Artykuł metodologiczny

Otrzymywanie gigantycznych pęcherzyków otaczających mikrosfery przez odwirowanie emulsji typu woda w oleju

DOI:

10.3791/55282

⸱

24 stycznia 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Mathematical and Physical Sciences, Faculty of Science, Japan Women's University, 2Department of Bioorganization Research, Okazaki Institute for Integrative Bioscience, National Institutes of Natural Sciences, 3Department of Life and Coordination-Complex Molecular Science, Institute for Molecular Science, National Institutes of Natural Sciences, 4Research Center for Complex Systems Biology, The University of Tokyo

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gigantyczne pęcherzyki zawierające wysoko upakowane składniki o rozmiarach mikrometrów są użytecznymi modelami komórek. Metoda wirowania emulsji typu woda w oleju jest prostym, ale potężnym narzędziem do przygotowywania gigantycznych pęcherzyków z zamkniętymi materiałami.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podejście biologii konstruktywnej i biologii syntetycznej do tworzenia sztucznego życia polega na oddolnym składaniu materiałów biologicznych lub niebiologicznych. Takie podejścia spotkały się z dużym zainteresowaniem w badaniach nad granicą między materią ożywioną i nieożywioną i zostały wykorzystane do budowy sztucznych komórek w ciągu ostatnich dwóch dekad. W szczególności pęcherzyki olbrzymie (GV) były często używane jako sztuczne błony komórkowe. W artykule opisano sposób otrzymywania GV kapsułkujących wysoko upakowane mikrosfery jako model komórek zawierających wysoce skondensowane biomolekuły. GV przygotowano za pomocą prostej metody wirowania emulsji typu woda w oleju. W szczególności homogenizator użyto do emulgowania roztworu wodnego zawierającego materiały, które mają być kapsułkowane, oraz oleju zawierającego rozpuszczone fosfolipidy, a otrzymaną emulsję ostrożnie nałożono warstwami na powierzchnię innego roztworu wodnego. System warstwowy został następnie odwirowany w celu wygenerowania GV. Ta potężna metoda została wykorzystana do hermetyzacji materiałów, od małych cząsteczek po mikrosfery.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Konstruktywne lub syntetyczne podejście biologiczne jest fascynującą drogą do odkrywania granicy między materią ożywioną i nieożywioną. Ponieważ komórka jest minimalną jednostką wymaganą do życia, tak jak je obecnie rozumiemy, różni badacze próbowali skonstruować sztuczne komórki z prostych, dobrze znanych substancji chemicznych, aby można było badać zjawiska zachodzące w takich sztucznych komórkach, z ostatecznym celem wyjaśnienia początków życia i zbadania podstawowych funkcji żywych komórek1, 2,3. W szczególności pęcherzyki4, które są sferycznymi mikrokompartmentami zbudowanymi z cząsteczek amfifilowych i mogą otaczać cząsteczki biologiczne, takie jak białka5,6 i DNA7,8,9,10, były często używane jako modele błon biologicznych.

Pęcherzyki można sklasyfikować jako małe (zdefiniowane jako mające średnicę <100 nm), duże (średnica <1 μm) lub gigantyczne (średnica >1 μm). Gigantyczne pęcherzyki (GV) były szeroko badane, ponieważ są podobne do żywych komórek pod względem wielkości, kształtu i struktury. Ze względu na wielkość GV, zmiany morfologiczne w błonach GV można łatwo obserwować w czasie rzeczywistym pod mikroskopem optycznym.

Zgłoszono kilka metod przygotowania GV11, w tym metoda hydracji12,13, metoda zamrażania i rozmrażania14, metoda elektroformacji15,16, oraz metoda urządzenia fluidycznego17,18. Jednak kapsułkowanie białek i innych makrocząsteczek w GV w wysokich stężeniach za pomocą tych metod jest trudne. W szczególności niezwykle trudne jest zamknięcie materiału biologicznego w wystarczającej ilości (20-30 obj.), aby naśladować zatłoczone środowisko wewnątrz komórek19,20. Aby natychmiast utworzyć GV, Weitz i jego współpracownicy opracowali metodę wirowania emulsji metodą wody w oleju (bez o)21,22. Ta metoda ma pięć ważnych cech. Po pierwsze, ponieważ GV przygotowane tą metodą mają niską blaszkowatość23,24, ich membrany są tak cienkie, że łatwo ulegają deformacji. Badano deformację błony GV indukowaną przez FtsZ (białko podziału komórek bakteryjnych), tubulinę i inne makrocząsteczki25,26,27,28, i zaobserwowaliśmy wielościenną deformację membran GV wywołaną enkapsulacją mikrosfer29,30. Po drugie, białka błonowe mogą być wstawione do błony pęcherzykowej za pomocą tej metody, aczkolwiek z trudnością31. Na przykład grupa Yomo wykorzystała tę metodę do zbadania syntezy in vitro i aktywności porotwórczej białka błonowego α-hemolizyna32. Po trzecie, możliwe jest wygenerowanie asymetrycznych GV, w których składniki lipidowe wewnętrznych i zewnętrznych listków są różne22. Na przykład Whittenton i in. wygenerowali asymetryczne GV z lipidami kationowymi w wewnętrznej ulotce w celu enkapsulacji ujemnie naładowanych polinukleotydów oraz z neutralnymi lipidami na zewnętrznej ulotce w celu zmniejszenia toksyczności i nieswoistego wychwytu komórkowego33. Po czwarte, stężenie i udział objętościowy substancji wewnątrz GV mogą być stosunkowo wysokie28,34. Po piąte, można obudować wiele rodzajów materiałów35. Na przykład Nishimura i in. zamknęli system transkrypcji i translacji in vitro w GV i wykorzystali system do ekspresji białka zielonej fluorescencji (GFP) w GVs36. Te pięć cech sprawia, że wirowanie emulsyjne bez emulsji jest nieodzowną metodą generowania GV naśladujących komórki.

