Artykuł metodologiczny

Metody samointegracji biopolimerów megamolekularnych na granicy faz powietrze-LC

DOI:

10.3791/55274

⸱

7 kwietnia 2017

 ,  ,  , 
1Japan Advanced Institute of Science and Technology, 2Department of Bioengineering, School of Engineering, The University of Tokyo

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metoda indukowanej suszeniem samointegracji megamolekularnych biopolimerów na granicy powietrzno-ciekłokrystalicznej jest dostępna tutaj. Metodologia ta będzie przydatna nie tylko do zrozumienia makroskopowego potencjału biopolimerów, ale także jako metoda oceny materiałów miękkich w dziedzinach biomedycznych i środowiskowych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Żywe organizmy, które używają wody, są zawsze podatne na wysychanie w środowisku. Ich aktywność jest napędzana przez mikro- i makrostruktury oparte na biopolimerach, co widać w przypadkach przemieszczania wody w wiązkach naczyniowych i nawilżania wody w warstwach skóry. W niniejszej pracy opracowaliśmy metodę oceny wpływu wodnych roztworów ciekłokrystalicznych (LC) składających się z biopolimerów na suszenie. Ponieważ biopolimery LC mają masę megacząsteczkową, zdecydowaliśmy się zbadać polisacharydy, białka cytoszkieletu i DNA. Obserwacja roztworów biopolimerowych podczas suszenia w świetle spolaryzowanym ujawnia miliskalową samointegrację, zaczynając od niestabilnej granicy faz powietrze-LC. Dynamikę wodnych roztworów biopolimeru LC można monitorować poprzez odparowanie wody z jednostronnie otwartej komórki. Analizując zdjęcia wykonane przy użyciu światła spolaryzowanego krzyżowo, możliwe jest rozpoznanie zmian czasoprzestrzennych w orientational order parametr. Metoda ta może być przydatna do charakteryzacji nie tylko sztucznych materiałów w różnych dziedzinach, ale także naturalnych żywych tkanek. Wierzymy, że zapewni on metodę oceny materiałów miękkich w dziedzinie biomedycyny i środowiska.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Skupiając się na sztywnych, prętowatych strukturach biopolimerów, dynamiczne miękkie materiały zostały użyte do różnych zastosowań, w tym polisacharydowe matryce biofilmu1, "aktywne żele" złożone z białek cytoszkieletu2, oraz "DNA origami" o pożądanych kształtach3. Aby wyjaśnić właściwości strukturalne, zbadano wiele strategii, takich jak transmisyjna mikroskopia elektronowa, skaningowa mikroskopia elektronowa, mikroskopia sił atomowych i konfokalna mikroskopia fluorescencyjna. Ponieważ jednak metody te są najczęściej podejmowane w stanie suchym lub statycznym, trudno jest wyjaśnić dynamiczne zachowania w skalach makroskopowych, jak to widać w rzeczywistych żywych systemach. Ostatnio z powodzeniem zaobserwowaliśmy dynamiczne zachowanie biopolimerów na granicy faz powietrze-LC w świetle spolaryzowanym4. Podczas wizualizacji zorientowanej struktury podczas suszenia roztworu biopolimeru, zmiany czasowe wskazywały na samointegrację biopolimerów na niestabilnym granicy faz powietrze-LC.

Tutaj opisujemy protokół suszenia roztworów biopolimeru LC na granicy faz powietrze-LC za pomocą spolaryzowanych instrumentów. W przeciwieństwie do innych analiz fazy LC, które nie uwzględniają suszenia5,6, dynamika LC podczas procesu suszenia została tutaj zbadana poprzez ocenę parametru kolejności orientacyjnej w widoku bocznym fazy płynnej w komorze jednostronnie otwartej. Połączenie parowania komórek i zastosowanie spolaryzowanych instrumentów pozwoliło na makroskopowy monitoring z kontrolowanym kierunkiem parowania. Ponadto możliwe było zweryfikowanie zapisów suszenia poprzez skupienie się na strukturach krystalicznych zaadsorbowanych mikrodomen, na które miała wpływ masa cząsteczkowa, stężenie itp. Aby wykazać skuteczność metody, zbadano procesy suszenia podstawowych biopolimerów o sztywnych kształtach prętów, takich jak polisacharydy, mikrotubule (MT) i DNA. Wybraliśmy te biopolimery, ponieważ są one typowymi przykładami hierarchicznych makrocząsteczek o masach megacząsteczkowych, a ich interakcje międzycząsteczkowe umożliwiają im tworzenie stanów LC.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Instrumenty

  1. Urządzenie polaryzacyjne
    1. Aby skonstruować urządzenie polaryzacyjne, należy zapewnić źródło światła z lampą halogenową, światłowodem, polaryzatorami, stolikiem na próbkę, szyną optyczną, stojakami na pręty i cyfrową lustrzanką jednoobiektywową (patrz rysunek 1C i lista materiałów dla części urządzenia polaryzacyjnego).

