Konfigurowalna komora do pomiaru migracji komórek

Summary

Ten protokół szczegółowo opisuje konfigurowalną metodę pomiaru migracji komórek w odpowiedzi na chemoatraktanty, które mogą być również użyte do określenia szybkości dyfuzji leku z matrycy polimerowej.

Abstract

Migracja komórek jest istotną częścią odpowiedzi immunologicznej, wzrostu i gojenia się ran. Migracja komórek to złożony proces, który obejmuje interakcje między komórkami, macierzą zewnątrzkomórkową oraz rozpuszczalnymi i nierozpuszczalnymi czynnikami chemicznymi (np. chemoatraktantami). Standardowe metody pomiaru migracji komórek, takie jak test z komorą Boydena, działają poprzez liczenie komórek po obu stronach dzielnika. Techniki te są łatwe w użyciu; Oferują jednak niewielką modyfikację geometryczną dla różnych zastosowań. W przeciwieństwie do tego, urządzenia mikroprzepływowe mogą być używane do obserwacji migracji komórek z konfigurowalnymi gradientami stężeń rozpuszczalnych czynników^1,2. Jednak metody wykonywania testów opartych na mikrofluidyce mogą być trudne do nauczenia.

Tutaj opisujemy prostą metodę tworzenia komór do hodowli komórkowych w celu pomiaru migracji komórek w odpowiedzi na gradienty stężeń chemicznych. Nasza metoda komory migracji komórek może tworzyć różne liniowe gradienty stężeń w celu badania migracji komórek do różnych zastosowań. Ta metoda jest stosunkowo łatwa w użyciu i jest zwykle wykonywana przez studentów studiów licencjackich.

Komora mikrokanałowa została utworzona poprzez umieszczenie akrylowej wkładki w kształcie końcowej komory mikrokanałowej w szalce Petriego. Następnie poli(dimetylosiloksan) (PDMS) wylano na wierzch wkładki. Pozostawiono PDMS do stwardnienia, a następnie usunięto wkładkę. Pozwoliło to na tworzenie studni w dowolnym pożądanym kształcie i rozmiarze. Komórki mogą być następnie dodawane do komory mikrokanałowej, a środki rozpuszczalne mogą być dodawane do jednej z studzienek poprzez namoczenie bloku agarozy w żądanym środku. Blok agarozy dodaje się do jednej z studzienek i można wykonać zdjęcia poklatkowe komory mikrokanałowej w celu ilościowego określenia migracji komórek. Warianty tej metody można tworzyć dla danej aplikacji, dzięki czemu metoda ta jest wysoce konfigurowalna.

Introduction

Aby mogły zaistnieć kluczowe procesy, takie jak gojenie się ran, reakcje immunologiczne i rozwój embrionalny, musi nastąpić migracja komórek. Migracja komórek obejmuje interakcję między komórkami a sąsiednimi komórkami, macierzą zewnątrzkomórkową i rozpuszczalnymi sygnałami chemicznymi (atraktantami lub repelentami). Na przykład w procesie gojenia się ran fibroblasty odgrywają integralną rolę w fibrogenezie i kurczeniu się ran, gdzie komórki są rekrutowane do miejsca urazu w celu syntezy kolagenu w celu utworzenia macierzy zewnątrzkomórkowej³. Zbadano liczne mechanizmy stojące za migracją fibroblastów do miejsca rany, w tym różne czynniki mechaniczne, fizyczne, elektryczne i chemotaktyczne⁴. Fibroblasty szczególnie dobrze reagują na różne gradienty stężeń czynników wzrostu. Te różne czynniki wzrostu współpracują ze sobą, aby zoptymalizować regenerację tkanek⁵. Obserwując odpowiedź chemotaktyczną fibroblastów na stężenia czynnika wzrostu, można badać wzorzec kierunkowej migracji fibroblastów i sposób, w jaki orientują się one wokół przeszkód fizycznych, aby dotrzeć do celu. Dlatego celem tego badania było po pierwsze opracowanie systemu, w którym wzrost fibroblastów mógłby być śledzony pod kierunkiem barier fizycznych, a po drugie modelowanie wzrostu fibroblastów podczas ich poruszania się w systemie.

