Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Identyfikacja sekwencji lokalizacji plazmodesmalnej w białkach w Planta

7.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55301

⸱

15 sierpnia 2017

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Cell Biology, State University of New York, 2Department of Plant Pathology and Plant-Microbe Biology, Cornell University

W tym artykule

Podsumowanie

Połączenia międzykomórkowe roślin, plazmodesmaty (Pd), odgrywają kluczową rolę w fizjologii roślin i interakcjach między roślinami a wirusami. Kluczowe znaczenie dla transportu Pd mają sygnały sortujące, które kierują białka do Pd. Jednak nasza wiedza na temat tych sekwencji jest wciąż w powijakach. Opisujemy strategię identyfikacji sygnałów lokalizacji Pd w białkach docelowych Pd.

Streszczenie

Plasmodesmata (Pd) to połączenia między komórkami, które funkcjonują jako bramy, przez które małe i duże cząsteczki są transportowane między komórkami roślinnymi. Podczas gdy zakłada się, że transport Pd małych cząsteczek, takich jak jony i woda, zachodzi pasywnie, transport makrocząsteczek biologicznych z komórki do komórki, takich białek, najprawdopodobniej zachodzi poprzez aktywny mechanizm, który obejmuje specyficzne sygnały celowania w transportowaną cząsteczkę. Niedobór zidentyfikowanych sygnałów lokalizacji plazmodesmatów (Pd) (PLS) poważnie ograniczył zrozumienie szlaków sortowania białek zaangażowanych w transport i komunikację makromolekularną między komórkami roślinnymi. Spośród bogactwa roślinnych białek endogennych i wirusowych, o których wiadomo, że przemieszczają się przez PD, do tej pory zgłoszono tylko trzy PLS, wszystkie z nich pochodzą z endogennych białek roślinnych. Dlatego ważne jest, aby opracować wiarygodną i systematyczną strategię eksperymentalną w celu zidentyfikowania funkcjonalnej sekwencji PLS, która jest zarówno niezbędna, jak i wystarczająca do celowania w Pd, bezpośrednio w żywych komórkach roślinnych. W tym miejscu opisujemy jedną z takich strategii, wykorzystując jako paradygmat białko ruchu między komórkami (MP) wirusa mozaiki tytoniu (TMV). Eksperymenty te, które zidentyfikowały i scharakteryzowały pierwszego roślinnego wirusa PLS, mogą być przystosowane do odkrycia sekwencji PLS w większości białek ukierunkowanych na PD.

Wprowadzenie

Plasmodesmaty (Pd) funkcjonują jako kanały do transportu międzykomórkowego kluczowych regulatorów rozwoju i morfogenezy roślin, począwszy od czynników transkrypcyjnych, a skończywszy na mRNA i małych cząsteczkach RNA. Co więcej, ta makromolekularna zdolność transportowa Pd jest wykorzystywana przez większość wirusów roślinnych do ich międzykomórkowego rozprzestrzeniania się podczas infekcji; aby przemieszczać się przez Pd, wirusy roślinne wyewoluowały wyspecjalizowane białka, zwane białkami ruchu (MP), które są specjalnie ukierunkowane na Pd1,2,3,4,5,6,7. Molekularne szlaki transportu Pd najprawdopodobniej są ściśle powiązane z określonymi sekwencjami, które kierują transportowane białka do tych szlaków. W związku z tym identyfikacja tych sygnałów lokalizacyjnych Pd (PLS) może być diagnostyką odpowiadającego im szlaku transportu Pd. Jest to analogia do transportu Pd8, na przykład do różnych ścieżek importu jądrowego, które mogą być specyficzne dla różnych sekwencji sygnału lokalizacji jądrowej (NLS)9,10. Koncepcyjnie zarówno NLS, jak i PLS reprezentują nierozszczepialne subkomórkowe sekwencje celowania, które są niezbędne i wystarczające do celowania. Jednak w przeciwieństwie do NLSs11, informacje o sekwencji PLS są poważnie ograniczone. W szczególności opisano tylko cztery sekwencje białek zaangażowane w celowanie w Pd, z których wszystkie pochodzą z endogennych białek roślinnych. Pierwsza z nich jest reprezentowana przez domenę homeoboxa KN112 – czynnik transkrypcyjny, który przemieszcza się z wewnętrznych warstw komórkowych do naskórka liścia rośliny13 – i jego homologi KNOX14. Drugi również pochodzi od czynnika transkrypcyjnego, Dof, który zawiera przypuszczalny PLS opisany jako motyw transportu międzykomórkowego (IT)15. Trzecia sekwencja pochodzi z białka błonowego typu 1 rezydującego w plazmodesmacie PDLP1 i jest reprezentowana przez domenę transbłonową16. Wreszcie, czwarta sekwencja celująca w Pd została niedawno zgłoszona dla białek zakotwiczonych w glikozylofosfatydyloinozytolu (GPI) i jest reprezentowana przez sygnał modyfikacji glikozylofosfatydyloinozytolu (GPI)17.