W poprzedniej pracy, GV generowane przez wirowanie były zbierane za pomocą strzykawki wyposażonej w długą igłę ze stali nierdzewnej 16 G, zawierającą część końcowego roztworu wodnego22. W rękach niedoświadczonych techników ta metoda zbierania może łatwo doprowadzić do zanieczyszczenia GV częścią oleju. W tym badaniu wykorzystaliśmy protokół wirowania emulsji bez użycia emulsji opracowany przez grupę Yomo23,37, w którym wytrącone GV są zbierane przez otwór otwarty na dnie probówki wirówkowej, w której są przygotowywane. Przygotowaliśmy GV zamykające mikrosfery 1,0 μm, które wielkością są zbliżone do organelli wewnątrzkomórkowych. Zastosowanie mikrosfer pozwoliło nam oszacować ich stężenie poprzez obliczenie ich ułamka objętościowego. Ustalenie metody przygotowania GV, w której materiały są gęsto upakowane, jest ważnym krokiem w tworzeniu sztucznych komórek. Aby potwierdzić użyteczność naszego protokołu dla różnych rodzajów materiałów wewnętrznych, wykazaliśmy również, że GFP i mała rozpuszczalna w wodzie cząsteczka fluorescencyjna (uranina) mogą być zamknięte w GV.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie GV metodą wirowania emulsji bez użycia

  1. Przygotować roztwór podstawowy 1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfocholiny (DOPC, 25 mM) i roztworu podstawowego 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-fosfoetanoloaminy, sól trietyloamoniową Texas Red (Texas Red DHPE, 0,20 mM) w chloroformie i przechowywać roztwory podstawowe w temperaturze -20 °C.
  2. Przygotuj roztwór oleju.
    1. Utworzyć film lipidowy na wewnętrznej powierzchni szklanej fiolki o pojemności 5 ml poprzez odparowanie mieszaniny roztworu podstawowego DOPC (51,0 μl i roztworu podstawowego Texas Red DHPE (19,2 μl) pod przepływającym azotem.
    2. Inkubować film pod zmniejszonym ciśnieniem przez noc, a następnie dodać 1,0 ml płynnej parafiny (0,86-0,89 g/cm3) do fiolki. Owinąć fiolkę w folię aluminiową i inkubować w temperaturze 80 °C O/N w spoczynku. Końcowe stężenia DOPC i Texas Red DHPE wynoszą odpowiednio 1,3 i 3,8 x 10−3 mM, a stosunek molowy DOPC:Texas Red DHPE wynosi 100:0,3.
  3. Przygotować wewnętrzną dyspersję wodną.
    1. W mikroprobówce z pokrywką o pojemności 1,5 ml wymieszać 237,5 μl dyspersji mikrosfer niefluorescencyjnych 1,0 μm (2,5% obj.) i 12,5 μl dyspersji mikrosfer fluorescencyjnych 1,0 μm (2,5 obj.); odpowiada to stosunkowi 95:5 (v/v) mikrosfer niefluorescencyjnych do fluorescencyjnych.
    2. Dodać 64 mg sacharozy, a następnie 125 μl roztworu buforowanego trisem (TBS, 1 M) i 875 μl wody dejonizowanej. Końcowy udział objętościowy mikrosfer wynosi 0,5% obj., a końcowe stężenia Tris-HCl (pH 7,5) i sacharozy wynoszą odpowiednio 0,1 i 0,15 M.
    3. Wirować mikroprobówkę przez 30 sekund, a następnie poddawać ją sonifikacji przez 10 minut.
  4. Przygotować zewnętrzny roztwór wodny.
    1. Po przygotowaniu 10 ml roztworu buforowanego Tris (0,1 M Tris-HCl [pH 7,5], 0,15 M glukozy) w tej samej procedurze, co wewnętrzne podłoże wodne, umieścić 1 ml roztworu w mikroprobówce o pojemności 1,5 ml z pokrywką. Wirować mikroprobówkę przez 30 sekund, a następnie poddawać ją sonifikacji przez 10 minut.
  5. Przygotować emulsję bez mikrosfer.
    1. Zmieszać 1 ml roztworu oleju (ciekła parafina zawierająca DOPC i Texas Red DHPE) z 300 μl wewnętrznego roztworu wodnego w mikroprobówce o pojemności 1,5 ml.
    2. Emulgować dwa składniki w mikroprobówce za pomocą homogenizatora mechanicznego (mieszadła z łopatkami, które obracają się z dużą prędkością) pracującego z prędkością 10 000 obr./min przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
  6. Wytrącić GV.
    1. Delikatnie nałożyć 300 μl emulsji bez użycia na górną powierzchnię 1 ml zewnętrznego roztworu wodnego w temperaturze 4 °C w mikroprobówce o pojemności 1,5 ml z pokrywką. Schłodzić mikroprobówkę przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  7. Zbierz GV.
    1. Natychmiast po schłodzeniu mikroprobówki należy ją odwirować przy 18 000 x g przez 30 minut. Wytrącone GV należy uzyskać, przekłuwając dno mikroprobówki pinezką i zbierając jedną kroplę do wysterylizowanej mikroprobówki o pojemności 1,5 ml.
    2. Rozcieńczyć wytrąconą kroplę GV 10-100 razy objętościowo zewnętrznym roztworem wodnym, jeśli otrzymane GV są otrzymywane w ilościach wystarczająco dużych, aby utrudnić obserwację.

