Identyfikacja sekwencji lokalizacji plazmodesmalnej w białkach w Planta

Plasmodesmaty (Pd) funkcjonują jako kanały do transportu międzykomórkowego kluczowych regulatorów rozwoju i morfogenezy roślin, począwszy od czynników transkrypcyjnych, a skończywszy na mRNA i małych cząsteczkach RNA. Co więcej, ta makromolekularna zdolność transportowa Pd jest wykorzystywana przez większość wirusów roślinnych do ich międzykomórkowego rozprzestrzeniania się podczas infekcji; aby przemieszczać się przez Pd, wirusy roślinne wyewoluowały wyspecjalizowane białka, zwane białkami ruchu (MP), które są specjalnie ukierunkowane na Pd^{1,2,3,4,5,6,7}. Molekularne szlaki transportu Pd najprawdopodobniej są ściśle powiązane z określonymi sekwencjami, które kierują transportowane białka do tych szlaków. W związku z tym identyfikacja tych sygnałów lokalizacyjnych Pd (PLS) może być diagnostyką odpowiadającego im szlaku transportu Pd. Jest to analogia do transportu Pd⁸, na przykład do różnych ścieżek importu jądrowego, które mogą być specyficzne dla różnych sekwencji sygnału lokalizacji jądrowej (NLS)^9,10. Koncepcyjnie zarówno NLS, jak i PLS reprezentują nierozszczepialne subkomórkowe sekwencje celowania, które są niezbędne i wystarczające do celowania. Jednak w przeciwieństwie do NLSs¹¹, informacje o sekwencji PLS są poważnie ograniczone. W szczególności opisano tylko cztery sekwencje białek zaangażowane w celowanie w Pd, z których wszystkie pochodzą z endogennych białek roślinnych. Pierwsza z nich jest reprezentowana przez domenę homeoboxa KN1¹² – czynnik transkrypcyjny, który przemieszcza się z wewnętrznych warstw komórkowych do naskórka liścia rośliny¹³ – i jego homologi KNOX¹⁴. Drugi również pochodzi od czynnika transkrypcyjnego, Dof, który zawiera przypuszczalny PLS opisany jako motyw transportu międzykomórkowego (IT)¹⁵. Trzecia sekwencja pochodzi z białka błonowego typu 1 rezydującego w plazmodesmacie PDLP1 i jest reprezentowana przez domenę transbłonową¹⁶. Wreszcie, czwarta sekwencja celująca w Pd została niedawno zgłoszona dla białek zakotwiczonych w glikozylofosfatydyloinozytolu (GPI) i jest reprezentowana przez sygnał modyfikacji glikozylofosfatydyloinozytolu (GPI)¹⁷.

Ciekawe, że do niedawna nie zgłoszono żadnych PLS dla wirusowych MP. Wcześniejsze badania wykazały obecność przypuszczalnych sekwencji PLS w wirusach roślinnych MPS^18,19, ale w wirusowym MP nie zidentyfikowano prawdziwej sekwencji aminokwasów, tj. minimalnej sekwencji aminokwasów, zarówno koniecznej, jak i wystarczającej do celowania w Pd niepowiązanej cząsteczki ładunku (np. CFP). Jednak jedno z tych białek, MP wirusa mozaiki tytoniu (TMV), było pierwszym, dla którego wykazano lokalizację i transport Pd²⁰.

Aby wypełnić tę lukę, opracowaliśmy eksperymentalną strategię identyfikacji TMV MP PLS. Strategia ta opierała się na trzech koncepcjach. (i) Zdefiniowaliśmy PLS jako minimalną sekwencję aminokwasów, która jest zarówno niezbędna, jak i wystarczająca do kierowania białka do Pd²¹. (ii) Ponieważ TMV MP najpierw atakuje Pd, a następnie translokuje się przez te kanały²², naszym celem było rozdzielenie tych dwóch działań i zidentyfikowanie działającego w dobrej wierze PLS, który działa tylko do namierzania Pd, a nie do późniejszego transportu. (iii) Przeanalizowaliśmy zidentyfikowany PLS pod kątem reszt aminokwasowych ważnych dla jego aktywności ukierunkowanej na Pd, zarówno strukturalnie, jak i funkcjonalnie. Korzystając z tego podejścia, nakreśliliśmy sekwencję 50-aminokwasowych reszt na końcu aminowym TMV MP, która działa jak bona fide PLS. Dokonano tego poprzez wyprodukowanie serii fragmentów TMV MP, które nasyciły całą długość białka, oznaczając ich końce karboksylowe CFP i przejściowo eksprymując je w tkankach roślinnych. Lokalizację Pd każdego z badanych fragmentów określono poprzez ich koekspresję z białkiem markerowym Pd, PDCB1 (Pd callose binding protein 1)²³. Najmniejszy fragment, który nadal znajdował się w Pd, ale nie przechodził przez Pd, został uznany za reprezentujący PLS. Na koniec PLS został zeskanowany alaniną w celu określenia kluczowych reszt aminokwasowych wymaganych do jego struktury i/lub funkcji.

