Artykuł metodologiczny

In vitro Różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w komórki trofoblastyczne

DOI:

10.3791/55268

⸱

16 marca 2017

 , 
1Department of Biomedical Sciences, School of Veterinary Medicine, University of Pennsylvania

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół efektywnego generowania ludzkich komórek trofoblastycznych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu białka morfogennego kości 4 i inhibitorów szlaków aktywinowych/węzłowych. Metoda ta jest odpowiednia do skutecznego różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych i może generować duże ilości komórek do manipulacji genetycznej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Łożysko jest pierwszym organem, który rozwija się podczas embriogenezy i jest niezbędne do przetrwania rozwijającego się zarodka. Łożysko składa się z różnych komórek trofoblastycznych, które różnicują się od pozazarodkowych komórek trofektodermy blastocysty preimplantacyjnej. W związku z tym nasza wiedza na temat wczesnych zdarzeń różnicowania ludzkiego łożyska jest ograniczona z powodu etycznych i prawnych ograniczeń dotyczących izolacji i manipulacji ludzką embriogenezą. Ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste (hPSC) są solidnym systemem modelowym do badania rozwoju człowieka i mogą być również różnicowane in vitro w komórki trofoblastyczne, które wyrażają markery różnych typów komórek trofoblastu. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół różnicowania hPSC w komórki trofoblastyczne z wykorzystaniem białka morfogennego kości 4 i inhibitorów szlaków sygnałowych Activina/Nodal. Protokół ten generuje różne typy komórek trofoblastu, które mogą być transfekowane siRNA w celu zbadania fenotypów utraty funkcji lub mogą być zakażone patogenami. Ponadto hPSC mogą być modyfikowane genetycznie, a następnie różnicowane w progenitory trofoblastu w celu przeprowadzenia analiz wzmocnienia funkcji. Ta metoda różnicowania in vitro do generowania ludzkich trofoblastów, począwszy od hPSC, pokonuje etyczne i prawne ograniczenia pracy z wczesnymi ludzkimi embrionami, a system ten może być wykorzystywany do różnych zastosowań, w tym do odkrywania leków i badań nad komórkami macierzystymi.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Łożysko jest niezbędne do wzrostu i przetrwania płodu podczas ciąży i ułatwia wymianę gazów, składników odżywczych, produktów przemiany materii i hormonów między krążeniem matki i płodu. Pierwszym narządem powstającym podczas embriogenezy ssaków jest łożysko, które zaczyna się rozwijać 6-7 dni po zapłodnieniu u ludzi i 3,5-4,5 dnia u myszy1,2,3,4. Komórki trofoblastyczne są najważniejszymi komórkami łożyska, a komórki te reprezentują jedno z najwcześniejszych zdarzeń różnicowania linii zarodka ssaków. Powstają one z zewnętrznych pozazarodkowych komórek trofektodermy blastocysty preimplantacyjnej. Nasza wiedza na temat wczesnych etapów rozwoju łożyska jest ograniczona przez etyczne i logistyczne ograniczenia w modelowaniu wczesnego rozwoju człowieka.

Podczas implantacji embrionalnej, trofoblasty atakują nabłonek matki i różnicują się w wyspecjalizowane komórki progenitorowe5. Cytotrofoblasty (CTB) to jednojądrzaste, niezróżnicowane komórki progenitorowe, które łączą się i różnicują w syncytiotrofoblasty (SYN) i zewnątrzkosmkowe inwazyjne trofoblasty (EVT), które zakotwiczają łożysko w macicy. SYN to wielojądrowe, kończnie zróżnicowane komórki, które syntetyzują hormony niezbędne do utrzymania ciąży. Wczesne zdarzenia różnicowania, które generują EVT i SYN, są niezbędne do tworzenia łożyska, ponieważ upośledzenie komórek trofoblastycznych powoduje poronienie, stan przedrzucawkowy i wewnątrzmaciczne ograniczenie wzrostu1. Typy ludzkich linii komórkowych trofoblastu, które zostały opracowane, obejmują unieśmiertelnione CTB i raki kosmówki, które wytwarzają hormony łożyskowe i wykazują właściwości inwazyjne6. Pierwotne komórki trofoblastyczne z ludzkich łożysk w pierwszym trymestrze ciąży można wyizolować, ale komórki szybko różnicują się i przestają się namnażać in vitro. Co ważne, transformowane i pierwotne linie komórkowe mają różne profile ekspresji genów, co wskazuje, że rakotwórcze i unieśmiertelnione linie komórkowe trofoblastów mogą nie reprezentować dokładnie pierwotnych trofoblastów7. Ponadto jest mało prawdopodobne, aby linie te przypominały przodków komórek macierzystych trofoblastu łożyskowego, ponieważ pochodzą z późniejszych etapów od pierwszego do trzeciego trymestru.