Obecnie, test komorowy Boydena jest najczęściej używanym systemem do pomiaru migracji komórek⁶. Komora Boydena składa się z dwukomorowej płytki wielodołkowej, z której każda może zawierać pożywkę z chemoatraktantami lub bez⁷. Membrana filtracyjna zapewnia porowaty interfejs między dwiema komorami w każdej studni; Tworzy to barierę, przez którą komórki nie mogą przejść, chyba że odbywa się to przez aktywną migrację. Zazwyczaj w komorze Boydena do dolnej komory dodaje się chemoatraktant, a system może się zrównoważyć, tworząc gradient między górnym i dolnym dołkiem⁴. Jednym z problemów związanych z testem w komorze Boydena jest to, że strome gradienty tworzą się wzdłuż jednej osi prostopadłej do powierzchni membrany. Powoduje to, że różnica w stężeniu chemoatraktantu między górnym i dolnym dołkiem jest niższa niż pierwotnie oczekiwano. Ze względu na to ograniczenie, test w komorze Boydena utrudnia skorelowanie określonych odpowiedzi komórek z określonymi cechami gradientu, takimi jak nachylenie i różnica stężeń. Bez tych pomiarów trudno jest badać wielogradientową integrację sygnału.

Aby rozwiązać niektóre z ograniczeń tradycyjnego testu komorowego Boydena, opracowano testy mikroprzepływowe, które tworzą konfigurowalne gradienty stężeń¹. Standardowe metody tworzenia układów mikroprzepływowych wymagają pomieszczeń czystych dla technik litograficznych. Techniki te mogą być trudne do nauczenia, zwłaszcza w standardowych warunkach klasowych. W związku z tym zaprojektowaliśmy system komorowy do pomiaru migracji komórek, który można wykonać bez użycia pomieszczenia czystego. Korzystając z naszego systemu, studzienki testowe można dostosować do preferowanego rozmiaru i można uzyskać liniowy gradient stężenia o niestandardowym nachyleniu. Pozwala to na dokładny pomiar chemotaksji od ruchu losowego. Konstrukcja jest niedrogim i łatwym w użyciu systemem do modelowania wzrostu komórek w odpowiedzi na różne bodźce chemiczne.

Protocol

1. Tworzenie komory mikrokanałowej w celu stworzenia gradientu stężeń

1. Wycinanie akrylowego elementu formy
   1. Uzyskaj kawałek akrylu o pożądanej szerokości. Zwykle używaj arkuszy akrylowych o grubości 1/16 cala. Grubsze arkusze są trudne do dobrego cięcia, a bardzo cienkie arkusze nie mają wymaganej wytrzymałości mechanicznej, co powoduje ich pękanie lub wypaczanie się podczas procesu.
   2. Utwórz plik CAD o pożądanym kształcie elementu akrylowego, aby utworzyć wgłębienie w polidimetylosiloksanie (PDMS). Dostosuj szerokość i długość kanału, aby uzyskać żądany gradient odpowiedni dla poszczególnych protokołów eksperymentalnych.
      1. W tym przypadku użyj elementu akrylowego o następujących wymiarach: dwa kwadraty (0,254 cm x 0,254 cm) połączone kanałem o szerokości 0,127 cm (długości 0,254 cm) (rysunek 1).
   3. Zaimportuj plik CAD do urządzenia do cięcia laserowego i umieść element akrylowy w wycinarce laserowej zgodnie z protokołem producenta.
      UWAGA: Alternatywnie, wydrukuj element w 3D z projektu CAD. Zaletą tej metody jest to, że do formy można użyć alternatywnych materiałów; jednak rozdzielczość i powtarzalność można zmniejszyć w przypadku druku 3D w porównaniu z cięciem laserowym.