Ciekawe, że do niedawna nie zgłoszono żadnych PLS dla wirusowych MP. Wcześniejsze badania wykazały obecność przypuszczalnych sekwencji PLS w wirusach roślinnych MPS18,19, ale w wirusowym MP nie zidentyfikowano prawdziwej sekwencji aminokwasów, tj. minimalnej sekwencji aminokwasów, zarówno koniecznej, jak i wystarczającej do celowania w Pd niepowiązanej cząsteczki ładunku (np. CFP). Jednak jedno z tych białek, MP wirusa mozaiki tytoniu (TMV), było pierwszym, dla którego wykazano lokalizację i transport Pd20.

Aby wypełnić tę lukę, opracowaliśmy eksperymentalną strategię identyfikacji TMV MP PLS. Strategia ta opierała się na trzech koncepcjach. (i) Zdefiniowaliśmy PLS jako minimalną sekwencję aminokwasów, która jest zarówno niezbędna, jak i wystarczająca do kierowania białka do Pd21. (ii) Ponieważ TMV MP najpierw atakuje Pd, a następnie translokuje się przez te kanały22, naszym celem było rozdzielenie tych dwóch działań i zidentyfikowanie działającego w dobrej wierze PLS, który działa tylko do namierzania Pd, a nie do późniejszego transportu. (iii) Przeanalizowaliśmy zidentyfikowany PLS pod kątem reszt aminokwasowych ważnych dla jego aktywności ukierunkowanej na Pd, zarówno strukturalnie, jak i funkcjonalnie. Korzystając z tego podejścia, nakreśliliśmy sekwencję 50-aminokwasowych reszt na końcu aminowym TMV MP, która działa jak bona fide PLS. Dokonano tego poprzez wyprodukowanie serii fragmentów TMV MP, które nasyciły całą długość białka, oznaczając ich końce karboksylowe CFP i przejściowo eksprymując je w tkankach roślinnych. Lokalizację Pd każdego z badanych fragmentów określono poprzez ich koekspresję z białkiem markerowym Pd, PDCB1 (Pd callose binding protein 1)23. Najmniejszy fragment, który nadal znajdował się w Pd, ale nie przechodził przez Pd, został uznany za reprezentujący PLS. Na koniec PLS został zeskanowany alaniną w celu określenia kluczowych reszt aminokwasowych wymaganych do jego struktury i/lub funkcji.

Podczas gdy tutaj ilustrujemy to podejście, opisując identyfikację TMV MP PLS, może ono być wykorzystane do odkrycia PLS w innych białkach ukierunkowanych na Pd, czy to kodowanych przez patogeny roślinne, czy przez same rośliny; dzieje się tak dlatego, że nasza metoda nie wykorzystuje żadnych unikalnych cech wirusowych MP w odniesieniu do ich zdolności do kierowania na Pd.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Materiał roślinny

  1. Wybór gatunków roślin
  2. Należy użyć gatunku rośliny rodzimego dla białka będącego przedmiotem zainteresowania, tj. takiego, który koduje to białko dla białek endogennych lub który stanowi naturalnego gospodarza dla patogenu dla białek wirusowych. Ponadto wybrane gatunki roślin muszą być podatne na wybraną metodę przejściowej transformacji genetycznej.
    UWAGA: W badaniach rutynowo wykorzystuje się Nicotiana benthamiana, która stanowi dobrego gospodarza dla TMV i jest skutecznie przekształcana przez technikę transformacji genetycznej za pośrednictwem Agrobacterium, tj. agroinfiltracji (patrz Krok 3). Rośliny N. benthamiana są również łatwe w uprawie i mają duże liście, które są łatwo zaszczepiane przez Agrobacterium i łatwo analizowane za pomocą mikroskopii konfokalnej.
  3. Wzrost roślin
    1. Posadź nasiona N. benthamiana w wilgotnej glebie o dużej gęstości. Przechowuj je w komorze o kontrolowanym środowisku w temperaturze 20-25 °C pod 16 godzinami światła przy ~75 μmol fotonach m-2 s-1 i 8 godzinach ciemności. Gdy średnica eufilu osiągnie 0,5 cm, ostrożnie przenieś sadzonki do większych doniczek i kontynuuj wzrost w tej samej komorze w tych samych warunkach.
    2. Utrzymuj rośliny do momentu, gdy osiągną fazę 4-8 liści w ciągu 4 tygodni, gdy największe liście mają średnicę 4-6 cm; w tym czasie można je wykorzystać do agroinfiltracji (patrz Krok 3).
      UWAGA: Co ważne, nigdy nie używaj roślin, jeśli zaczęły kwitnąć, ponieważ na tym etapie rozwoju architektura liści często się zmienia24,25, co czasami prowadzi do niespójnych wyników.

