Artykuł metodologiczny

Analizy linii komórkowych i badania funkcji genów z wykorzystaniem MARCM w bliźniaczej plamce

DOI:

10.3791/55278

⸱

2 marca 2017

 ,  ,  , 
1Institute of Cellular and Organismic Biology, Academia Sinica, 2Graduate Institute of Life Sciences, National Defense Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół techniki etykietowania mozaiki, który pozwala na wizualizację neuronów pochodzących ze wspólnej komórki progenitorowej w dwóch różnych kolorach. Ułatwia to analizę linii neuronalnej z możliwością datowania pojedynczych neuronów na narodziny i badania funkcji genów w tych samych neuronach różnych osób.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mosaic a nalysis with a repressible cell marker (MARCM) to system pozytywnego etykietowania mozaikowego, który jest szeroko stosowany w badaniach neurobiologicznych Drosophila do przedstawiania skomplikowanych morfologii i manipulowania funkcją genów w podzbiorach neuronów w organizmach inaczej nieoznaczonych i niezaburzonych. Mozaiki genetyczne generowane w systemie MARCM są mediowane przez specyficzną dla miejsca rekombinację między homologicznymi chromosomami w dzielących się komórkach prekursorowych w celu wytworzenia zarówno oznaczonych (klony MARCM), jak i nieoznaczonych komórek potomnych podczas mitozy. Rozszerzenie metody MARCM, zwane twin-spot MARCM (tsMARCM), oznacza obie bliźniacze komórki pochodzące od wspólnego przodka dwoma różnymi kolorami. Technika ta została opracowana, aby umożliwić uzyskanie użytecznych informacji z obu półlinii. Dzięki kompleksowej analizie różnych par klonów tsMARCM, system tsMARCM umożliwia mapowanie linii neuronowych w wysokiej rozdzielczości, aby ujawnić dokładną kolejność narodzin znakowanych neuronów wytworzonych ze wspólnych komórek progenitorowych. Co więcej, system tsMARCM rozszerza również badania nad funkcjami genów, umożliwiając analizę fenotypową identycznych neuronów różnych zwierząt. W tym miejscu opisujemy, jak zastosować system tsMARCM, aby ułatwić badania nad rozwojem neuronalnym u Drosophila.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mózg, składający się z ogromnej liczby różnorodnych typów neuronów, wyposaża zwierzęta w zdolność postrzegania, przetwarzania i reagowania na wyzwania ze świata zewnętrznego. Neurony dorosłego Drosophila centralnego mózgu pochodzą z ograniczonej liczby nerwowych komórek macierzystych, zwanych neuroblastami (NB), podczas rozwoju1,2. Większość NB biorących udział w neurogenezie mózgu u Drosophila przechodzi asymetryczny podział w celu wytworzenia samoodnawiających się NB i komórek macierzystych zwojów (GMC), a GMC przechodzą następnie przez kolejną rundę podziału, aby wytworzyć dwie komórki potomne, które różnicują się w neurony3 (Figura 1A). Ze względu na złożoność morfologii neuronów i wyzwania związane z identyfikacją konkretnych neuronów, wynaleziono technologię pozytywnego znakowania mozaiki, analizę mozaiki z represyjnym markerem komórkowym (MARCM), aby umożliwić wizualizację pojedynczego neuronu lub małego podzbioru neuronów z populacji otaczających, nieoznakowanych neuronów4.