Podczas gdy tutaj ilustrujemy to podejście, opisując identyfikację TMV MP PLS, może ono być wykorzystane do odkrycia PLS w innych białkach ukierunkowanych na Pd, czy to kodowanych przez patogeny roślinne, czy przez same rośliny; dzieje się tak dlatego, że nasza metoda nie wykorzystuje żadnych unikalnych cech wirusowych MP w odniesieniu do ich zdolności do kierowania na Pd.

1. Materiał roślinny

1. Wybór gatunków roślin
2. Należy użyć gatunku rośliny rodzimego dla białka będącego przedmiotem zainteresowania, tj. takiego, który koduje to białko dla białek endogennych lub który stanowi naturalnego gospodarza dla patogenu dla białek wirusowych. Ponadto wybrane gatunki roślin muszą być podatne na wybraną metodę przejściowej transformacji genetycznej.
   UWAGA: W badaniach rutynowo wykorzystuje się Nicotiana benthamiana, która stanowi dobrego gospodarza dla TMV i jest skutecznie przekształcana przez technikę transformacji genetycznej za pośrednictwem Agrobacterium, tj. agroinfiltracji (patrz Krok 3). Rośliny N. benthamiana są również łatwe w uprawie i mają duże liście, które są łatwo zaszczepiane przez Agrobacterium i łatwo analizowane za pomocą mikroskopii konfokalnej.
3. Wzrost roślin
   1. Posadź nasiona N. benthamiana w wilgotnej glebie o dużej gęstości. Przechowuj je w komorze o kontrolowanym środowisku w temperaturze 20-25 °C pod 16 godzinami światła przy ~75 μmol fotonach ^{m-2 s-1} i 8 godzinach ciemności. Gdy średnica eufilu osiągnie 0,5 cm, ostrożnie przenieś sadzonki do większych doniczek i kontynuuj wzrost w tej samej komorze w tych samych warunkach.
   2. Utrzymuj rośliny do momentu, gdy osiągną fazę 4-8 liści w ciągu 4 tygodni, gdy największe liście mają średnicę 4-6 cm; w tym czasie można je wykorzystać do agroinfiltracji (patrz Krok 3).
      UWAGA: Co ważne, nigdy nie używaj roślin, jeśli zaczęły kwitnąć, ponieważ na tym etapie rozwoju architektura liści często się zmienia^24,25, co czasami prowadzi do niespójnych wyników.

