oraz 75 μl skoncentrowanego produktu PCR z kroku 4.1.3.
      UWAGA: DNA z nasienia łososia należy gotować przez 5 min i umieścić na lodzie przez co najmniej 5 min przed dodaniem do reakcji. Całkowitą objętość dodanego DNA plazmidu szkieletowego należy utrzymać na minimalnym poziomie (~80 μl lub mniej). Przykład plazmidu szkieletowego przedstawiono w sekcji Wyniki Reprezentatywne.
    7. Gruntownie wymieszaj zawartość probówki z koktajlem i podziel równo na osiem probówek mikrowirówkowych (Probówki 1–8).
    8. Przygotuj następujące dwie kontrolne reakcje transformacji:
      1. Probówka 9 (kontrola bez produktu PCR): 100 μl komórek z kroku 4.2.5, 5 μl wrzonych przez 5 min DNA z nasienia łososia o stężeniu 10 mg/ml (zob. uwaga do kroku 4.2.6), łącznie 1,56 μg DNA plazmidu szkieletowego, bez dodania produktu PCR.
      2. Probówka 10 (kontrola bez DNA): 100 μl komórek z kroku 4.2.5, 5 μl wrzonych DNA z nasienia łososia o stężeniu 10 mg/ml (zob. uwaga do kroku 4.2.6), bez dodania DNA plazmidu szkieletowego i bez produktu PCR.
      3. Delikatnie, ale dokładnie wymieszaj obie probówki poprzez wielokrotne pipetowanie w górę i w dół.
    9. Inkubuj dziesięć probówek w 30 ˚C przez 30 min.
    10. Do każdej probówki dodaj 1,2 ml 40% polietylenu glikolu (PEG 3350) w roztworze TE/LiAc. Dokładnie wymieszaj za pomocą pipety P-1000 aż do uzyskania jednolitego roztworu.
    11. Inkubuj dziesięć probówek w 30 °C przez 30 min. Delikatnie wymieszaj roztwór pipetowaniem, a następnie inkubuj probówki w 42 °C przez 15 min.
    12. Zbierz komórki poprzez wirówkowanie probówek w mikrowirówce przy ~14 000 x g przez 30 s. Odrzuć ciecz i wstrząśnij komórki w 1 ml sterylnej wody dH2O.
    13. Zbierz komórki poprzez wirówkowanie probówek w mikrowirce przy ~14 000 x g przez 30 s. Odrzuć ciecz i wstrząśnij komórki w 500 μl sterylnej wody dH2O.
    14. Połącz probówki 1–8 (łącznie 4 ml) i dokładnie wymieszaj poprzez pipetowanie w górę i w dół.
    15. Nanosząc po 200 μl mieszaniny na każdą z dwudziestu kompletnych minimalnych płyt selekcyjnych11 (płyty 1–20), dokonaj selekcji plazmidu szkieletowego.
    16. Nanosząc po 200 μl mieszaniny z Probówki 9 i 200 μl z Probówki 10, każda na osobną płytę selekcyjną (odpowiednio płyty 21 i 22).
    17. Inkubuj 22 płyty w 30 °C przez 3–5 dni w celu selekcji transformantów plazmidowych.
    18. Sprawdź płyty transformacji po 3–5 dniach inkubacji. Na płytach 1–21 powinno być widocznych około 5000 kolonii (zob. Wyniki Reprezentatywne), natomiast na płytce 22 nie powinno być żadnych kolonii.

5. Wykonaj ekranowanie transformantów opornych na 5-FOA

  1. Przenieś komórki z płytek 1–20 (oraz płytki transformacji 21 jako kontroli) na płytki z 5-fluoroorotanem (5-FOA)11 metodą replikowania12, aby wyselekcjonować utratę genu URA3 wynikającą z integracji produktów PCR w pożądanym miejscu.
    1. Usuń pokrywkę płytki i przyciśnij płytkę zawierającą kolonie do sterylnej tkaniny welwetowej. Przenieś komórki z welwetu na płytkę 5-FOA, przyciskając płytkę do welwetu. Inkubuj płytki przez 2 dni w 30 ˚C.
  2. Po 2-dniowej inkubacji dokładnie przeanalizuj płytki 5-FOA pod kątem wzrostu.
    UWAGA: Kandydujące zdarzenie integracji będzie reprezentowane przez małą, nieregularną, „spłaszczoną” kolonię na płytce 5-FOA – z kolei małe papille rosnące na płytach 5-FOA najprawdopodobniej wskazują na spontaniczne mutacje genu URA3, które pojawiły się podczas wzrostu kolonii na płytach transformacji, i dlatego nie są najprawdopodobniej pożądane zdarzeniem integracji (zobacz rysunek 3 w sekcji Reprezentatywne wyniki w celu uzyskania dodatkowych wyjaśnień oraz przykładów).