MARCM wykorzystuje system rozpoznawania flippazy (FLP)/celu rozpoznawania FLP (FRT) do pośredniczenia w specyficznej dla miejsca rekombinacji między homologicznymi chromosomami w obrębie dzielącej się komórki prekursorowej niosącej heterozygotyczny allel genu represorowego, którego ekspresja normalnie hamuje ekspresję genu reporterowego4. Po podziale mitotycznym rekombinowane chromosomy są segregowane na bliźniacze komórki, tak że jedna komórka zawiera homozygotyczne allele genu represorowego, a druga komórka nie ma genu represorowego - ekspresja reportera w tej komórce (i jej potomkach) nie jest już zablokowana4. W eksperymencie MARCM zwykle znajdują się trzy wzorce klonalne, gdy FLP jest indukowany stochastycznie w NB lub GMC: klony jednokomórkowe i dwukomórkowe GMC, które przedstawiają morfologię neuronów w rozdzielczości pojedynczej komórki, oraz wielokomórkowe klony NB, które ujawniają całe wzorce morfologiczne neuronów pochodzących ze wspólnego NB (Figura 1B). Technika MARCM jest szeroko stosowana w badaniach neurobiologicznych Drosophila, w tym w identyfikacji typów neuronów w celu rekonstrukcji sieci przewodowych w całym mózgu, analizach linii neuronalnych w celu ujawnienia historii rozwoju neuronów, charakterystyce fenotypowej funkcji genów zaangażowanych w specyfikację losu komórki oraz badaniach morfogenezy i różnicowania neuronów5,6,7,8,9,10. Ponieważ konwencjonalny MARCM znakuje tylko jedną z dwóch komórek potomnych (i linii) po indukowanym zdarzeniu rekombinacji mitotycznej, potencjalnie użyteczne informacje ze strony nieoznaczonej są tracone. To ograniczenie wyklucza zastosowanie podstawowego systemu MARCM do wysokorozdzielczych analiz wielu linii neuronalnych, które zmieniają losy komórek w szybkim tempie lub do precyzyjnych analiz funkcji genów w identycznych neuronach różnych zwierząt11,12.

Twin-spot MARCM (tsMARCM) to zaawansowany system, który oznacza neurony pochodzące od wspólnego przodka dwoma różnymi kolorami, co umożliwia odzyskanie użytecznych informacji z obu stron bliźniaczych komórek, pokonując w ten sposób ograniczenia oryginalnego systemu MARCM11 (Rysunek 2A-2C). W systemie tsMARCM dwa supresory oparte na interferencji RNA (RNAi) znajdują się w miejscach trans chromosomów homologicznych w komórce prekursorowej, a ekspresja tych supresorów niezależnie hamuje ekspresję ich odpowiednich reporterów (Figura 2B). Po specyficznej dla miejsca rekombinacji mitotycznej za pośrednictwem systemu FLP / FRT, dwa supresory oparte na RNAi ulegają segregacji w komórkach bliźniaczych, aby umożliwić ekspresję odrębnych reporterów (Figura 2B). Dwa wzorce klonalne, pojedyncza komórka związana z klonami pojedynczych komórek i dwukomórkowa GMC związana z wielokomórkowymi klonami NB, są zwykle obserwowane w eksperymencie tsMARCM (Figura 2C). Informacje pochodzące z jednej strony bliźniaczych komórek mogą być wykorzystane jako odniesienie dla drugiej strony, umożliwiając analizy linii neuronalnej o wysokiej rozdzielczości, takie jak datowanie urodzeń znakowanych neuronów oraz analizy fenotypowe identycznych neuronów u różnych zwierząt w celu dokładnego zbadania funkcji genów neuronalnych11,12. W tym miejscu przedstawiamy krok po kroku protokół opisujący, jak przeprowadzić eksperyment tsMARCM, który może być wykorzystany przez inne laboratoria do poszerzenia swoich badań nad rozwojem neuronalnym (a także rozwojem innych tkanek, jeśli dotyczy) u Drosophila.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Zbuduj muchy gotowe do tsMARCM przy użyciu wymaganych Transgenes11,13