2. Konstrukcja wektora wyrażenia

  1. Wybór systemu odciągania pokarmu
    1. Należy wybrać system ekspresji, tj. wektory i metodę dostarczania wektorów, najlepiej dopasowany do ekspresji białka będącego przedmiotem zainteresowania u badanych gatunków roślin.
      UWAGA: Czasami takie specyficzne kombinacje badanych gatunków białek/roślin mogą wymagać określonych wektorów i metody dostarczania wektorów w celu optymalnej ekspresji i funkcji białka będącego przedmiotem zainteresowania. Jednak w przypadku większości roślin dwuliściennych należy wybrać plazmidy binarne jako wektory ekspresji i agroinfiltrację jako system dostarczania.
  2. Znakowanie fluorescencyjne białek
    1. Oznacz fluorescencyjnie każde białko ulegające ekspresji w celu analizy jego dystrybucji subkomórkowej22, w tym lokalizację Pd.
      UWAGA: Zastosuj białka autofluorescencyjne, takie jak CFP i DsRed2, jako znaczniki. Oznacz badane białko CFP i poddaj je koekspresji za pomocą wolnego DsRed2. CFP funkcjonuje zarówno jako znacznik, jak i jako cząsteczka ładunkowa niezwiązana z wirusem. Funkcje DsRed2 w celu kalibracji ogólnej wydajności ekspresji w stanach nieustalonych oraz, ponieważ jest autonomiczny dla komórki, w celu identyfikacji początkowo przekształconej komórki; Ta ostatnia funkcja jest ważna przy ocenie przemieszczania się między komórkami potencjalnie nieautonomicznych badanych białek. W celu koekspresji z markerem Pd PDCB1, który również jest autonomiczny komórkowo, oznacz badane białko CFP, a PDCB1 DsRed2.
    2. Z reguły połącz znacznik autofluorescencyjny z końcem karboksylowym wyrażonego białka. Jeśli jednak oznakowane badane białko o pełnej długości wykazuje upośledzone celowanie w Pd, przenieś znacznik do końca aminowego białka.
    3. Sklonuj sekwencje kodujące białek, które mają być badane, do odpowiedniego wektora ekspresji roślinnej.
      UWAGA: Istnieje wiele różnych wektorów ekspresji roślin, które umożliwiają znakowanie fluorescencyjne. Używamy serii plazmidów pSAT 26 lub niektórych z ich pochodnych 27,28, które są odpowiednie do klonowania interesującej nas sekwencji bezpośrednio w ramce z sugerowanymi znacznikami autofluorescencyjnymi (patrz Krok 2.2.1) zarówno w orientacji amino-, jak i karboksylowo-końcowej.
    4. Przenieś każdą kasetę z wyrażeniami do wektora binarnego Agrobacterium.
      UWAGA: Chociaż konstrukty oparte na pSAT nadają się do bezpośredniego dostarczania biolistycznego do tkanek roślinnych, agroinfiltracja, która jest zalecaną tutaj metodą transformacji (patrz Krok 3), wymaga, aby kaseta ekspresji znajdowała się między granicami T-DNA wektora binarnego29.
      UWAGA: Wszystkie wektory pSAT są zaprojektowane tak, aby umożliwić taki transfer do wielogenowego wektora binarnego ekspresji pPZP-RCS2 26,30 poprzez jednoetapowe klonowanie przy użyciu rzadkich nukleaz tnących AscI, I-PpoI, I-SceI, I-CeuI, PI-PspI i PI-TliI26. Naukowcy, którzy preferują klonowanie rekombinatoryczne, np. przy użyciu heterologicznych miejsc lox31, mogą zastosować warianty wektorów pSAT 26,27.
    5. W celu uzyskania koekspresji przenieś obie kasety ekspresji, np. badane białko-CFP i DsRed2 lub badane białko-CFP i PDCB1-DsRed2 (patrz krok 2.1), do tego samego wektora binarnego pPZP-RCS2.
      UWAGA: Alternatywnie, kultury Agrobacterium zawierające indywidualne konstrukty binarne mogą być mieszane ze sobą w celu infiltracji do N. benthamiana (patrz Krok 3.1).

