Artykuł metodologiczny

Biodetekcja potencjału błonowego neuronu ruchowego w żywych zarodkach danio pręgowanego

6.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55297

⸱

26 czerwca 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Biotechnology and Translational Medicine, Università degli Studi di Milano, 2Department of Neuroscience; Department of Cell Biology, Howard Hughes Medical Institute, Yale University School of Medicine, 3Program in Cellular Neuroscience, Neurodegeneration and Repair, Yale University School of Medicine, 4Department of BioSciences, Università degli Studi di Milano

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Opisane tutaj protokoły pozwalają na badanie właściwości elektrycznych komórek pobudliwych w najbardziej nieinwazyjnych warunkach fizjologicznych poprzez wykorzystanie zarodków danio pręgowanego w systemie in vivo wraz z genetycznie kodowanym wskaźnikiem napięcia (GEVI) opartym na rezonansie fluorescencyjnym (FRET), selektywnie wyrażanym w interesującym typie komórki.

Streszczenie

Opisane tutaj protokoły są zaprojektowane tak, aby umożliwić badaczom badanie komunikacji komórkowej bez zmiany integralności środowiska, w którym komórki się znajdują. W szczególności zostały one opracowane do analizy aktywności elektrycznej komórek pobudliwych, takich jak neurony rdzeniowe. W takim scenariuszu kluczowe znaczenie ma zachowanie integralności komórki rdzenia, ale ważne jest również zachowanie anatomii i fizjologicznego kształtu zaangażowanych układów. Rzeczywiście, zrozumienie sposobu, w jaki działa układ nerwowy – i inne złożone systemy – musi opierać się na podejściu systemowym. Z tego powodu jako system modelowy wybrano żywy zarodek danio pręgowanego, a zmiany napięcia błony neuronu rdzeniowego oceniono bez ingerencji w warunki fizjologiczne zarodków.

Tutaj opisane jest podejście łączące wykorzystanie embrionów danio pręgowanego z biosensorem opartym na FRET. Zarodki danio pręgowanego charakteryzują się bardzo uproszczonym układem nerwowym i dzięki swojej przezroczystości nadają się szczególnie do zastosowań obrazowych, co pozwala na zastosowanie fluorescencyjnych wskaźników napięcia na błonie plazmatycznej podczas rozwoju danio pręgowanego. Synergia między tymi dwoma składnikami umożliwia analizę aktywności elektrycznej komórek w nienaruszonych organizmach żywych, bez zaburzania stanu fizjologicznego. Wreszcie, to nieinwazyjne podejście może współistnieć z innymi analizami (np. nagraniami spontanicznych ruchów, jak pokazano tutaj).

Wprowadzenie

Analiza komponentów systemowych in vivo pozwala naukowcom badać zachowanie komórek w najbardziej wiarygodny sposób. Jest to szczególnie prawdziwe, gdy badana aktywność jest silnie uzależniona od interakcji komórka-komórka (zarówno zależnej od kontaktu, jak i niezależnej), jak w układzie nerwowym, gdzie zmiany napięcia błonowego napędzają komunikację między pobudliwymi komórkami. Zrozumienie informacji zakodowanych przez te sygnały elektryczne jest kluczem do zrozumienia sposobu, w jaki działa układ nerwowy zarówno w stanach fizjologicznych, jak i chorobowych.

W celu zbadania właściwości elektrycznych komórek w najbardziej nieinwazyjnych warunkach fizjologicznych, ostatnio opracowano kilka genetycznie kodowanych wskaźników napięcia1. W przeciwieństwie do poprzednich generacji optycznych czujników napięcia (głównie barwników wrażliwych na napięcie)2, GEVI pozwalają na analizy in vivo nienaruszonego układu nerwowego, a ich ekspresja może być ograniczona do określonych typów komórek lub populacji.