  1. Wygeneruj oryginalną wersję much gotowych do tsMARCM z transgenów, które są przenoszone przez poszczególne muchy11 (patrz Tabela 1). Przeprowadź standardowe schematy krzyżowania genetycznego much, które zostały opisane wcześniej, umieszczając wiele transgenów w tym samym stadzie much13.
    1. W jednej linii rodzicielskiej złóż transgeny FRT40A, UAS-mCD8::GFP (pierwszy reporter, mCD8::GFP; ekspresja transgenu jest pod kontrolą promotora sekwencji aktywacji w górę, który wytwarza uwięziony błoną reporter mysiego klastra białka różnicowania 8 połączonego z białkiem zielonej fluorescencji) i UAS-rCD2RNAi (supresor, który hamuje ekspresję drugiego reportera; RNAi przeciwko ekspresji szczurzego klastra różnicowania 2, rcd2) na lewym ramieniudrugiego chromosomu. Jeśli to możliwe, umieść specyficzny tkankowo sterownik GAL4 na chromosomie X lub 3.
    2. W drugiej linii rodzicielskiej złóż transgeny FRT40A, UAS-rCD2::RFP (drugi reporter, rCD2::RFP; drugi reporter na uwięzi błonowej składający się z białka rCD2 połączonego z białkiem czerwonej fluorescencji) i UAS-GFPRNAi (supresor, który hamuje ekspresję mCD8::GFP; RNAi przeciwko ekspresji gfp) na lewym ramieniu drugiego chromosomu. Jeśli to możliwe, umieść FLP szoku cieplnego (hs)-FLP lub FLP specyficznego dla tkanki na chromosomie X lub 3.
  2. Wygeneruj nową wersję much gotowych do tsMARCM z transgenów, które są przenoszone przez poszczególne muchy14 (patrz Tabela 1). Przeprowadź standardowe schematy krzyżowania genetycznego much, które zostały opisane wcześniej, umieszczając wiele transgenów w tym samym stadzie much13.
    1. W jednej linii rodzicielskiej zbierz transgeny miejsca FRT i UAS-mCD8.GFP.UAS-rCD2i (połączony transgen mCD8::GFP i supresora, który hamuje ekspresję rCD2::RFP) razem w tym samym ramieniu 2. lub 3. chromosomu (odpowiednie pary transgenów FRT i UAS-mCD8.GFP.UAS-rCD2i przedstawiono w Tabeli 1). Jeśli to możliwe, umieścić swoisty tkankowo sterownik GAL4 na chromosomach innych niż chromosom wybranego miejsca FRT.
    2. W drugiej linii rodzicielskiej zbierz transgeny miejsca FRT i UAS-rCD2.RFP.UAS-GFPi (drugi połączony transgen rCD2::RFP i supresor, który hamuje ekspresję mCD8::GFP) w tym samym ramieniu 2. lub 3. chromosomu (odpowiednie pary transgenów FRT i UAS-rCD2.RFP.UAS-GFPi są wskazane w Tabeli 1). Jeśli to możliwe, umieść hs-FLP lub swoisty tkankowo FLP na chromosomach innych niż chromosom wybranego miejsca FRT.

2. Muchy gotowe do krzyżowania tsMARCM w celu wygenerowania klonów tsMARCM w swoim potomstwie

  1. Skrzyżuj ze sobą muchy gotowe do użycia w tsMARCM (np. umieść razem 10-15 samców much z kroku 1.1.1 lub 1.2.1 i 20-30 dziewiczych samic much z kroku 1.1.2 lub 1.2.2) w fiolce z pokarmem dla much ze świeżo wygotowaną pastą drożdżową na ściance fiolki.
  2. Trzymaj skrzyżowane muchy gotowe do tsMARCM w temperaturze 25 °C przez 2 dni, aby zwiększyć szansę na krycie przed zebraniem zapłodnionych jaj.
  3. Często przenoś skrzyżowane muchy gotowe do tsMARCM do świeżo drożdżowych fiolek, aby uniknąć stłoczenia (opukaj muchy lub użyj dwutlenku węgla do znieczulenia much, aby ułatwić przenoszenie; trzymaj nie więcej niż 80-100 zapłodnionych jaj w fiolce z pokarmem dla much o pojemności 10 ml, aby uniknąć zbyt wielu wyklutych larw).
  4. Hodowla zwierząt tsMARCM (tj. zapłodnione jaja; przykładem genotypu zwierząt tsMARCM, użytego na rysunku 3, jest hs-FLP[22],w/w; UAS-mCD8::GFP,UAS-rCD2RNAi,FRT 40A,GAL4-GH146/UAS-rCD2::RFP,UAS-GFPRNAi,FRT40A; +; +), które zostały złożone w seryjnie przenoszonych fiolkach w temperaturze 25 °C do momentu osiągnięcia pożądanych etapów (np. zarodki, larwy lub poczwarki).
  5. Umieścić przeniesione fiolki zawierające zwierzęta tsMARCM w tym samym stadium rozwoju w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 10, 20, 30, 40 i 50 minut, aby określić optymalny czas szoku cieplnego, który indukuje ekspresję FLP w celu wytworzenia interesujących klonów tsMARCM. Pomiń ten krok, jeśli w eksperymencie tsMARCM używany jest FLP specyficzny dla tkanek (hs-FLP jest preferowany do analiz linii neuronalnej; powody tej preferencji zostały opisane wcześniej15).
    UWAGA: Powtórz krok 2.5, używając optymalnego czasu szoku cieplnego w przyszłych eksperymentach tsMARCM, jeśli chcesz uzyskać więcej interesujących klonów tsMARCM; ogólnie rzecz biorąc, w hs-FLP indukowana jest większa ekspresja FLP [22] w porównaniu z hs-FLP [1] przy tym samym czasie szoku cieplnego.
  6. Hodować zwierzęta z wytrząsanym przegrzaniem w temperaturze 25 °C, aż osiągną odpowiednie stadium rozwoju, a następnie przejść do etapu 3.