2. Przygotowanie roztworu biopolimeru

  1. Roztwory polisacharydowe
    1. Rozpuść sacran7 (0.5 g) w czystej wodzie (100 ml) mieszając w temperaturze ~80 °C przez ponad 12 godzin. Podczas rozpuszczania przykryj pojemnik folią, aby zapobiec parowaniu. W ten sam sposób przygotuj wodny roztwór gumy ksantanowej.
    2. Schłodzić roztwory w temperaturze ~25 °C do uzyskania 0,5% wag. roztworów wodnych.
    3. Odwirować roztwór sakranowy w celu usunięcia zanieczyszczeń (48 400 x g, 4 °C, 1 h, 3 razy).
  2. Rozwiązanie MT
      Przygotować 0,5% wag. roztwór tubuliny (1 ml) w buforze Brittona-Robinsona (80 mM piperazyno-N,N′-bis(kwas 2-etanosulfonowy) (PIPES); 1 mM glikolu etylenowego-bis(β-aminoetyloeter)-N,N,N',N'-tetraoctowego (EGTA); i 5 mM MgCl2, pH 6,8) na lodzie8.
    2. Użyć 0,5% wag. roztworu tubuliny (50 μl) i trifosforanu guanozyno-5'-[(α,β)-metyleno]trifosforanu (GpCpp) (5 μl) w celu przygotowania roztworu tubuliny zawierającego GpCpp (50 μl). Inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 godziny w celu uzyskania stabilnego jądra MT.
      UWAGA: Rolą GpCpp jest wspomaganie tworzenia MT i całkowite zahamowanie depolimeryzacji MT do tubuliny.
    3. Mieszać 0,5% wag. roztwór tubuliny (950 μl) i roztwór tubuliny zawierający GpCpp (50 μL) w temperaturze ~25 °C przez 1 dzień, aby uzyskać stabilny roztwór MT o stężeniu 0,5% wag.
  3. Roztwór DNA
    1. Przygotować 0,5% wagowy roztwór DNA (1 ml) w roztworze buforowym Tris-EDTA (10 mM Tris, pH 8,0, z 1 mM EDTA).
  4. Roztwory próbek biopolimeru o stężeniu 0,5% wagowym należy przechowywać w temperaturze 25 °C do czasu przeprowadzenia eksperymentu suszenia.

