Identyfikacja sekwencji lokalizacji plazmodesmalnej w białkach w Planta

Summary

Połączenia międzykomórkowe roślin, plazmodesmaty (Pd), odgrywają kluczową rolę w fizjologii roślin i interakcjach między roślinami a wirusami. Kluczowe znaczenie dla transportu Pd mają sygnały sortujące, które kierują białka do Pd. Jednak nasza wiedza na temat tych sekwencji jest wciąż w powijakach. Opisujemy strategię identyfikacji sygnałów lokalizacji Pd w białkach docelowych Pd.

Abstract

Plasmodesmata (Pd) to połączenia między komórkami, które funkcjonują jako bramy, przez które małe i duże cząsteczki są transportowane między komórkami roślinnymi. Podczas gdy zakłada się, że transport Pd małych cząsteczek, takich jak jony i woda, zachodzi pasywnie, transport makrocząsteczek biologicznych z komórki do komórki, takich białek, najprawdopodobniej zachodzi poprzez aktywny mechanizm, który obejmuje specyficzne sygnały celowania w transportowaną cząsteczkę. Niedobór zidentyfikowanych sygnałów lokalizacji plazmodesmatów (Pd) (PLS) poważnie ograniczył zrozumienie szlaków sortowania białek zaangażowanych w transport i komunikację makromolekularną między komórkami roślinnymi. Spośród bogactwa roślinnych białek endogennych i wirusowych, o których wiadomo, że przemieszczają się przez PD, do tej pory zgłoszono tylko trzy PLS, wszystkie z nich pochodzą z endogennych białek roślinnych. Dlatego ważne jest, aby opracować wiarygodną i systematyczną strategię eksperymentalną w celu zidentyfikowania funkcjonalnej sekwencji PLS, która jest zarówno niezbędna, jak i wystarczająca do celowania w Pd, bezpośrednio w żywych komórkach roślinnych. W tym miejscu opisujemy jedną z takich strategii, wykorzystując jako paradygmat białko ruchu między komórkami (MP) wirusa mozaiki tytoniu (TMV). Eksperymenty te, które zidentyfikowały i scharakteryzowały pierwszego roślinnego wirusa PLS, mogą być przystosowane do odkrycia sekwencji PLS w większości białek ukierunkowanych na PD.

Introduction

Plasmodesmaty (Pd) funkcjonują jako kanały do transportu międzykomórkowego kluczowych regulatorów rozwoju i morfogenezy roślin, począwszy od czynników transkrypcyjnych, a skończywszy na mRNA i małych cząsteczkach RNA. Co więcej, ta makromolekularna zdolność transportowa Pd jest wykorzystywana przez większość wirusów roślinnych do ich międzykomórkowego rozprzestrzeniania się podczas infekcji; aby przemieszczać się przez Pd, wirusy roślinne wyewoluowały wyspecjalizowane białka, zwane białkami ruchu (MP), które są specjalnie ukierunkowane na Pd^1,2,3,....

Protocol

1. Materiał roślinny

1. Wybór gatunków roślin
2. Należy użyć gatunku rośliny rodzimego dla białka będącego przedmiotem zainteresowania, tj. takiego, który koduje to białko dla białek endogennych lub który stanowi naturalnego gospodarza dla patogenu dla białek wirusowych. Ponadto wybrane gatunki roślin muszą być podatne na wybraną metodę przejściowej transformacji genetycznej.
   UWAGA: W badaniach rutynowo wykorzystuje się Nicotiana benthamiana, która stanowi dobrego gospodarza dla TMV i jest skutecznie przekształcana przez technikę transformacji genetycznej za pośrednictwem Agrobacterium, tj. agroinfiltracji (patrz Krok ....

Results

Reprezentatywne dane, które wiernie ilustrują oczekiwane wyniki z opisanych protokołów i identyfikują TMV MP PLS, zostały zaadaptowane z Yuan et al.²¹. Rysunek 1A najpierw podsumowuje główne konstrukty wyrażające pełnowymiarowe TMV MP (1-268), TMV MP PLS (zawierające pierwsze 50 reszt aminokwasowych białka, 1-50) i jego pochodne V4A skanujące alaninę połączone z CFP (wygenerowane zgodnie z opisem w krokach 2.2, 5.2 i 6), podczas gdy

Discussion

Protokół ten składa się z czterech podstawowych elementów: koncepcji identyfikacji sekwencji, która jest zarówno niezbędna, jak i wystarczająca do ukierunkowania na Pd, systematycznego podziału białka będącego przedmiotem zainteresowania na fragmenty, które są stopniowo skracane pod względem długości, łączenia badanych fragmentów z białkiem autofluorescencyjnym, które służy zarówno jako znacznik, jak i jako ładunek makrocząsteczkowy, oraz testu funkcjonalnego do celowania w Pd w żywych tkankach roślinnych po przejściowej.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy (CLSM)	Zeiss	LSM5	Każdy CLSM o podobnych możliwościach jest odpowiedni
Oprogramowanie Zen do obrazowania mikroskopem konfokalnym	Wersja Zeiss	2009	Oprogramowanie powinno być kompatybilne z używanym przez CLSM
zestawem do mutagenezy ukierunkowanej na miejsce Quickchange II	Agilent	200523
Acetosyringone	Sigma-Aldrich	D134406
MES	Sigma-Aldrich	69892
Strzykawki bez igieł	BD	309659
MgCl2	FisherScientific	M33-500
Spectinomycin	Sigma-Aldrich	S4014
Ryfampicyna	Sigma-Aldrich	R3501
Ampicylina	Sigma-Aldrich	A0166