Opisane tutaj protokoły pozwalają na badanie właściwości elektrycznych komórek pobudliwych w najbardziej nieinwazyjnych warunkach fizjologicznych poprzez wykorzystanie zarodków danio pręgowanego w systemie in vivo wraz z genetycznie kodowanym wskaźnikiem napięcia (GEVI) opartym na rezonansie fluorescencyjnym (FRET), selektywnie wyrażanym w interesującym typie komórki.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Biodetekcja potencjału błonowego neuronu ruchowego w żywych zarodkach danio pręgowanego
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Opisane tutaj protokoły są zaprojektowane tak, aby umożliwić badaczom badanie komunikacji komórkowej bez zmiany integralności środowiska, w którym komórki się znajdują. W szczególności zostały one opracowane do analizy aktywności elektrycznej komórek pobudliwych, takich jak neurony rdzeniowe. W takim scenariuszu kluczowe znaczenie ma zachowanie integralności komórki rdzenia, ale ważne jest również zachowanie anatomii i fizjologicznego kształtu zaangażowanych układów. Rzeczywiście, zrozumienie sposobu, w jaki działa układ nerwowy – i inne złożone systemy – musi opierać się na podejściu systemowym. Z tego powodu jako system modelowy wybrano żywy zarodek danio pręgowanego, a zmiany napięcia błony neuronu rdzeniowego oceniono bez ingerencji w warunki fizjologiczne zarodków.
Tutaj opisane jest podejście łączące wykorzystanie embrionów danio pręgowanego z biosensorem opartym na FRET. Zarodki danio pręgowanego charakteryzują się bardzo uproszczonym układem nerwowym i dzięki swojej przezroczystości nadają się szczególnie do zastosowań obrazowych, co pozwala na zastosowanie fluorescencyjnych wskaźników napięcia na błonie plazmatycznej podczas rozwoju danio pręgowanego. Synergia między tymi dwoma składnikami umożliwia analizę aktywności elektrycznej komórek w nienaruszonych organizmach żywych, bez zaburzania stanu fizjologicznego. Wreszcie, to nieinwazyjne podejście może współistnieć z innymi analizami (np. nagraniami spontanicznych ruchów, jak pokazano tutaj).
Wprowadzenie
Analiza komponentów systemowych in vivo pozwala naukowcom badać zachowanie komórek w najbardziej wiarygodny sposób. Jest to szczególnie prawdziwe, gdy badana aktywność jest silnie uzależniona od interakcji komórka-komórka (zarówno zależnej od kontaktu, jak i niezależnej), jak w układzie nerwowym, gdzie zmiany napięcia błonowego napędzają komunikację między pobudliwymi komórkami. Zrozumienie informacji zakodowanych przez te sygnały elektryczne jest kluczem do zrozumienia sposobu, w jaki działa układ nerwowy zarówno w stanach fizjologicznych, jak i chorobowych.
W celu zbadania właściwości elektrycznych komórek w najbardziej nieinwazy....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. pHuC_Mermaid Generacja plazmidu
UWAGA: Syrenka to biosensor opracowany przez sparowanie domeny wykrywania napięcia (VSD) jelita Ciona intestinalis (obecnie Ciona robusta)5 czujnik napięcia zawierający fosfatazę (Ci-VSP) z fluoroforami partnerskimi FRET Umi-Kinoko Green (mUKG: donor) i monomeryczną wersją emitującego pomarańczowo białka fluorescencyjnego Kusabira Orange (mKOk: akceptor). W przypadku tego biosensora zmiany konformacyjne domeny VSD, wywołane depolaryzacją błony, zwiększają bliskość białek fluorescencyjnych donora i akceptora, zwiększając w ten sposób transfer energii między n....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Wektor ekspresyjny zawierający sekwencję kodującą biosensor Mermaid oparty na technice FRET pod kontrolą panneuronalnego promotora pHuC, który kieruje syntezę białka wyłącznie w układzie nerwowym, wprowadzono do pojedynczych zapłodnionych jaj metodą mikroiniekcji w celu uzyskania przejściowych embrionów transgenicznych (Rysunek 1, lewy panel). Po opanowaniu techniki mikroiniekcji odsetek embrionów Mermaid-dodatnich wynosił blisko 100%. spośród nich do ana.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przedstawiony tutaj protokół pozwolił nam zbadać związek między właściwościami elektrycznymi neuronów ruchowych rdzenia kręgowego danio pręgowanego a spontanicznym zwijaniem, najwcześniejszą stereotypową aktywnością motoryczną, która pojawia się około 17 hpf rozwoju embrionalnego i trwa do 24 hpf10.
Nasze podejście zapewnia naukowcom narzędzie do badania układu nerwowego nienaruszonych zarodków, w pełni zachowując złożoność interakcji między komórkami w rozwijającej się.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy chcieliby podziękować Simonie Rodighiero za jej bezcenne wsparcie przy analizie obrazowania FRET.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Niska temperatura topnienia agarozy | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | W387520 | |
| Riluzol | Sigma-Aldrich | R116 | |
| Pfu Ultra HQ polimeraza DNA | Agilent Technologies - Dział Produktów Stratagene | 600389 | |
| Uniwersalny podkład T3 | Sigma-Aldrich | ||
| Wizard SV Żel i system do czyszczenia PCR | Promega | A9280 | |
| Uniwersalny podkład SmaI | Eurofins | ||
| StrataClone / wektor pCMV-SC | Agilent Technologies - Dział Produktów Stratagene | ||
| SmaI | New England Biolabs | R0141S Ligaza | |
| DNA T4 | Promega | M1801 | |
| SalI | New England Biolabs | R0138S | |
| EcoRV | New England Biolabs | R0195S | |
| 35 mm, miska do obrazowania ze szklanym dnem | Kleszczyki Ibidi | 81151 | |
| Sigma-Aldrich | F6521 | ||
| Mikroskop stereoskopowy | Leica Microsystems | M10 F Aparat | |
| cyfrowy | Oprogramowanie Leica Microsystems | DFC 310 FX | |
| Leica Application Suite 4.7.1 | Leica Microsystems | ||
| QuickTime Player, v10.4 | |||
| (odwrócony) | Mikrowtryskiwacz Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| Eppendorf | Makro Femtojet | ||
| ImageJ Biosensor_FRET | |||
| GraphPad Prism 6.0c | Oprogramowanie GraphPad, Inc |
Bibliografia
- Knöpfel, T., Gallero-Salas, Y., Song, C. Genetically encoded voltage indicators for large scale cortical imaging come of age. Curr Opin Chem Biol. 27, 75-83 (2015).
- Chemla, S., Chavane, F. Voltage-sensitive dye imaging: Technique review and models. J Physi....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