2. Konstrukcja wektora wyrażenia

1. Wybór systemu odciągania pokarmu
   1. Należy wybrać system ekspresji, tj. wektory i metodę dostarczania wektorów, najlepiej dopasowany do ekspresji białka będącego przedmiotem zainteresowania u badanych gatunków roślin.
      UWAGA: Czasami takie specyficzne kombinacje badanych gatunków białek/roślin mogą wymagać określonych wektorów i metody dostarczania wektorów w celu optymalnej ekspresji i funkcji białka będącego przedmiotem zainteresowania. Jednak w przypadku większości roślin dwuliściennych należy wybrać plazmidy binarne jako wektory ekspresji i agroinfiltrację jako system dostarczania.
2. Znakowanie fluorescencyjne białek
   1. Oznacz fluorescencyjnie każde białko ulegające ekspresji w celu analizy jego dystrybucji subkomórkowej²², w tym lokalizację Pd.
      UWAGA: Zastosuj białka autofluorescencyjne, takie jak CFP i DsRed2, jako znaczniki. Oznacz badane białko CFP i poddaj je koekspresji za pomocą wolnego DsRed2. CFP funkcjonuje zarówno jako znacznik, jak i jako cząsteczka ładunkowa niezwiązana z wirusem. Funkcje DsRed2 w celu kalibracji ogólnej wydajności ekspresji w stanach nieustalonych oraz, ponieważ jest autonomiczny dla komórki, w celu identyfikacji początkowo przekształconej komórki; Ta ostatnia funkcja jest ważna przy ocenie przemieszczania się między komórkami potencjalnie nieautonomicznych badanych białek. W celu koekspresji z markerem Pd PDCB1, który również jest autonomiczny komórkowo, oznacz badane białko CFP, a PDCB1 DsRed2.
   2. Z reguły połącz znacznik autofluorescencyjny z końcem karboksylowym wyrażonego białka. Jeśli jednak oznakowane badane białko o pełnej długości wykazuje upośledzone celowanie w Pd, przenieś znacznik do końca aminowego białka.
   3. Sklonuj sekwencje kodujące białek, które mają być badane, do odpowiedniego wektora ekspresji roślinnej.
      UWAGA: Istnieje wiele różnych wektorów ekspresji roślin, które umożliwiają znakowanie fluorescencyjne. Używamy serii plazmidów pSAT ²⁶ lub niektórych z ich pochodnych ^27,28, które są odpowiednie do klonowania interesującej nas sekwencji bezpośrednio w ramce z sugerowanymi znacznikami autofluorescencyjnymi (patrz Krok 2.2.1) zarówno w orientacji amino-, jak i karboksylowo-końcowej.
   4. Przenieś każdą kasetę z wyrażeniami do wektora binarnego Agrobacterium.
      UWAGA: Chociaż konstrukty oparte na pSAT nadają się do bezpośredniego dostarczania biolistycznego do tkanek roślinnych, agroinfiltracja, która jest zalecaną tutaj metodą transformacji (patrz Krok 3), wymaga, aby kaseta ekspresji znajdowała się między granicami T-DNA wektora binarnego²⁹.
      UWAGA: Wszystkie wektory pSAT są zaprojektowane tak, aby umożliwić taki transfer do wielogenowego wektora binarnego ekspresji pPZP-RCS2 ^26,30 poprzez jednoetapowe klonowanie przy użyciu rzadkich nukleaz tnących AscI, I-PpoI, I-SceI, I-CeuI, PI-PspI i PI-TliI²⁶. Naukowcy, którzy preferują klonowanie rekombinatoryczne, np. przy użyciu heterologicznych miejsc lox³¹, mogą zastosować warianty wektorów pSAT ^26,27.
   5. W celu uzyskania koekspresji przenieś obie kasety ekspresji, np. badane białko-CFP i DsRed2 lub badane białko-CFP i PDCB1-DsRed2 (patrz krok 2.1), do tego samego wektora binarnego pPZP-RCS2.
      UWAGA: Alternatywnie, kultury Agrobacterium zawierające indywidualne konstrukty binarne mogą być mieszane ze sobą w celu infiltracji do N. benthamiana (patrz Krok 3.1).