Rysunek 1: Komputerowe wspomaganie projektowania (CAD) odwzorowania komory mikrokanałowej. Ten obraz przedstawia rysunek CAD wkładki akrylowej potrzebnej do stworzenia komory mikrokanałowej. 1A) Widok z góry rysunku CAD, 1B) Widok z boku rysunku CAD z wymiarami w calach, 1C) Widok z góry rysunku CAD z wymiarami w calach Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Nalewanie polidimetylosiloksanu (PDMS)
   1. W łodzi wagowej zmieszać 10 części wagowych komercyjnej bazy elastomerowej (np. Sylgard 184) z 1 częścią wagową komercyjnego utwardzacza elastomerowego (np. Sylgard 194). Zazwyczaj miesza się 10 g bazy elastomerowej z 1 g utwardzacza elastomerowego.
   2. Mieszać w celu połączenia bazy i utwardzacza za pomocą mikropipety przez 5 minut.
   3. Ustaw dzwon próżniowy i umieść łódź ważącą z PDMS w próżni na 30 minut, aby usunąć uwięzione pęcherzyki powietrza.
   4. Wyłącz odkurzacz i wyjmij łódkę ważącą. Wylej PDMS na wierzch akrylowej wycinanki na małej szalce Petriego. Upewnij się, że PDMS całkowicie zakrywa wkładkę.
   5. Pozostawić PDMS do utwardzenia przez noc (co najmniej 18 godzin) w temperaturze pokojowej.
3. Wyjmowanie wkładki z PDMS
   1. Po utwardzeniu PDMS wyjmij wkład, ostrożnie przecinając PDMS wokół elementu akrylowego za pomocą skalpela.

2. Powlekanie komórek w komorze mikrokanałowej

1. Sterylizacja komory do galwanizacji komórek.
   UWAGA: Podczas gdy PDMS można sterylizować przy użyciu tlenku etylenu lub innych technik, szybka obróbka UV jest szybka, niedroga i wystarczająca do badań nad kulturami komórkowymi. Krótki czas trwania obróbki UV nie naruszył struktury ani integralności mechanicznej elementu PDMS.
   1. W standardowej komorze do hodowli komórkowych całkowicie przykryj komorę 70% etanolem.
   2. Umieść szalkę Petriego w okapie z przepływem laminarnym ze zdjętymi pokrywkami.
   3. Zamknij maskę i włącz światło UV. Wystawić na działanie światła UV przez 1-2 godziny.
   4. Otwórz okap z przepływem laminarnym i odczekaj 15 minut, aby przywrócić przepływ.
   5. Usuń 70% etanolu.
   6. Umyć komory dwukrotnie sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Użyj 1 ml PBS do każdego prania. Wyjmij PBS i pozostaw komory do wyschnięcia na noc ze zdjętymi pokrywkami.
      UWAGA: Alternatywnie, zamiast używać okapu z przepływem laminarnym, użyj komory UV do sterylizacji, jeśli jest dostępna. Zrób pudełko UV, umieszczając źródło światła UV z tyłu kartonu wyłożonego folią aluminiową. Folia aluminiowa odbija światło, aby umożliwić równomierne oświetlenie próbki.
2. Komórki galwaniczne w komorze
   1. Policz komórki za pomocą błękitu trypanowego i hemocytometru.
      1. Dodać 100 μl zawiesiny komórkowej do 400 μl 0,4% błękitu trypanowego i delikatnie wymieszać. Nanieść 100 μl tego roztworu na hemocytometr, delikatnie wypełniając obie komory pod szklanym szkiełkiem nakrywkowym.
      2. Użyj mikroskopu z obiektywem 10X, aby ustawić ostrość na siatce na hemocytometrze. Użyj ręcznego licznika liczenia, aby policzyć żywe, niebarwione komórki w jednym zestawie 16 kwadratów na hemocytometrze.
      3. Policz komórki we wszystkich 4 zestawach po 16 kwadratów. Weź średnią liczbę komórek z 4 zestawów 16 kwadratów i pomnóż przez 5x10⁴. Ta końcowa liczba to liczba komórek/ml w zawiesinie komórek.
   2. Dodaj 2,500 komórek do jednego dołka w każdej komorze. Przekłada się to na gęstość komórek prawie zlewającą się wynoszącą ~30 000/cm².
   3. Pozostaw komórki w komorze na 60 minut przed dodaniem pożywki (zmodyfikowane podłoże Eagle's Medium firmy Dulbecco, 10% płodowa surowica bydlęca, 1% penicylina-streptomycyna).