3. Eksperymenty i obserwacje suszenia w świetle spolaryzowanym krzyżowo

  1. Roztwory w celi jednostronnie otwartej (rysunek 1A)
    1. Wytnij arkusz silikonu (patrz Lista materiałów) na odpowiedni kształt o grubości 1 mm (wymiar wewnętrzny 5-15 mm, 1 mm i ~20 mm; Rysunek 1A).
      1. Zamontuj jednostronnie otwartą komórkę składającą się z silikonowej przekładki o wymiarze wewnętrznym 5-15 mm, 1 mm i ~20 mm oraz dwóch niemodyfikowanych szkiełek szklanych (76 mm × 1 mm × 26 mm). Zamocuj wcześniej obie strony celi za pomocą podwójnych klipsów, aby zapobiec wyciekaniu roztworu próbki.
    2. Powoli dodawać każdy z 0,5% wagowych roztworu biopolimeru (100-300 μl) za pomocą końcówki pipety o wielkości porów ~1 mm do każdej komórki w temperaturze ~25 °C. Usunąć pęcherzyki powietrza z komórek za pomocą igły strzykawki.
    3. Umieścić komórki w piecu z cyrkulatorem powietrza o temperaturze 60 °C pod ciśnieniem atmosferycznym w celu odparowania; kierunek parowania jest przeciwny do kierunku grawitacyjnego.
  2. Obserwacje w świetle spolaryzowanym krzyżowo (Rysunek 1B-1C)
    1. Zapewniają proste światło widzialne za pomocą lampy halogenowej o mocy 100 W ze źródłem światła o płaskiej powierzchni na dużym obszarze (80 mm x 80 mm). Ustaw polaryzatory na 45° i 135° za pomocą uchwytów (Rysunek 1C).
    2. Ustal pozycje źródła światła, polaryzatorów, sample stage i kamery za pomocą szyny optycznej i stojaków na pręty (Rysunek 1C). Umieść sample stage między dwoma polaryzatorami (odległość między polaryzatorami powinna wynosić ~5 cm). Umieść aparat w odległości ~20 cm od stolika na próbki, aby umożliwić ustawienie ostrości.
    3. W określonych momentach umieść próbki z kroku 3.1.3 między polaryzatorami na stoliku równoległym do płaszczyzny XZ i przykryj urządzenie czarną kurtyną; rzeczywiste urządzenie pokazano na rysunku 1C.
    4. Sfotografuj próbki przez liniowe skrzyżowane polaryzatory za pomocą cyfrowej lustrzanki jednoobiektywowej ze standardowym obiektywem zmiennoogniskowym (patrz Lista materiałów). Kontroluj ustawienia aparatu, takie jak odległość ogniskowa, za pomocą oprogramowania komputerowego (patrz Lista materiałów).
  3. Analiza czasoprzestrzenna natężenia światła przechodzącego (rys. 1C)
    1. Aby ocenić zmianę parametru kolejności orientacji w procesie suszenia, należy zbierać zdjęcia co godzinę przez 24 godziny.
    2. Zmierz natężenie światła przechodzącego wzdłuż linii środkowej w kierunku Z jako wartość szarości za pomocą programu do przetwarzania obrazu (np. ImageJ).
    3. Narysuj wykres wartości szarości w funkcji odległości od górnej otwartej strony.
  4. Obserwacje mikroskopowe w świetle spolaryzowanym krzyżowo (rysunek 1D)
    1. Aby sprawdzić metody, wykonaj obserwacje mikroskopowe za pomocą mikroskopu polaryzacyjnego wyposażonego w kamerę CCD9. Utrzymuj płytkę opóźniającą pierwszego rzędu na ścieżce światła. Kontroluj warunki na zdjęciach za pomocą oprogramowania komputerowego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z urządzenia, jak pokazano na rysunku 1, oceniono samointegrację z mikrodomeny do makrodomeny na interfejsie suszącego powietrza LC (Rysunek 2A). Jako pierwszą demonstrację eksperymentu suszenia porównano dwa rodzaje polisacharydów wielkocząsteczkowych, sachran (Mw = 1,9 x 107 g mol-1) i gumę ksantanową (4,7 x 106 g mol-1). Rysunek 2B przedstawia fotografie roztwo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Czasami aparat miał trudności z ustawieniem ostrości na próbce ze względu na zbyt niskie natężenie przepuszczanego światła. W takich przypadkach umieszczenie na scenie przedłużonej przezroczystej folii z tworzywa sztucznego pomogło w ustawieniu ostrości. Ograniczenie obserwowalnej rozdzielczości było zależne od obiektywu aparatu, w tym przypadku ~10 μm. Obserwowane ograniczenie grubości próbki, Δy, zależało od maksymalnego natężenia światła lampy, w tym przypadku ~10 mm.