3. Agroinfiltracja

1. Dodać 1 μg plazmidu na bazie pPZP-RCS2 z kroku 2.2.5 do 100 μl hodowli kompetentnych komórek Agrobacterium tumefaciens szczep EHA105 lub GV3101 przygotowanych zgodnie z opisem^{32, inkubować na lodzie przez 30 minut, zamrażać w ciekłym azocie przez 1 minutę i inkubować w temperaturze 28 °C przez 15} minut.
   1. Następnie dodać 1 ml pożywki LB (10 g/l tryptonu, 5 g/l ekstraktu drożdżowego i 10 g/l NaCl) do właściwej mieszaniny komórek i inkubować w temperaturze 28 °C przez 2 godziny. Odwirować komórki w temperaturze 3 000 × g przez 1 minutę, ponownie zawiesić je w 0,2 ml LB i umieścić na agarze LB uzupełnionym odpowiednimi antybiotykami (np. 100 mg/l spektynomycyny i 50 mg/l ryfampicyny dla wektorów opartych na pPZP-RSC2^26,30). Rosnąć w temperaturze 28 °C przez 48 godzin, aż pojawią się pojedyncze kolonie.
2. Zebrać i ułożyć na płytce z agarem świeże LB (patrz krok 3.1), hodować w temperaturze 28 °C przez 48 godzin i pobrać niewielką ilość bakterii do analizy metodą colony PCR³³, aby potwierdzić obecność określonych konstruktów binarnych.
3. Hodować każdą kolonię Agrobacterium z interesującym konstruktem przez noc w temperaturze 28 °C w 5 ml pożywki LB uzupełnionej odpowiednimi antybiotykami (patrz krok 3.1.1). Odwirować komórki w stężeniu 3 000 × g i ponownie zawiesić je do OD₆₀₀ = 0,5 w buforze agroinfiltracyjnym (10 mM MgCl₂, 10 mM MES (pH 5,6), 150 μM acetosyringonu). Inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
   1. W przypadku stosowania mieszaniny plazmidów binarnych, a nie pojedynczego plazmidu o ekspresji wielogenowej do koekspresji białek, przed infiltracją wymieszaj odpowiednie kultury komórkowe w stosunku 1:1 v/v. Następnie inkubować komórki w temperaturze 28 °C przez 2 godziny.
4. Załadować inokulum do plastikowej strzykawki o pojemności 1 ml i docisnąć dyszę strzykawki (bez igły) do dolnego (abaksjalnego) naskórka w pełni dojrzałych liści N. benthamiana. Przytrzymaj liść palcem w rękawiczce na powierzchni adaxial^34,35.
   1. Wprowadzić Agrobacterium do pożywki infiltracyjnej przez powolne wstrzyknięcie. Aby uzyskać istotność statystyczną, naciekaj kilka liści na każdej roślinie.
      UWAGA: Należy pamiętać, że najstarsze liście nie są używane, ponieważ nie dają one stałych poziomów ekspresji.
   2. Zaszczepić wszystkie liście in situ. Utrzymuj infiltrowaną roślinę do czasu obserwacji opisanej w kroku 1.2 .

4. Mikroskopia konfokalna

1. Za pomocą ostrza pociąć każdy liść na fragmenty między żyłkami 24-48 godzin po infiltracji (w zależności od skuteczności przejściowej ekspresji określonego badanego białka); rozmiar każdego wycinka tkanki powinien być taki, aby wycinek był całkowicie pokryty szkłem nakrywkowym (22 mm x 40 mm) używanym do mikroskopii.
2. Umieść plastry liści na szkiełku przedmiotowym powierzchnią liścia aosiowego skierowaną do góry, umieść kroplę wody na plasterku liścia i przykryj go szkłem nakrywkowym. Unieruchom szkło nakrywkowe małymi kawałkami taśmy z każdej strony.
3. Obserwuj agroinfiltrowane tkanki pod laserowym skaningowym mikroskopem konfokalnym i zapisz uzyskane obrazy.
   1. Najpierw użyj soczewki obiektywowej 10x, aby zidentyfikować komórki z sygnałem, a następnie użyj soczewki obiektywu 63x, aby uzyskać bardziej szczegółowe obserwacje.
   2. Użyj długości fali 458 nm z lasera argonowo-jonowego do wzbudzenia CFP i 543 nm do wzbudzenia DsRed2. Zachowaj wszystkie ustawienia akwizycji obrazu, tj. intensywność lasera i ustawienia lampy fotopowielacza (PMT), między eksperymentami. Średnio zbadaj 100-120 komórek dla każdego warunku eksperymentalnego.