6. Oczyszczanie kolonii opornych na 5-FOA i utrata plazmidu szkieletowego

  1. Za pomocą sterylnych patyczków wybrać kolonie kandydujące z płytek 5-FOA opisanych w kroku 5.2 i wyizolować pojedyncze kolonie na płytach YPD. Inkubować przez 2–3 dni w temperaturze 30 °C.
  2. Po inkubacji replika-nałożyć hodowlę z każdej płytki YPD używanej do oczyszczania na świeżą płytę YPD oraz na płytę bez uracylu, aby sprawdzić utratę URA3 gen oraz drugiej płytki selekcyjnej do monitorowania obecności lub braku szkieletowego plazmidu. Inkubuj przez 1–2 dni w temperaturze 30 °C.
  3. Po inkubacji wybierz kolonię z każdej próbki kandydującej, która rośnie na płycie YPD, ale nie rośnie na żadnej z płyt drop-out (taka kolonia powinna stracić URA3 gen poprzez zdarzenie rekombinacji i utraciły plazmid szkieletowy podczas podziału mitotycznego). Przesiewaj te kolonie na świeże płytki YPD. Kolonie te są kandydatami do integracji i zostaną dalej przeanalizowane w kroku 7.

7. Analizy molekularne w celu sprawdzenia poprawnej integracji allelu mutanta

  1. Wyizoluj DNA genomowe z próbek kandydujących, stosując standardowe procedury10.
  2. Pomnóż region genomowy obejmujący miejsce docelowe.
    1. Przygotuj następującą reakcję PCR dla każdej próbki: 0,5 μl DNA matrycowego, 5 μl 10 μM startera w kierunku do przodu, 5 μl 10 μM startera w kierunku wstecz, 0,5 μl (2,5 jednostki) polimerazy Taq DNA, 5 μl buforu 10x do polimerazy Taq DNA, 5 μl mieszaniny dNTP (po 2 mM), oraz 29 μl H2O.
      UWAGA: DNA matrycowe to DNA genomowe pozyskane z próbek kandydujących. Zaleca się dodatkowo wykonanie dwóch reakcji kontrolnych: jednej z użyciem DNA genomowego pochodzącego z oryginalnego szczepu histone geneΔ::URA3 jako matrycy oraz drugiej z użyciem DNA genomowego z histonowego szczepu typu dzikiego jako matrycy. Aby uwzględnić różnice w stężeniu DNA oraz poziomie zanieczyszczeń w różnych przygotowaniach genomowych, zaleca się zoptymalizowanie reakcji poprzez użycie nieskroconego DNA lub różnych rozcieńczeń przygotowań genomowych (np. 1:10 i 1:100). Ważne jest, aby te startery wiązały się z sekwencjami DNA poza regionem obejmowanym przez potencjalnie zintegrowany produkt PCR – w ten sposób rozmiar produktów PCR w tych reakcjach może służyć jako narzędzie diagnostyczne potwierdzające integrację produktów w odpowiednim miejscu genomowym (zobacz Przykładowe wyniki w celu zapoznania się z przykładem).
    2. Umieść reakcje w termocyklerze ustawionym na następujące parametry: 94 °C przez 3 min; 30 cykli następujących warunków: 94 °C przez 45 sek, 50 °C przez 45 sek, 72 °C przez 2 min; oraz 72 °C przez 10 min.
      UWAGA: Może być konieczna optymalizacja parametrów PCR dla konkretnych zestawów starterów i docelowego genu histonowego.
  3. Przetwarzanie produktów PCR
    1. Przeprowadź elektroforezę 20 μl z każdej reakcji w żelu agarozowym TBE o stężeniu 0,8%.
    2. Oceń rozmiar produktów PCR, wykorzystując standardy DNA jako odniesienie, aby określić, czy gen URA3 został pomyślnie zastąpiony przez potencjalnie zmieniony gen histonowy (zobacz Przykładowe wyniki w celu zapoznania się z przykładem).
      UWAGA: W niektórych przypadkach wprowadzone do genów histonowych pożądane mutacje mogą tworzyć lub niszczyć miejsce restrykcyjne. Jeśli tak jest, obecność pożądanej mutacji w produktach PCR o rozmiarze wskazującym na poprawną integrację można ocenić, poddając produkty trawieniu odpowiednim enzymem restrykcyjnym, a następnie analizie za pomocą elektroforezy w żelu (zobacz Przykładowe wyniki w celu zapoznania się z przykładem).
    3. Podaj produkty PCR o rozmiarze wskazującym na poprawną integrację do sekwencjonowania DNA, aby potwierdzić obecność pożądanych mutacji oraz upewnić się, że do genomu nie zostały wprowadzone żadne dodatkowe mutacje.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Opisujemy generowanie allelu hht2 wykazującego ekspresję zmutowanego białka histony H3, zawierającego substytucję w pozycji 53 z argininy na kwas glutaminowy (mutant H3-R53E), jako reprezentatywny przykład strategii celowanej mutagenezy in situ .