Zarodek danio pręgowanego jest wybranym "substratem" in vivo, aby wykorzystać ogromny potencjał przypisywany GEVIs. W rzeczywistości, dzięki swojej przejrzystości optycznej i uproszczonemu, ale ewolucyjnie zachowanemu układowi nerwowemu, model danio pręgowanego pozwala na prostą identyfikację i manipulację każdym elementem komórkowym sieci. Rzeczywiście, zastosowanie opartego na FRET GEVI Mermaid3 doprowadziło do identyfikacji przedobjawowych zmian w zachowaniu rdzeniowego neuronu ruchowego w modelu stwardnienia zanikowego bocznego (ALS) danio pręgowanego4.

Poniższy protokół in vivo opisuje, jak monitorować właściwości elektryczne neuronów ruchowych rdzenia kręgowego w nienaruszonych zarodkach danio pręgowanego, które wyrażają syrenę w sposób specyficzny dla neuronów. Co więcej, wykazano, w jaki sposób farmakologicznie wywołane zmiany takich właściwości elektrycznych mogą być powiązane ze zmianami w częstotliwości spontanicznych zwijania się zarodka, stereotypowej aktywności motorycznej, która charakteryzuje zachowanie ruchowe danio pręgowanego na bardzo wczesnych etapach rozwoju.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. pHuC_Mermaid Generacja plazmidu

UWAGA: Syrenka to biosensor opracowany przez sparowanie domeny wykrywania napięcia (VSD) jelita Ciona intestinalis (obecnie Ciona robusta)5 czujnik napięcia zawierający fosfatazę (Ci-VSP) z fluoroforami partnerskimi FRET Umi-Kinoko Green (mUKG: donor) i monomeryczną wersją emitującego pomarańczowo białka fluorescencyjnego Kusabira Orange (mKOk: akceptor). W przypadku tego biosensora zmiany konformacyjne domeny VSD, wywołane depolaryzacją błony, zwiększają bliskość białek fluorescencyjnych donora i akceptora, zwiększając w ten sposób transfer energii między nimi (zwiększając współczynnik FRET)3. VSD zapewnia efektywną lokalizację biosensora na błonie plazmatycznej. Ekspresja neuronalna biosensora (w rdzeniu kręgowym sygnał jest wykrywalny zarówno w interneuronach, jak i neuronach ruchowych) osiąga się poprzez sklonowanie otwartej ramki odczytu Syreny (ORF) pod pan-neurolistycznym promotorem danio pręgowanego HuC6.