3. Bloki agarozy nasączone dekstranem

1. Tworzenie bloku agarozy
   1. Wlej 3% agarozy do wydrukowanej w 3D formy (2 mm x 2 mm x 2 mm).
   2. Pozostaw agarozę do zestalenia się w komorze próżniowej na 30 minut, aby usunąć wszelkie pęcherzyki.
   3. Wyjmij blok agarozy z formy.
      UWAGA: Alternatywnie wlej 3% agarozy do małej szalki Petriego o grubości 2 mm. Wytnij blok o wymiarach 2 mm x 2 mm x 2 mm za pomocą skalpela lub innego narzędzia tnącego. Nie jest to tak precyzyjne jak system form, ale może być nieco łatwiejsze do wykonania.
2. Całkowicie zanurz blok agarozy w roztworze o pożądanym stężeniu czynnika chemotaktycznego. Aby ocenić tworzenie się gradientu stężeń, należy najpierw przepłukać komorę fluorescencyjnym dekstranem. Stężenie i masa cząsteczkowa dekstranu powinny odpowiadać stężeniu i masie cząsteczkowej czynnika rozpuszczalnego lub leku będącego przedmiotem zainteresowania.
3. Namocz blok agarozy przez noc.

4. Upływ czasu dyfuzji dekstranu w celu oceny gradientu stężenia czynnika rozpuszczalnego

1. Umieść blok agarozy nasączony dekstranem w małym kwadratowym dołku komory mikrokanałowej.
2. Umieść komorę mikrokanałową w systemie obrazowania komórek lub użyj innego mikroskopu fluorescencyjnego z funkcją poklatkową. Rozpocznij film poklatkowy zgodnie z instrukcjami producenta.
   UWAGA: Pokazane wyniki są wykonane z filtrem GFP, 50% światłem, pH 4/10 i 4-krotnym powiększeniem.

5. Upływ czasu wzrostu komórek

1. Płytki w komorze mikrokanalików na jednym końcu komory. Tutaj użyj fibroblastów 3T3. Dodaj 2,500 komórek do jednej studzienki w komorze mikrokanałowej. Policz komórki zgodnie z opisem w ppkt 2.2.1.
   1. Pozostaw komórki w komorze na 60 minut przed dodaniem pożywki (zmodyfikowane podłoże Eagle's Medium firmy Dulbecco, 10% płodowa surowica bydlęca, 1% penicylina-streptomycyna). Utrzymuj komorę mikrokanalików z platerowanymi ogniwami w temperaturze 37 °C przy 5% CO₂ . Migrację komórek przez kanał można oglądać pod mikroskopem.
   2. Dodaj marker lub użyj mikroskopijnego defektu w komorze jako markera, aby służył jako punkt wyjścia do ilościowego określenia odległości, na jaką przesuwa się przód komórki.
2. Ustal gradient, umieszczając żel agarozowy (blok 8 mm³) zawierający skoncentrowany czynnik wzrostu, chemoatraktant, lek lub inny badany czynnik (tutaj jako przykład stosuje się 40% FBS) na jednym końcu komory mikrokanałowej.
3. Zrób zdjęcia poklatkowe poruszającego się frontu komórki. W tym przypadku wyniki pokazują obrazy frontu komórki, które były wykonywane co 12 godzin za pomocą systemu obrazowania.
4. Użyj zdjęć przodu komórki, aby określić ilościowo tempo wzrostu komórek. Oblicz szybkość wzrostu, najpierw używając funkcji MATLAB polyfit (roipoly), aby utworzyć maskę wielokątną zdefiniowaną przez przód komórki, ściany kanału i znacznik odniesienia. Wymiary tej maski dają odległość migracji frontu, na podstawie której obliczana jest średnia prędkość czoła komórki. Inne badania wykorzystywały podobną metodę⁸.
   UWAGA: Porównaj krawędź frontu wzrostu komórek na każdej klatce ze stężeniem rozpuszczalnego czynnika w tej samej odległości. Gradient stężenia czynnika rozpuszczalnego oblicza się przy użyciu przybliżenia modelu dyfuzji 1D.
5. Wykonaj fluorescencyjne obrazy komórek za pomocą barwienia falloidyną i DAPI.
   1. Napraw komórki przed barwieniem falloidyną.
      1. Ciepły 4% paraformaldehyd w temperaturze 37 °C.
      2. Dodaj tyle 4% paraformaldehydu, aby pokryć komórki. Utrzymuj komórki w paraformaldehydzie przez 10 minut.
      3. Płukać dwukrotnie PBS przez 15 minut za każdym razem. Użyj wystarczającej ilości PBS, aby pokryć komórki.
   2. Usuń PBS z komórek i dodaj wystarczającą ilość roztworu przepuszczalnego (0,1% Triton X-100 w PBS), aby pokryć komórki. Pozostaw roztwór na 10 minut.
   3. Umyć dwukrotnie PBS przez 5 minut za każdym razem. Użyj wystarczającej ilości PBS, aby pokryć komórki.
   4. Usunąć PBS z komórek i dodać roztwór blokujący (1% albuminy surowicy bydlęcej w PBS) na 20 minut.
   5. Usunąć roztwór blokujący i przemyć 2 razy PBS przez 5 minut za każdym razem. Użyj wystarczającej ilości PBS, aby pokryć komórki.
   6. Od tego momentu chroń ogniwa przed światłem folią aluminiową, gdy nie są używane. Usunąć PBS z komórek i dodać falloidynę 488 rozcieńczoną w stosunku 1:50 w PBS przez 1 godzinę.
   7. Prać 2 razy w PBS przez 5 minut na każde pranie. Użyj wystarczającej ilości PBS, aby pokryć komórki. Następnie usuń PBS z komórek.
   8. Dodaj DAPI (4',6-diamidino-2-fenyloindole) rozcieńczony w stosunku 1:1,000 w PBS do komórek przez 15 minut.
   9. Usuń DAPI i umyj komórki dwukrotnie PBS przez 5 minut na każde pranie.
   10. Usuń ostatnie pranie i dodaj tyle PBS, aby pokryć komórki. Komórki można teraz obrazować za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