2. Obserwacja mikroskopowa GV

  1. Przygotuj próbkę mikroskopową.
    1. Umieść adhezyjną komorę inkubacyjną do łańcuchowej reakcji polimerazy in situ i hybrydyzacji (rozmiar komory 9 mm x 9 mm x 0,3 mm grubości) na wierzchu szkła nakrywkowego mikroskopu.
    2. Za pomocą mikropipety nanieść 25 μl rozcieńczonych, wytrąconych GV na powierzchnię próbki i natychmiast umieścić kolejne szkło nakrywkowe (o grubości około 0,15 mm) na wierzchu komory inkubacyjnej.
  2. Rejestruj obrazy z mikroskopii kontrastowej interferencji różnicowej GV.
    1. Rejestruj obrazy mikroskopowe pęcherzyków za pomocą mikroskopu (obiektywy 10X, 20X i 40X) wyposażonego w lampę halogenową 12V100WHAL-L.
  3. Przeprowadzanie obserwacji mikroskopią fluorescencyjną.
    1. Włóż lustrzane zwierciadła fluorescencyjne U-FBNA i U-FMCHE do mikroskopu. Wyposaż jednostki odpowiednio w filtry wzbudzenia 470-495 nm i 565-585 nm oraz w filtry emisyjne, które przepuszczają światło odpowiednio 510-550 nm i 600-690 nm.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metoda wirowania emulsji bez użycia emulsji jest zilustrowana fotograficznie i schematycznie na rysunku 1. Schematyczny obraz na rysunku 1 sugeruje, że najważniejszym wyznacznikiem sukcesu tej metody jest to, że ciężar właściwy wewnętrznego roztworu wodnego musi być większy niż ciężar właściwy zewnętrznego roztworu wodnego, tak aby GV wytrąciły się podczas wirowania. Ponadto wytworzenie monowarstwy lipidowej na granicy faz wymaga schładzania systemu przez 10 minut po nałożeniu emulsji na zewnętrzny roztwór wodny. Ponieważ GV powstają w wyniku przenoszenia kropelek emulsji przez granicę faz bez wyjścia, ciśnienia osmotyczne w wewnętrznej i zewnętrznej warstwie wodnej muszą być takie same. W ramach eksperymentu kontrolnego przygotowaliśmy również GV niezawierające mikrosfer za pomocą procesu pokazanego na rysunku 1 i kroku 1.3, z wyjątkiem tego, że wewnętrzny roztwór wodny przygotowano bez mikrosfer.

Zbiór wytrąconych GV po odwirowaniu pokazano na rysunku 2. Oprócz fazy półprzezroczystej na samym dnie mikroprobówki, zaobserwowaliśmy również białą, mętną fazę pośrednią w zewnętrznym roztworze wodnym (ryc. 2a). Ta faza pośrednia była bogata w agregacje mikrosfer i ropy, podczas gdy faza dolna zawierała GV. Dlatego po przebiciu dna mikroprobówki pinezką (Rysunek 2b), zebraliśmy tylko pierwszą kroplę (Rysunek 2c), która zawierała ogromne ilości GV. Ważne jest, aby upewnić się, że zebrano nie więcej niż dwie krople; wszelkie dodatkowe krople mogą zawierać agregacje mikrosfer i lipidów, co spowoduje zmniejszenie gęstości GV. Uzyskana dyspersja pęcherzykowa często zawierała zamknięte w kapsułkach materiały na zewnątrz GV, ponieważ GV często pękają podczas wirowania. Aby uzyskać tylko GV, należy wybrać metodę sortowania, taką jak dializa, filtracja żelowa lub sortowanie komórek aktywowane fluorescencją, ze względu na rozmiary materiałów kapsułkujących. Jeżeli jest to konieczne do celów, do których mają być użyte wytrącone GV, można je rozcieńczyć zewnętrznym roztworem wodnym. W niektórych przypadkach faza pośrednia rozciągała się na dno rurki, co sugeruje, że wszelkie pęcherzyki, które się utworzyły, były utrzymywane razem przez olej.

Uzyskaliśmy obrazy z mikroskopii interferencyjnej różnicowej i mikroskopii fluorescencyjnej GV bez mikrosfer (Rysunek 3a, 3b) i z mikrosferami (Rysunek 3c-3 f). Zgodnie z poprzednimi raportami23,37, GV o niskiej blaszkowatości zostały utworzone przez nasz protokół. Lipidy sprzężone z Texas Red DHPE, który emituje czerwoną fluorescencję, zostały użyte, aby można było bezpośrednio potwierdzić tworzenie pęcherzyków poprzez wizualizację cienkiej błony. Spośród 160 GV, które uzyskaliśmy, 55 zamkniętych mikrosfer i 105 było pustych, co daje współczynnik enkapsulacji wynoszący 34%.