Istnieje potrzeba solidnego systemu hodowli in vitro ludzkich trofoblastów we wczesnym stadium w celu zbadania wczesnych etapów powstawania i funkcjonowania łożyska. Ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESC), które mają wspólne właściwości z wewnętrzną masą komórkową zarodka preimplantacyjnego, są często wykorzystywane do modelowania wczesnego rozwoju człowieka, w tym tworzenia wczesnego łożyska. Zarówno ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC), jak i hESC mogą być różnicowane w trofoblasty in vitro przy użyciu Bone Morphogenic Protein 4 (BMP4)8,9,10,11,12,13,14,15. Ta konwersja komórek pluripotencjalnych do komórek trofoblastycznych przy użyciu BMP4 jest specyficzna dla komórek ludzkich i jest szeroko stosowana do badania rozwoju wczesnego ludzkiego łożyska, ponieważ nie wymaga dostępu do wczesnych ludzkich embrionów9,16. Niedawno odkryto, że dodanie inhibitorów A83-01 (A) i PD173074 (P), które blokują szlaki sygnałowe SMAD2/3 i MEK1/2, zwiększa efektywność różnicowania hPSC do progenitorów podobnych do trofektodermy, głównie SYN i EVT, bez ekstensywnego generowania komórek mezodermy, endodermy lub ektodermy9,17. Korzystając z tych warunków pożywki, hESC różnicowane przez 12 dni mają podobne profile ekspresji genów jak komórki trofektodermy wyizolowane z ludzkich zarodków w stadium blastocysty i wydzielają różne hormony wzrostu specyficzne dla łożyska, co potwierdza trafność tego systemu modelowego in vitro9,11. W tym miejscu przedstawiono szczegółowy protokół różnicowania in vitro hPSC do ludzkich progenitorów trofoblastu przy użyciu pożywki hodowlanej BMP4/A/P. Warunki te wytwarzają obfitą liczbę komórek do szerokiej gamy zastosowań, w tym sekwencjonowania RNA, rozrywania genów za pomocą siRNA, infekcji patogenami i modyfikacji genetycznej za pomocą transfekcji za pośrednictwem lipofekcji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: W celu różnicowania hESC lub hiPSC w progenitory trofoblastu, hPSC hodowane na mysich fibroblastach embrionalnych (MEF) są przenoszone do warunków wolnych od karmienia przez dwa pasaże przed rozpoczęciem różnicowania za pomocą BMP4/A/P. Proces ten eliminuje zanieczyszczenie MEF zróżnicowanych komórek. W tym miejscu przedstawiamy protokół różnicowania hESC i ten sam protokół można zastosować do hiPSC.