Zaletą urządzenia poka...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez grant dla Młodych Naukowców (16K17956) z Ministerstwa Edukacji, Kultury, Sportu, Nauki i Technologii Japonii, Centrum Technonauki w Kioto oraz Fundacji Mitani na rzecz Badań i Rozwoju.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
sacranGreen Science Materials Inc., JaponiaZ Aphanothece sacrum.
Mw = 1,9 × 107 g mol-1
guma ksantanowaTaiyo Kagaku Co., JaponiaNeosoft XCZ Xanthomonas campestris.
Mw = 4,7 × 106 g mol-1
tubulinaCytoskeleton, Inc., USAT240Z mózgu świni.
GpCppJena Bioscience, NiemcyNU405L
piperazyna-N,N′ -bis (kwas 2-etanosulfonowy)Sigma-Aldrichi, Co. LLC.Kwas P6757-500G
glikol-bis(β-aminoetylowy)-N,N,N',-tetraoctowyDojindo Molecular Technologies, Inc.342-01314EGTA
MgCl2-6H2O Wako Pure Chemical Industries, Ltd.135-15055
KOHWako Pure Chemical Industries, Ltd.162-21813granulki
DNASigma-Aldrich, Co. LLC.D1626Z jąder łososia.
Mw = 1,3 & razy; 106 Da (~ 2,000 pz)
Roztwór buforowy Tris-EDTASigma-Aldrich, Co. LLC.T9285-100ML10 mM Tris, pH 8,0, ze
szkłem szkiełkowymMatsunami Glass Ind., Ltd., JaponiaS1111
Asone Co.6-611-32Grubość: 1 mm
wirówkaBeckman-Coulter, Inc., USAAvanti J-25wyposażona w źródło światła z wirnikiem JA-20
Sumita Optical Glass, Inc., JaponiaLS-LHA
Sumita Optical Glass, Inc., JaponiaGF7.2-1-L1500R-M80 (AAAR-015M)80 mm & 80 mm
Ushio Inc., JaponiaJCR 15V150WBN
posiadaczSigmakoki, Co., Ltd.KMH-80
Sigmakoki, Co., Ltd.TARW-25503L
uchwyt na próbkiSigmakoki, Co., Ltd.Pręt SHA-25RO
Sigmakoki, Co., Ltd.ROU-12-40
uchwyt słupkówSigmakoki, Co., Ltd.RS-6-40
Sigmakoki, Co., Ltd.RS-12-60
Sigmakoki, Co., Ltd.RS-12-80
Sigmakoki, Co., Ltd.Przewoźnik RS-12-130
Sigmakoki, Co., Ltd.Uchwyt kamery CAA-25LS
Sigmakoki, Co., Ltd.CMH-2
średnia szyna optycznaSigmakoki, Co., Ltd.Tubus obiektywu OBA-500SH
Tomytech, tubus obiektywu BORGBK80φ, L25 mm 
tubusobiektywu Tomytech, tubus obiektywu BORGBK80φ, L50 mm 
wielopasmowyTomytech, BORG80φ  
Płyta VTomytech, BORGV płyta 60S uchwyt talerza
Viexen, Co., Ltd.uchwyt na talerz SX
EOS Kiss X7i Canon Inc., Japonia8594B001ze standardowym obiektywem zmiennoogniskowym,  Oprogramowanie fotograficzne EFP 18-55 mm
Canon Inc., JaponiaEOS Utility
PCMicrosoftSurface
polaryzacyjnyOlympusBX51
płyta opóźniająca pierwszego rzęduOlympusU-TP530λ = 530 nm
AparatOlympusDP80
OlympuscellSens Standardowy
program do przetwarzania obrazów oparty na Javie, National Institutes of HealthImageJ
1 mM EDTA Arkusz kauczuku silikonowego Światłowód Lampa halogenowa Stolik na próbkę Uchwyt słupków Uchwyt słupków Uchwyt słupków mikroskop fotograficzny

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Flemming, H. -C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nat. Rev. Microbiology. 8 (9), 623-633 (2010).
  2. Osada, Y., Kawamura, R., Sano, K. Hydrogels of cytoskeletal proteins. , Springer. (2016).
  3. Rothemund, P. W. K. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440, 297-302 (2006).
  4. Okeyoshi, K., Okajima, M. K., Kaneko, T. Milliscale self-integration of megamolecule biopolymers on a drying gas-aqueous liquid crystalline interface. Biomacromolecules. 17 (6), 2096-2103 (2016).
  5. De Gennes, P. G., Prost, J. The physics of liquid crystals. , Oxford University Press. Oxford, UK. (1993).
  6. De Gennes, P. G., Brochard-Wyart, F., Quere, D. Capillarity and wetting phenomena: drops, bubbles, pearls, waves. , Springer. (2003).
  7. Okajima, M. K., Kaneko, D., Mitsumata, T., Kaneko, T., Watanabe, J. Cyanobacteria that produce megamolecules with efficient self-orientations. Macromolecules. 42 (8), 3058-3062 (2009).
  8. Okeyoshi, K., Kawamura, R., Yoshida, R., Osada, Y. Thermo- and photo-enhanced microtubule formation from Ru(bpy)32+-conjugated tubulin. J. Mater. Chem. B. 2, 41-45 (2014).
  9. Olympus. Support BX51P. , Available from: http://www.olympus-ims.com/microscope/bx51p/ (2016).
  10. Matsuo, E. S., Tanaka, T. Kinetics of discontinuous volume-phase transition of gels. J. Chem. Phys. 89, 1695-1703 (1988).
  11. Okajima, K., Mishima, R., Amornwachirabodee, K., Mitsumata, T., Okeyoshi, K., Kaneko, T. Anisotropic swelling in hydrogels formed by cooperatively aligned megamolecules. RSC Adv. 5, 86723-86729 (2015).
  12. Joshi, G., Okeyoshi, K., Okajima, M. K., Kaneko, T. Directional control of diffusion and swelling in megamolecular polysaccharide hydrogels. Soft Matter. 12, 5515-5518 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

rodowisko suszeniamikroskopia w wietle spolaryzowanymroztwory biopolimer wanaliza spacjoczasowaparametr porz dku orientacyjnegoogniwo otwarte z jednej stronywiat o skrzy owane

Powiązane artykuły