Określiliśmy udział objętościowy (φ, % obj. %) mikrosfer w GV za pomocą następującej metody. Ponieważ każdy GV zawiera od kilkudziesięciu do kilkuset mikrosfer, zliczenie wszystkich mikrosfer pod mikroskopem optycznym jest wyzwaniem. Dlatego zmieszaliśmy niefluorescencyjne mikrosfery 1,0 μm z niewielką ilością mikrosfer fluorescencyjnych, które zostały ręcznie zliczone pod mikroskopem fluorescencyjnym. Całkowitą liczbę (N) mikrosfer zamkniętych w kapsułkach obliczono poprzez pomnożenie liczby (n) ręcznie zliczonych mikrosfer fluorescencyjnych przez 20 (w oparciu o oryginalny stosunek 95:5 [v/v] mikrosfer niefluorescencyjnych do fluorescencyjnych). Wartość φ oszacowano wówczas jako Nv100/V, gdzie v to objętość mikrosfer, a V to objętość pojedynczej GV. Należy zauważyć, że oszacowanie N na podstawie n powoduje błędy liczenia, które muszą być brane pod uwagę przy obliczaniu φ. Wartość φ została oszacowana na podstawie N, która została bezpośrednio obliczona jako 20n, a to z kolei spowodowało, że prawdopodobieństwo, że φ dokładnie odzwierciedla rzeczywistą wartość, wynosi <50%. W rzeczywistości N waha się do pewnego stopnia wokół 20n, więc musimy traktować je jako 20(n ±i), gdzie i jest błędem w n. Oszacowaliśmy i, aby prawdopodobieństwo n ±i mogło być większe niż 50% uzyskane na podstawie rozkładu Poissona. Oszacowaliśmy i, co z kolei pozwoliło nam obliczyć 20(n ± i) oraz wartości φ, które uwzględniały błędy zliczania dla GV o średnicach 10 i 15 μm (tab. 1). Zgodnie z tą procedurą udział objętościowy mikrosfer w GV pokazanym na rysunku 3c oszacowano na 11 ±3 % obj. Precyzja obliczonego ułamka objętościowego wynosiła 10-30%.

Nasze wyniki wskazują, że udało nam się obudować mikrosfery 1 μm w GV przy dużej frakcji objętościowej. Byliśmy również w stanie zakapsułkować inne materiały w 100% DOPC GV przy użyciu tego samego zewnętrznego roztworu wodnego i tego samego protokołu (Rysunek 4). W szczególności GV zawierające mikrosfery 0,1 μm przygotowano z roztworu buforowanego Tris zawierającego 0,1 M Tris-HCl (pH 7,5), 0,15 M sacharozy i 0,5% obj. mikrosfer fluorescencyjnych za pomocą protokołu opisanego dla GV zawierających mikrosfery 1,0 μm (Rysunek 4a). Zgodnie z protokołem opisanym powyżej, DOPC GV zawierające GFP (0,1 M Tris-HCl [pH 7,5], 0,15 M sacharozy i 100 μg/ml GFP; Rysunek 4b) oraz GV zawierające uraninę (0,1 M Tris-HCl [pH 7,5], 0,15 M sacharozy i 30 μM uraniny; Rysunek 4c) zostały również przygotowane.

nNφ (średnica 10 μm)φ (średnica 15 μm)
360 ± 206.0 ± 2.01,8 ± 0,6
480 ± 208.0 ± 2.02,4 ± 0,6
5100 ± 2010 ± 23,0 ± 0,6
6od 120 ± 3012 ± 43,6 ± 1,2
10200 ± 3220 ± 35,9 ± 0,9
20400 ± 4540 ± 512 ± 2
Rozdział 30600 ± 55-18 ± 2
a Błędy zostały określone zgodnie z opisem w tekście; n = liczba ręcznie policzonych mikrosfer; N = całkowita liczba zamkniętych mikrosfer.

Tabela 1: Liczby i ułamki objętościowe (φ, objętościowe%) mikrosfera. a Błędy zostały określone zgodnie z opisem w tekście; n = liczba ręcznie policzonych mikrosfer; N = całkowita liczba zamkniętych mikrosfer.