1. Hodowla i odzyskiwanie hESC na napromieniowanych mysich fibroblastach embrionalnych (MEF) (Przygotowania)

  1. Napromieniowanie promieniowaniem gamma MEF
    1. Przygotuj 500 ml pożywki do hodowli MEF: DMEM z 10% FBS, 2 mM L-glutaminy, 1x penicylina / streptomycyna (Pen / Strep) i 0,1 mM aminokwasów endogennych (NEAA).
    2. Rozmrozić jedną fiolkę z pierwotnymi MEF-ami i użyć pożywki MEF do hodowli komórek. Rozwiń podstawowe MEF do 30 płytek za pomocą pożywki hodowlanej MEF.
      UWAGA: Stężenia tlenu nie są krytyczne na tym etapie, więc można wykorzystać warunki fizjologiczne (4%) lub warunki otoczenia (20%) w inkubatorze.
    3. Zbierz MEFS. Użyj 0,25% trypsyny, aby usunąć MEF z płytek i przenieś komórki do stożkowej probówki. Umieść MEF w instrumencie do napromieniania i wystaw komórki na działanie 3,500 grays.
      UWAGA: Czas będzie zależał od aktywności źródła wewnątrz promiennika.
    4. Ponownie zawiesić napromieniowane MEF-y pożywką hodowlaną MEF i policzyć liczbę komórek za pomocą hemocytometru.
    5. Osadzać MEF-y za pomocą wirówki i dodawać 50% pożywki hodowlanej MEF i 50% pożywki do zamrażania komórek (80% pożywki FBS i 20% pożywki hodowlanej MEF). Podwielokrotność 1 x 106 komórek w fiolce.
    6. Napromieniowane fiolki MEF należy umieścić na noc w zamrażarce w temperaturze -80 °C, a następnie przenieść je do ciekłego azotu w celu długotrwałego przechowywania.
  2. Rozmrażanie zamrożonych MEF-ów i ludzkich komórek macierzystych do hodowli
    1. Przygotuj 500 ml pożywki hESC: DMEM / F-12 z 20% zamiennikiem surowicy, 0,1 mM NEAA, 2 mM L-glutaminy, 10 ng / ml bFGF, 0,1 mM ß-merkaptoetanolu i 1x Pen / Strep.
    2. Rozmrozić jedną fiolkę MEF na dzień przed rozmrożeniem hESC. Pokryj 6-dołkową płytkę 0,1% żelatyną, używając 1 ml na każdą studzienkę. Inkubować przez co najmniej 20 minut w temperaturze pokojowej, a następnie usunąć żelatynę.
    3. Wyjąć fiolkę z MEF z magazynu w ciekłym azocie i zanurzyć fiolkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Obserwuj fiolkę z przerwami, aż pozostaną tylko małe kryształki lodu. Szybko przenieść zawartość fiolki do 9 ml pożywki MEF w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.
    4. Osadzać komórki przez odwirowywanie przy 200 x g przez 5 minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w pożywce MEF. Równomiernie rozdzielić MEF-y na płytkę 6-dołkową. Umieścić płytkę w inkubatorze o niskiej temperaturze 37 °C i niskiej temperaturze tlenu (4%) na noc.
  3. Rutynowa hodowla komórek macierzystych w obrębie komórek macierzystych na MEF
    1. Wyjąć fiolkę z hESC z ciekłego azotu i szybko rozmrozić fiolkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Delikatnie odpipetować hESC do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 9 ml pożywki z hESC i odwirowywać w dół przy 200 x g przez 5 minut. Usunąć pożywkę i ponownie zawiesić komórki 1 ml pożywki z hESC.
    2. Odessać pożywkę MEF z płytki przygotowanej w kroku 1.2.4 i dodać 1 ml pożywki hESC. Dodać inhibitor skał Y-27632 (10 μM) do pożywki hESC. Przenieś hESC do MEF.
    3. Umieść komórki w inkubatorze o niskiej temperaturze 37 °C i niskiej zawartości tlenu (4%) na noc. Pożywkę z implantem hESC należy wymieniać codziennie. Zeskrob zróżnicowane komórki za pomocą pipety Pasteura, uwidocznionej pod pionowym mikroskopem z 4-krotną prędkością.
    4. Pasaż komórek macierzystych ESC należy przeprowadzać co 4-6 dni, w zależności od konfluencji komórek i wielkości kolonii komórek macierzystych. Przygotuj talerz MEF-ów na dzień przed pasażem. Gdy komórki są gotowe do przejścia, należy usunąć pożywkę z hESC i przemyć studzienkę 1 ml PBS.
    5. Dodać 1 mg/ml kolagenazy (wstępnie podgrzanej do 37 °C), inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut i usunąć kolagenazę. Umyj komórki PBS, dodaj 1 ml pożywki hESC do dołka i ręcznie zeskrob komórki w małe grudki za pomocą końcówki pipety o pojemności 5 ml. Przenieść zawieszone grudki komórek do nowej studzienki (studzienek) pokrytej MEF.