3. Przygotuj, zabarwij i zamontuj mózgi much zawierające klony tsMARCM

  1. Przygotuj naczynia chroniące przed kleszczami. Wymieszaj część A (30 g) i część B (3 g) zestawu elastomerów silikonowych z węglem aktywnym (0,25 g). Wlej mieszaninę do odpowiednich naczyń.
  2. Wypreparuj larwy, poczwarki lub dorosłe mózgi zwierząt tsMARCM w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) za pomocą kleszczy na naczyniu ochronnym przed kleszczami, oglądanym przez mikroskop preparacyjny. UWAGA: Protokół sekcji mózgu muchy został opisany wcześniej16.
  3. Umieść mózgi much w szklanej płytce punktowej z 1x PBS zawierającym 4% formaldehydu w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Przetwarzaj mózgi much na tej szklanej płytce punktowej przez resztę kroków.
  4. Opłucz mózgi muchy trzykrotnie 1% PBT (1x PBS zawiera 1% Triton X-100) i umyj je trzy razy przez 30 minut każdy w 1% PBT (spłucz: usuń PBT i szybko dodaj nowy PBT; przemyj: usuń PBT, dodaj nowy PBT i inkubuj mózgi much w nowym PBT za pomocą wytrząsarki orbitalnej).
  5. Inkubować mózgi muszek z mieszaniną przeciwciał pierwszorzędowych przez noc w temperaturze 4 °C lub przez 4 godziny w temperaturze pokojowej. Przykładem mieszaniny przeciwciał pierwszorzędowych jest szczurze przeciwciało anty-CD8 (1:100), przeciwciało królika anty-DsRed (1:800) i mysie przeciwciało anty-Bruchpilot (Brp) (1:50) w 1% PBT zawierającym 5% normalnej surowicy koziej (NGS).
  6. Opłucz mózgi muchy trzykrotnie 1% PBT, a następnie umyj je trzy razy przez 30 minut każdy z 1% PBT.
  7. Mózgi much inkubować z mieszaniną przeciwciał drugorzędowych przez noc w temperaturze 4 °C lub przez 4 godziny w temperaturze pokojowej. Przykładem mieszaniny przeciwciał drugorzędowych jest kozie przeciwciało anty-szczurze IgG sprzężone z barwnikiem zielonofluorescencyjnym (1:800), kozie przeciwciało anty-królicze IgG sprzężone z barwnikiem żółtej fluorescencji (1:800) i kozie przeciwciało anty-mysie IgG sprzężone z barwnikiem dalekiej czerwonej fluorescencji (1:800) w 1% PBT zawierającym 5% NGS.
  8. Opłucz mózgi muchy trzykrotnie 1% PBT, a następnie umyj je trzy razy przez 30 minut każdy z 1% PBT. Zamontuj je na mikro szkiełku z odczynnikiem antyhartowniczym. Umieść mikro szkło nakrywkowe na mikro szkiełku, aby zakryć i chronić mózg muchy. Uszczelnij krawędzie mikro szkła nakrywkowego i mikroszkiełka za pomocą przezroczystego lakieru do paznokci. Zmontowane i zapieczętowane próbki mózgu muchy należy przechowywać w temperaturze 4 °C.

4. Rób, przetwarzaj i analizuj obrazy fluorescencyjne klonów tsMARCM

  1. Uchwyć obrazy fluorescencyjne klonów tsMARCM z próbek utworzonych w kroku 3.8 za pomocą wybranego systemu mikroskopii konfokalnej.
  2. Projektuj stosy konfokalnych obrazów fluorescencyjnych tsMARCM w dwuwymiarowe, spłaszczone obrazy za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazu dostarczonego z wybranym systemem mikroskopii konfokalnej (patrz rysunek 3B-3E, 3G-3J, 3L-3O i 3Q-3T dla przykładów spłaszczonych konfokalnych obrazów fluorescencyjnych).
  3. Policz liczbę komórek po stronie wielokomórkowej NB klonów tsMARCM za pomocą odpowiedniego oprogramowania do przetwarzania obrazu (np. funkcji "Cell Counter" w ImageJ17; patrz Rysunek 3E, 3J, 3O i 3T dla przykładów ciał komórkowych neuronów).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