3. Agroinfiltracja

  1. Dodać 1 μg plazmidu na bazie pPZP-RCS2 z kroku 2.2.5 do 100 μl hodowli kompetentnych komórek Agrobacterium tumefaciens szczep EHA105 lub GV3101 przygotowanych zgodnie z opisem32, inkubować na lodzie przez 30 minut, zamrażać w ciekłym azocie przez 1 minutę i inkubować w temperaturze 28 °C przez 15 minut.
    1. Następnie dodać 1 ml pożywki LB (10 g/l tryptonu, 5 g/l ekstraktu drożdżowego i 10 g/l NaCl) do właściwej mieszaniny komórek i inkubować w temperaturze 28 °C przez 2 godziny. Odwirować komórki w temperaturze 3 000 × g przez 1 minutę, ponownie zawiesić je w 0,2 ml LB i umieścić na agarze LB uzupełnionym odpowiednimi antybiotykami (np. 100 mg/l spektynomycyny i 50 mg/l ryfampicyny dla wektorów opartych na pPZP-RSC226,30). Rosnąć w temperaturze 28 °C przez 48 godzin, aż pojawią się pojedyncze kolonie.
  2. Zebrać i ułożyć na płytce z agarem świeże LB (patrz krok 3.1), hodować w temperaturze 28 °C przez 48 godzin i pobrać niewielką ilość bakterii do analizy metodą colony PCR33, aby potwierdzić obecność określonych konstruktów binarnych.
  3. Hodować każdą kolonię Agrobacterium z interesującym konstruktem przez noc w temperaturze 28 °C w 5 ml pożywki LB uzupełnionej odpowiednimi antybiotykami (patrz krok 3.1.1). Odwirować komórki w stężeniu 3 000 × g i ponownie zawiesić je do OD600 = 0,5 w buforze agroinfiltracyjnym (10 mM MgCl2, 10 mM MES (pH 5,6), 150 μM acetosyringonu). Inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
    1. W przypadku stosowania mieszaniny plazmidów binarnych, a nie pojedynczego plazmidu o ekspresji wielogenowej do koekspresji białek, przed infiltracją wymieszaj odpowiednie kultury komórkowe w stosunku 1:1 v/v. Następnie inkubować komórki w temperaturze 28 °C przez 2 godziny.
  4. Załadować inokulum do plastikowej strzykawki o pojemności 1 ml i docisnąć dyszę strzykawki (bez igły) do dolnego (abaksjalnego) naskórka w pełni dojrzałych liści N. benthamiana. Przytrzymaj liść palcem w rękawiczce na powierzchni adaxial34,35.
    1. Wprowadzić Agrobacterium do pożywki infiltracyjnej przez powolne wstrzyknięcie. Aby uzyskać istotność statystyczną, naciekaj kilka liści na każdej roślinie.
      UWAGA: Należy pamiętać, że najstarsze liście nie są używane, ponieważ nie dają one stałych poziomów ekspresji.
    2. Zaszczepić wszystkie liście in situ. Utrzymuj infiltrowaną roślinę do czasu obserwacji opisanej w kroku 1.2 .

4. Mikroskopia konfokalna

  1. Za pomocą ostrza pociąć każdy liść na fragmenty między żyłkami 24-48 godzin po infiltracji (w zależności od skuteczności przejściowej ekspresji określonego badanego białka); rozmiar każdego wycinka tkanki powinien być taki, aby wycinek był całkowicie pokryty szkłem nakrywkowym (22 mm x 40 mm) używanym do mikroskopii.
  2. Umieść plastry liści na szkiełku przedmiotowym powierzchnią liścia aosiowego skierowaną do góry, umieść kroplę wody na plasterku liścia i przykryj go szkłem nakrywkowym. Unieruchom szkło nakrywkowe małymi kawałkami taśmy z każdej strony.
  3. Obserwuj agroinfiltrowane tkanki pod laserowym skaningowym mikroskopem konfokalnym i zapisz uzyskane obrazy.
    1. Najpierw użyj soczewki obiektywowej 10x, aby zidentyfikować komórki z sygnałem, a następnie użyj soczewki obiektywu 63x, aby uzyskać bardziej szczegółowe obserwacje.
    2. Użyj długości fali 458 nm z lasera argonowo-jonowego do wzbudzenia CFP i 543 nm do wzbudzenia DsRed2. Zachowaj wszystkie ustawienia akwizycji obrazu, tj. intensywność lasera i ustawienia lampy fotopowielacza (PMT), między eksperymentami. Średnio zbadaj 100-120 komórek dla każdego warunku eksperymentalnego.