2. Przejście hESC z MEF do warunków bezobciążeniowych na płytkach pokrytych macierzą zewnątrzkomórkową

  1. Przygotuj pożywkę kondycjonowaną MEF (CM)
    1. Napromieniowane MEF-y należy umieścić na płytce w kolbie T75 przy 90-100% zbieżności; ważne jest, aby MEF-y były gęsto pokryte. Obserwować komórki za pomocą mikroskopu, aby określić, czy przyczepiły się do dna kolby (MEF-y przyczepiają się około 6 godzin po posiewie lub następnego dnia).
      UWAGA: Nieprzyłączone komórki unoszą się w pożywce podczas obserwacji pod mikroskopem. Następnego dnia należy usunąć pożywkę MEF i dodać 25 ml pożywki hESC pozbawionej B-FGF.
    2. Zebrać kondycjonowaną pożywkę po 24 godzinach inkubacji. Wymieniać na świeżą pożywkę codziennie przez maksymalnie 12 dni.
    3. Przefiltruj pobrany CM za pomocą filtra 0,22 μM. Przed użyciem dodaj świeży B-FGF do CM.
      UWAGA: CM można zamrażać w temperaturze -80 °C i przechowywać do 1 roku. Alternatywnie, CM można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 2 tygodnie.
  2. Przenieś hESC z hodowli na MEF do bezkomórkowych płytek pokrytych macierzą zewnątrzkomórkową.
    1. Przygotowanie macierzy zewnątrzkomórkowej do powlekania płytek do kultur tkankowych
      1. Rozmrozić porcję macierzy zewnątrzkomórkowej na lodzie (około 3-4 godzin). Używając lodowatych końcówek, jednej zimnej, stożkowej probówki o pojemności 50 ml i pożywki DMEM/F12, przenieś 2 mg macierzy zewnątrzkomórkowej do 24 ml lodowatego DMEM/F-12 (rozcieńczenie zależy od stężenia w macierzy zewnątrzkomórkowej od dostawcy).
      2. Natychmiast przenieść stożkową probówkę o pojemności 50 ml do lodu i przechowywać w temperaturze 4 °C. W celu pokrycia płytek do hodowli tkankowych należy dodać odpowiednią ilość rozcieńczonej macierzy zewnątrzkomórkowej do dołka (np. 1 ml na studzienkę w płytce 6-dołkowej). Obracać, aby pokryć płytkę i inkubować w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 godzinę.
    2. Pasaż hESC z MEF (jak w kroku 1.3) przy użyciu CM zawierającego B-FGF (10 ng/ml).
      1. Odessać, aby usunąć macierz zewnątrzkomórkową z nowej płytki i dodać CM zawierający B-FGF. Przenieść zeskrobane grudki komórkowe z płytki MEF za pomocą pipety i podzielić je na płytkę pokrytą macierzą zewnątrzkomórkową. Inkubować przez noc w inkubatorze o niskiej temperaturze 37 °C.
      2. Codziennie zastępować CM pożywką B-FGF; ilość pożywki będzie zależeć od wielkości kolby hodowlanej. Użyj 2 ml pożywki na jeden 6-dołkowy dołek. Zeskrob zróżnicowane komórki pipetą Pasteura.
      3. Pasaż hESC co 6-7 dni, kiedy kolonie są jasne podczas oglądania pod mikroskopem.
        UWAGA: Kolonie hESC wyhodowane na płytkach pokrytych macierzą zewnątrzkomórkową rosną większe niż komórki hodowane w MEF.
      4. Gdy komórki wolne od podawania są gotowe do przejścia, usunąć pożywkę, przemyć przez dodanie 1 ml PBS za pomocą pipety, odessać w celu usunięcia PBS, dodać 0,5 mg/ml dypazy (wstępnie podgrzanej do 37 °C) za pomocą pipety i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut.
      5. Przemyć komórki PBS, dodając 2 ml PBS na studzienkę, a następnie odsysając. Dodać 1 ml CM do dołka i ręcznie zeskrobać komórki w małe grudki za pomocą końcówki pipety o pojemności 5 ml.
      6. Umieść zawieszoną komórkę w nowych płytkach pokrytych macierzą zewnątrzkomórkową; komórki powinny przylegać po 24 godzinach.