System tsMARCM został wykorzystany do ułatwienia analiz linii neuronalnych i badań funkcji genów poprzez pobieranie ważnych informacji o neuronach pochodzących z popularnych NB. System został wykorzystany do identyfikacji większości (jeśli nie wszystkich) typów neuronów, określenia liczby komórek każdego typu neuronów i ustalenia kolejności narodzin tych neuronów11,12,18 (zobacz sekcję Dy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kluczowe kroki w ramach protokołu

Kroki 1.1.1, 1.2.1, 2.3, 2.5 i 3.2 mają kluczowe znaczenie dla uzyskania dobrych wyników tsMARCM. Specyficzne tkankowo sterowniki GAL4 , które nie wyrażają GAL4 w neuronalnych komórkach progenitorowych, są preferowane w krokach 1.1.1 i 1.2.1. Unikaj nadmiernego stłoczenia zwierząt hodowanych w fiolkach z pokarmem dla much w kroku 2.3. Ponieważ opóźnienie indukcji, poziom ekspresji FLP po szoku cieplnym i średni czas podziału neuronalnych komórek progenit...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Ministerstwo Nauki i Technologii (MOST 104-2311-B-001-034) oraz Instytut Biologii Komórkowej i Organizmów, Academia Sinica, Tajwan.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Dwutlenek węgla (CO2)Lokalny sprzedawcanie dotyczy.Znieczuleniemuchy
CO2 Lokalnysprzedawcanie dotyczy.Sortowanie, krzyżowanie i przenoszenie much
10x PBS pH 7.4Uniregion Bio-Tech (lub inni dostawcy)PBS001Preparacja, płukanie, mycie i barwienie immunologiczne mózgów muchy
FormaldehydSigma-Aldrich252549Napraw mózgi much
Triton X-100Sigma-AldrichT8787Płukanie, mycie i barwienie immunologiczne mózgów much
Normalna kozaJackson ImmunoResearch 005-000-121Surowica mózgów muchy immunostainowej
Przeciwciało
przeciw myszom CD8InvitrogenMCD0800Immunostainowe mózgi much
Królicze przeciwciało anty-DsRedClonetech632496Immunostainowe mózgi muchy
Mysie przeciwciało anty-BrpBadania rozwojowe Hybridoma Banknc82Immunostain Mózgi much
Kozie przeciwciało anty-szczurze IgG sprzężone z Alexa Fluor 488InvitrogenA11006Immunostainowe mózgi muchy
Kozie przeciwciało anty-królicze IgG skoniugowane z Alexa Fluor 546InvitrogenA11035Immunostainowe mózgi muchy
Kozie przeciwciało anty-mysie IgG sprzężone z Alexa Fluor 647InvitrogenA21236Immunostainowe mózgi muchy
Odczynnik przeciw blaknięciu złota SlowFadeSondy molekularneS36936Zamontuj mózgi much i chroń wygaszanie fluorescencji 
PYREX 9 szklana płyta depresyjnaCorning7220-85Preparowanie, płukanie, mycie i barwienie immunologiczne mózgów much
Zestaw elastomerów silikonowych Sylgard 184World Precision InstrumentsSYLG184Zrób czarne naczynia Sylgard, aby chronić kleszcze podczas sekcji mózgu
Węgiel aktywnySigma-Aldrich242276-250GZrób czarne naczynia Sylgard
Kleszcze Dumont #5Fine Science Narzędzia11252-30Wypreparuj i zamontuj mózgi much
Mikro zjeżdżalniaCorning2948-75x25Zamontuj mózgi much Mikro
szkło osłonowe nr 1.5VWR International48366-205Zamontuj móżdżki much
Lakier do paznokciLokalny sprzedawcaniedostępnyUszczelnij mikro szkło nakrywkowe na mikroszkiełkach
Inkubator Kultura Kansin InstrumentsLTI603leci w temperaturze 25 & stopni; C
(lub inni sprzedawcy)
Łaźnia wodnaKansin InstrumentsWB212-B2Wywołaj szok cieplny u much w temperaturze 37 & stopni; C
(lub inni dostawcy)
Wytrząsarka orbitalnaKansin InstrumentsOS701Mycie i barwienie immunologiczne mózgów much(
lub innych dostawców)
Mikroskop preparacyjnyLeicaEZ4Sortuj, krzyżuj i przenoś muchy; Preparować, płukać, myć i barwieć immunologicznie mózgi much
Mikroskop konfokalnyZeiss (lub inni dostawcy)LSM 700 (lub inne modele)Obraz tsMARCM klonuje
oprogramowanie do przetwarzania obrazu 1
(np. , przeglądarka obrazów Zeiss LSM) 		ZeissniedostępnyStosy projektów obrazów konfokalnych
oprogramowanie do przetwarzania obrazów 2
(np. , ImageJ) 		niedostępne niedostępnePolicz liczbę komórek klonów tsMARCM