Wygenerowaliśmy szczep, w którym cała otwarta ramka odczytu (ORF) genu HHT2 została zastąpiona genem URA3 (patrz krok 1 protokołu). Szczep ten, yA...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Wysoki poziom homologii sekwencji między dwoma nieallelicznymi genami, które kodują każde z czterech podstawowych białek histonowych w haploidalnych komórkach S. cerevisiae, może stanowić wyzwanie dla badaczy, którzy chcą specyficznie ukierunkować jeden z dwóch genów na mutagenezę. Wcześniej opisane metodologie mutagenezy drożdży, w tym Delitto Perfetto, mutageneza genomowa specyficzna dla miejsca (SSG) i metody zastępowania alleli oparte na PCR bez klonowania 5,6,7

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Dziękujemy Reine Protacio za pomocne komentarze podczas przygotowywania tego manuskryptu. Wyrażamy wdzięczność Narodowej Fundacji Nauki (granty nr 1243680 i 1613754) oraz Hendrix College Odyssey Program za wsparcie finansowe.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1 kb Drabinka DNA (standardy DNA)New England BioLabsN3232L
Agaroza SigmaA5093-100G
Kwas borowySigmaB0394-500G
Mieszanka dNTP (10 mM każdy)ThermoFisher ScientificR0192
Roztwór EDTA (0,5 M, pH 8,0)AmericanBioAB00502-01000
Etanol (200 dowodów)Fisher Scientific16-100-824
Sól disodowa kwasu etylenodiaminotetraoctowego dwuwodna (EDTA))SigmaE4884-500G
Dwuwodny octan lituSigmaL6883-250G
MyCycler Thermal CyclerBioRad170-9703
Poli(glikol etylenowy) (PEG)SigmaP3640-1KG
PrimeSTAR HS DNA Polymerase (polimeraza DNA o wysokiej wierności)  i 5x buforFisher Scientific50-443-960
Roztwór DNA plemników łososiaThermoFisher Scientific15632-011
Sigma 7-9 (baza Tris, postać proszku)SigmaT1378-1KG
Trójwodny octan soduSigma236500-500G
Supra Sieve GPG Agaroza (agaroza o niskiej temperaturze mieszania)AmericanBioAB00985-00100
Polimeraza Taq i 10x BuforNew England BioLabsM0273X
WykałaczkiFisher ScientificS67859
Tris-HCl (1 M, pH 8,0)AmericanBioAB14043-01000
a-D(+)-GlukozaFisher ScientificAC170080025do pożywek drożdżowych
AgarFisher ScientificDF0140-01-0do pożywki drożdżowej
PeptoneFisher ScientificDF0118-07-2dla pożywki YPD
Ekstrakt drożdżowyFisher ScientificDF0127-17-9dla pożywki YPD
Kwas 4-aminobenzoesowySigmaA9878-100Gdla kompletnego minimalnego podłoża dropout 
AdenineSigmaA8626-100Gdla kompletnego zminimalizowanego podłoża dropout 
Chlorowodorek glicynySigmaG2879-100Gdla kompletnego zminimalizowanego odpadania podłoża 
L-AlanineSigmaA7627-100Gdla kompletnego minimalnego dropoutu średniego 
Monochlorowodorek L-argininySigmaA5131-100Gdla kompletnego zminimalizowanego odpadania podłoża 
L-Asparagina monohydratSigmaA8381-100Gdla kompletnego minimalnego dropoutu medium 
Monohydrat soli sodowej kwasu L-asparaginowegoSigmaA6683-100Gdla kompletnego minimalnego dropoutu 
Jednowodny chlorowodorek L-cysteinySigmaC7880-100Gdla kompletnego podłoża o minimalnym odpadaniu 
Chlorowodorek kwasu L-glutaminowegoSigmaG2128-100Gdla kompletnego podłoża o minimalnym odpadaniu 
L-GlutaminaSigmaG3126-100Gdla kompletnego minimalnego podłoża dropout 
Monochlorowodorek L-histydyny monohydratSigmaH8125-100Gdla kompletnego minimalnego podłoża dropout 
L-IsoleucineSigmaI2752-100Gdla kompletnego zminimalizowanego dropoutu medium 
L-LeucineSigmaL8000-100Gdla kompletnego minimalnego dropoutu medium 
Monochlorowodorek L-lizynySigmaL5626-100Gdla kompletnego minimalnego podłoża dropout 
L-MethionineSigmaM9625-100Gdla kompletnego zminimalizowanego podłoża dropout 
L-fenyloalaninaSigmaP2126-100Gdla kompletnego zminimalizowanego dropout medium 
L-ProlineSigmaP0380-100Gdla kompletnego minimalnego dropoutu medium 
L-SerineSigmaS4500-100Gdla kompletnego zminimalizowanego odstępu powietrza 
L-TreoninaSigmaT8625-100Gdla kompletnego zminimalizowanego dropoutu medium 
L-TryptofanSigmaT0254-100Gdla kompletnego minimalnego podłoża dropout 
L-TyrozynaSigmaT3754-100Gdla kompletnego minimalnego dropoutu medium 
L-ValineSigmaV0500-100Gdla kompletnego minimalnego dropoutu średniego 
myo-InositolSigmaI5125-100Gdla kompletnego minimalnego dropoutu medium 
UracilSigma U0750-100Gdla całkowicie minimalnego podłoża dropout 
Siarczan amonuFisher ScientificA702-500dla kompletnego podłoża o minimalnym spadku aktywności 
Drożdżowa baza azotowaFisher ScientificDF0919-07-3dla kompletnego zminimalizowanego odpadania podłoża 
Kwas 5-fluoroorotyczny (5-FOA)AmericanBioAB04067-00005dla  Pożywki 5-FOA