3. Różnicowanie komórek macierzystych za pomocą BMP4/A/P

  1. Przygotować pożywkę różnicującą. Użyj CM (brak B-FGF) i dodaj (świeży) BMP4 (50 ng/ml), A83-01 (1 μM) i PD173074 (0,1 μM). Dodaj te inhibitory do CM przed użyciem.
  2. Użyj niezależnych od karmów hESC rosnących na płytkach pokrytych macierzą zewnątrzkomórkową przez 1 pasaż, hodowanych w inkubatorze nastawionym na 4% tlenu. Po pierwszym przejściu na płytki pokryte macierzą zewnątrzkomórkową, pozwól komórkom przyczepić się na 24 godziny. Następnego dnia zainicjuj różnicowanie. Usunąć CM (zawierający B-FGF) i zastąpić go CM zawierającym BMP4/A/P (2 ml na studzienkę w płytce 6-dołkowej). Kontynuuj hodowlę komórek przy użyciu 4% poziomu tlenu.
  3. Wymieniać CM zawierający BMP4/A/P (2 ml/basenik dla płytki 6-dołkowej) co 2 dni. Zassać, aby usunąć stare podłoże i dodać nowy CM za pomocą pipety. Na drugi dzień po dodaniu BMP4 i usunięciu B-FGF (uważany za dzień różnicowania 2), morfologia komórek zmieni się, wydając się większa, gdy będzie obserwowana pod mikroskopem.
    UWAGA: Niezróżnicowane komórki, które mają jasne, zaokrąglone krawędzie, nie będą obecne.
  4. Zbierz komórki w żądanych punktach czasowych. Zróżnicowane komórki przestaną się dzielić po około 2 tygodniach. Komórki transfekcyjne w tym okresie (patrz następna sekcja).

4. Transfekcja komórek trofoblastycznych za pomocą siRNA lub plazmidowego DNA

  1. Przygotuj komórki trofoblastyczne do transfekcji
    1. Hodowla hESC dla dwóch pasaży na macierzy zewnątrzkomórkowej po przeniesieniu ich z MEF (patrz krok 2.2). Należy użyć pożywki hESC zawierającej B-FGF.
    2. Podziel hESC na nową płytkę macierzy zewnątrzkomórkowej na dzień przed różnicowaniem. Ważna jest wysoka konfluencja komórkowa, więc podziel komórki 1:1 na nową płytkę/studzienkę, która zapewni co najmniej 50% konfluencję następnego dnia. Inkubować komórki przez noc w inkubatorze o niskiej zawartości tlenu.
      UWAGA: na tym etapie nie trzeba zliczać komórek macierzystych.
    3. Następnego dnia zastąp pożywkę pożywką różnicującą (CM zawierającą BMP4/A/P i pozbawioną B-FGF, używając 2 ml/dołek na płytkę 6-dołkową). Usunąć starą pożywkę przez aspirację i przenieść nową pożywkę (2 ml) za pomocą pipety. Umieść komórki w inkubatorze o niskiej zawartości tlenu (4% tlenu) na noc.
  2. Transfekcje z użyciem siRNA do rozerwania genów lub z użyciem plazmidowego DNA
    1. Różnicuj komórki do pożądanego punktu czasowego (między 1 a 14 dniem). Dzień przed transfekcją trypsynuj komórki za pomocą 0,05% trypsyny przez 5 minut. Płytkować je do pożądanego zbiegu (w zależności od protokołu odczynnika do transfekcji) na płytce pokrytej żelatyną (dodać 0,1% żelatyny do płytki do hodowli tkankowej na 20 minut i aspirować do usunięcia). Dodać CM zawierający BMP4/A/P (bez B-FGF) i inkubować przez noc.
    2. Następnego dnia dodaj do komórek świeżą pożywkę różnicującą. Transfekcja siRNA za pomocą odczynnika do transfekcji siRNA. W przypadku plazmidowego DNA należy użyć odpowiedniego odczynnika lipofektaminowego.
    3. Postępuj zgodnie z protokołem produktu opisanym dla każdego odczynnika do transfekcji. Przenieś kompleksy siRNA-lipofektamina do każdego dołka/płytki komórek, delikatnie wymieszaj i hoduj komórki przez noc w inkubatorze o niskiej zawartości tlenu.
      UWAGA: Niektóre odczynniki do transfekcji są hamowane przez antybiotyki, które wymagają CM bez Pen/Strep.
    4. Następnego dnia zastąp je świeżymi pożywkami różnicującymi.
    5. Zbierz komórki w żądanych punktach czasowych (np. 24 godziny, 48 godzin i 72 godzinach), aby sprawdzić skuteczność rozerwania genów za pomocą ilościowego RT-PCR. Do pobierania komórek należy użyć 0,05% trypsyny, dodając 1 ml na studzienkę i inkubując przez 5 minut w temperaturze 37 °C. Dodać 5 ml pożywki MEF na studzienkę, aby zneutralizować trypsynę. Wiruj komórki w temperaturze 200 x g przez 5 minut i użyj osadu komórkowego do izolacji RNA.