5. Identyfikacja PLS

1. Zdiagnozuj lokalizację badanego białka za pomocą mikroskopu konfokalnego (punkt 4). Sprawdź, czy badane białko ma charakterystyczny peryferyjny wzór punktowy^{25,36,37,38,39,40,41} i kolokalizuje się ze znacznikiem Pd PDCB1²³. Wskazuje to, że badane białko najprawdopodobniej zawiera sekwencje PLS.
2. Po potwierdzeniu aktywności PLS badanego białka, stopniowo podziel jego otwartą ramkę odczytu (ORF) (numer dostępu do banku genów BAF93925.1) na mniejsze fragmenty, autofluorescencyjnie (np. CFP) oznacz każdy z nich i przeanalizuj ich lokalizację subkomórkową zgodnie z opisem w Kroku 4. Początkowo zalecana jest wielkość 100 reszt aminokwasowych dla każdego podzielonego fragmentu.
3. Następnie należy podzielić obcięte fragmenty, które mają aktywność PLS i sprawdzić ich lokalizację subkomórkową, jak opisano w kroku 4, aż zostanie zidentyfikowany najmniejszy fragment, który nadal lokalizuje się w Pd, tj. jest wystarczający do przetransportowania ładunku znacznika autofluorescencyjnego do Pd. Przypuszcza się, że ten fragment reprezentuje sekwencję PLS.
4. Usuń przypuszczalny PLS z badanego białka o pełnej długości, tj. połącz pozostałą część badanego białka bez przypuszczalnego PLS ze znacznikiem autofluorescencyjnym i określ subkomórkową lokalizację powstałego zmutowanego białka, jak opisano w kroku 4. Jeśli to zmutowane białko, które nie ma przypuszczalnego PLS, nie zlokalizuje się w Pd, będzie to oznaczać, że zidentyfikowany PLS jest nie tylko wystarczający (patrz Krok 5.3), ale także niezbędny do transportu Pd badanego białka.
5. Agroinfiltrować liście mieszaniną kultur Agrobacterium zawierających konstrukt wyrażenia dla PLS znakowanego CFP i wolnego DsRed2 (patrz krok 3.3). Obserwuj naciekaną tkankę za pomocą mikroskopu konfokalnego z soczewką obiektywową 10x, używając tych samych ustawień, co w kroku 4.3.
6. Oceń komórki, które zawierają zarówno sygnały CFP, jak i DsRed2 jako początkowo naciekające komórki, i oceń sąsiednie komórki, które zawierały tylko sygnał CFP, jako te, które wykazują ruch.
   UWAGA: Ten krok bada zidentyfikowany PLS pod kątem jego potencjalnej zdolności do przemieszczania się między komórkami; dzieje się tak, ponieważ wiele białek, które celują w Pd (w tym większość wirusów roślinnych MP) również przemieszcza się przez Pd do sąsiednich komórek. Stężenie Agrobacterium stosowanego do infiltracji zależy odpowiednio od skuteczności ekspresji różnych struktur. Do agroinfiltracji należy upewnić się, że używasz rozcieńczenia hodowli komórkowej, które zapewnia (i) transformację pojedynczych komórek, pozostawiając sąsiednie komórki nieprzekształcone, (ii) osiąga podobną wydajność ekspresji. Na przykład nasze eksperymenty wykorzystują OD₆₀₀ wynoszące 0,01 i 0,005 do ekspresji odpowiednio PLS znakowanych CFP i wolnego DsRed2.

6. Identyfikacja kluczowych pozostałości PLS za pomocą skanowania alaniny⁴²

1. Użyj standardowych protokołów PCR, aby amplifikować sekwencję kodującą PLS za pomocą pary starterów zaprojektowanych tak, aby zawierały pożądaną mutację, tj. Podstawienie docelowej reszty aminokwasowej alaniną, wokół centralnego obszaru każdego startera, jak opisano²¹. Wykonaj projekt podkładu i użyj zestawu do mutagenezy ukierunkowanej na miejsce do mutagenezy ukierunkowanej zgodnie z instrukcjami producenta.
2. Oczyść otrzymane produkty PCR przy użyciu dowolnego standardowego zestawu do oczyszczania DNA i strawij je w temperaturze 37 °C za pomocą DpnI w celu wyeliminowania rodzicielskiego (tj. niezmutowanego) metylowanego i hemimetylowanego DNA. Schładzaj to przez 5 minut w temperaturze pokojowej (nie na lodzie). Następnie przekształć mieszaninę bezpośrednio w komórki kompetentne E. coli⁴³ i zidentyfikuj kolonie z pożądanymi zmutowanymi konstruktami, jak opisano w kroku 3.2.
3. Wprowadź zmutowane konstrukty do wektora binarnego zgodnie z opisem w kroku 2.2.4, przeprowadź agroinfiltrację zgodnie z opisem w kroku 3 i oceń celowanie w Pd zgodnie z opisem w krokach 4 i 5.1.