Bibliografia

  1. Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
  2. Campos, E. I., Reinberg, D. Histones: annotating chromatin. Annu Rev Genet. 43, 559-599 (2009).
  3. Rando, O. J., Winston, F. Chromatin and transcription in yeast. Genetics. 190 (2), 351-387 (2012).
  4. Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. Budding yeast for budding geneticists: a primer on the Saccharomyces cerevisiae model system. Genetics. 197 (1), 33-48 (2014).
  5. Storici, F., Resnick, M. A. Delitto perfetto targeted mutagenesis in yeast with oligonucleotides. Genet Eng (N Y). 25, 189-207 (2003).
  6. Gray, M., Kupiec, M., Honigberg, S. M. Site-specific genomic (SSG) and random domain-localized (RDL) mutagenesis in yeast. BMC Biotechnol. 4, 7(2004).
  7. Erdeniz, N., Mortensen, U. H., Rothstein, R. Cloning-free PCR-based allele replacement methods. Genome Res. 7 (12), 1174-1183 (1997).
  8. Brachmann, C. B., et al. Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications. Yeast. 14 (2), 115-132 (1998).
  9. Lundblad, V., Hartzog, G., Moqtaderi, Z. Manipulation of cloned yeast DNA. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 13, (2001).
  10. Hoffman, C. S. Preparation of yeast DNA. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 13, (2001).
  11. Treco, D. A., Lundblad, V. Preparation of yeast media. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 13, (2001).
  12. Lederberg, J., Lederberg, E. M. Replica plating and indirect selection of bacterial mutants. J Bacteriol. 63 (3), 399-406 (1952).
  13. Sikorski, R. S., Hieter, P. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 122 (1), 19-27 (1989).
  14. Johnson, P., et al. A systematic mutational analysis of a histone H3 residue in budding yeast provides insights into chromatin dynamics. G3 (Bethesda). 5 (5), 741-749 (2015).
  15. DiCarlo, J. E., et al. Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. Nucleic Acids Res. 41 (7), 4336-4343 (2013).
  16. Cross, S. L., Smith, M. M. Comparison of the structure and cell cycle expression of mRNAs encoded by two histone H3-H4 loci in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol. 8 (2), 945-954 (1988).
  17. Libuda, D. E., Winston, F. Amplification of histone genes by circular chromosome formation in Saccharomyces cerevisiae. Nature. 443 (7114), 1003-1007 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Celowana mutogenezaPCR z rekombinacją homologicznąendogenne miejsca genomicznenokaut URA3PCR fuzyjnyprzesiew z użyciem 5-FOAtrawienie EcoR1techniki genetyki drożdży
Ukierunkowana mutageneza in situ genów histonów u pączkujących drożdży
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.