5. Zakażenie patogenem komórek trofoblastycznych: Zakażenie wirusem Sendai

  1. Przygotowanie komórek macierzystych wątroby (hESC) do różnicowania
    1. Hodowla hESC dla dwóch pasaży w macierzy zewnątrzkomórkowej po przeniesieniu z MEF (patrz krok 2.2). Należy użyć pożywki hESC zawierającej B-FGF.
    2. Podziel hESC na nową płytkę macierzy zewnątrzkomórkowej na dzień przed różnicowaniem. Ważna jest wysoka konfluencja komórkowa, więc podziel komórki 1:1 na nową płytkę/studzienkę, która zapewni co najmniej 50% konfluencję następnego dnia. Inkubuj komórki przez noc w inkubatorze o niskiej zawartości tlenu (4% tlenu).
      UWAGA: na tym etapie nie trzeba zliczać komórek macierzystych.
    3. Następnego dnia zastąp pożywkę pożywką różnicującą (CM zawierającą BMP4/A/P i pozbawioną B-FGF) i hoduj przez noc w inkubatorze o niskiej zawartości tlenu (4% tlenu).
  2. Zakażenie wirusowe komórek trofoblastycznych Sendai
    1. Na dzień przed pożądanym dniem różnicowania trypsynuj komórki różnicujące (do pojedynczych komórek) za pomocą 0,05% trypsyny przez 5 minut i przenieś je na płytkę pokrytą żelatyną. Dodać pożywkę różnicującą i inkubować przez noc w inkubatorze o niskiej zawartości tlenu.
    2. Następnego dnia dodaj pożywkę do infekcji (będzie się to różnić w zależności od wirusa). Użyć CM bez wstrzykiwacza/paciorkowca zawierającego BMP4/A/P, używając 0,5 ml na jeden dołek płytki 6-dołkowej. Dodaj wirusa Sendai dla MOI = 1. Inkubować przez 8 godzin w inkubatorze o niskiej zawartości tlenu.
    3. Jeśli konieczne są dodatkowe punkty czasowe, po 4 godzinach usuń pożywkę zawierającą wirusa i zastąp ją BMP4/A/P CM. Zebrać komórki do izolacji RNA za pomocą skrobaka do komórek.
    4. Określ skuteczność infekcji wirusowej, wykonując qRT-PCR dla genów zaangażowanych w odpowiedź wirusową18.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przegląd różnicowania komórek hPSC metodą in vitro