  1. Amplifikować za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) Mermaid ORF z plazmidu pCS4+ Mermaid plasmid3 za pomocą polimerazy DNA Pfu (korekta) przy użyciu startera T3 Universal i startera Mermaid SmaI (5′TATCCCGGGATTCGACGGTTCAGATTTTA) w celu wprowadzenia miejsca ograniczenia SmaI przed Mermaid ORF.
    1. Użyj następującej mieszaniny PCR: 0,5 μl polimerazy DNA Pfu, 7,5 μl specyficznego buforu 10x, 1 μl 10 mM dNTPs, 2,5 μl dimetylosulfotlenku (DMSO), 0,5 μl (50 ng) preparatu plazmidu i 1 μL 20-μM roztworów podstawowych każdego startera w łącznej objętości 50 μL.
    2. Podgrzewać mieszaninę PCR przez 15 s w temperaturze 95 °C, zalewać ją przez 15 s w temperaturze 50 °C i wydłużać przez 4 minuty w temperaturze 72 °C, co daje łącznie 35 cykli.
  2. Oczyść żelem specyficzny produkt PCR za pomocą komercyjnego zestawu do oczyszczania żelu, zgodnie z protokołem producenta.
  3. Sklonuj fragment DNA do wektora pCMV-SC zgodnie z protokołem producenta.
  4. Linearyzuj plazmid syreny dodatni (o nazwie pCMV-SC_Mermaid) enzymem restrykcyjnym SmaI do następnej insercji promotora HuC.
    1. Ustawić reakcję restrykcyjną w następujący sposób: 0,5 μl (10 U) enzymu restrykcyjnego SmaI, 2 μl zestawu 10x buforu i 5 μg plazmidowego DNA w całkowitej objętości 20 μL. Inkubować reakcję w temperaturze 25 °C przez 1 godzinę.
  5. Żelem oczyść strawiony plazmid za pomocą dostępnego w handlu zestawu do oczyszczania żelu zgodnie z protokołem producenta.
  6. Amplifikacja PCR promotora HuC (pHuC), z polimerazą DNA Pfu i genomowym DNA danio pręgowanego jako matrycą, przy użyciu pary starterów specyficznych dla HuC (HuCprom-forw1_SalI: 5′-GTAGTCGACCAGACTTCAAAAGGGTCCA i HuCprom-rev1: 5′-TCCATTCTTGACGTACAAAGATG) i obejmujący region 3,150 pz przed ATG.
    1. Przygotuj mieszaninę PCR, stosując następujący schemat: 0,5 μl polimerazy DNA Pfu, 7,5 μl specyficznego buforu 10x, 1 μl 10 mM dNTP, 2,5 μl DMSO, 200 ng genomowego DNA i 1 μl 20-μM roztworów podstawowych każdego startera w całkowitej objętości 50 μL.
    2. Po początkowym etapie trwającym 2 minuty w temperaturze 95 °C podgrzewać mieszaninę PCR przez 15 s w temperaturze 95 °C, zalewać ją przez 15 s w temperaturze 50 °C i wydłużać przez 4 minuty w temperaturze 72 °C, co daje łącznie 35 cykli.
  7. Oczyść żelem specyficzny produkt PCR za pomocą komercyjnego zestawu do oczyszczania żelu zgodnie z protokołem producenta.
  8. Zremisować równomolową ilość oczyszczonego pCMV-SC_Mermaid (etap 1.5) i DNA pHuC (etap 1.7) przy użyciu 1 μl ligazy DNA T4 i 1 μl specyficznego buforu 10X w całkowitej objętości 10 μL. Inkubować reakcję przez 16 godzin w temperaturze 4 °C.
  9. Przekształć podwielokrotność kompetentnych komórek w 5 μl reakcji ligacji (krok 1.8) zgodnie z instrukcjami producenta.
  10. Wybrać klony pHuC-dodatnie (pHuC_Mermaid) z promotorem wprowadzonym we właściwej orientacji przez podwójne trawienie Sal I-EcoRV (miejsce restrykcji SalI zostało wstawione przed fragmentem promotora w kroku 1.6, podczas gdy miejsce restrykcji EcoRV znajduje się poniżej regionu poliadenylacji, PolyA, plazmidu pCMV-SC).
    1. Ustawić reakcję restrykcyjną w następujący sposób: 0,5 μl (10 U) enzymów restrykcyjnych SalI i EcoRV, 2 μl buforu kit10X i 1 μg pHuC_Mermaid DNA w całkowitej objętości 20 μL. Inkubować reakcję w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. Przeprowadzić reakcje na żelu agarozowym.

2. Mikroiniekcja zarodka

  1. Przenieś zapłodnione jaja uzyskane z dorosłego danio pręgowanego typu dzikiego (szczep AB) lub Sod1-G93R Zebry4 na 10-milimetrową szalkę Petriego za pomocą plastikowej pipety.
  2. Opłucz zarodki w zimnej (4 °C) wodzie dla ryb i natychmiast wstrzyknij je do żółtka z 200 pg plazmidu pHuC_Mermaid za pomocą mikrowstrzykiwacza (ogólny i szczegółowy opis procedury mikroiniekcji znajduje się w piśmiennictwie 7 i 8).
  3. Za pomocą plastikowej pipety przenieść zarodki na szalkę Petriego i inkubować je w wodzie dla ryb w temperaturze 28 °C, aż osiągną pożądany etap rozwojowy (20-24 godziny po zapłodnieniu, hpf) w celu przeprowadzenia kolejnych analiz.