Reprezentatywne dane, które wiernie ilustrują oczekiwane wyniki z opisanych protokołów i identyfikują TMV MP PLS, zostały zaadaptowane z Yuan et al.21. Rysunek 1A najpierw podsumowuje główne konstrukty wyrażające pełnowymiarowe TMV MP (1-268), TMV MP PLS (zawierające pierwsze 50 reszt aminokwasowych białka, 1-50) i jego pochodne V4A skanujące alaninę połączone z CFP (wygenerowane zgodnie z opisem w krokach 2.2, 5.2 i 6), podczas gdy Rysunek 1B podsumowuje i określa ilościowo subkomórkową lokalizację tych oznakowanych białek. Rysunek 1C ilustruje charakterystyczne obwodowe punktowe wzorce lokalizacji Pd obserwowane dla TMV MP-CFP i dla TMV MP PLS-CFP, a także dla koeksprymowanego markera Pd, PDCB1-DsRed2 (patrz krok 5.1). Rysunek 2A ilustruje celowanie w Pd TMV MP-CFP i dla TMV MP PLS-CFP oraz rozkład nukleocytoplazmatyczny koeksprymowanego wolnego DeRed2 (patrz krok 5.1). Wreszcie, rysunek 2B ilustruje utratę celowania Pd zarówno przez TMV MP, jak i TMV MP PLS z pojedynczą podstawionką alaniny V4A, co wskazuje, że ta reszta jest ważna dla struktury lub funkcji PLS; w tych samych komórkach koeksprymowany marker Pd PDCB1 nadal lokalizuje się w Pd (patrz Krok 6).

Te dane pokazują, że ta koncepcyjnie i technicznie prosta procedura systematycznej produkcji fragmentów białka, ich fuzji z autofluorescencyjnym markerem-białkiem ładunkowym oraz testowania zdolności do lokalizacji do Pd może zidentyfikować minimalną sekwencję białka niezbędną i wystarczającą do celowania w Pd, tj.PLS. Dla prawidłowej interpretacji tych danych lokalizacyjnych kluczowe znaczenie ma przeprowadzenie eksperymentów kolokalizacyjnych ze znanym białkiem Pd, np. PDLP lub członkami rodziny PDCB16,23 lub jednym z wirusów roślinnych, które sortują do Pd44. Oczywiście kolokalizacja nie musi być całkowita, ponieważ nie wszystkie białka lokalizujące P mogą być ukierunkowane na tę samą Pd, ale statystycznie istotny stopień kolokalizacji z co najmniej jednym z białek markerowych Pd jest niezbędny do zdefiniowania aktywności PLS.

Rysunek 1: Identyfikacja TMV MP PLS. (A) Podsumowanie głównych konstruktów CFP-fuzja stosowanych do identyfikacji TMV MP PLS. Sekwencje TMV MP, zielone pola; WPRyb, skrzynki niebieskie; P, promotor; T, terminator. Liczby po lewej stronie wskazują reszty aminokwasowe zawarte w każdym fragmencie TMV MP. (B) Podsumowanie subkomórkowej lokalizacji białek fuzyjnych pokazanych w (A). Lokalizację Pd lub lokalizację nukleocytoplazmatyczną określono na podstawie lokalizacji odpowiednich markerów subkomórkowych, odpowiednio PDCB1-DsRed2 i wolnego DsRed2. Odsetek komórek wykazujących każdy wzorzec lokalizacji jest pokazany na podstawie oceny 100 komórek wyrażających ekspresję na konstrukt w trzech niezależnych eksperymentach. Dane są średnimi ± błędami standardowymi (SE). (C) Ukierunkowanie na Pd TMV MP-CFP, TMV MP PLS-CFP i marker Pd PDCB1-DsRed2. Sygnał CFP jest w kolorze niebieskim; Sygnał DsRed2 jest w kolorze fioletowym; Autofluorescencja plastydów została odfiltrowana. Obrazy są pojedynczymi sekcjami konfokalnymi. Podziałka = 10 μm. DIC, Mikroskopia kontrastu różnicowego z interferencją. Ten rysunek jest zaadaptowany z Yuan et al.21. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 2: Celowanie w Pd TMV MP, TMV MP PLS i ich mutanty skanujące alaninę. (A) Subkomórkowa lokalizacja TMV MP-CFP, TMV MP PLS-CFP i markera nukleocytoplazmatycznego DsRed2. (B) Utrata zdolności namierzania Pd przez mutanty V4A skanujące alaninę TMV MP-CFP i TMV MP PLS-CFP. Pd wizualizowano przez koekspresję markera Pd PDCB1-DsRed2. Sygnał CFP jest w kolorze niebieskim; Sygnał DsRed2 jest w kolorze fioletowym; Autofluorescencja plastydów została odfiltrowana. Obrazy są pojedynczymi sekcjami konfokalnymi. Podziałka = 10 μm. DIC, Mikroskopia kontrastu różnicowego z interferencją. Ten rysunek jest zaadaptowany z Yuan et al.21. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Nie stwierdzono konfliktu interesów.