Ten protokół różnicowania in vitro rozpoczyna się od niezróżnicowanych hESC hodowanych na MEF-ach, które są przenoszone do warunków wolnych od karmienia przez jedno przejście (Rysunek 1A). Chociaż opisaliśmy różnicowanie hESC w tym protokole, użyliśmy tego protokołu do skutecznego różnicowania hiPSC w komórki trofoblastyczne. Przejście do macierzy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiono podstawowe etapy różnicowania hESC w progenitory trofoblastu. Protokół ten został ostatnio zoptymalizowany w celu szybkiego różnicowania hESC poprzez dodanie aktywiny/inhibitorów sygnalizacji węzłowej, zwiększając różnicowanie do komórek trofoblastycznych i unikając generowania progenitorów mezodermy, które są zwykle obserwowane w przypadku samego leczenia BMP4. System modelowy BMP4 pozwala na badanie najwcześniejszych etapów specyfikacji i ekspansji linii trofoblastu człowieka. Ponadto ten system modelowy ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Pennsylvania Health Research Formula Fund.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DMEM/F12Invitrogen11330-057
Wymiana surowicy do nokautuInvitrogen10828-028W niniejszym protokole nazywa się to "wymianą surowicy".
NEAAInvitrogen11140-050
FBSInvitrogen16000-044
L-GlutaminaInvitrogen10828-028
Penicylina/StreptomycynaInvitrogen15140-155
2-merkaptoetanolSigmaM-7522
B-FGFMilliporeGF-003
DMEMInvitrogen11965-118
DispaseInvitrogen17105-041
Kolagenaza typu IVInvitrogen17104-019
Inhibitor skał Y27632Calbiochem688000
Napromieniowane CF1 MEFGlobalStem6001GMEF mogą być generowane od 13,5 dnia embyos embrionalnego i napromieniane.
0,22 &mikro; m filtr strzykawkowyMilliporeSLGS033SS
Inkubator niskotlenowy Heracell 150iHeracell/VWR89187-192Wystarczy dowolny inkubator do hodowli tkankowych o zdolności regulacji stężenia tlenu.
BMP4R& D Systems314-BP-01M
A 83-01R& D Systems2939/10
PD173074R& D Systems3044/10
RNAiMaxInvitrogen13778150
TrizolThermoFisher15596026Trizol służy do izolacji całkowitego RNA.
X-tremeGENE 9Roche6365779001
MatrigelCorning356231W tym protokole nazywa się to "macierzą zewnątrzkomórkową".