figure-results-1
Rysunek 1: Schemat blokowy i schematyczne przedstawienie metody wirowania emulsji bez wyjścia. a) Roztwór oleju składający się z DOPC i Texas Red DHPE (stosunek molowy 100:0,3) w ciekłej parafinie. b) Wewnętrzna dyspersja wodna składająca się z sacharozy i mikrosfer w buforze Tris-HCl. c) Zewnętrzny roztwór wodny składający się z glukozy w buforze tris-HCl. d) Mieszanina 1 ml roztworu oleju i 300 μl wewnętrznej dyspersji wodnej. (e) Emulgowanie homogenizatorem (10 000 obr./min, 2 min). f) Emulsja bez w/o. g) Nawarstwianie 300 μl emulsji na 1 ml zewnętrznego roztworu wodnego. h) Wytrącone GV bezpośrednio po odwirowaniu. (i) Schematyczne przedstawienie zasady działania metody wirowania emulsyjnego bez użycia emulsji. strzałka wskazuje kierunek przyspieszenia odśrodkowego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Przekłucie mikrorurki. a) Wytrącone GV bezpośrednio po odwirowaniu (również przedstawione na rysunku 1h). Czerwona elipsa oznacza kroplę wytrąconej dyspersji GV. (b) Przekłucie mikrorurki pinezką. Granulat zawierający GV uzyskano poprzez przekłucie mikrorurki w pobliżu dna pinezką i zebranie kropelek z otworu. c) Kropla wytrąconych GV (oznaczona żółtą strzałką) rozcieńczona zewnętrznym roztworem wodnym. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Obrazy mikroskopowe GV. (a) Obraz z mikroskopii kontrastowej interferencji różnicowej GV bez mikrosfer. Średnica GV wynosiła około 10 μm. Podziałka = 10 μm. (b) Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej GV bez mikrosfer. Czerwona fluorescencja została wyemitowana przez Texas Red DHPE. (c) Obraz z mikroskopii kontrastowej interferencji różnicowej GV zawierającej mikrosfery. (d) Obraz mikroskopii fluorescencyjnej mikrosfer 1,0 μm (mikrosfery karboksylowe YG) wewnątrz GV. Liczba zliczonych mikrosfer fluorescencyjnych (n) wynosiła 6. Oszacowaliśmy błędy (i = 2) na podstawie rozkładu Poissona. Następnie oszacowaliśmy całkowitą liczbę mikrosfer wewnętrznych (N = 20 (n ±i)) na 120 ±40. Obliczono, że GV zawiera 1,0 μm mikrosfer o ułamku objętościowym (φ = Nv100/V) wynoszącym około 11 ± 3 vol%, gdzie v jest objętością mikrosfer, a V jest objętością GV. (e) Obraz membrany GV z mikroskopii fluorescencyjnej. Czerwona fluorescencja została wyemitowana przez Texas Red DHPE. (f) Scalony obraz obrazów w panelach d i e. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Obrazy z mikroskopii interferencyjnej i fluorescencyjnej GV z różnymi materiałami zamkniętymi. Obrazowanie z mikroskopii kontrastowej interferencyjnej różnicowej (na górze) i mikroskopii fluorescencyjnej (na dole) GV zawierających (a) mikrosfery 0,1 μm, (b) GFP i (c) uraninę. Podziałka = 10 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ciężar właściwy wewnętrznego wodnego podłoża dyspersyjnego i zewnętrznego roztworu wodnego musi być starannie dobrany. Aby emulsja bez o mogła wytrącić się do zewnętrznego roztworu wodnego podczas wirowania, ciężar właściwy wewnętrznego wodnego ośrodka dyspersyjnego musi być większy niż ciężar właściwy zewnętrznego roztworu wodnego. Próbowaliśmy przygotować GV przy użyciu roztworów wewnętrznych i zewnętrznych bez cukrów, ale nie uzyskaliśmy GV w tych warunkach, ponieważ wewnętrzny roztwór wodny nie miał wystarczającej masy, aby przejść przez interferencję między dwiema fazami. Jeśli między tymi dwoma roztworami występuje duża różnica ciśnień osmotycznych, GV, które wytrącają się w zewnętrznym roztworze wodnym, mogą się skurczyć lub pęknąć. Dlatego ciśnienie osmotyczne wewnątrz i na zewnątrz GV musi być równe. Aby to osiągnąć, użyliśmy sacharozy jako substancji rozpuszczonej w wewnętrznej dyspersji wodnej i glukozy jako substancji rozpuszczonej w zewnętrznym roztworze wodnym; Oba cukry były w tym samym stężeniu. Do takich celów używano zarówno soli22, jak i cukru 23,35,38, ale zwykle stosuje się cukier, ponieważ jest mniej toksyczny i lepiej rozpuszczalny niż sól. Jeśli jednak doda się zbyt dużo cukru, GV mogą zetknąć się z dnem szkła nakrywkowego i zapaść się. Istnieje kilka strategii, aby tego uniknąć. Jedną ze strategii jest zmniejszenie różnicy ciężaru właściwego między wewnętrznymi i zewnętrznymi roztworami wodnymi, tak aby GV wytrącały się w łagodnych warunkach; w szczególności supernatant wytrąconej dyspersji GV może być wymieniony na roztwór, który jest identyczny z wewnętrznym roztworem wodnym, aby zmniejszyć możliwość pęknięcia pęcherzyków przez przyleganie do szkła nakrywkowego w wyniku wyporu. Inną strategią jest wstępne pokrycie obu szkieł nakrywkowych cienką warstwą lipidową29.