5. Identyfikacja PLS

  1. Zdiagnozuj lokalizację badanego białka za pomocą mikroskopu konfokalnego (punkt 4). Sprawdź, czy badane białko ma charakterystyczny peryferyjny wzór punktowy25,36,37,38,39,40,41 i kolokalizuje się ze znacznikiem Pd PDCB123. Wskazuje to, że badane białko najprawdopodobniej zawiera sekwencje PLS.
  2. Po potwierdzeniu aktywności PLS badanego białka, stopniowo podziel jego otwartą ramkę odczytu (ORF) (numer dostępu do banku genów BAF93925.1) na mniejsze fragmenty, autofluorescencyjnie (np. CFP) oznacz każdy z nich i przeanalizuj ich lokalizację subkomórkową zgodnie z opisem w Kroku 4. Początkowo zalecana jest wielkość 100 reszt aminokwasowych dla każdego podzielonego fragmentu.
  3. Następnie należy podzielić obcięte fragmenty, które mają aktywność PLS i sprawdzić ich lokalizację subkomórkową, jak opisano w kroku 4, aż zostanie zidentyfikowany najmniejszy fragment, który nadal lokalizuje się w Pd, tj. jest wystarczający do przetransportowania ładunku znacznika autofluorescencyjnego do Pd. Przypuszcza się, że ten fragment reprezentuje sekwencję PLS.
  4. Usuń przypuszczalny PLS z badanego białka o pełnej długości, tj. połącz pozostałą część badanego białka bez przypuszczalnego PLS ze znacznikiem autofluorescencyjnym i określ subkomórkową lokalizację powstałego zmutowanego białka, jak opisano w kroku 4. Jeśli to zmutowane białko, które nie ma przypuszczalnego PLS, nie zlokalizuje się w Pd, będzie to oznaczać, że zidentyfikowany PLS jest nie tylko wystarczający (patrz Krok 5.3), ale także niezbędny do transportu Pd badanego białka.
  5. Agroinfiltrować liście mieszaniną kultur Agrobacterium zawierających konstrukt wyrażenia dla PLS znakowanego CFP i wolnego DsRed2 (patrz krok 3.3). Obserwuj naciekaną tkankę za pomocą mikroskopu konfokalnego z soczewką obiektywową 10x, używając tych samych ustawień, co w kroku 4.3.
  6. Oceń komórki, które zawierają zarówno sygnały CFP, jak i DsRed2 jako początkowo naciekające komórki, i oceń sąsiednie komórki, które zawierały tylko sygnał CFP, jako te, które wykazują ruch.
    UWAGA: Ten krok bada zidentyfikowany PLS pod kątem jego potencjalnej zdolności do przemieszczania się między komórkami; dzieje się tak, ponieważ wiele białek, które celują w Pd (w tym większość wirusów roślinnych MP) również przemieszcza się przez Pd do sąsiednich komórek. Stężenie Agrobacterium stosowanego do infiltracji zależy odpowiednio od skuteczności ekspresji różnych struktur. Do agroinfiltracji należy upewnić się, że używasz rozcieńczenia hodowli komórkowej, które zapewnia (i) transformację pojedynczych komórek, pozostawiając sąsiednie komórki nieprzekształcone, (ii) osiąga podobną wydajność ekspresji. Na przykład nasze eksperymenty wykorzystują OD600 wynoszące 0,01 i 0,005 do ekspresji odpowiednio PLS znakowanych CFP i wolnego DsRed2.