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rugg-Gunn, P. J. Epigenetic features of the mouse trophoblast. Reproductive biomedicine online. 25 (1), 21-30 (2012).
  2. Rossant, J., Cross, J. C. Placental development: lessons from mouse mutants. Nature reviews. Genetics. 2 (7), 538-548 (2001).
  3. Hertig, A. T., Rock, J., Adams, E. C., Menkin, M. C. Thirty-four fertilized human ova, good, bad and indifferent, recovered from 210 women of known fertility; a study of biologic wastage in early human pregnancy. Pediatrics. 23 (1 Part 2), 202-211 (1959).
  4. Steptoe, P. C., Edwards, R. G., Purdy, J. M. Human blastocysts grown in culture. Nature. 229 (5280), 132-133 (1971).
  5. Delorme-Axford, E., Sadovsky, Y., Coyne, C. B. The placenta as a barrier to viral infections. Annual Review of Virology. 1, 133-146 (2014).
  6. Ji, L., et al. Placental trophoblast cell differentiation: physiological regulation and pathological relevance to preeclampsia. Molecular aspects of medicine. 34 (5), 981-1023 (2013).
  7. Bilban, M., et al. Identification of novel trophoblast invasion-related genes: heme oxygenase-1 controls motility via peroxisome proliferator-activated receptor gamma. Endocrinology. 150 (2), 1000-1013 (2009).
  8. Xu, R. H., et al. BMP4 initiates human embryonic stem cell differentiation to trophoblast. Nature biotechnology. 20 (12), 1261-1264 (2002).
  9. Amita, M., et al. Complete and unidirectional conversion of human embryonic stem cells to trophoblast by BMP4. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (13), E1212-E1221 (2013).
  10. Genbacev, O., et al. Establishment of human trophoblast progenitor cell lines from the chorion. Stem Cells. 29 (9), 1427-1436 (2011).
  11. Marchand, M., et al. Transcriptomic signature of trophoblast differentiation in a human embryonic stem cell model. Biology of reproduction. 84 (6), 1258-1271 (2011).
  12. Hyslop, L., et al. Downregulation of NANOG induces differentiation of human embryonic stem cells to extraembryonic lineages. Stem cells. 23 (8), 1035-1043 (2005).
  13. Harun, R., et al. Cytotrophoblast stem cell lines derived from human embryonic stem cells and their capacity to mimic invasive implantation events. Human reproduction. 21 (6), 1349-1358 (2006).
  14. Lichtner, B., Knaus, P., Lehrach, H., Adjaye, J. BMP10 as a potent inducer of trophoblast differentiation in human embryonic and induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 34 (38), 9789-9802 (2013).
  15. Chen, Y., Wang, K., Chandramouli, G. V., Knott, J. G., Leach, R. Trophoblast lineage cells derived from human induced pluripotent stem cells. Biochemical and biophysical research communications. , (2013).
  16. Roberts, R. M., et al. Differentiation of trophoblast cells from human embryonic stem cells: to be or not to be? Reproduction. 147 (5), D1-D12 (2014).
  17. Sarkar, P., et al. Activin/nodal signaling switches the terminal fate of human embryonic stem cell-derived trophoblasts. The Journal of biological chemistry. 290 (14), 8834-8848 (2015).
  18. Penkala, I., et al. lncRHOXF1, a Long Noncoding RNA from the X Chromosome That Suppresses Viral Response Genes during Development of the Early Human Placenta. Mol Cell Biol. 36 (12), 1764-1775 (2016).
  19. Penkala, I., et al. lncRHOXF1, a Long Noncoding RNA from the X Chromosome That Suppresses Viral Response Genes during Development of the Early Human Placenta. Molecular and cellular biology. 36 (12), 1764-1775 (2016).
  20. Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nature biotechnology. 29 (8), 731-734 (2011).
  21. Bernardo, A. S., et al. BRACHYURY and CDX2 mediate BMP-induced differentiation of human and mouse pluripotent stem cells into embryonic and extraembryonic lineages. Cell stem cell. 9 (2), 144-155 (2011).
  22. Zhang, P., et al. Short-term BMP-4 treatment initiates mesoderm induction in human embryonic stem cells. Blood. 111 (4), 1933-1941 (2008).
  23. Vallier, L., et al. Early cell fate decisions of human embryonic stem cells and mouse epiblast stem cells are controlled by the same signalling pathways. PloS one. 4 (6), e6082(2009).
  24. Arman, E., Haffner-Krausz, R., Chen, Y., Heath, J. K., Lonai, P. Targeted disruption of fibroblast growth factor (FGF) receptor 2 suggests a role for FGF signaling in pregastrulation mammalian development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (9), 5082-5087 (1998).
  25. Yu, P., Pan, G., Yu, J., Thomson, J. A. FGF2 sustains NANOG and switches the outcome of BMP4-induced human embryonic stem cell differentiation. Cell stem cell. 8 (3), 326-334 (2011).
  26. Sudheer, S., Bhushan, R., Fauler, B., Lehrach, H., Adjaye, J. FGF inhibition directs BMP4-mediated differentiation of human embryonic stem cells to syncytiotrophoblast. Stem cells and development. 21 (16), 2987-3000 (2012).
  27. Bischof, P., Irminger-Finger, I. The human cytotrophoblastic cell, a mononuclear chameleon. The international journal of biochemistry & cell biology. 37 (1), 1-16 (2005).
  28. Cole, L. A. Hyperglycosylated hCG, a review. Placenta. 31 (8), 653-664 (2010).
  29. Apps, R., et al. Human leucocyte antigen (HLA) expression of primary trophoblast cells and placental cell lines, determined using single antigen beads to characterize allotype specificities of anti-HLA antibodies. Immunology. 127 (1), 26-39 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

R nicowanie kom rek trofoblastycznebia ko morfogenetyczne ko ci 4inhibitory sygnalizacji aktywiny i nodalpowlekanie macierz zewn trzkom rkowhodowla bez kom rek karmionekinkubacja w warunkach niskiego st enia tlenutransfekcja siRNAilo ciowy RT PCRpowlekanie elatyn

Powiązane artykuły