Results

Rysunek 2 pokazuje ruch przodu komórki w poprzek kanału w odpowiedzi na gradient płodowej surowicy bydlęcej umieszczonej na przeciwległym końcu kanału od miejsca, w którym komórki są platerowane. Przód ogniwa pokazano po 48 godzinach (rysunek 2A), 72 godzinach (rysunek 2B), 96 godzinach (rysunek 2C) i 120 godzinach (rysunek 2D) po poszyciu. Ruch frontu komórki był śledzony za pomocą tych zdjęć poklatkowyc...

Discussion

Nasza komora mikrokanałowa może być wykorzystywana do wielu celów, w tym do określania szybkości migracji komórek w odpowiedzi na czynniki wzrostu i chemoatraktanty oraz pomiaru szybkości dyfuzji leku z matrycy polimerowej. Możliwe jest wykorzystanie naszej komory mikrokanałowej do hodowli komórek i umieszczenia chemoatraktantu na jednym końcu komory. Komórki rosną w odpowiedzi na chemoatraktant, a migrację komórek można określić ilościowo, wykonując zdjęcia poklatkowe, które można analizować w celu określenia szybkości ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sylgard 184 Zestaw elastomerów silikonowych	Sigma-Aldrich	761036	2-częściowy zestaw z poli(dimetylosiloksanem) zawierający bazę z elastomeru silikonowego i utwardzacz z elastomeru silikonowego
Arkusze akrylowe	US Plastic	44200
Jednorazowe szalki Petriego	Sokół	25373-041
Izotiocyjanian fluoresceiny– dekstran	Sigma-Aldrich	FD20s-100MG
Agaroza, typ I, niska EEO	Sigma-Aldrich	A6013-100G
Zmodyfikowany Eagle's Medium firmy Dulbecco	Fisher Scientific	11965092	Składniki pożywki komórkowej
Surowica bydlęca	płodu Fisher Scientific	16000036	Składniki pożywki komórkowej
Penicylina-streptomycyna	Fisher Scientific	15140148	Składniki pożywki komórkowej
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)	Fisher Scientific	BP24384
EVOS XL System obrazowania komórek	Thermo Fisher Scientific	AME3300	Przyrząd służący do wykonywania zdjęć poklatkowych
Versa Laser	Universal Laser Systems, Inc.	Numer modelu VLS2.30	Wycinarka laserowa służąca do cięcia tworzyw sztucznych