Ważne jest odpowiednie przygotowanie i inkubacja emulsji. Do przygotowania roztworu olejowego użyliśmy ciekłej parafiny. Olej mineralny26,31, dodekan21,33 i skwalan33,39 są również często stosowane jako oleje rozpuszczalnikowe. Ponieważ materiały te różnią się ciężarem właściwym, lepkością i napięciem powierzchniowym, tworzy się różna liczba pęcherzyków, nawet gdy stosuje się te same warunki wirowania33. Aby uzyskać pęcherzyki o docelowych właściwościach, konieczne jest zoptymalizowanie ciężaru właściwego i lepkości wewnętrznych i zewnętrznych roztworów wodnych, a także przyspieszenia odśrodkowego. W celu przygotowania fazy olejowej inkubacja musi odbywać się w wysokiej temperaturze i w suchym środowisku, takim jak inkubator lub odwadniacz. W tym badaniu podgrzaliśmy ciekłą parafinę do 80 °C, aby całkowicie rozpuścić cząsteczki lipidów. Ponadto emulsja powinna być przygotowywana tylko w razie potrzeby i powinna być natychmiast poddana wirowaniu, ponieważ jest niestabilna zaraz po przygotowaniu, a kropelki bez kropelek łatwo łączą się ze sobą. Emulsję można przygotować w dużych ilościach przez sonikację, wirowanie lub stukanie. Jednak zastosowanie homogenizatora pozwala na szybkie przygotowanie dużych ilości emulsji i łatwiejszą emulgację w oleju o dużej lepkości. Ważne jest również, aby emulsja była delikatnie i szybko nakładana warstwami na zewnętrzny roztwór wodny, a następnie schładzana w temperaturze 4 °C. Aby skrócić czas między emulgacją a wirowaniem, system zewnętrznego roztworu wodnego oleju może być wstępnie schładzony przed nałożeniem na niego warstwy emulsji, a następnie cały system można natychmiast odwirować. Jeśli białe zmętnienie pojawia się szybciej lub wolniej niż zwykle, homogenizator mechaniczny należy dokładnie wypłukać w celu usunięcia detergentów czyszczących. Ponadto przed emulgacją roztwór oleju, wewnętrzny roztwór wodny i emulgator należy przywrócić do temperatury pokojowej.

Ważne jest również odpowiednie przyspieszenie odśrodkowe. Wirując przy 18 000 x g, byliśmy w stanie przygotować GV z pojedynczym materiałem wewnętrznym zamkniętym w kapsułkach w wysokim stężeniu. Gdy wymagana jest hermetyzacja wielu materiałów, lepiej jest zmniejszyć przyspieszenie odśrodkowe. Na przykład system składania aktyny zawierający siedem związków uzyskano przy odwirowaniu przy stężeniach poniżej 350 x g35. W przypadkach, w których odwirowanie jest niepożądane, GV można uzyskać poprzez dostosowanie stężenia cukru lub wytrącanie emulsji pod wpływem jej własnej masy 38,40,41.

Opisana w niniejszym dokumencie metoda ma dwa główne ograniczenia. Jednym z nich jest to, że cząsteczki oleju (w tym przypadku parafiny) mogą być rozpuszczane w błonie GV, jak wskazała grupaWeitza 21. Gdy pożądane jest wprowadzenie białka błonowego do błony GV, należy wziąć pod uwagę wpływ współistniejących cząsteczek oleju na białko. Drugim ograniczeniem jest zmienność ułamka objętościowego. W tym badaniu oszacowaliśmy, że frakcje objętościowe mikrosfer w GV wahały się od 4 do 30% obj.; frakcje objętościowe nie były identyczne z frakcją objętościową wewnętrznego roztworu wodnego użytego do przygotowania GV. Chociaż udało nam się zamknąć mikrosfery w GV przy ułamku objętościowym wystarczająco wysokim do obserwacji mikroskopowej, metoda ta nie nadaje się do przygotowania GV o jednolitym rozkładzie frakcji objętościowej. Doniesiono, że rozkład frakcji objętościowych mikrosfery zmienia się podczas wirowania34.