6. Identyfikacja kluczowych pozostałości PLS za pomocą skanowania alaniny42

  1. Użyj standardowych protokołów PCR, aby amplifikować sekwencję kodującą PLS za pomocą pary starterów zaprojektowanych tak, aby zawierały pożądaną mutację, tj. Podstawienie docelowej reszty aminokwasowej alaniną, wokół centralnego obszaru każdego startera, jak opisano21. Wykonaj projekt podkładu i użyj zestawu do mutagenezy ukierunkowanej na miejsce do mutagenezy ukierunkowanej zgodnie z instrukcjami producenta.
  2. Oczyść otrzymane produkty PCR przy użyciu dowolnego standardowego zestawu do oczyszczania DNA i strawij je w temperaturze 37 °C za pomocą DpnI w celu wyeliminowania rodzicielskiego (tj. niezmutowanego) metylowanego i hemimetylowanego DNA. Schładzaj to przez 5 minut w temperaturze pokojowej (nie na lodzie). Następnie przekształć mieszaninę bezpośrednio w komórki kompetentne E. coli43 i zidentyfikuj kolonie z pożądanymi zmutowanymi konstruktami, jak opisano w kroku 3.2.
  3. Wprowadź zmutowane konstrukty do wektora binarnego zgodnie z opisem w kroku 2.2.4, przeprowadź agroinfiltrację zgodnie z opisem w kroku 3 i oceń celowanie w Pd zgodnie z opisem w krokach 4 i 5.1.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Reprezentatywne dane, które wiernie ilustrują wyniki oczekiwane po zastosowaniu opisanych protokołów i identyfikują PLS białka MP wirusa TMV, zostały zaadaptowane z pracy Yuan et al.21. Rysunek 1A przedstawia zestawienie głównych konstruktów wykazujących ekspresję pełnej długości TMV MP (1-268), TMV MP PLS (obejmującego pierwsze 50 reszt aminokwasowych białka, 1-50) oraz jego pochodnych z mutacjami w ramach skanowania alaniną V4A, połączon...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten składa się z czterech podstawowych elementów: koncepcji identyfikacji sekwencji, która jest zarówno niezbędna, jak i wystarczająca do ukierunkowania na Pd, systematycznego podziału białka będącego przedmiotem zainteresowania na fragmenty, które są stopniowo skracane pod względem długości, łączenia badanych fragmentów z białkiem autofluorescencyjnym, które służy zarówno jako znacznik, jak i jako ładunek makrocząsteczkowy, oraz testu funkcjonalnego do celowania w Pd w żywych tkankach roślinnych po przejściowej...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

Z braku miejsca, cytowaliśmy głównie artykuły przeglądowe i przepraszamy naszych kolegów, których oryginalne prace nie zostały zacytowane. Prace w laboratorium V.C. są wspierane przez granty z NIH, NSF, USDA/NIFA, BARD i BSF dla V.C., a laboratorium SGL jest wspierane przez NIH oraz fundusze z Zakładów Patologii Roślin i Biologii Mikroorganizmów dla S.G.L.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy (CLSM)ZeissLSM5Każdy CLSM o podobnych możliwościach jest odpowiedni
Oprogramowanie Zen do obrazowania mikroskopem konfokalnymWersja Zeiss2009Oprogramowanie powinno być kompatybilne z używanym przez CLSM
zestawem do mutagenezy ukierunkowanej na miejsce Quickchange II Agilent200523
AcetosyringoneSigma-AldrichD134406
MESSigma-Aldrich69892
Strzykawki bez igiełBD309659
MgCl2FisherScientificM33-500
Spectinomycin Sigma-AldrichS4014
RyfampicynaSigma-AldrichR3501
Ampicylina Sigma-AldrichA0166
powiedział:

Bibliografia

  1. Lee, J. Y. Plasmodesmata: a signaling hub at the cellular boundary. Curr. Opin. Plant Biol. 27, 133-140 (2015).
  2. Kumar, D., Kumar, R., Hyun, T. K., Kim, J. Cell-to-cell movement of viruses via plasmodesmata. J. Plant Res. 128, 37-47 (2015).
  3. Kitagawa, M., Paultre, D., Rademaker, H. Intercellular communication via plasmodesmata. New Phytol. 205, 970-972 (2015).
  4. Jackson, D. Plasmodesmata spread their influence. F1000Prime Rep. 7, 25(2015).
  5. Brunkard, J. O., Runkel, A. M., Zambryski, P. C. The cytosol must flow: intercellular transport through plasmodesmata. Curr. Opin. Cell Biol. 35, 13-20 (2015).
  6. Yadav, S. R., Yan, D., Sevilem, I., Helariutta, Y. Plasmodesmata-mediated intercellular signaling during plant growth and development. Front. Plant Sci. 5, 44(2014).
  7. Sager, R., Lee, J. Y. Plasmodesmata in integrated cell signaling: insights from development and environmental signals and stresses. J. Exp. Bot. 65, 6337-6358 (2014).
  8. Jans, D. A., Xiao, C. Y., Lam, M. H. Nuclear targeting signal recognition: a key control point in nuclear transport? BioEssays. 22, 532-544 (2000).
  9. Miyamoto, Y., et al. Different modes of nuclear localization signal (NLS) recognition by three distinct classes of NLS receptors. J. Biol. Chem. 272, 26375-26381 (1997).
  10. Nair, R., Carter, P., Rost, B. NLSdb: database of nuclear localization signals. Nucleic Acids Res. 31, 397-399 (2003).
  11. Lee, J. Y., Yoo, B. C., Lucas, W. J. Parallels between nuclear-pore and plasmodesmal trafficking of information molecules. Planta. 210, 177-187 (2000).
  12. Kim, J. Y., Rim, Y., Wang, J., Jackson, D. A novel cell-to-cell trafficking assay indicates that the KNOX homeodomain is necessary and sufficient for intercellular protein and mRNA trafficking. Genes Dev. 19, 788-793 (2005).
  13. Lucas, W. J., et al. Selective trafficking of KNOTTED1 homeodomain protein and its mRNA through plasmodesmata. Science. 270, 1980-1983 (1995).
  14. Chen, H., Jackson, D., Kim, J. Y. Identification of evolutionarily conserved amino acid residues in homeodomain of KNOX proteins for intercellular trafficking. Plant Signal. Behav. 9, e28355(2014).
  15. Chen, H., Ahmad, M., Rim, Y., Lucas, W. J., Kim, J. Y. Evolutionary and molecular analysis of Dof transcription factors identified a conserved motif for intercellular protein trafficking. New Phytol. 198, 1250-1260 (2013).
  16. Thomas, C. L., Bayer, E. M., Ritzenthaler, C., Fernandez-Calvino, L., Maule, A. J. Specific targeting of a plasmodesmal protein affecting cell-to-cell communication. PLOS Biol. 6, e7(2008).
  17. Zavaliev, R., Dong, X., Epel, B. L. Glycosylphosphatidylinositol (GPI) modification serves as a primary plasmodesmal targeting signal. Plant Physiol. 172, 1061-1073 (2016).
  18. Sasaki, N., Park, J. W., Maule, A. J., Nelson, R. S. The cysteine-histidine-rich region of the movement protein of Cucumber mosaic virus contributes to plasmodesmal targeting, zinc binding and pathogenesis. Virology. 349, 396-408 (2006).
  19. Kaido, M., Funatsu, N., Tsuno, Y., Mise, K., Okuno, T. Viral cell-to-cell movement requires formation of cortical punctate structures containing Red clover necrotic mosaic virus movement protein. Virology. 413, 205-215 (2011).
  20. Creager, A. N. H., Scholthof, K. B. G., Citovsky, V., Scholthof, H. B. Tobacco mosaic virus: pioneering research for a century. Plant Cell. 11, 301-308 (1999).
  21. Yuan, C., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. Identification of a functional plasmodesmal localization signal in a plant viral cell-to-cell movement protein. mBio. 7, e02052-e02015 (2016).
  22. Ueki, S., Citovsky, V. To gate, or not to gate: regulatory mechanisms for intercellular protein transport and virus movement in plants. Mol. Plant. 4, 782-793 (2011).
  23. Simpson, C., Thomas, C. L., Findlay, K., Bayer, E., Maule, A. J. An Arabidopsis GPI-anchor plasmodesmal neck protein with callose binding activity and potential to regulate cell-to-cell trafficking. Plant Cell. 21, 581-594 (2009).
  24. Maule, A. J. Plasmodesmata: structure, function and biogenesis. Curr. Opin. Plant Biol. 11, 680-686 (2008).
  25. Roberts, I. M., et al. Dynamic changes in the frequency and architecture of plasmodesmata during the sink-source transition in tobacco leaves. Protoplasma. 218, 31-44 (2001).
  26. Tzfira, T., et al. pSAT vectors: a modular series of plasmids for fluorescent protein tagging and expression of multiple genes in plants. Plant Mol. Biol. 57, 503-516 (2005).