3. Analiza spontanicznego zwijania ogona

UWAGA: Oceń spontaniczne zwijanie ogona u 20-24 zarodków hpf z lub bez leku riluzol.

  1. Przenieś zarodek na okrągłą szalkę Petriego o średnicy 90 mm wypełnioną wodą rybną zawierającą 0,2% DMSO (nośnik riluzolu) i ręcznie go zdechorionuj za pomocą dwóch kleszczyków jubilerskich z ostrymi końcówkami. Inkubować zarodek przez 5 minut.
  2. Wykryj zwijanie ogona przy natężeniu ruchu podczas 1-minutowego nagrania wideo za pomocą kamery cyfrowej zamontowanej na mikroskopie stereoskopowym. Uzyskuj szeregi czasowe w rozdzielczości czasowej 30 klatek/s.
  3. Oblicz częstotliwość spontanicznych zwijania ogona, licząc liczbę zgięć (zarówno przeciwbieżnych, jak i ipsilateralnych) na jednostkę czasu.
  4. Aby ocenić działanie leku riluzol, delikatnie użyj plastikowej pipety Pasteura, aby przenieść zarodek na nową 90-milimetrową szalkę Petriego wypełnioną wodą rybną zawierającą 5 μM riluzolu.
    1. Inkubuj zarodek przez 5 minut, a następnie nagraj 1-minutowy film i przeprowadź analizę behawioralną, jak powyżej.

4. Konfiguracja obrazowania do wizualizacji biosensora syrenki w żywych zarodkach: jednoczesne wykrywanie sygnałów dawcy i akceptora