Metoda wirowania emulsyjnego bez użycia emulsji jest powszechnie stosowana do tworzenia GV zawierających materiały zamknięte. Jednak niewiele doniesień opisywało przygotowanie GV zawierających materiały w mikroskali34,42. Ostatnio skonstruowano roboty molekularne zawierające zamknięte w kapsułkach urządzenie DNA lub urządzenie molekularne 43,44. GV z komorami są pierwszym wyborem do tego rodzaju zastosowań; W związku z tym można się spodziewać, że techniki takie jak nasza, które mogą być wykorzystane do hermetyzacji mikrosfer magnetycznych i mikrosfer o zróżnicowanej funkcjonalizacji powierzchni, okażą się użyteczne44.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Tomoko Yamaguchi za narysowanie schematycznego obrazu na rysunku 1. Badanie to było wspierane przez projekt Okazaki ORION Instytutu Integracyjnej Nauk Biologicznych Okazaki Narodowych Instytutów Nauk Przyrodniczych (NINS); w ramach projektu Centrum Astrobiologii (nr AB281010) numerów NINS; w ramach grantu Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Dynamiczne porządkowanie układów biomolekularnych w celu tworzenia zintegrowanych funkcji) (nr 25102008) przyznanego przez Japońskie Towarzystwo Promocji Nauki (JSPS); w ramach grantu dla młodych naukowców (B) (dla K.K., nr 15K17850) z JSPS; oraz dotację na rozpoczęcie działalności badawczej (dla Y.N., nr 15H06653) od JSPS. Dodatkowego wsparcia udzielił grant z Instytutu Noguchi, grant z Kao Foundation for Arts and Sciences oraz grant z Kurita Water and Environment Foundation.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
< SILNE>ODCZYNNIKI:
1,2-Dioleoiloilo-sn-glicero-3-fosfocholina (DOPC)Avanti Polar Lipids850375CCząsteczka błony pęcherzykowej
Texas Red 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-fosphoethanolamine, sól trietyloamonowa (Texas Red DHPE)Thermo Fisher ScientificT1395MP
1 M Tris-HCl (pH 7,5)Nippon Gene Co.318-90225Roztwór buforowy
D(+)-glukozaWako Pure Chemical Industries049-31165Do zewnętrznego roztworu wodnego
SacharozaWako Pure Chemical Industries196-00015Do wewnętrznego roztworu wodnego
Mikrosfery karboksylowe Polybead 1,0 i mikro; mPolysciences08226-15Niefluorescencyjny, 2R = 1,0 &mikro; m
Mikrosfery karboksylowe Fluoresbrite YG 1,0 i mikro; mPolysciences15702-10Fluorescencyjny, 2R = 1,0 &mikro; m
Mikrosfery karboksylowe Fluoresbrite YG 0,10 i mikro; mPolysciences16662-10Fluorescencyjny, 2R = 0,10 &mikro; m
Sól sodowa fluoresceiny (uranina)Sigma Aldrich JapanF6377-100G
GFP standard (rekombinowany)Vector LaboratoriesMB-0752
NazwaFirmaNumer katalogowyUwagi
>SPRZĘT:
Wirówka 5427REppendorf 5409000233Wirnik wirówki: FA-45-48-11
PhyscotronMicrotec Co.NS-310EIIIPoręczny mikrohomogenizator
Wał generatora MicrotecCo.Przystawka do homogenizatoraNS-4
Komory inkubacyjne Frame-Seal do in situ PCR i hybrydyzacjiBio-Rad LaboratoriesSLF0201Objętość komory hybrydyzacyjnej: 25 i mikro; L
Wielkość komory: 9 i razy; 9 i razy; Komory
inkubacyjne 0,3 mm Frame-Seal do in situ PCR i hybrydyzacjiBio-Rad LaboratoriesSLF0601Objętość komory hybrydyzacyjnej: 65 &mikro; L                   
Wielkość komory: 15 i razy; 15 i razy;
Pipeta Microman EGilsonFD100060,3 mm do lepkiej cieczy. Za pomocą tego zmierzyliśmy ciekłą parafinę.
Mikroskop odwróconyOlympus Co.IX73
LusterkoOlympus Co.U-FBNA: 470 - 495 nm
Filtr emisyjny: 510 - 550 nm
Jednostka lustrzanaOlympus Co.U-FMCHE: 565 - 585 nm
Filtr emisyjny: 600 - 690 nm
Filtr wzbudzenia Filtr wzbudzenia