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ito, M., Masuda, N., Shinomiya, K., Endo, K., Ito, K. Systematic analysis of neural projections reveals clonal composition of the Drosophila brain. Curr Biol. 23 (8), 644-655 (2013).
  2. Yu, H. H., et al. Clonal development and organization of the adult Drosophila central brain. Curr Biol. 23 (8), 633-643 (2013).
  3. Goodman, C. S., Doe, C. Q. The Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Arias, A. M. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1993).
  4. Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
  5. Lee, T., Lee, A., Luo, L. Development of the Drosophila mushroom bodies: sequential generation of three distinct types of neurons from a neuroblast. Development. 126 (18), 4065-4076 (1999).
  6. Lee, T., Marticke, S., Sung, C., Robinow, S., Luo, L. Cell-autonomous requirement of the USP/EcR-B ecdysone receptor for mushroom body neuronal remodeling in Drosophila. Neuron. 28 (3), 807-818 (2000).
  7. Chiang, A. S., et al. Three-dimensional reconstruction of brain-wide wiring networks in Drosophila at single-cell resolution. Curr Biol. 21 (1), 1-11 (2011).
  8. Jefferis, G. S., Marin, E. C., Stocker, R. F., Luo, L. Target neuron prespecification in the olfactory map of Drosophila. Nature. 414 (6860), 204-208 (2001).
  9. Hong, W., Luo, L. Genetic control of wiring specificity in the fly olfactory system. Genetics. 196 (1), 17-29 (2014).
  10. Zhu, S., et al. Gradients of the Drosophila Chinmo BTB-zinc finger protein govern neuronal temporal identity. Cell. 127 (2), 409-422 (2006).
  11. Yu, H. H., Chen, C. H., Shi, L., Huang, Y., Lee, T. Twin-spot MARCM to reveal the developmental origin and identity of neurons. Nat Neurosci. 12 (7), 947-953 (2009).
  12. Yu, H. H., et al. A complete developmental sequence of a Drosophila neuronal lineage as revealed by twin-spot MARCM. PLoS Biol. 8 (8), (2010).
  13. Greenspan, R. J. Fly pushing : the theory and practice of Drosophila genetics. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1997).
  14. Awasaki, T., et al. Making Drosophila lineage-restricted drivers via patterned recombination in neuroblasts. Nat Neurosci. 17 (4), 631-637 (2014).
  15. Lee, T. Generating mosaics for lineage analysis in flies. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 3 (1), 69-81 (2014).
  16. Wu, J. S., Luo, L. A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining. Nat Protoc. 1 (4), 2110-2115 (2006).
  17. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  18. Lin, S., Kao, C. F., Yu, H. H., Huang, Y., Lee, T. Lineage analysis of Drosophila lateral antennal lobe neurons reveals notch-dependent binary temporal fate decisions. PLoS Biol. 10 (11), e1001425(2012).
  19. Zhan, X. L., et al. Analysis of Dscam diversity in regulating axon guidance in Drosophila mushroom bodies. Neuron. 43 (5), 673-686 (2004).
  20. Griffin, R., et al. The twin spot generator for differential Drosophila lineage analysis. Nat Methods. 6 (8), 600-602 (2009).
  21. Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis. Cell. 141 (3), 536-548 (2010).
  22. Lai, S. L., Lee, T. Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila. Nat Neurosci. 9 (5), 703-709 (2006).
  23. Kao, C. F., Yu, H. H., He, Y., Kao, J. C., Lee, T. Hierarchical deployment of factors regulating temporal fate in a diverse neuronal lineage of the Drosophila central brain. Neuron. 73 (4), 677-684 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Analiza linii kom rkowychneurobiologia Drosophilaekspresja flippazymikroskopia konfokalnaprotok szoku termicznegomapowanie linii neuronowychsystem znakowania mozaikowegomozaiki genetyczne

Powiązane artykuły