  1. Umieść 20 - 24 zarodki hpf w 1% agarozie o niskiej temperaturze topnienia w wodzie rybnej o temperaturze 37 °C w naczyniu do obrazowania o średnicy 35 mm ze szklanym dnem. Ułóż zarodki na bokach. Poczekaj, aż agaroza zestali się w temperaturze pokojowej.
  2. Przenieść czaszę obrazowania do stolika odwróconej konfokalnej zamontowanej na odwróconym mikroskopie. Zidentyfikuj neurony ruchowe wyrażające bioczujnik za pomocą obiektywu 20X (apertura numeryczna 0,7, NA) poprzez wzbudzenie mUKG za pomocą linii lasera argonowego 488 nm i zarejestrowanie jego emisji w zakresie od 495 do 525 nm.
  3. Aby uzyskać pomiar FRET, wzbudz mUKG, donora pary FRET, za pomocą linii laserowej 488 nm. Jednoczesne wykrywanie, za pomocą skanera rezonansowego pracującego z częstotliwością 8 000 Hz w trybie dwukierunkowym, fluorescencji emitowanej przez donor (między 495 a 525 nm) oraz fluorescencji emitowanej przez akceptor mKOk (między 550 a 650 nm, kanał FRET). Jeśli to możliwe, użyj lasera 473 nm.
    UWAGA: Sprawność wzbudzenia dawcy będzie nieznacznie zmniejszona (85% zamiast 93% przy 488 nm), ale wzbudzenie krzyżowe akceptora również zostanie zmniejszone (z 17% przy długości fali 488 nm do 9% przy linii laserowej 473 nm).
  4. Aby zmniejszyć fototoksyczność i bielenie fluoroforowe, zminimalizuj oświetlenie próbki, zmniejszając moc linii laserowej (w oknie ścieżki wiązki w oprogramowaniu do akwizycji).
  5. Zoptymalizuj wzbudzenie, aby dopasować parametry wzmocnienia i przesunięcia, które są ustawione na początku eksperymentu i utrzymywane na stałym poziomie przez całą sesję. Aby ustawić przesunięcie, zmień kolor obrazu na wartości intensywności (korzystając z tabeli przeglądowej Q) i podczas skanowania z wyłączonym laserem przekręć pokrętło przesunięcia (inteligentne przesunięcie) tak, aby piksele tła miały intensywność nieco wyższą od zera. Korzystając z tej samej tabeli przeglądowej, włączając laser podczas skanowania, przekręć pokrętło wzmocnienia (inteligentne wzmocnienie), aby zmaksymalizować stosunek sygnału do szumu, uważając, aby uniknąć nasyconych pikseli.
  6. Korzystając z otwartego otworka otworkowego (2 jednostki wentylacyjne), uzyskaj 16-bitowe obrazy, aby zapewnić wystarczający zakres dynamiki do analiz ilościowych. Unikaj uśredniania, aby zwiększyć szybkość akwizycji i zminimalizować fotowybielanie.
  7. W oknie akwizycji oprogramowania wybierz z menu rozwijanego rozmiar pola obrazu 512 x 64 pikseli (rozmiar piksela: 605 nm).
  8. W oknie trybu akwizycji wybierz xyt (upływ czasu na pojedynczej płaszczyźnie xy) zmenu rozwijanego i rejestruj zmiany napięcia neuronu rdzeniowego zarodka, uzyskując pojedynczą płaszczyznę xy, ustawiając parametry akwizycji tak, aby rejestrować jeden obraz co 30 ms przez 1 min.
  9. Aby ocenić wpływ podawania riluzolu na depolaryzację błony w tym samym neuronie, należy uzyskać nowy zestaw danych 5 minut po dodaniu wody rybnej zawierającej 5 μM riluzolu.
  10. Do analizy FRET należy użyć Biosensor_FRET makra ImageJ (wyrażającego jednołańcuchowe biosensory FRET.
  11. Oceń stosunek FRET błony podstawowej każdego neuronu przy t1 jako ((średnia FRET - tło FRET)/(średnia dawcy - tła dawcy)), gdzie średnia intensywność FRET i dawcy to średnia intensywność fluorescencji obliczona w tym samym obszarze zainteresowania (ROI) narysowanym wokół komórki dla każdego nabytego kanału, a FRET i tło dawcy to średnia intensywność fluorescencji obliczona w ROI pola widzenia bez próbki fluorescencyjnej.
    UWAGA: Szczegółowy opis korzystania z wtyczki krok po kroku znajduje się na stronie www.med.unc.edu/microscopy/resources/imagej-plugins-and-macros/biosensor-fret.
  12. Użyj oprogramowania do tworzenia wykresów, aby porównać częstotliwość, amplitudę i czas trwania depolaryzacji między różnymi paradygmatami eksperymentalnymi. Porównaj dwie grupy za pomocą niesparowanego testu t-Studenta i uznaj średnie wartości za statystycznie różne, gdy P <0,05.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wektor ekspresyjny zawierający sekwencję kodującą biosensor Mermaid oparty na technice FRET pod kontrolą panneuronalnego promotora pHuC, który kieruje syntezę białka wyłącznie w układzie nerwowym, wprowadzono do pojedynczych zapłodnionych jaj metodą mikroiniekcji w celu uzyskania przejściowych embrionów transgenicznych (Rysunek 1, lewy panel). Po opanowaniu techniki mikroiniekcji odsetek embrionów Mermaid-dodatnich wynosił blisko 100%. spośród nich do ana...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawiony tutaj protokół pozwolił nam zbadać związek między właściwościami elektrycznymi neuronów ruchowych rdzenia kręgowego danio pręgowanego a spontanicznym zwijaniem, najwcześniejszą stereotypową aktywnością motoryczną, która pojawia się około 17 hpf rozwoju embrionalnego i trwa do 24 hpf10.