  27. Chakrabarty, R., et al. pSITE vectors for stable integration or transient expression of autofluorescent protein fusions in plants: probing Nicotiana benthamiana-virus interactions. Mol. Plant-Microbe Interact. 20, 740-750 (2007).
  28. Chung, S. M., Frankman, E. L., Tzfira, T. A versatile vector system for multiple gene expression in plants. Trends Plant Sci. 10, 357-361 (2005).
  29. Lee, L. Y., Gelvin, S. B. T-DNA binary vectors and systems. Plant Physiol. 146, 325-332 (2008).
  30. Goderis, I. J., et al. A set of modular plant transformation vectors allowing flexible insertion of up to six expression units. Plant Mol. Biol. 50, 17-27 (2002).
  31. Walhout, A. J., et al. GATEWAY recombinational cloning: application to the cloning of large numbers of open reading frames or ORFeomes. Methods Enzymol. 328, 575-592 (2000).
  32. Tzfira, T., et al. Transgenic Populus: a step-by-step protocol for its Agrobacterium-mediated transformation. Plant Mol. Biol. Rep. 15 (3), 219-235 (1997).
  33. Woodman, M. E., Savage, C. R., Arnold, W. K., Stevenson, B. Direct PCR of intact bacteria (colony PCR). Curr. Protoc. Microbiol. 42 (3D), 1-7 (2016).
  34. Kapila, J., De Rycke, R., Van Montagu, M., Angenon, G. An Agrobacterium-mediated transient gene expression system for intact leaves. Plant Sci. , 101-108 (1997).
  35. Wroblewski, T., Tomczak, A., Michelmore, R. Optimization of Agrobacterium-mediated transient assays of gene expression in lettuce, tomato and Arabidopsis. Plant Biotechnol. J. 3, 259-273 (2005).
  36. Boyko, V., Ferralli, J., Ashby, J., Schellenbaum, P., Heinlein, M. Function of microtubules in intercellular transport of plant virus RNA. Nat. Cell Biol. 2, 826-832 (2000).
  37. Heinlein, M., Epel, B. L., Padgett, H. S., Beachy, R. N. Interaction of tobamovirus movement proteins with the plant cytoskeleton. Science. 270, 1983-1985 (1995).
  38. Oparka, K. J., Prior, D. A. M., Santa-Cruz, S., Padgett, H. S., Beachy, R. N. Gating of epidermal plasmodesmata is restricted to the leading edge of expanding infection sites of tobacco mosaic virus (TMV). Plant J. 12, 781-789 (1997).
  39. Crawford, K. M., Zambryski, P. C. Non-targeted and targeted protein movement through plasmodesmata in leaves in different developmental and physiological states. Plant Physiol. 125, 1802-1812 (2001).
  40. Kotlizky, G., et al. A dysfunctional movement protein of Tobacco mosaic virus interferes with targeting of wild-type movement protein to microtubules. Mol. Plant-Microbe Interact. 14, 895-904 (2001).
  41. Ueki, S., Lacroix, B., Krichevsky, A., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. Functional transient genetic transformation of Arabidopsis leaves by biolistic bombardment. Nat. Protoc. 4, 71-77 (2009).
  42. Giesman-Cookmeyer, D., Lommel, S. A. Alanine scanning mutagenesis of a plant virus movement protein identifies three functional domains. Plant Cell. 5, 973-982 (1993).
  43. Ausubel, F. M., et al. Current Protocols in Molecular Biology. , Wiley-Interscience. New York. (1987).
  44. Waigmann, E., Ueki, S., Trutnyeva, K., Citovsky, V. The ins and outs of non-destructive cell-to-cell and systemic movement of plant viruses. Crit. Rev. Plant Sci. 23, 195-250 (2004).
  45. Lee, M. W., Yang, Y. Transient expression assay by agroinfiltration of leaves. Methods Mol. Biol. 323, 225-229 (2006).
  46. Burch-Smith, T. M., Schiff, M., Liu, Y., Dinesh-Kumar, S. P. Efficient virus-induced gene silencing in Arabidopsis. Plant Physiol. 142, 21-27 (2006).
  47. Tian, G. W., et al. High-throughput fluorescent tagging of full-length Arabidopsis gene products in planta. Plant Physiol. 135, 25-38 (2004).
  48. Tian, G. W., Chen, M. H., Zaltsman, A., Citovsky, V. A pollen-specific pectin methylesterase involved in pollen tube growth. Dev. Biol. 294, 83-91 (2006).
  49. Hunter, C. C., et al. Multiple nuclear localization signals mediate nuclear localization of the GATA transcription factor AreA. Eukaryot. Cell. 13, 527-538 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Lokalizacja plasmodesmatsygnały kierowania białekinfiltracja Agrobacteriummikroskopia konfokalnaznakowanie białkami fluorescencyjnymiwirus mozaiki tytoniukomunikacja komórek roślinnychtransport molekularnykierowanie do plasmodesmattransport międzykomórkowy
Identyfikacja sekwencji lokalizacji plazmodesmalnej w białkach w Planta
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.