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Luisi, P. L. The emergence of life: from chemical origins to synthetic biology. , Cambridge University Press. (2006).
  2. Luisi, P. L., Stano, P. The minimal cell: the biophysics of cell compartment and the origin of cell. , Springer. (2011).
  3. Rasmussen, S., et al. Protocells: Bridging nonliving and living matter. , The MIT Press. (2008).
  4. Luisi, P. L., Walde, P. Giant vesicles: perspectives in supramolecular chemistry. , Wiley-Interscience. (2000).
  5. Kita, H., et al. Replication of genetic information with self-encoded replicase in liposomes. Chem Bio Chem. 9 (15), 2403-2410 (2008).
  6. Nomura, S. M., et al. Gene expression within cell-sized lipid vesicles. Chem Bio Chem. 4 (11), 1172-1175 (2003).
  7. Oberholzer, T., Albrizio, M., Luisi, P. L. Polymerase chain reaction in liposome. Chem Biol. 2 (10), 677-682 (1995).
  8. Shohda, K., et al. Compartment size dependence of performance of polymerase chain reaction inside giant vesicle. Soft Matter. 7 (8), 3750-3753 (2011).
  9. Kurihara, K., et al. Self-reproduction of supramolecular giant vesicles combined with the amplification of encapsulated DNA. Nat Chem. 3 (10), 775-781 (2011).
  10. Kurihara, K., et al. A recursive vesicle-based model protocell with a primitive model cell cycle. Nat Comm. 6, 8352(2015).
  11. Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant vesicles: preparations and applications. Chem Bio Chem. 11 (7), 848-865 (2010).
  12. Reeves, J. P., Dowben, R. M. Formation and properties of thin-walled phospholipid Vesicles. J Cell Physiol. 73 (1), 49-60 (1969).
  13. Needham, D., Evans, E. Structure and mechanical properties of giant lipid (DMPC) vesicle bilayers from 20 °C below to 10 °C above the liquid crystal-crystalline phase transition at 24 °C. Biochemistry. 27 (21), 8261-8269 (1988).
  14. Oku, N., MacDonald, R. C. Differential effects of alkali metal chlorides on formation of giant liposomes by freezing and thawing and by dialysis. Biochemistry. 22 (4), 855-863 (1983).
  15. Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Far Disc Chem Soc. 81, 303-311 (1986).
  16. Dimitrov, D. S., Angelova, M. I. Lipid swelling and liposome formation on solid surfaces in external electric fields. New Trends Coll Sci. 73, 48-56 (1987).
  17. Funakoshi, K., Suzuki, H., Takeuchi, S. Formation of giant lipid vesicle like compartments from a planar lipid membrane by a pulsed jet flow. J Am Chem Soc. 129 (42), 12608-12609 (2007).
  18. Stachowiak, J. C., et al. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (12), 4697-4702 (2008).
  19. Ellis, R. J. Macromolecular crowding: obvious but underappreciated. Trends Biochem Sci. 26 (10), 597-604 (2001).
  20. Ellis, R. J., Minton, A. P. Cell biology: join the crowd. Nature. 425 (6953), 27-28 (2003).
  21. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
  22. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Engineering asymmetric vesicles. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (19), 10718-10721 (2003).
  23. Nishimura, K., et al. Population analysis of structural properties of giant liposomes by flow cytometry. Langmuir. 25 (18), 10439-10443 (2009).
  24. Chiba, M., Miyazaki, M., Ishiwata, S. Quantitative analysis of the lamellarity of giant liposomes prepared by the inverted emulsion method. Biophys J. 107 (2), 346-354 (2014).
  25. Cabré, E. J., et al. Bacterial division proteins FtsZ and ZipA induce vesicle shrinkage and cell membrane invagination. J Biol Chem. 288, 26625-26634 (2013).
  26. Osawa, M., Erickson, H. P. Liposome division by a simple bacterial division machinery. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (27), 11000-11004 (2013).
  27. Hayashi, M., et al. Reversible morphological control of tubulin-encapsulating giant liposomes by hydrostatic pressure. Langmuir. 32 (15), 3794-3802 (2016).
  28. Terasawa, H., Nishimura, K., Suzuki, H., Matsuura, T., Yomo, T. Coupling of the fusion and budding of giant phospholipid vesicles containing macromolecules. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (16), 5942-5947 (2012).
  29. Natsume, Y., Toyota, T. Asymmetrical polyhedral configuration of giant vesicles induced by orderly array of encapsulated colloidal particles. PLOS ONE. 11 (1), e0146683(2016).
  30. Natsume, Y., Toyota, T. Appearance of crystalline pattern for colloidal particles encapsulated in giant vesicles: direct cross-sectional observation of ordered and disordered phases. Trans Mater Res Soc Jpn. 41 (2), 147-149 (2016).
  31. Noireaux, V., Libchaber, A. A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (51), 17669-17674 (2004).
  32. Fujii, S., Matsuura, T., Sunami, T., Kazuta, Y., Yomo, T. In vitro evolution of α-hemolysin using a liposome display. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (42), 16796-16801 (2013).
  33. Whittenton, J., et al. Evaluation of asymmetric liposomal nanoparticles for encapsulation of polynucleotides. Langmuir. 24 (16), 8533-8540 (2008).
  34. Natsume, Y., Toyota, T. Giant vesicles containing microspheres with high volume fraction prepared by water-in-oil emulsion centrifugation. Chem Lett. 42 (3), 295-297 (2013).
  35. Pontani, L. L., et al. Reconstitution of an actin cortex inside a liposome. Biophys J. 96 (1), 192-198 (2009).
  36. Nishimura, K., et al. Cell-free protein synthesis inside giant unilamellar vesicles analyzed by flow cytometry. Langmuir. 28 (22), 8426-8432 (2012).
  37. Fujii, S., Matsuura, T., Sunami, T., Nishikawa, T., Kazuta, Y., Yomo, T. Liposome display for in vitro selection and evolution of membrane proteins. Nat Protoco. 9 (7), 1578-1591 (2014).
  38. Hamada, T., et al. Construction of asymmetric cell-sized lipid vesicles from lipid-coated water-in-oil microdroplets. J Phys Chem B. 112 (47), 14678-14681 (2008).
  39. Levine, R. M., Pearce, T. R., Adil, M., Kokkoli, E. Preparation and characterization of liposome-encapsulated plasmid DNA for gene delivery. Langmuir. 29 (29), 9208-9215 (2013).
  40. Saito, H., et al. Time-resolved tracking of a minimum gene expression system reconstituted in giant liposomes. ChemBioChem. 10 (10), 1640-1643 (2009).
  41. Yanagisawa, M., Iwamoto, M., Kato, A., Yoshikawa, K., Oiki, S. Oriented reconstitution of a membrane protein in a giant unilamellar vesicle: experimental verification with the potassium channel KcsA. J Am Chem Soc. 133 (30), 11774-11779 (2011).
  42. Saito, A. C., Ogura, T., Fujiwara, K., Murata, S., Nomura, S. M. Introducing micrometer-sized artificial objects into live cells: a method for cell-giant unilamellar vesicle electrofusion. PLOS ONE. 9 (9), e106853(2014).
  43. Murata, S., Konagaya, A., Kobayashi, S., Saito, H., Hagiya, M. Molecular robotics: a new paradigm for artifacts. New Gener Comput. 31 (1), 27-45 (2013).
  44. Hagiya, M., Konagaya, A., Kobayashi, S., Saito, H., Murata, S. Molecular robots with sensors and intelligence. Acc Chem Res. 47 (6), 1681-1690 (2014).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Metoda odwirowywaniaenkapsulacja mikrosferb ona lipidowa DOPCroztw r buforowy Trismikroskopia fluorescencyjnar nicowa mikroskopia interferencyjnacytometria przep ywowabiologia syntetyczna

Powiązane artykuły