Nasze podejście zapewnia naukowcom narzędzie do badania układu nerwowego nienaruszonych zarodków, w pełni zachowując złożoność interakcji między komórkami w rozwijającej się...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Simonie Rodighiero za jej bezcenne wsparcie przy analizie obrazowania FRET.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Niska temperatura topnienia agarozy Sigma-AldrichA9414
DMSO Sigma-AldrichW387520
RiluzolSigma-AldrichR116
Pfu Ultra HQ polimeraza DNA Agilent Technologies - Dział Produktów Stratagene600389
Uniwersalny podkład T3 Sigma-Aldrich
Wizard SV Żel i system do czyszczenia PCRPromegaA9280
Uniwersalny podkład SmaI Eurofins
StrataClone / wektor pCMV-SC Agilent Technologies - Dział Produktów Stratagene 
SmaI New England BiolabsR0141S Ligaza
DNA T4PromegaM1801
SalINew England BiolabsR0138S
EcoRVNew England BiolabsR0195S
35 mm, miska do obrazowania ze szklanym dnem Kleszczyki Ibidi81151
Sigma-AldrichF6521
Mikroskop stereoskopowyLeica MicrosystemsM10 F Aparat
cyfrowyOprogramowanie Leica MicrosystemsDFC 310 FX
Leica Application Suite 4.7.1 Leica Microsystems
QuickTime Player, v10.4
(odwrócony)Mikrowtryskiwacz Leica MicrosystemsTCS SP5
 Eppendorf Makro Femtojet
ImageJ Biosensor_FRET 
GraphPad Prism 6.0c Oprogramowanie GraphPad, Inc
System wektorów ekspresji ssaków 240228 Mikroskop konfokalny Apple

Bibliografia

  1. Knöpfel, T., Gallero-Salas, Y., Song, C. Genetically encoded voltage indicators for large scale cortical imaging come of age. Curr Opin Chem Biol. 27, 75-83 (2015).
  2. Chemla, S., Chavane, F. Voltage-sensitive dye imaging: Technique review and models. J Physiol Paris. 104 (1-2), 40-50 (2010).
  3. Tsutsui, H., Karasawa, S., Okamura, Y., Miyawaki, A. Improving membrane voltage measurements using FRET with new fluorescent proteins. Nat Methods. 5 (8), 683-685 (2008).
  4. Benedetti, L., et al. INaP selective inhibition reverts precocious inter- and motorneurons hyperexcitability in the Sod1-G93R zebrafish ALS model. Sci Rep. 6, 24515(2016).
  5. Pennati, R., et al. Morphological differences between larvae of the Ciona intestinalis species complex: hints for a valid taxonomic definition of distinct species. PLoS ONE. 10 (5), 0122879(2015).
  6. Park, H. C., et al. Analysis of upstream elements in the HuC promoter leads to the establishment of transgenic zebrafish with fluorescent neurons. Dev Biol. 227 (2), 279-293 (2000).
  7. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J Vis Exp. (27), (2009).
  8. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
  9. Drapeau, P., et al. Development of the locomotor network in zebrafish. Prog Neurobiol. 68 (2), 85-111 (2002).
  10. Brustein, E., et al. Steps during the development of the zebrafish locomotor network. J Physiol Paris. 97 (1), 77-86 (2003).
  11. Drapeau, P., Ali, D. W., Buss, R. R., Saint-Amant, L. In vivo recording from identifiable neurons of the locomotor network in the developing zebrafish. J Neurosci Methods. 88, 1-13 (1999).
  12. Kawakami, K. Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates. Genome Biol. 8, Suppl 1S7 (2007).
  13. Sungmoo, L., et al. Imaging Membrane Potential with Two Types of Genetically Encoded Fluorescent Voltage Sensors. J Vis Exp. (108), e53566(2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Biosensor FRETneurony rdzeniowemikroskopia konfokalnaobrazowanie fluorescencyjnekodowanie genetycznewska niki napi cialeczenie riluzolemanaliza zwijania ogona

Powiązane artykuły